CN105916389B - 包含来源于嗜热菌的糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含来源于嗜热菌的糖‑差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物及利用其组合物的非磷酸己糖差向异构体的制备方法。本发明的来源于嗜热菌糖‑差向异构酶可有效地诱导非磷酸己糖的差向异构反应，可容易地获取非磷酸己糖的差向异构形态、尤其为稀少的己糖，因此可有效地利用于制药及食品产业中。
Description
技术领域
本发明涉及包含来源于嗜热菌的糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物及利用其组合物的非磷酸己糖差向异构体的制备方法。
背景技术
甜味料可定义为可产生甜味的调味料及食品添加剂，通常，甜味料包括除了碳水化合物中的膳食纤维之外的糖类及具有高甜度的食品添加剂。作为最具有代表性的甜味料可选为食糖，过去的十几个世纪以来，人类已经习惯于食糖的甜味。食糖为葡萄糖与果糖通过α-1、2相结合的二糖，在食品加工中发挥着如下大作用：不仅以低费用对食品赋予理想的甜味，还为食品增进风味和色泽，并且提高储存性能等。
然而，近来急增的肥胖症和糖尿病的主要原因被视为随着生活水平的提高过多摄取含有大量食糖的高热量食品。由此“低热量食品原材料”或“保健功能性”等作为食品产业的新的产品开发的关键词(keywords)来出现。尤其对于减少热量的努力，与具有高甜度、低(无)热量及功能性的替代用甜味料的开发一同，扩大适用至全球性食品原材料化及商品化的动向连接。
作为天然原原材料的甜味料，用于替代食糖、葡萄糖及果糖来适用于加工食品制备中的甜味原材料可分为如下：(i)相对糖度明显高，可致力于降低热量的高甜度原材料(例如，甜菊糖、阿斯巴甜等)；(ii)抗消化性的无热量甜味原材料(例如，三氯蔗糖等)；以及(iii)通过调节生活方式病的危险因素(risk factors)来满足健康指向性的消费者需求而被开发的区分为功能性甜味原材料(例如，如木糖醇等糖醇类、低聚糖类等)等。有关过多摄取食糖可引发肥胖症、糖尿病等的生活方式病的报告更加增大了对这些替代甜味原材料的兴趣，从而相关的市场正在扩大及成长。并且，消费者对于以预防生活方式病为目的的优质生活食品、健康食品的强烈的需求，与试图在食糖添加比率高的食品类中，适用替代用甜味料的动向相连接。由此，在韩国国内也发表有如下在糕点、面包、年糕、饮料的制作工序中适用食糖替代用甜味料的的多个研究：添加有木糖醇的松饼和吐司、添加有功能性糖醇及低聚糖的果冻、添加有木糖醇和赤藓糖醇的柚子茶、用于糖尿病患者的添加有替代用甜味料的蛋糕、添加有海藻糖的年糕及适用高甜度低热量的替代用甜味料的饮料等。
在加工食品中，食糖不仅具有提供甜味的甜味料的作用，还作为具有向最终产品中提供优选的物性的理化学性特性的功能性原材料的作用，而适用于多种食品。即，食糖除了甜味之外，(i)因来源于于羟基(hydroxyl)的优秀的吸湿性而可对产品施加保湿效果；(ii)作为抗淀粉糊化及抗老化剂，在加工中根据使用量和使用时间点，可调节含淀粉食品的物性；以及(iii)因与含有氨基成分之间的美拉德(Maillard)反应及由热处理引起的焦糖化(Caramelization)反应，产生色素及香味成分，来可对产品赋予物性及官能性特性。因此，在加工食品中适用替代用甜味料，不是考虑相对糖度的单纯的量上的替代，而是需要对于在最终产品中的理化学变化及消费者所感受到的官能性特性的检验。
对此，本发明人在用于将作为可取代食糖、葡萄糖及果糖等的以往甜味料的功能性取代用天然甜味料而备受瞩目的非磷酸己糖的生产最大化的研究开发中，确认了来源于嗜热菌糖-差向异构酶对非磷酸己糖的差向异构化非常有效，并且达到了完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明提供包含来源于嗜热菌的糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物。
并且，本发明的另一实施方式提供利用上述组合物的非磷酸己糖差向异构体的制备方法。
解决问题的方案
本发明的一实施方式提供包含来源于嗜热菌的糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物。
上述嗜热菌可以为热袍菌目(Thermotogales目)。
并且，上述糖-差向异构酶可以为选自由醛糖-1-差向异构酶、D-塔格糖3-差向异构酶、L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶、核酮糖磷酸3-差向异构酶、核苷酸糖差向异构酶、尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及D-塔格糖酮酸差向异构酶组成的组中的一种以上的差向异构酶。
上述非磷酸己糖可以为己醛醣或已酮醣。
上述己醛醣可以为阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、塔罗糖(talose)及半乳糖(galactose)组成的组中的一种以上的己醛醣。
