CN101189332A - 利用d-阿洛酮糖差向异构酶的d-阿洛酮糖生产方法 - Google Patents

利用d-阿洛酮糖差向异构酶的d-阿洛酮糖生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供利用源自根瘤土壤杆菌的D－阿洛酮糖差向异构酶生产D－阿洛酮糖的方法。本发明提供具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列并具有阿洛酮糖3－差向异构酶活性的蛋白质，编码所述蛋白质的基因，含有所述基因的重组表达载体，以及通过大规模生产的蛋白质与D－果糖的反应生产D－阿洛酮糖的方法。所述生产D－阿洛酮糖的方法是利用新型酶的对环境友好的方法，其中使用了便宜的底物，且所述酶的活性能够长期保持。因此，所述方法能够有效地用于D－阿洛酮糖的大规模生产。

Description

利用D-阿洛酮糖差向异构酶的D-阿洛酮糖生产方法
技术领域
本发明涉及一种利用源自根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的D-阿洛酮糖差向异构酶(下文中称为阿洛酮糖3-差向异构酶)生产D-阿洛酮糖的方法。
技术背景
通常，D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，且在甜味强度和种类方面与D-果糖非常相似。然而，与D-果糖不同，D-阿洛酮糖在体内同化作用过程中很难代谢，且具有较低程度的热量供给。因此，D-阿洛酮糖能用作膳食的有效成分。当广泛用作非糖甜味剂的糖醇在多于规定剂量摄取时会引起副作用，如腹泻，而D-阿洛酮糖没有这样的副作用。而且，D-阿洛酮糖具有几乎为零的卡路里值，这是因为它在人体内几乎不可代谢，并且D-阿洛酮糖具有通过抑制脂肪生成酶的活性而减少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖能够用作甜味剂，该甜味剂还对有助于重量减轻(参见，例如，Matsuo，T.，Y.Baba，M.Hashiguchi，K.Takeshita，K.Izumori andH.Suzuki，″Dietary D-psicose，a C-3 epimer of D-fructose，suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymes in rats，″AsiaPac.J.Clin.Nutr.，10：233-237(2001)；和Matsuo，T.and K.Izumori，″D-psicose，a rare sugar that provides no energy and additionallybeneficial effects for clinical nutrition，″Asia Pac.J.Clin.Nutr.，13：S127(2004))。
就此而论，D-阿洛酮糖作为饮食的甜味剂吸引了大量的兴趣，并且在食品工业中存在着的对开发高效生产D-阿洛酮糖的方法增加的需要。这是因为D-阿洛酮糖仅作为在theriae处理或葡萄糖异构化反应过程中的中间体非常少量地存在于在自然界中，且不能化学合成。
因此，为了解决上述的问题，进行了对利用D-果糖作为底物来酶促生产D-阿洛酮糖的方法的研究。
然而，在迄今为止开发的方法中存在着一个问题，即其生产成本高，这是由于D-阿洛酮糖的低产量所导致的。
附图简述
图1A是显示根据本发明实施方案的阿洛酮糖3-差向异构酶活性对应于反应pH的曲线图；
图1B是显示根据本发明实施方案的阿洛酮糖3-差向异构酶活性对应于反应温度的曲线图；
图2是显示D-阿洛酮糖(■)和D-果糖(□)间平衡比例的曲线图，其中所述D-阿洛酮糖和D-果糖是由根据本发明实施方案的阿洛酮糖3-差向异构酶与D-果糖在温度范围30℃-60℃间反应所获得的；和
图3是根据本发明实施方案的重组表达载体的卵裂图。
发明详述
技术问题
