JP6856894B2 - ポリオール酸化酵素 - Google Patents
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Description
酵素センサーは、これまでの一般的な分析方法である液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどに比べて、簡便、迅速、正確、小型、かつ低コストなどのメリットがあり、そのため、臨床診断や食品分析、環境汚染の測定などで広く利用されている。
酵素センサーとしては、例えば、 D−ソルビトールやグルコースが混在する検体に、ポリオール酸化酵素含有試薬を添加してキシリトールをD−キシロースに変換後、キシロースデヒドロゲナーゼ含有試薬を作用させて、生じたD−キシロースを検出し、検体中に存在するキシリトールを簡便かつ特異的に定量できるようにした(特許文献1)提案や、ソルビトール、マンニトール、キシリトールおよびアラビトールからなる群から選ばれた少なくとも1種のポリオールを含有する試料にソルビトールオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素またはD−グルコース、マンノース、キシロースまたはアラビノースまたは消費する酸素量を測定してポリオールを測定する試料中のポリオールの測定法(特許文献2)など数多くの提案がなされている。
Pseudomonas stutzri(FERM BP−8593)由来のL−ラムノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を作用させてD−アロースへと異性化するD−アロースの生産方法(特許文献3)や、D−プシコースおよび/またはL−プシコースを含有する溶液にD−キシロース・イソメラーゼを作用させて、D−プシコースからはD−アロースとD−アルトロースを、L−プシコースからはL−アルトロースを生成せしめ、これらD−アロース、D−アルトロース及びL−アルトロースから選ばれる1種または2種以上のアルドヘキソースを採取するアルドヘキソースの製造方法(特許文献4)が提案されている。
このアルドースを作る3つの方法を、それぞれのアルドースに適切な方法を用いて作ることが可能である。従来技術として最も研究が遅れているのが、3)のポリオールを原料とするポリオール酸化酵素を用いた生産方法である。
すなわち、本発明は、アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物由来の新規ポリオール酸化酵素に関するものであり、その酵素を利用して、特定の糖アルコールの1位のOH基を酸化して、希少糖を含む、対応するアルドースを製造する方法を提供するものである。
(1)下記(a)から(g)に記載の性質を有するアルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物由来のポリオール酸化酵素。
(a)基質のポリオールは、ポリオールの2位と3位のOH基がL−エリスロ型の構造またはL−スレオ型の構造を有する糖アルコールである。
(b)作用は、酸素の存在下、糖アルコールの1位のOH基を酸化し、糖アルコールに対応するアルドースと過酸化水素を生成する。
(c)SDS−PAGEで測定した見掛けの分子量が約45kDaである。
(d)安定pHはpH6.0以上であり、反応至適pHは7.0から10.0である。
(e)作用温度は60℃以下であり、反応至適温度は50℃である。
(f)基質特異性が、キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールの順である。
(g)作用は、酸素の存在下、キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールの1位のOH基を酸化し、それぞれ、D−キシロース、D−グルコース、L−アルトロース、D−ガラクトース、L−アラビノース、D−マンノース、D−リキソース、D−タロースを生成する。
(2)アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)M30(寄託番号 NITE BP−1111)である(1)に記載のポリオール酸化酵素。
(3)アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物を、キシリトールを単一炭素源とする無機塩培地で培養後、(1)または(2)に記載のポリオール酸化酵素を単離精製することを特徴とする、ポリオール酸化酵素の製造方法。
(4)アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)M30(寄託番号 NITE BP−1111)である(3)に記載のポリオール酸化酵素の製造方法。
(5)L−エリスロ型の構造またはL−スレオ型の構造を有する糖アルコールに、(1)または(2)に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、対応するアルドースを生産する方法。