上述已酮醣可以为选自由果糖(fructose)、阿洛酮糖(psicose)、山梨糖(sorbose)及塔格糖(tagatose)组成的组中的一种以上的已酮醣。
上述差向异构化可以为非磷酸己糖的C-2、C-3或C-4的差向异构化。
在上述糖-差向异构酶为来源于热袍菌目的葡萄糖-4-差向异构酶或D-塔格糖酮酸差向异构酶的情况下，上述非磷酸己糖的差向异构体可以为塔格糖或果糖。
并且，本发明一实施方式提供包括利用上述非磷酸己糖的差向异构化用组合物对上述非磷酸己糖进行处理的步骤的非磷酸己糖差向异构体的制备方法。
上述非磷酸己糖可以为己醛醣或已酮醣。
上述己醛醣可以为选自由阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、塔罗糖(talose)及半乳糖(galactose)组成的组中的一种以上的己醛醣。
上述已酮醣可以为选自由果糖(fructose)、阿洛酮糖(psicose)、山梨糖(sorbose)及塔格糖(tagatose)组成的组中的一种以上的已酮醣。
发明的效果
本发明的来源于嗜热菌的糖-差向异构酶可有效地诱导非磷酸己糖的差向异构反应，可容易地获取非磷酸己糖的差向异构形态，尤其为稀少的己糖，因此可有效地利用于制药及食品产业中。
附图说明
图1为表示来源于海栖热袍菌(T.maritima)和C.yonseiensis的糖-差向异构酶的基因信息的图。
图2为以示意图的方式表示用于确认上述酶的非磷酸己糖的差向异构化可能性的实验的图。
图3为确认来源于海栖热袍菌的基因中，具有非磷酸己糖的差向异构化可能性的4个上述基因(TM 0282、1034、0416及0509)和具有来源于C.yonseiensis(Caldanaerobacteryonseiensis)的非磷酸己糖差向异构化可能性的1个上述基因(CYTE)的聚合酶链式反应(PCR)扩增产物的图。
图4为通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来确认上述5个基因的表达和其中3个所表达的酶(TM 0416、TM 0509及CYTE)的纯化的图。
图5为通过生物液相色谱仪(BioLC)，对经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的葡萄糖和半乳糖反应生成物进行分析的图。
图6为通过生物液相色谱仪，对经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的果糖和塔格糖的反应生成物进行分析的图。
图7为对根据与经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的果糖的反应时间的塔格糖的制备收率进行分析的图。
图8为通过生物液相色谱仪，对经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶的果糖和塔格糖反应生成物进行分析的图。
图9为对根据与经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶的果糖的反应时间的塔格糖的制备收率进行分析的图。
图10为非磷酸己糖的借助上述来源于嗜热菌的糖-差向异构酶可进行差向异构化的图。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更加详细地说明。然而，这些实施例仅用于示例性地说明本发明，因此本发明的范围不局限于这些实施例。
实施例1：用于非磷酸己糖的差向异构化的酶的筛选
为了开发非磷酸己糖，尤其为了开发可制备稀少的己糖的酶，对来源于作为嗜热菌的海栖热袍菌和C.yonseiensis的糖-差向异构酶进行了检讨。
上述海栖热袍菌为直接地对DSMZ 3109型菌株进行菌株分配，并且利用专性厌氧培养方法而获取，C.yonseiensis为从印度尼西亚的火山地区的热水通过专性厌氧培养方法在实验室直接地进行分离纯化而获取。
具体地，海栖热袍菌和C.yonseiensis的糖-差向异构酶为醛糖-1-差向异构酶、D-塔格糖3-差向异构酶、L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶、核酮糖磷酸3-差向异构酶、核苷酸糖差向异构酶、尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及D-塔格糖酮酸差向异构酶，上述酶的一部分基因信息如图1所示。
基于上述7种酶的基因信息，确认了非磷酸己糖差向异构化的可能性。图2为以示意图的方式示出的用于确认上述酶的非磷酸己糖的差向异构化的可能性的实验的图。
实施例2：来源于海栖热袍菌和C.yonseiensis的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构
酶及D-塔格糖酮酸差向异构酶的克隆
通过分析用于对海栖热袍菌MSB8的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶进行编码的基因的碱基序列，来制备作为引物的血栓调节蛋白(TM)-尿苷二磷酸-葡萄糖4-表(NdeI)F：5'-CATATGAACATTCTGGTAACAGGCG-3'及作为引物的血栓调节蛋白-尿苷二磷酸-葡萄糖4-表(XhoI)R：5'-CTCGAGTCACTCAAGGGTTTTTCTG-3'，利用上述引物，从海栖热袍菌MSB8的整个基因(基因组脱氧核糖核酸，genomic DNA)进行了聚合酶链式反应。