本发明的发明人进行了从差向异构酶中选择这样的酶的尝试，所选择的酶能够利用D-果糖作为底物高产量地生产D-阿洛酮糖，其中所述差向异构酶不通过功能表征，而仅通过碱基序列或氨基酸序列表征，并且本发明的发明人证明了所述被选择的酶的特殊作用。本发明提供一种利用所选择的酶来高产量地生产D-阿洛酮糖的新型方法。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列并具有阿洛酮糖3-差向异构酶活性的蛋白质。
根据本发明的另一个方面，提供了编码所述蛋白质的基因。
根据本发明的另一个方面，提供了含有所述基因的重组表达载体。
根据本发明的另一个方面，提供了通过上述蛋白质与D-果糖的反应生产D-阿洛酮糖的方法。
下文中，将对本发明进行详细描述。
可以理解本文中所使用的技术术语和科学术语指的是本领域中普通的技术人员所常规理解的术语，除非另外指明。
而且，将不对与常规已知技术构造和机制相同的技术构造和机制的描述进行重复。
本发明人研究了源自根瘤土壤杆菌的未表征的塔格糖3-差向异构酶的特性，这是通过以下步骤进行的：克隆源自根瘤土壤杆菌的塔格糖3-差向异构酶基因或对应于塔格糖3-差向异构酶的基因，培养经包含所述基因的表达载体转染的微生物，并过表达塔格糖3-差向异构酶。作为结果，发现塔格糖3-差向异构酶对阿洛酮糖比对塔格糖具有更高的特异性，并且因此，证明了该源自根瘤土壤杆菌的“已知是”塔格糖3-差向异构酶实际上是阿洛酮糖3-差向异构酶。因此，本发明提供一种利用所述阿洛酮糖3-差向异构酶生产D-阿洛酮糖的方法。
更特殊地，在尝试获得对本发明有用的已知塔格糖3-差向异构酶基因中，使用了已知产生塔格糖3-差向异构酶基因的细菌菌株，且所述菌株包括海栖热袍菌(Thermotoga maritime)，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)，Mesorhizobium loti，根瘤土壤杆菌，Rhodopirelluiabaltica，小小梨形菌属菌株(Pirellula sp.)，发光光杆状菌亚种laumondii(Photorhabdus luminescens subsp.laumondii)和Sinorhizobium meliloti。通过本发明首次证明了只有从源自根瘤土壤杆菌ATCC33970的基因所表达的酶(NP_535228；SEQ ID NO：1)具有能够将D-果糖转化为D-阿洛酮糖的活性。
为了确定塔格糖3-差向异构酶的特性，在本发明中，通过聚合酶链反应(PCR)从含有塔格糖3-差向异构酶基因的细菌菌株中大量获得塔格糖3-差向异构酶基因，所述塔格糖3-差向异构酶基因是仅根据DNA碱基序列，而不根据其酶功能方面的表征结果所设计的。然后，将所获得的塔格糖3-差向异构酶基因插入到适合的表达载体中，从而产生含有塔格糖3-差向异构酶基因的重组载体，并且将所述重组载体转化到适合的微生物中。将该转化的微生物培养在发酵培养基中，并在该微生物中过表达所述塔格糖3-差向异构酶基因的蛋白质产物。然后分离和纯化所述塔格糖3-差向异构酶基因的蛋白质产物，以备用。
本发明的生产D-阿洛酮糖的方法包括使阿洛酮糖3-差向异构酶(通过已知为塔格糖3-差向异构酶)与作为底物的果糖反应。
由本发明的方法所产生的阿洛酮糖3-差向异构酶可具有这样的氨基酸序列，该序列不仅限于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，而且包括由SEQ IDNO：1的氨基酸序列中一些氨基酸残基的替换、插入或缺失所形成的氨基酸序列，只要这些修饰的氨基酸能够将D-果糖转化为D-阿洛酮糖。
在本发明的方法中，能用于产生重组表达载体的表达载体可以是任何常规用于遗传重组技术的表达载体，并且可以是，例如，pET-24a(+)。能够通过重组表达载体转化的微生物可以是大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。然而，所述微生物是不受限制的，只要它是任何这样的细菌菌株，即该细菌菌株能够在经过包含所需要基因的重组表达载体转化后过表达该基因，并且作为过表达的结果能够产生活性蛋白质。
