CN102250988A - 一种生物酶法生产塔格糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物酶法生产塔格糖的方法，步骤是(1)构建L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)工程菌大肠杆菌BL21(pET-15b/AI)；(2)利用构建的工程菌发酵获得含L-AI的细胞；(3)L-AI的分离纯化；(4)以L-AI催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖；(5)选择可代谢D-半乳糖，而不代谢D-塔格糖的微生物代谢除去D-半乳糖，纯化获得D-塔格糖。本发明利用基因工程技术构建了高效表达L-AI的大肠杆菌工程菌，使L-AI得到了大量表达，拟补了该酶催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖的效率较低的不足，同时利用可代谢D-半乳糖，而不代谢D-塔格糖的微生物除去酶催化反应后残留的底物半乳糖，得到了高纯度的D-塔格糖，具有重大的市场应用价值。

Description

一种生物酶法生产塔格糖的方法

技术领域

本发明涉及一种生产塔格糖的方法，尤其涉及一种利用生物酶法生产塔格糖的方法。

背景技术

塔格糖是D-果糖的同分异构体，自然界稀少，近年来被发现具有特殊保健功能，甜度是蔗糖的92％，热值仅为1.5Kcal/g(蔗糖为4Kcal/g)，可改善肠道菌群，降低血糖，抗龋齿等。经过十几年的动物和人体试验，2001至2005年先后在美国、韩国、澳大利亚、国际卫生组织、欧盟等认定为安全食品，使用上不需要任何限制。随后D-塔格糖被广泛健康饮料及酸乳、果汁等产品，作为蔗糖的代用品。由于D-塔格糖引起非常低的血糖和胰岛素应答，仅为葡萄糖的3％，因此还被广泛应用于糖尿病专用食品、减肥食品、口香糖、谷物食品、饮料、肉制品、糖果等工业中，并在医药中被用于止咳糖浆、粉剂、起泡剂、固定假牙的豁合剂及口腔消毒剂中。塔格糖作为2型糖尿病药物，2007年美国的Spherix Incorporated公司主持三期临床试验，以评估塔格糖对2型糖尿病人的血糖控制和安全性。

D-塔格糖的生产方法，有化学法和生物酶法。化学法是在一定化学条件下，将D-半乳糖异构化转化为D-塔格糖，目前利用化学方法大量生产D-塔格糖主要是基于1991年Spherix Incorporated的专利。生物酶法，根据底物不同有三种方法(1.利用D-半乳糖醇转化生产D-塔格糖；2.利用D-果糖先转化生成D-阿洛酮糖再进一步转化生成D-塔格糖；3.D-半乳糖一步酶促反应生产D-塔格糖)。第一种方法生产成本高，商业价值较低；第二种方法，由于D-阿洛酮糖的批量生产，使之具有一定的商业价值；三种方法中最有潜力的是第三种方法，即利用L-阿拉伯糖同分异构酶(EC 5.3.1.4，L-AI)催化D-半乳糖一步反应生产D-塔格糖。L-阿拉伯糖同分异构酶在体内催化L-阿拉伯糖转化成L-核酮糖，体外可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖。目前，已有30多种不同微生物来源的L-AIs基因得到克隆与表达，大部分在Oh的综述中被概述(Oh DK.Tagatose：properties，applications，and biotechnological processes.Appl MicrobiolBiotechnol，2007，76(1)：1-8)。

L-阿拉伯糖同分异构酶催化D-半乳糖一步反应生产D-塔格糖过程中，存在的问题一是酶本身：催化效率低，Kcat在2-20s-1范围内；对底物D-半乳糖的Km值非常高；大部分AIs催化反应的最适pH较高。通过人工进化酶的这些性质得到部分改善(Kim P，Yoon SH，Seo MJ，Oh DK，Choi JH.Improvement of tagatose conversion rate by geneticevolution of thermostable galactose isomerase.Biotechnol Appl Biochem.2001.34：99-102；Moez Rhimi，Michel Juy，Nushin Aghajari，Richard Haser，and SamirBejar.Probing the Essential Catalytic Residues and Substrate Affinity in theThermoactive Bacillus syesrothermophilus US100 L-Arabinose Isomerase bySite-Directed Mutagenesis.Jaurnal of Bactriology 2007，189(9)：3556-3563)。二是D-塔格糖的纯化问题，酶催化反应产物中存在D-半乳糖和D-塔格糖，二者为同分异构体，化学、物理性质相近。文献报道用Ca离子型的阳离子交换树脂柱层析可以实现二者的分离，但分离度较低，另外操作过程需较高温度(70℃)，柱不稳定，操作复杂。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用生物酶法生产塔格糖的方法。