通过分析用于对海栖热袍菌MSB8的醛糖1-差向异构酶进行编码的基因的碱基序列，来制备作为引物的血栓调节蛋白-醛糖1-表(NdeⅠ)F：5'-CATATGGAATATCTGATGAGCCACA-3'及作为引物的血栓调节蛋白-醛糖1-表(BamHI)R：5'-GGATCCTCAAACTTCAACAGAAAATC-3'，利用上述引物，从海栖热袍菌MSB8的基因组脱氧核糖核酸(DNA)进行了聚合酶链式反应。
通过分析用于对海栖热袍菌MSB8的尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶进行编码的基因的碱基序列，来制备作为引物的血栓调节蛋白-尿苷二磷酸-葡糖胺2-表(NdeⅠ)F：5'-CATATGGTGATCAGAGTTCTCAGCG-3'及作为引物的血栓调节蛋白-尿苷二磷酸-葡糖胺2-表(XhoⅠ)R：5'-CTCGAGTCAGCAGAACTCCTCTG-3'，利用上述引物，从海栖热袍菌MSB8的基因组脱氧核糖核酸进行了聚合酶链式反应。
通过分析用于对海栖热袍菌MSB8的D-塔格糖3-差向异构酶进行编码的基因的碱基序列，来制备作为引物的血栓调节蛋白-D-塔格糖3-表(NdeⅠ)F：5'-CATATGttgaagctatctctggtgatc-3'及作为引物的血栓调节蛋白-D-塔格糖3-表(BamHⅠ)R：5'-GGATCCtcatgtaagtttaataatcagttc-3'，利用上述引物，从海栖热袍菌MSB8的基因组脱氧核糖核酸进行了聚合酶链式反应。
通过分析用于对C.yonseiensisKB-1的D-塔格糖酮酸差向异构酶进行编码的基因的碱基序列，来制备作为引物的CY-D-tagaturo表(NdeⅠ)F：5'-CATATGAttaacaaagtagctgagtatctttc-3'及作为引物的CY-D-tagaturo表(BamHⅠ)R：5'-GGATCCTTATTTACTGAATATCTCTTTAAAGTG-3'，利用上述引物，从C.yonseiensisKB-1的基因组脱氧核糖核酸进行了聚合酶链式反应。
所利用的聚合酶链式反应的反应液为如下：100ng的模板(获取的海栖热袍菌MSB8及C.yonseiensisKB-1基因组脱氧核糖核酸)、0.5μL(2.5units/μL)的日本宝(TaKaRa)公司生产的聚合酶(Prime Star系列)、10μL的5X Prime star缓冲液、4μL的dNTP混合物(2.5mM)及各个最终浓度为0.2μM的前(Forward)引物及后(Reverse)引物，加入灭菌蒸馏水使最终体积为50μL，进行聚合酶链式反应使上述基因扩增。聚合酶链式反应进行了30次以如下方式构成的循环：在95℃进行1分钟的变性，在58℃进行30秒的退火及在72℃进行1分钟的延伸。如图3所示，对聚合酶链式反应产物进行了确认。
如图3所示，扩增的产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳来确认。Lane1(A1E)为海栖热袍菌醛糖1-差向异构酶(TM0282，1071bp)、lane2(G2E)为海栖热袍菌尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶(TM1034，1137bp)、lane3(T3E)为栖热袍菌D-塔格糖3-差向异构酶(TM0416，813bp)、lane4(G4E)海栖热袍菌尿苷磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶(TM0509，930bp)及lane5(CYTE)为C.yonseiensisD-塔格糖酮酸差向异构酶(CYTE，1452bp)的编码化的基因的聚合酶链式反应的扩增产物。
将上述聚合酶链式反应产物插入于pTOP Blunt V2载体(Enzynomics Co.，韩国)，来制备了载体pTOPV2-A1E、G2E、T3E、G4E及CYTE，上述载体pTOPV2-A1E、G2E、T3E、G4E及CYTE包含对海栖热袍菌MSB8的醛糖1-差向异构酶、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶、D-塔格糖3-差向异构酶、尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及C.yonseiensisKB-1的D-塔格糖酮酸差向异构酶进行编码化的基因。
并且，将上述重组的载体与为了转化而准备的合适的(competent)100μl的大肠菌DH5α相混合之后，在42℃温度下，通过进行45秒的热冲击(heat-shock)，来制备导入有上述载体的经转化的大肠菌，并且涂抹于包含100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基中，来对经转化的大肠菌进行筛选。
实施例3：重组表达载体及重组菌株的制备