更详细地，以下培养转化的微生物和诱导本发明的蛋白质过表达的过程可以根据本发明的示范的实施方案如以下描述进行。将低温保存的大肠杆菌BL21(DE3)的接种体接种到装有50mlLB培养基的250ml的烧瓶中，并将该菌株在维持在37℃的摇动培养箱中培养，直到600nm处的吸光度达到2.0。将该培养溶液加入到装有5L发酵培养基的7L的发酵器(BiotronCo.，Ltd.，Korea)中，所述发酵培养基由10g/L甘油，1g/L蛋白胨，30g/L酵母提取物，0.14g/L二磷酸钾和1g/L单磷酸钠组成，并将该混合物培养在所述发酵器中，直到600nm处的吸光度达到2.0。然后，加入1mM的ITPG，以诱导本发明的蛋白质的过表达。在操作过程中，可维持搅拌速率为500rpm，通风率为1.0vvm，及培养温度为37℃，而且上述培养条件有利于大规模生产阿洛酮糖3-差向异构酶。
为了纯化由过表达所产生的蛋白质，将所述转化的细菌菌株的培养溶液在6,000×g，4℃离心30分钟，然后用0.85％的NaCl洗涤两次。随后，将该细胞加入到含有1mg/ml溶菌酶的细胞溶解缓冲溶液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0)中，并将含有所述细胞的细胞溶解缓冲溶液置于冰浴中30分钟。利用法国压力机(French press)在15,000lb/in2的压力下破坏该细胞溶解缓冲溶液中的细胞，将破坏的细胞在13,000×g，4℃离心20分钟，并将其除去，而使上清液通过孔径0.45μm的滤纸进行过滤，并通过低温条件下的快速蛋白质色谱法对其进行纯化。将含有本发明的蛋白质的滤出液应用于HisTrap HP柱，所述HisTrap HP柱是经过pH8.0的50mM磷酸盐缓冲溶液平衡的，其中所述磷酸盐缓冲溶液含有300mM氯化钠(NaCl)和10mM咪唑。随后，用相同的磷酸盐缓冲溶液洗涤该HisTrap HP柱，并且再用含有浓度梯度为从10mM到200mM的咪唑的相同磷酸盐缓冲溶液洗脱附着于该柱的蛋白质，其流速为1ml/min。将含有本发明蛋白质的洗脱级分加入到HiPrep 16/60去矿质化树脂柱中，所述HiPrep 16/60去矿质化树脂柱是经过pH7.5的50mM的PIPES缓冲溶液平衡的，并且再以6ml/min的速率洗脱该蛋白质。将由此所收集的蛋白质溶液应用到Sephacryl S-100 HR柱中以洗脱该蛋白质，所述Sephacryl S-100 HR柱是经过pH7.5的含有0.15M氯化钠的50mM的PIPES缓冲溶液平衡的，其流速为6.6ml/分钟。最后将洗脱的蛋白质在50mM的PIPES缓冲溶液中进行渗析。
如上述所获得的本发明的蛋白质是阿洛酮糖3-差向异构酶，所述阿洛酮糖3-差向异构酶是具有分子量32,600Da的单体。该阿洛酮糖3-差向异构酶是金属酶，其活性由金属离子调节。
根据本发明的另一个实施方案，阿洛酮糖3-差向异构酶和D-果糖间的反应可在金属离子的存在下进行，从而实现提高D-阿洛酮糖生产产量的目的，所述金属离子选自由下列各项组成的组：锰、镁、铁、钴和铝，其浓度范围为0.5-5mM，例如，1mM。当所述金属离子的浓度低于0.5mM时，提高生产产量的作用的微不足道的，而当所述金属离子的浓度高于5mM时，该提高相对于其超出的量效率更低。
阿洛酮糖3-差向异构酶和D-果糖间的反应可利用浓度为55-75％(w/w)，pH7-8和温度为55-65℃的底物(即，D-果糖)进行。当该底物，即D-果糖的浓度在55-75％(w/w)的范围内时，D-阿洛酮糖的生产产量很好，且上述范围的pH和温度条件是对阿洛酮糖3-差向异构酶活性最佳的pH和温度范围。