(6)L−タリトールに、(1)または(2)に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、L−アルトロースへと酸化することを特徴とするL−アルトロースの生産方法。
(7)D−アラビトールに、(1)または(2)に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、D−リキソースへと酸化することを特徴とするD−リキソースの生産方法。
(8)D−タリトールに、(1)または(2)に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、D−タロースへと酸化することを特徴とするD−タロースの生産方法。
1.各種の希少糖アルドースを糖アルコールから生産するポリオール酸化酵素を提供することができる。
2.キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールに作用するポリオール酸化酵素を提供することができる。
3.一般的な分析方法である液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどに比べ、簡便、迅速、正確、小型、かつ低コストとなり、希少糖に関わる臨床診断や食品分析、環境汚染の測定などに有用である。
4.希少糖を効率よく製造することができる。
5.本酵素は一段階の反応で、しかも酸化反応の不可逆的な反応のため、ほぼ100%の収率で希少糖の大量生産が可能になる。
6.本ポリオール酸化酵素を利用することにより、以下のアルドースの特異的製造方法を提供できる。
a. キシリトールを原料としてD−キシロースを製造する方法
b. D−ソルビトールを原料としてD−グルコースを製造する方法
c. L−タリトールを原料としてL−アルトロースを製造する方法
d. ガラクチトールを原料としてD−ガラクトースを製造する方法
e. L−アラビトールを原料としてL−アラビノースを製造する方法
f. D−マンニトールを原料としてD−マンノースを製造する方法
g. D−アラビトールを原料としてD−リキソースを製造する方法
h. D−タリトールを原料としてD−タロースを製造する方法
(Arthrobacter)属に属する微生物由来のポリオール酸化酵素に関するものである。
(a)基質のポリオールは、ポリオールの2位と3位のOH基がL−エリスロ型の構造またはL−スレオ型の構造を有する糖アルコールである。
(b)作用は、酸素の存在下、糖アルコールの1位のOH基を酸化し、糖アルコールに対応するアルドースと過酸化水素を生成する。
(c)SDS−PAGEで測定した見掛けの分子量が約45kDaである。
(d)安定pHはpH6.0以上であり、反応至適pHは7.0から10.0である。
(e)作用温度は60℃以下であり、反応至適温度は50℃である。
(f)基質特異性が、キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールの順である。
(g)作用は、酸素の存在下、キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールの1位のOH基を酸化し、それぞれ、D−キシロース、D−グルコース、L−アルトロース、D−ガラクトース、L−アラビノース、D−マンノース、D−リキソース、D−タロースを生成する。
菌株の同定は、16SrRNA遺伝子塩基配列相同性により行い、16SrRNA遺伝子領域を解析し塩基数734を特定した。
この菌株の16SrRNA遺伝子の塩基配列について、BLASTサーチ(日本DNAデータバンク)により既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数734の塩基配列に対し相同性97%以上であった菌株名と相同性(%)の値からM30株の微生物は、アルスロバクター グロビホルミス(Arthrobacter
globiformis)であることが決定された。
本発明のポリオール酸化酵素を有する菌株であるアルスロバクター グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)M30は、2011年6月22日付で千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに、寄託番号 NITE P−1111として寄託し、2012年5月2日にブタペスト条約に基づく国際寄託として、寄託番号 NITE BP−1111として国際寄託した。
一方、本発明のポリオール酸化酵素は、D−アラビトールからはD−リキソースが生産され、また、D−ソルビトールからはD−グルコースが、L−タリトールからはL−アルトロースが、D−タリトールからはD−タロースの生産が可能である。
現在、D−タロースはD−プシコースから異性化酵素を用いて生産されている。そして、D−リキソースはD−グルコースからD−アラビトール、D−キシロースと多段階の反応を経て生産されており、本発明の酵素は希少糖の新たな生産系への利用が期待されるものである。