为了回收实施例2的4个重组载体pTOPV2-A1E、G2E、T3E、G4E及CYTE的质粒脱氧核糖核酸，利用质粒提取试剂(美国建伦(QIAGEN)公司)来回收了质粒脱氧核糖核酸。并且，为了从大肠菌中大量地表达包含上述尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的5个基因，对上述酶的基因TM0282(A1E)、1034(G2E)、0416(T3E)、0509(G4E)及CYTE进行限制性酶NdeI及XhoI或BamHI处理之后，上述基因与利用相同的限制性酶进行处理的表达载体pET15b(美国Novagen公司生产)相连接制备了重组载体。接着，将上述重组的表达载体pET 15b-A1E、G2E、T3E、G4E及CYTE与用于转基因而准备的合适的大肠菌BL21(E.coli BL21/DE3)相混合之后，在42℃温度下，通过进行45秒的热冲击，来制备导入有上述载体的转基因大肠菌，并涂抹于包含100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基，来筛选了经转化的大肠菌。将此命名为“大肠菌BL21/DE3 pET 15b-A1E、G2E、T3E、G4E及CYTE(E.coli BL21/DE3pET 15b-G4E)”。
实施例4：包含重组尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及D-塔格糖酮酸差向异构
酶的5个酶的表达
将在上述实施例3中制备而成的重组菌株大肠菌BL21/DE3pET 15b-A1E、G2E、T3E、G4E及CYTE在LB培养基中接种1％(v/v)，并在37℃温度下培养2个半小时之后，添加IPTG使最终浓度为1mM，来在6个小时中诱导了包含重组尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及D-塔格糖酮酸差向异构酶的5个酶的表达。为了测定被表达的酶的活性，对培养液进行离心分离(10000xg，10分钟)，来仅收集菌体，在20mM的Tris-HCl、0.5M的NaCl及5mM的咪唑(pH7.9)中重新进行悬浮。接着，进行超声波处理完全破碎细胞之后，将其作为酶液来使用，来进行了果糖差向异构反应。果糖差向异构反应为混合1mg的上述酶液和作为基质的50mM的果糖，并使1mL的酶反应液(20mM Tris-HCl，pH7.5)在80℃温度下反应3小时来进行。将生成的产物注入于安装有Carbo PAC-PA1柱(4×250mm)及ED50电化学检测仪的生物液相色谱仪(美国戴安(Dionex)公司生产)来进行了分析。上述分析中以1.0ml/分钟的速度使作为移动相的16mM的NaOH流动，并获取了色谱。D-塔格糖和D-果糖的标准物及所有酶反应样品与如上所述的组合物一同反应，来利用蒸馏水稀释10倍，并测定了5mM的浓度的糖。标准物是测定了从美国西格玛公司购买的D-塔格糖和D-果糖，并对尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶与果糖相反应的生成物进行了分析。并且，确定了检测出规定量的塔格糖。
实施例5：尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及D-塔格糖酮酸差向异构酶的分离
纯化
为了对利用上述实施例4的方法进行表达的重组尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及D-塔格糖酮酸差向异构酶进行纯化，对重组菌株培养液进行离心分离(10000xg，10分钟)，来仅收集菌体之后，进行超声波处理来破坏大肠菌的细胞壁，在14000×g下进行20分钟的离心分离来去除沉淀物(菌体)并获取了上清液。接着，将上述上清液在70℃温度下进行15分钟的热处理，在14000×g下进行20分钟的离心分离来去除沉淀物之后，并获取了上清液之后，进行Ni2+柱层析，来分离了重组尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶与D-塔格糖酮酸差向异构酶相分离。为了去除粘贴于被表达的重组蛋白质的N-末端的六组氨酸，对凝血酶(Thrombin)(由美国NOVAGEN公司生产)进行了处理，最终利用S200gel柱层(由美国GEHealthcare公司生产)对处理的酶液进行了分离纯化。
如图4所示，通过SDS-PAGE蛋白质电泳，来确认了对来自海栖热袍菌的重组醛糖1-差向异构酶(A1E)、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶(G2E)、D-塔格糖3-差向异构酶(T3E)、尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶(G4E)和来自C.yonseiensis的重组D-塔格糖酮酸差向异构酶(CYTE)进行编码化的基因的表达，，其中，利用凝血酶剪切G4E和CYTE的his标签，通过凝胶(gel柱来进行了最终精制。
实施例6：被分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的葡萄糖和半乳糖反
应生成物的分析