根据本发明另一个实施方案，阿洛酮糖3-差向异构酶和D-果糖间用于产生D-阿洛酮糖的反应可通过在反应过程中将阿洛酮糖3-差向异构酶固定在载体上进行，这是因为固定在载体上的阿洛酮糖3-差向异构酶能够长期地保持酶活性。用于本发明目前的实施方案中的载体可以是任意已知其在酶固定中用途的载体，并且可以是例如，海藻酸钠。海藻酸钠是天然胶体多糖，它在藻类细胞壁中很丰富，且含有β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸残基，所述β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸残基通过β-1，4键合随机地连接。因此，海藻酸钠容许阿洛酮糖3-差向异构酶稳定的固定，且有利于获得高D-阿洛酮糖产量。为了获得D-阿洛酮糖的最大产量，海藻酸钠可用于进行阿洛酮糖3-差向异构酶的固定，其浓度为1.5-4重量％，例如浓度为2.5重量％。当海藻酸钠用作固定阿洛酮糖3-差向异构酶的载体时，将所述阿洛酮糖3-差向异构酶的溶液加入到海藻酸钠水性溶液中，所述海藻酸钠水性溶液的体积是阿洛酮糖3-差向异构酶溶液体积的一倍或两倍，然后利用注射器泵和真空泵将该混合物逐滴地加入到0.2M钙离子溶液中，从而形成阿洛酮糖3-差向异构酶-海藻酸钠复合体珠。这些阿洛酮糖3-差向异构酶-海藻酸钠复合体珠可直接用于与D-果糖的反应中。
根据本发明实施方案的生产D-阿洛酮糖的方法是对环境友好的，这是因为使用了源自微生物的酶，并且该方法要求简单的酶固定过程，以及显著地增加了D-阿洛酮糖的生产产量，因此是降低了生产成本，而最大化了生产的效果。
由此生产的D-阿洛酮糖能够有效地用作饮食或药物的添加剂。
有利作用
如上所述，根据本发明实施方案的生产D-阿洛酮糖的方法是对环境友好的，这是因为使用了源自微生物的酶，并且该方法要求简单的酶固定的过程，使用比常规方法中所使用的更便宜的底物，以及显著地增加了D-阿洛酮糖的生产产量，因此是降低了生产成本，而最大化了生产的效果。
由此生产的D-阿洛酮糖能够有效地用作饮食或药物的添加剂。
最佳模式
下文中，将参考具体实施例对本发明进行更详细地描述。这些实施例仅仅是为了例证的目的，而不意欲限制本发明的范围。
试验实施例
在目前的试验实施例中，使用MALDI-TOF-MS测量阿洛酮糖3-差向异构酶的分子量，并使用肉桂酸作为基质。利用D-果糖作为底物测量了其酶活性。为了测量其酶活性，容许阿洛酮糖3-差向异构酶与D-果糖在含有1.0％D-果糖的50mM PIPES缓冲溶液中，在pH7.5和50℃反应20分钟，再在100℃加热该反应溶液5分钟，以终止该反应。所述含有D-果糖的PIPES缓冲溶液是通过将D-果糖溶解于pH7-8的PIPES缓冲溶液中，以达到60-70重量％浓度配制而成的，并且将该含有D-果糖的PIPES缓冲溶液持续地加入到维持在40-60℃的生物反应器中。为了实现方便比较其酶活性的目的，将一单位的阿洛酮糖3-差向异构酶定义为在pH7.5和50℃时每分钟生产1摩尔D-阿洛酮糖所需要的阿洛酮糖3-差向异构酶的量。D-果糖、D-阿洛酮糖、D-山梨糖、D-塔格糖、D-木酮糖和D-核酮糖的浓度是利用高效液相色谱法(HPLC)系统测量的，该高效液相色谱法(HPLC)系统具有BP-100钙离子碳氢化合物柱和RI探测器。对该柱进行了调节，从而容许了80℃的速率为0.5ml/min的蒸馏水流。
实施例：阿洛酮糖3-差向异构酶的物理性质
实施例1：阿洛酮糖3-差向异构酶的大规模生产
阿洛酮糖3-差向异构酶基因是通过利用聚合酶链反应(PCR)扩增根瘤土壤杆菌ATCC33970的DNA大量获得的，该PCR使用了基于基因的DNA碱基序列而设计的引物，该基因被认为是根瘤土壤杆菌C58的塔格糖3-差向异构酶基因，但尚未对其进行功能性表征。通过利用限制性内切酶XhoI和NdeI，将获得的阿洛酮糖3-差向异构酶基因插入到表达载体pET-24a(+)(Novagen，Inc.)中，从而产生重组表达载体pET-24a(+)/阿洛酮糖3-差向异构酶(见图3)。通过常规转化方法，将该重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。在为了大规模生产而进行培养前，将转化的菌株大肠杆菌BL21(DE3)低温储存在液氮中。