本酵素は、公知の固定化手段、例えば担体結合法、架橋法、ゲル包括法、マイクロカプセル化法等を利用して固定化酵素として、アルドースの生産や酵素センサーとして用いることができ、例えば、本酵素を共有結合法によって固定化したバイオリアクターを用いれば、連続法で目的とするアルドースの大量生産が可能である。
なお、本明細書で使用する場合、「約」は、プラスマイナス10%を意味する。
(1)タンパク質定量
タンパク質の定量は、Bradford法に基づきナカライテクス株式会社製プロテインアツセイCBB溶液を用いて行った。検量線の作成には標準タンパク質として牛血清アルブミンを用いた。吸光度の測定には日立製分光光度計U−3200を用いた。
(2)ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)
SDS−PAGEは、分離ゲル15%、濃縮ゲル4%になるように調整し、
Laemmliの方法に従って行った。分子量マーカーはSIGMA社製の
Protein Marker Low Rangeを用いた。
(3)ポリオール酸化酵素活性測定方法
ポリオール酸化酵素の活性測定方法であるペルオキシダーゼ法を図4に示した。420nmの吸光度の上昇を測定することにより行った。酵素反応はキシリトールを添加することにより開始させ、日立製分光光度計U−2010を用いて30℃の反応条件下で10分間の時間変化で吸光度を測定した。反応は、反応液が総量1mlとなるように調製した。1unitは、吸光度420nmにおいて1分間に吸光度が1上昇する酵素量と定義した。
この方法は、酸化反応により生じる過酸化水素を比色定量することで活性を測定する。基質との酸化反応により精製された過酸化水素とペルオキシダーゼが反応すると、ABTSの酸化反応が触媒され、酸化型のABTSが生じる。酸化型ABTSは青色に呈色するため、420nmの吸光度を測定することで酸化酵素活性を測定した。
菌体からの酵素の精製は、図2に示した工程によって行った。各工程の説明は以下のとおりである。
(1)菌体の培養
キシリトールを単一炭素源とし、硫安を窒素原として通常の無機塩培養基を用いた。キシリトールを1%含む液体培地10Lに、アルスロバクター グロビホルミス
(Arthrobacter globiformis)M30株の種培養液を無菌的に添加し、ジャーファーメンターにより200rpm30℃で24時間培養した。
(2)粗酵素溶液の調製
遠心分離により培養液から菌体を回収した。回収した菌体は、1mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)を用いて洗浄した。次いで、菌体を10mlの50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(株式会社SONICS&MATERIALS)で細胞破砕した。破砕物を12,000rpmで20分遠心し、その遠心上清を粗酵素溶液とした。
(1)硫安分画
超音波破砕によって得られた酵素は、硫酸アンモニウムを50%飽和濃度になる様に添加して得られた沈殿を除去した。その後、更に70%飽和濃度になる様に硫酸アンモニウムを添加して得られた沈殿を回収し、50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)20mlに懸濁した。
(2)HiPrep PHenyl HPカラムクロマトグラフィー
得られた粗酵素液は、60mlの1.0M(NH4)2SO4含有50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したHiPrep PHenyl HPに供した。酵素は緩衝液中の硫酸アンモニウム濃度を1.0M〜0Mへ直線的濃度勾配をかけることにより溶出し、活性のある画分を回収した。次に得られた活性画分に含まれる硫酸アンモニウムを20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)を用いて4℃、一晩透析によって除した。
次に、透析後の酵素液は、15mlの20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したHiTrap Q HPに供した。酵素は緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0〜1.0Mへ直線的濃度勾配をかけることにより溶出し、活性のある画分を回収して、20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)を等量加えて希釈した。
(4)Resouce Qカラムクロマトグラフィー
次に、希釈活性画分を20mlの20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したResouce Qに供した。酵素は、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0〜1.0Mへ直線的濃度勾配をかけることにより溶出し、活性のある画分を回収した。