葡萄糖和半乳糖的差向异构反应为将1mg的从实施例5中进行了分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶液和分别与作为基质的50mM的葡萄糖和半乳糖进行混合，并使1mL的酶反应液(20mM的Tris-HCl，pH7.5)在80℃温度下反应3小时。将生成的产物注入于安装有Carbo PAC-PA1柱(4×250mm)及ED50注入安装有电化学检测仪的生物液相色谱仪(由美国戴安公司生产)来进行了分析。在上述分析中以1.0ml/分钟的速度使作为移动相的16mM的NaOH流动，并获取了色谱。D-葡萄糖、D-半乳糖及D-甘露糖的标准物及所有酶反应样品以与实施例4相同地进行了测定。其结果在图5中示出。
图5为通过生物液相色谱仪，对经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的D-葡萄糖和D-半乳糖反应生成物进行分析的图。a作为用于确认经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的D-葡萄糖和D-半乳糖的反应物和生成物的基准物(standard)-D-葡萄糖、D-半乳糖及D-甘露糖，通过生物液相色谱仪来进行分析的结果。b为在经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶中作为基质与D-葡萄糖进行反应时检测出D-甘露糖的结果。c为在经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶中作为基质与D-半乳糖进行反应时检测出D-葡萄糖的确认结果。如图5所示，确认了在经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶中作为基质与D-葡萄糖进行反应时检测出规定量的D-甘露糖，与D-半乳糖反应时检测出规定量的D-葡萄糖。
实施例7：对被分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的果糖和塔格糖反
应生成物的分析
果糖和塔格糖差向异构反应为将在实施例5中进行分离纯化的1mg的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶液分别与作为基质的50mM的D-果糖和D-塔格糖进行混合，将1mL的酶反应液(20mM Tris-HCl，pH7.5)在70℃温度下反应了75小时。生成的产物注入于安装有Carbo PAC-PA1柱(4×250mm)及ED50电化学检测仪的生物液相色谱仪(由美国戴安(Dionex)公司生产)来进行了分析。上述分析中以0.7ml/分钟的速度流动作为移动相的16mM的NaOH，并获取了色谱。D-葡萄糖、D-半乳糖及D-甘露糖的标准物及所有酶反应试样以与实施例4相同地进行了测定。其结果在图6中示出。
图6为通过生物液相色谱仪，对经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的D-果糖和D-塔格糖的反应生成物进行分析的图。A为用于确认经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的D-果糖和D-塔格糖的反应物和生成物的基准物，D-果糖、D-塔格糖通过生物液相色谱仪来进行分析的结果。B为在经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶中作为基质与D-果糖进行反应时检测出D-塔格糖的确认结果。图C为在经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶中作为基质与D-塔格糖进行反应时，检测出D-果糖的确认结果。如图6所示，确认了在经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶中作为基质与D-果糖进行反应时检测出规定量的D-塔格糖，与D-塔格糖反应时检测出规定量的D-果糖。
实施例8：根据与被分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的果糖之间的
反应时间的塔格糖的制备收率
利用在上述实施例5中进行分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶，从果糖来制备塔格糖时，测定了根据反应(温度、时间)的塔格糖制备收率。1mg的经分离纯化的酶反应液中，以10mM的果糖作为基质，在60、70及80℃温度下反应了96小时。在96小时的反应中，分别按时间(0、3、6、9、15、24、48、72及96小时)进行采样，并分析了塔格糖转换收率。将25μl的上述反应液与950μl的蒸馏水进行混合放入2ml容量的小瓶中，以50μl的反应液作为试样，注入于安装有Carbo PAC-PA1柱(4×250mm)及ED50电化学检测仪的生物液相色谱仪(美国戴安公司)来进行了分析。上述分析中以0.7ml/分钟的速度使作为移动相的16mM的NaOH流动，并获取了色谱。其结果在图7中示出。