此后，将该低温储存的大肠杆菌BL21(DE3)菌株的接种体接种在装有50ml LB培养基的250ml烧瓶中，并在37℃的摇动培养箱中进行预培养，直到该预培养溶液在600nm处的吸光度达到2.0。将该预培养溶液加入到装有5L发酵培养基(10g/L甘油，1g/L蛋白胨，30g/L酵母提取物，0.14g/L磷酸二钾和1g/L磷酸单钠)的7L的发酵器(Biotron Co.，Ltd.，KR)中，并使其进行主培养(main culture)。当主培养溶液在600nm处的光吸收度达到2.0时，加入1mM的ITPG到该主培养溶液中，以诱导大规模生产阿洛酮糖3-差向异构酶。在培养过程中，维持搅拌速率为500rpm，通风率为1.0vvm(体积/体积/分钟)，及培养温度为37℃。
实施例2：阿洛酮糖3-差向异构酶的纯化
为了对阿洛酮糖3-差向异构酶进行表征，利用亲合色谱法(HisTrap HP柱)，去矿质化(HiPrep 16/60柱)和凝胶过滤(Sephacryl S-100 HR柱)纯化阿洛酮糖3-差向异构酶。
测量了该纯化的阿洛酮糖3-差向异构酶的分子量，并发现该阿洛酮糖3-差向异构酶是具有分子量32,600 Da的单体。证实了该阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列与NCBI登记号NP_535228的氨基酸序列相同。
实施例3：阿洛酮糖3-差向异构酶的金属特异性
为了研究添加金属离子的作用，测量了该阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活性，该测量是在用EDTA处理该阿洛酮糖3-差向异构酶后或向阿洛酮糖3-差向异构酶加入1mM下表1中所示的各种金属离子后进行的。该阿洛酮糖3-差向异构酶反应在50mM的PIPES缓冲溶液中，pH7.5和50℃进行20分钟，其中所述PIPES缓冲溶液含有0.04单位/ml的该阿洛酮糖3-差向异构酶和1.0重量％的D-果糖，再将该反应溶液在100℃加热5分钟，以终止该反应。然后，测量了该阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活性。
作为结果，发现阿洛酮糖3-差向异构酶具有金属酶，这是因为如下表1所示，锰和钴离子增强其酶活性，而铜和锌离子抑制其酶活性。
表1
    金属离子     相对活性(％)
    无Al3+Ba2+Ca2+Co2+Cu2+Fe3+Fe2+Mg2+Mn2+Mo2+Zn2+EDTA     10010095.664.42682.212113910027493.34.420.0
实施例4：阿洛酮糖3-差向异构酶的底物特异性
该阿洛酮糖3-差向异构酶反应在50mM的PIPES缓冲溶液中，pH7.5和50℃进行20分钟，其中所述PIPES缓冲溶液含有0.04单位/ml的该阿洛酮糖3-差向异构酶和10mM下表2中所示的各种单独的单糖，再将每个反应溶液在100℃加热5分钟，以终止该反应。然后，测量了每种反应溶液中该阿洛酮糖3-差向异构酶的酶活性。
作为结果，发现该阿洛酮糖3-差向异构酶具有比对D-塔格糖更高的对D-阿洛酮糖的亲合性。因此，新近公认了阿洛酮糖3-差向异构酶，而非塔格糖3-差向异构酶，是能够进行阿洛酮糖差向异构作用的酶。
表2
单糖     相对活性(％)
    无金属离子加入     加入Mn2+
D-阿洛酮糖D-塔格糖D-核酮糖D-果糖D-山梨糖D-木酮糖D-果糖-6-磷酸盐D-核酮糖-5-磷酸盐     10065.510.237.90.85.80.00.0     27492.315.41391.712.40.00.0
实施例5：根据pH和温度的变化的阿洛酮糖3-差向异构酶活性
在实施例5中，该阿洛酮糖3-差向异构酶在不同的pH和温度下与D-果糖反应，且比较了在不同pH值和温度下获得的酶活性。为了研究pH的作用，该阿洛酮糖3-差向异构酶的反应在50mM的PIPES缓冲溶液中，pH值范围6.5-7.5中进行，其中所述PIPES缓冲溶液含有0.04单位/ml的该阿洛酮糖3-差向异构酶和1.0％的D-果糖，且相同的反应在50mM的EPPS缓冲溶液中，pH值范围7.5-8.5中进行，其中所述EPPS缓冲溶液含有0.04单位/ml的该阿洛酮糖3-差向异构酶和1.0％的D-果糖。在此，各自的反应在当无金属离子加入时在50℃进行，在当加入锰离子时，在60℃进行，并分别进行了20分钟。然后，通过在100℃加热5分钟来终止该反应，并测量了其酶活性。其结果在图1A中所说明。