(5)Superdex 200 pg increase
得られた活性画分はVIVASPIN TURBO 15(sartorius社製)を用いて約0.2mlに濃縮後、70mlの0.15mM塩化ナトリウムを含む150mMNaCl含有20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したSuperdex 200 pg increaseに供した。酵素は、150mM塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で溶出し、活性のある画分を回収した。回収した酵素液はSDS−PAGEよって純度を検討し、精製酵素とした。
精製段階を通じて、各精製工程後に280nmの吸光度によるタンパク質の定量と酵素活性の測定とSDS−PAGEによる純度の確認を行った。その結果を図3と表2に示す。精製の結果、収率は約2.4%、精製倍率は2000倍以上であった。SDS−PAGEで精製酵素は単一のバンドを示し、見掛けの分子量は約45kDaであった。
ポリオール酸化酵素の諸性質の解析を上述の調製方法で得られた精製酵素を用いて行った。
(1)作用
基質がキシリトールの場合、図1に示すように、酸素の存在下に、キシリトールの1位の酸化を触媒し、過酸化水素とD−キシロースを生成する。
同様に、他の糖アルコールに対しても、酸素の存在下、糖アルコールの1位のOH基を酸化し、糖アルコールに対応するアルドースと過酸化水素を生成する作用を触媒する。
(2)pH安定性
各pHの緩衝液を最終濃度0.1Mとなるよう酵素と混合し、氷上で15時間静置後、残存酵素活性を測定した。各緩衝液として、pH2.0にはグリシン−HCl緩衝液、pH3.0、4.0にはクエン酸緩衝液、pH4.0、5.0、6.0には酢酸緩衝液、pH6.0、7.0、8.0にはリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0、8.0、9.0にはトリス塩酸緩衝液、pH9.0、10.0、11.0にはグリシン−NaOH緩衝液を使用した。活性は、上述のポリオール酸化酵素活性測定方法により、キシリトールを基質として30℃の条件下での反応によって生じる吸光度420nmの上昇を日立製分光光度計U−2010を用いて測定した。
それぞれの酵素反応液で反応を測定したところ、PH8.0が反応最適pHであることがわかった。
10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃で反応を行った。各温度条件下の反応によって生じる吸光度420nmの上昇を日立製分光光度計U−2010を用いて測定した。
結果は図5に相対活性で示す。50℃における酵素活性を100とした場合において、本酵素は60℃以下で安定であり、至適反応温度は50℃であった。また、70℃以上ではほとんど活性がなくなった。
11種類の糖アルコールを用いて本酵素の基質特異性について検討した。酵素反応組成は、各基質0.2M350μl、酵素液350μl(トリス緩衝液pH7.5)で、30℃30分反応後、酵素活性を測定した。
その結果、キシリトールへの活性を100とした相対活性を、図7および表3に示した。基質特異性は、キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールの順であった。キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトールに最も強く作用し、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトールに強く作用し、D−アラビトール、D−タリトールにも作用する基質特異性を有する。
反応生成物をHPLCなどで確認した。その結果、キシリトールからD−キシロースが、D−アラビトールからD−リキソースが、D−ソルビトールからD−グルコースが産生されていた。このことから、本酵素は、2位と3位のOH基がL−エリスロ型の構造またはL−スレオ型の構造を有する糖アルコールに作用し、相当するアルドースを生成することが明らかになった。
基質特異性、基質認識機構ともに従来報告されているポリオール酸化酵素とは異なるものであり、本酵素は新規のポリオール酸化酵素であることがわかった。
酵素測定活性測定法の系に、1mMの各種金属イオン、添加物を加えて酵素活性を測定した。結果は図8に示すように、本酵素は、塩化第二銅、硫酸第二鉄、塩化コバルト、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化亜鉛で強く阻害されることが分かった。
また、反応液にEDTAを添加しても活性の減少が認められなかったこと、および種々の金属イオンの添加により活性の増加が確認できなかったことから、本酵素は金属イオンを要求しないことが明らかになった。