如图7所示，经分离纯化的尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶与D-果糖进行反应时，随着温度上升96小时，根据在各温度中的反应时间增加，向D-塔格糖的转换收率增加，尤其在80℃温度下经过72小时之后达到了从D-果糖向D-塔格糖的30％的转换收率。
实施例9：经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶的果糖和塔格糖反应生成物的
分析
果糖和塔格糖的差向异构反应为将在实施例5中进行分离纯化的1mg的D-塔格糖酮酸差向异构酶液分别与作为基质的50mM的D-果糖和D-塔格糖进行混合，使1mL的酶反应液(20mM Tris-HCl，pH7.5)在70℃温度下反应了75小时。生成的产物注入于安装有CarboPAC-PA1柱(4×250mm)及ED50电化学检测仪的生物液相色谱仪(由美国戴安公司生产)来进行了分析。上述分析中以0.7ml/分钟的速度使作为移动相的16mM的NaOH流动，并获取了色谱。D-葡萄糖、D-半乳糖及D-甘露糖的标准物及所有酶反应试样以与实施例4相同地进行了测定。其结果在图8中示出。
图8为通过生物液相色谱仪，来对经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶的D-果糖和D-塔格糖反应生成物进行分析的图。D为用于确认经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶的D-果糖和D-塔格糖的反应物和生成物的基准物-D-果糖、D-塔格糖通过生物液相色谱仪来进行分析的结果。E为在经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶中作为基质与D-果糖进行反应时检测出D-塔格糖的确认结果。图F为在经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶中作为基质与D-塔格糖进行反应时，检测出D-果糖的确认结果。如图8所示，确认了在经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶中作为基质与D-果糖进行反应时检测出规定量的D-塔格糖，与D-塔格糖反应时检测出规定量的D-果糖。
实施例10：根据与被分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶的果糖之间的反应时间
的塔格糖的制备收率
利用在上述实施例5中进行分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶，从果糖制备塔格糖时，测定了根据反应(温度、时间)的塔格糖制备收率。在1mg的经分离纯化的酶反应液中，以10mM的果糖作为基质，在70℃温度下反应了75小时。在75小时的反应中，按时间(0、1、3、5、13、27、48及75小时)进行采样，并分析了塔格糖转换收率。将25μl的上述反应液与950μl的蒸馏水进行混合放入2ml容量的小瓶中，以50μl的反应液作为试样，注入于安装有CarboPAC-PA1柱(4×250mm)及ED50电化学检测仪的生物液相色谱仪(由美国戴安公司生产)来进行了分析。上述分析中以0.7ml/分钟的速度使作为移动相的16mM的NaOH流动，并获取了色谱。其结果在图9中示出。
如图9所示，经分离纯化的D-塔格糖酮酸差向异构酶与D-果糖进行反应时，根据在75小时当中的反应时间的增加，向D-塔格糖的转换收率增加，尤其在75小时之后达到了从D-果糖向D-塔格糖的19％的转换收率。
综合如上所述的结果来看，预想到来源于嗜热菌糖-差向异构酶可实现非磷酸己糖的差向异构化，并且在图10中示出了其预想的差向异构化。
本发明提供包含来源于嗜热菌糖-差向异构酶的非磷酸己糖的差向异构化用组合物。
以下，详细地说明本发明。
在本发明中，嗜热菌为嗜极生物(extremophile)的一种，是指在相对高的温度，即大致在60℃温度以上具有最佳的生存温度的微生物，优选地，可以为热袍菌目(Thermotogales Order)，更优选地，可以为栖热孢菌属(The Genus of Thermotoga)、闪烁杆菌属(The Genus of Fervidobacterium)及Caldanaerobacter(原高温厌氧杆菌属)属(The Genus of Caldanaerobacter：previously Thermoanaerobacter)。在本发明中，上述糖-差向异构酶(epimerase)被认识为糖，即单糖类或多糖类来作为基质，是指用于促进它们的差向异构化的酶，其种类不受限制，优选地，可以为醛糖-1-差向异构酶、D-塔格糖3-差向异构酶、L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶、尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖2-差向异构酶、核酮糖磷酸3-差向异构酶、核苷酸糖差向异构酶、尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶及D-塔格糖酮酸差向异构酶，然而其种类不受限制。更优选地，上述糖-差向异构酶可来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)和C.yonseiensis(Caldanaerobacter yonseiensis)。