为了研究温度的作用，该反应在50mM的PIPES缓冲溶液中，温度范围30℃-70℃中进行了20分钟，其中所述PIPES缓冲溶液含有0.04单位/ml的该阿洛酮糖3-差向异构酶和1.0％的D-果糖，且当无金属离子加入时在pH7.5进行该反应，在当加入锰离子时，在pH7.0进行该反应。通过在100℃加热5分钟来终止该反应，并测量了其酶活性。其结果在图1B中所说明。
作为结果，发现当无金属离子加入时，该阿洛酮糖3-差向异构酶的最佳pH和温度分别为7.5和50℃。在当加入Mn2+离子时，该阿洛酮糖3-差向异构酶的最佳pH和温度分别为7.0和60℃。
图1A是显示根据本发明实施方案相对于反应pH的阿洛酮糖3-差向异构酶活性的曲线图。参考图1A，○指由不含金属离子的PIPES缓冲溶液中所获的结果；●指由含有Mn2+离子的PIPES缓冲溶液中所获的结果；□指由不含金属离子的EPPS缓冲溶液中所获的结果；和■指由含有Mn2+离子的EPPS缓冲溶液中所获的结果。
图1B是显示根据本发明实施方案相对于反应温度的阿洛酮糖3-差向异构酶活性的曲线图。参考图1B，○指由缺乏金属离子所获的结果；●指由存在1mM的Mn2+离子所获的结果。
实施例6：利用阿洛酮糖3-差向异构酶所获得的D-阿洛酮糖和D-果糖间的平衡
在实施例6中，该阿洛酮糖3-差向异构酶的反应在50mM的PIPES缓冲溶液中，pH7.0和温度范围30℃-60℃中进行24小时，从而容许该反应充分地进行，其中所述PIPES缓冲溶液含有每毫升0.04单位的该阿洛酮糖3-差向异构酶，1mM的Mn2+离子，和合起来0.1％的D-阿洛酮糖和D-果糖，这是为了确定D-阿洛酮糖和D-果糖间的平衡而进行的。然后，通过在100℃加热5分钟来终止该反应，并测量了其酶活性。
图2是显示D-阿洛酮糖(■)和D-果糖(□)的平衡比例的曲线图，其是在根据本发明实施方案的阿洛酮糖3-差向异构酶与D-果糖在温度范围30℃-60℃中反应后获得的。
作为结果，该反应起始于5种D-阿洛酮糖对D-果糖的初始比例：0∶100，25∶75，50∶50，75∶25和100∶0，反应24小时后确定D-阿洛酮糖对D-果糖的最终比例，如图2中所示。参考图2，D-阿洛酮糖对D-果糖的比例在30℃时为32∶68，而该比例在60℃时为37∶63。这些结果大约20％地优于由生产D-阿洛酮糖的常规方法所获得的产量。
实施例7：利用阿洛酮糖3-差向异构酶生产D-阿洛酮糖
为了生产高浓度的D-阿洛酮糖，该反应在50mM的PIPES缓冲溶液中，pH7.0和60℃进行了不同的反应时间，其中所述PIPES缓冲溶液含有每毫升14单位的该阿洛酮糖3-差向异构酶，1mM的Mn2+离子，和700g/L的D-果糖。然后，通过在100℃加热5分钟终止该反应，并测量了其酶活性。根据反应时间的D-阿洛酮糖生产率显示在下表3中。
表3
    反应时间(分钟)0     D-阿洛酮糖(g/L)0
    10     93
    30     155
    60     180
    120     211
    180240     210210
    300     209
作为结果，当利用120分钟的反应时间时，产生了211g/L的D-阿洛酮糖，且这个生产率相当于D-阿洛酮糖转化产量为30.2％。
实施例8：通过酶固定生产D-阿洛酮糖
为了研究该生产D-阿洛酮糖方法的效率，对阿洛酮糖3-差向异构酶进行了固定。测量了固定的阿洛酮糖3-差向异构酶的生产产量，将其与未固定的(自由的)阿洛酮糖3-差向异构酶的生产产量进行比较。