図10に示す方法により、D−アラビトールを基質としてポリオール酸化酵素を30℃で24時間反応させた反応生成物を、HPLCによって解析した。反応前のHPLC解析の結果が図11であり、24時間反応後の結果が図12であり、図12には、アラビノースではなく、リキソースが生成していたことが示されている。リキソースの光学活性は測定していないが、構造的に反応生成物は、D−リキソースであると考えられる。
この反応の構造式を図13に示す。D−アラビトールを基質としてD−リキソースとが生成されることが確認された。これまでに報告されているポリオール酸化酵素ではD−アラビトールの1位の水酸基が酸化され、D−アラビノースが生成されていた。
キシリトールとD−アラビトールの構造を図9に示した。キシリトールは、フィッシャーの構造式で表したとき、2位のOH基が右で3位のOH基が左を向いたL−スレオ型の構造を有し、D−アラビトールは、D−スレオ型とフィッシャーの構造式で表したとき2位のOH基が左で3位のOH基が左を向いたL−エリスロ型の両方の構造を有している。本酵素により、キシリトールからD−キシロースが、D−アラビトールからD−リキソースが生成したことにより、図10に示すように本酵素はL−スレオ型とL−エリスロ型を認識していることが示唆された。
キシリトールとD−アラビトールならびに本酵素と基質特異性の高い他の糖アルコールの構造を比較することにより、本酵素が認識する共通の構造が確認された。
本酵素は、L−エリスロ型またはL−スレオ型のポリオールに作用して、対応するアルドースを生成する新規なポリオールオキシダーゼであることが解明された。
キシリトールからD−キシリトール、D−ソルビトールからD−グルコース、L−タリトールからL−アルトロース、ガラクチトールからD−ガラクトース、D−マンニトールからD−マンノース、D−アラビトールからD−リキソース、D−タリトールからD−タロースを生成することができる実用性の高い有用なポリオールオキシダーゼである。
Claims (8)
- 下記(a)から(g)に記載の性質を有するアルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物由来のポリオール酸化酵素。
(a)基質のポリオールは、ポリオールの2位と3位のOH基がL−エリスロ型の構造またはL−スレオ型の構造を有する糖アルコールである。
(b)作用は、酸素の存在下、糖アルコールの1位のOH基を酸化し、糖アルコールに対応するアルドースと過酸化水素を生成する。
(c)SDS−PAGEで測定した見掛けの分子量が約45kDaである。
(d)安定pHはpH6.0以上であり、反応至適pHは7.0から10.0である。
(e)作用温度は60℃以下であり、反応至適温度は50℃である。
(f)基質特異性が、キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールの順である。
(g)作用は、酸素の存在下、キシリトール、D−ソルビトール、L−タリトール、ガラクチトール、L−アラビトール、D−マンニトール、D−アラビトール、D−タリトールの1位のOH基を酸化し、それぞれ、D−キシロース、D−グルコース、L−アルトロース、D−ガラクトース、L−アラビノース、D−マンノース、D−リキソース、D−タロースを生成する。 - アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)M30(寄託番号 NITE BP−1111)である請求項1に記載のポリオール酸化酵素。
- アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物を、キシリトールを単一炭素源とする無機塩培地で培養後、請求項1または2に記載のポリオール酸化酵素を単離精製することを特徴とする、ポリオール酸化酵素の製造方法。
- アルスロバクター(Arthrobacter)属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミス(Arthrobacter globiformis)M30(寄託番号 NITE BP−1111)である請求項3に記載のポリオール酸化酵素の製造方法。
- L−エリスロ型の構造またはL−スレオ型の構造を有する糖アルコールに、請求項1または2に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、対応するアルドースを生産する方法。
- L−タリトールに、請求項1または2に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、L−アルトロースへと酸化することを特徴とするL−アルトロースの生産方法。
- D−アラビトールに、請求項1または2に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、D−リキソースへと酸化することを特徴とするD−リキソースの生産方法。
- D−タリトールに、請求項1または2に記載のポリオール酸化酵素を作用させて、D−タロースへと酸化することを特徴とするD−タロースの生産方法。
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