上述糖-差向异构酶均包含天然存在的酶或由生物学或化学方法合成的酶。
上述酶获取所属基因之后，可通过转化等的一般方法来向微生物导入。上述差向异构酶基因可转化成单一或多个转基因的形态的转化为微生物。上述微生物包括原核细胞及真核细胞，优选地为原核细胞。上述微生物的一例为大肠菌。
本发明的来源于嗜热菌糖-差向异构酶可有效地诱导非磷酸己糖的差向异构反应，可容易地获取非磷酸己糖的差向异构形态，尤其为稀少的己糖，因此可有效地利用于制药及食品产业中。
在本发明中，上述非磷酸己糖可以为己醛醣或已酮醣，优选地，上述己醛醣可以为阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖或半乳糖，上述已酮醣可以为果糖、阿洛酮糖、山梨糖或塔格糖(Tagatose)。
优选地，在本发明中，上述差向异构化可以为非磷酸己糖的C-2、C-3或C-4差向异构化。
尤其，在本发明的上述糖-差向异构酶为来源于海栖热袍菌或C.yonseiensis的D-塔格糖酮酸差向异构酶或尿苷二磷酸-葡萄糖-4-差向异构酶的情况下，上述酶可使果糖向非磷酸己糖差向异构化，来制备塔格糖，也可对塔格糖进行差向异构化，来制备果糖。
并且，本发明提供利用上述组合物对非磷酸己糖进行处理的步骤的非磷酸己糖差向异构体的制备方法。
在本发明中，上述组合物根据如上所述中所定义。
在本发明中，上述非磷酸己糖可以为己醛醣或已酮醣，优选地，上述己醛醣可以为阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖或半乳糖，上述已酮醣可以为果糖、阿洛酮糖、山梨糖或塔格糖。
并且，本发明可提供用于对上述来源于嗜热菌糖-差向异构酶进行编码的聚核苷酸，利用包含上述聚核苷酸的重组载体，利用上述重组载体转化的宿主细胞及通过培养上述宿主细胞来制备来源于嗜热菌糖-差向异构酶的方法。
上述“聚核苷酸(polynucleotide)”以单链或双重链形态存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合体。核糖核酸(RNA)的基因序列包括脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))及由此转录的核糖核酸序列，在无特别涉及的情况下，包含天然的聚核苷酸的类似物。
上述聚核苷酸不仅包含用于对上述来源于嗜热菌糖-差向异构酶进行编码的核苷酸的序列，还包含对上述序列相辅性(complementary)的序列。上述相辅性序列不仅包括完美地相辅的序列，还包括实质上相辅性的序列。
并且，上述聚核苷酸可变形。上述变形包括核苷酸的添加、缺失或非保存性取代或保存性取代。用于对上述氨基酸序列进行编码的聚核苷酸还被解释为相对于上述核苷酸序列，还包括表示实质上相同的核苷酸序列。在上述实质上的相同性中，上述核苷酸序列与任意其他序列以最大限度相对应地排列，当利用本发明所属技术领域中通常利用的计算方法来对排列的序列进行分析时，可以为表示最小60％的同源性、最小70％的同源性、最小80％的同源性、最小90％的同源性或最小95％的同源性的序列。在本发明中上述“载体(vector)”意味着从宿主细胞表达目的基因的方法。例如，包含质粒载体、粘粒载体及噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体及腺相关病毒载体的病毒载体。可使用为上述重组载体的载体可对本发明所属技术领域中经常使用的质体(例如，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pGEX系列、pQE系列、pBAD系列、pET系列及pUC19等)、噬菌体(例如，λgt4λB、λ-Charon、λΔz1及M13等)或病毒(例如，CMV、SV40等)进行操作来制备。
在上述重组载体中对来源于嗜热菌糖-差向异构酶进行编码的聚核苷酸可操作性地与启动子相连接。术语“可操作性地相连接(operatively linked)”意味着核苷酸表达调节序列(例如，启动子序列)与其他核苷酸序列之间的功能性结合。因此，通过上述上述调节序列可调节上述其他核苷酸序列的转录和/或解读。
上述重组载体可作为用于典型的克隆的载体或用于表达的载体来体现。上述表达用载体可使用于在本发明所属技术领域中的植物、动物或微生物中表达外来蛋白质的通常所使用的表达载体。上述重组载体可通过在本发明所属技术领域中公知的多种方法来构建。
上述重组载体能够以原核细胞或真核细胞来作为宿主而构建。例如，使用的载体为表达载体，在以原核细胞作为宿主的情况下，可使转录进行的强力的启动子(例如，pLλ启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、T5启动子、T7启动子、PBAD启动子等)，通常包括用于公开解读的的核糖体的结合位置及转录/解读终结序列。在以真核细胞作为宿主的情况下，在包含于载体的真核细胞中工作的复制原点包括f1复制原点、SV40复制原点、pMB1复制原点、腺病毒复制原点、AAV复制原点、CMV复制原点及BBV复制原点等，但不局限与此。并且，来源于哺乳动物细胞的基因的启动子(例如，金属硫堇启动子)或来源于哺乳动物病菌的启动子可利用(例如，腺病毒后期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子及HSV的tk启动子)，作为转录终结序列通常具有多聚腺苷酸序列。