对于固定在载体上的阿洛酮糖3-差向异构酶，使用了阿洛酮糖3-差向异构酶-海藻酸钠复合体珠，该珠是通过如下方法制备的：将阿洛酮糖3-差向异构酶溶液加入到2.5％的海藻酸钠溶液中，所述海藻酸钠溶液的体积是所述阿洛酮糖3-差向异构酶溶液体积的1.5倍，再利用注射器泵和真空泵将该混合物加入到0.2M钙离子溶液中。
除了使用了固定的阿洛酮糖3-差向异构酶之外，该反应以与实施例7中相同的方式进行。该反应中所用的阿洛酮糖3-差向异构酶的量为140单位/10ml，并测量了D-阿洛酮糖生产率。其结果显示在下表4中。
表4
    反应时间(分钟)0     D-阿洛酮糖(g/L)0
    3060120     103172198
    180     220
    240300     235242
    360     245
实施例7的自由的阿洛酮糖3-差向异构酶在使用反应时间120分钟时引起最大转化率211g/L。然而，在本实施例的固定的阿洛酮糖3-差向异构酶的情形中，生产速度低于自由的阿洛酮糖3-差向异构酶，但是固定的阿洛酮糖3-差向异构酶的热稳定性较高，且D-阿洛酮糖的浓度随时间而增高。这样，D-阿洛酮糖的生产率在反应时间360分钟后为245g/L，且这个生产率相当于转化产量为35％。
实施例9：D-阿洛酮糖在生物反应器中的生产产量
以下反应在生物反应器中进行，从而检验实施例8的固定的阿洛酮糖3-差向异构酶的生产产量。
首先，该固定的阿洛酮糖3-差向异构酶和D-果糖以与实施例8中相同的方式制备，将D-果糖加入到该固定的阿洛酮糖3-差向异构酶中，并将该混合物调节为体积100ml。随后，将高100cm和直径26cm的生物反应器(Pharmacia Biotechnologies，Inc.，XK26，UK)中充满所述固定的阿洛酮糖3-差向异构酶和D-果糖的混合物，且该反应在流速10ml/h和60℃进行。所用的阿洛酮糖3-差向异构酶的量为500单位，且所用的D-果糖的浓度限制为600g/L，这归因于长时间操作过程中过量D-果糖的沉淀问题。其结果显示在下表5中。
表5
  经过的时间(天)     0.5     1     1.5     2     3     5     10     15     20     25     30
  D-阿洛酮糖生产率(g/L)     55     180     210     211     210     209     212     211     211     211     212
作为结果，阿洛酮糖3-差向异构酶和D-果糖间的反应在30天的整个试验周期中是稳定的，且其生产速率为21g/L/h，从D-果糖向D-阿洛酮糖的转化率为35％，而其生产率为210g/L。其产量在糖类大规模生产中是优秀的产量值。
因此，本发明能够提供利用生物反应器的D-阿洛酮糖生产系统，所述生物反应器能够进行工业规模的大规模生产。

Claims (9)

1.一种蛋白质，其具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并具有阿洛酮糖3-差向异构酶活性。
2.一种基因，其编码具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列且具有阿洛酮糖3-差向异构酶活性的蛋白质。
3.一种重组表达载体，其包含权利要求2的基因。
4.一种生产D-阿洛酮糖的方法，所述方法是通过将权利要求1的蛋白质与D-果糖反应进行的。
5.权利要求4的方法，其中所述蛋白质是通过如下方法获得的蛋白质产物：培养经权利要求3的重组表达载体转化的微生物，并从所述微生物的培养溶液中分离所述蛋白质。
6.权利要求4的方法，其中所述反应是在金属离子存在下进行的，所述金属离子选自由下列各项组成的组：锰、镁、铁、钴和铝。
7.权利要求4的方法，其中用于所述反应的D-果糖的浓度为55-75％(w/w)。
8.权利要求4的方法，其中所述反应是在pH为7-8及温度为55-65℃条件下进行的。
9.权利要求4的方法，其中所述蛋白质当被固定在载体上时，与D-果糖反应。
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