另一方面，上述载体不仅可表达本发明的肿瘤靶用肽，还可表达上述肽所融合的抗体的片段或抗体。在肽所融合的抗体或抗体的切片的情况下，载体为肽和抗体或抗体的片段从一个载体同时表达的载体系统或分别在各个载体进行表达的系统均可。在后者的情况下，两个载体可同时通过转化(共转化(co-transfomation))及靶转化(targetedtransformation)导入宿主细胞。
在本发明中，转化成上述重组载体的宿主细胞可利用本发明所属技术领域中公知的任意细胞，作为原核细胞具有例如，E.coli JM109、E.coli BL21、E.coli RR1、E.coliLE392、E.coli B、E.coli×1776、E.coli W3110、枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌等的芽孢杆菌属菌株及鼠伤寒沙门氏菌、灵杆菌及多种假单胞菌种等的肠内菌科菌株等，真核细胞中进行转基因时作为宿主细胞，可适用酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞、植物细胞及动物细胞，例如，SP2/0、CHO(Chinese hamster ovary)K1、CHO DG44、PER.C6、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、Huh7、3T3、RIN及MDCK细胞株等。
本发明另一实施方式可提供包括培养上述宿主细胞的步骤的来源于嗜热菌糖-差向异构酶的制备方法。
向上述聚核苷酸或包含上述聚核苷酸的重组载体的宿主细胞内的插入可利用本发明所属技术领域中众所周知的方法。上述输送方法，例如，在宿主细胞为原核细胞的情况下，可适用CaCl2方法或电穿孔法等，在宿主细胞为真核细胞的情况下，微细注入法、钙磷酸沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染法、热冲击及基因枪等，但不局限与此。
筛选上述转基因的宿主细胞的方法利用由选择标记来被表达的表现型，可根据本发明所属技术领域中众所周知的方法来进行容易地实施。例如，在上述选择标记为耐特定抗生素基因的情况下，上述抗生素中包含的培养基中培养转话体，从而可容易地对转基因体进行筛选。
Claims (12)
1.来源于Caldanaerobacter yonseiensis KB-1的D-塔格糖酮酸差向异构酶在制备非磷酸己糖差向异构体中的用途，其特征在于，通过差向异构化非磷酸己糖来制备非磷酸己糖差向异构体。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述非磷酸己糖为己醛醣或已酮醣。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，上述己醛醣为选自由阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖及半乳糖组成的组中的一种以上的己醛醣。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，上述已酮醣为选自由果糖、阿洛酮糖、山梨糖及塔格糖组成的组中的一种以上的已酮醣。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，上述差向异构化为非磷酸己糖的C-2、C-3或C-4的差向异构化。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述非磷酸己糖为塔格糖或果糖。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述非磷酸己糖为果糖，并且所述非磷酸己糖的差向异构体是塔格糖。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述非磷酸己糖是塔格糖，并且所述非磷酸己糖的差向异构体是果糖。
9.一种非磷酸己糖差向异构体的制备方法，其特征在于，包括利用来源于Caldanaerobacter yonseiensis KB-1的D-塔格糖酮酸差向异构酶对非磷酸己糖进行处理。
10.根据权利要求9所述的非磷酸己糖差向异构体的制备方法，其特征在于，上述非磷酸己糖为己醛醣或已酮醣。
11.根据权利要求10所述的非磷酸己糖差向异构体的制备方法，其特征在于，上述己醛醣为选自由阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖及半乳糖组成的组中的一种以上的己醛醣。
12.根据权利要求10所述的非磷酸己糖差向异构体的制备方法，其特征在于，上述已酮醣为选自由果糖、阿洛酮糖、山梨糖及塔格糖组成的组中的一种以上的已酮醣。
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