本发明所述生物酶法生产塔格糖的方法，步骤是：

(1)L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)工程菌大肠杆菌BL21(pET-15b/AI)构建；

(2)利用构建的工程菌发酵获得含L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的细胞；

(3)L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的分离纯化；

(4)以L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖；

(5)选择可代谢D-半乳糖，而不代谢D-塔格糖的微生物代谢除去D-半乳糖，纯化获得D-塔格糖；

其特征在于：

步骤(1)所述工程菌是克隆来源于Thermoanaerobacter mathranii的L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)基因araA，重组到表达载体pET-15b中，再转化到表达宿主大肠杆菌BL21中得到；

步骤(2)所述工程菌发酵的温度为37℃，用0.5mmol/L的IPTG诱导表达L-阿拉伯糖同分异构酶；

步骤(3)所述L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的纯化选Ni-NTA柱亲和层析纯化；

步骤(4)所述以L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖的反应温度为60℃，反应pH值为8.0。

步骤(5)所述可代谢D-半乳糖，而不代谢D-塔格糖的微生物选酿酒酵母菌。

本发明方法所产生的有益效果是：

由于D-半乳糖并非L-AI的天然底物，其催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖的效率较低(催化D-半乳糖异构化为D-塔格糖的Kcat在2-20s-1范围内)，本发明利用基因工程技术构建了高效表达L-AI的大肠杆菌工程菌，使L-AI得到了大量表达，拟补了该酶催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖的效率较低的不足。

D-半乳糖与D-塔格糖为同分异构体，物理、化学性质相近，使的D-塔格糖的分离纯化比较困难，尤其是得到高纯度的D-塔格糖更难。本发明选用可代谢半乳糖而不代谢塔格糖的微生物除去酶催化反应后残留的底物半乳糖，得到了高纯度的D-塔格糖，是一种新奇的D-塔格糖纯化方法，具有重大的市场应用价值。

附图说明

图1 SDS-PAGE分析表达和纯化的L-AI。

其中1：蛋白marker；2：不含重组质粒细胞粗提液对照；3：工程菌细胞粗提液；4：纯化的L-AI。

图2 L-AI催化D-半乳糖转化D-塔格糖变化曲线。

图3酿酒酵母选择代谢纯化D-塔格糖。

其中A：TLC定性检测D-半乳糖和D-塔格糖变化；B：总还原糖和D-塔格糖变化曲线。

图4离子色谱(IC)分析结果。

其中A：D-半乳糖标准品，B：D-塔格糖标准品，C：纯化前的酶反应液，D：选择代谢纯化后反应液。

具体实施方式

实施例1：生物酶法生产D-塔格糖

1.工程菌构建：

高效表达L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)工程菌大肠杆菌BL21(pET-15b/AI)构建：

PCR技术克隆来源于Thermoanaerobacter mathranii的L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)基因(ara A)，引物为：

Forward：5’-ACGCCTCGAGATGCAAACCAAGAAAAAGCC-3’(下划线为Xho I位点)；

Reverse：5’-GCGCGGATCCCTATACTTCTACATATTCAA-3’(下划线为BamHI位点)；

PCR反应体系：

PCR反应程序：

2-4步35个循环，得到两端含有Xho I和BamHI限制性酶切位点的L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)基因。

将该基因重组到pET-15b质粒，重组质粒先转化大肠杆菌DH5进行质粒扩增，经扩增的质粒再转化到表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，转化子通过限制性酶切图谱和基因测序验证，得到大肠杆菌BL21(pET-15b/AI)工程菌，用于高效表达L-阿拉伯糖同分异构酶。

2.工程菌发酵：

将得到的大肠杆菌BL21(pET-15b/AI)工程菌接种于250ml含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃培养，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，添加0.5mmol/L的IPTG诱导表达4小时，结束发酵后，以5000rpm离心10min，收集细胞，用无菌水洗涤1-2次细胞。

其中：上述LB培养基配方：蛋白胨10克/升，酵母粉5克/升，NaCl 1克/升。

3.L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的分离纯化：

将收集的细胞悬浮于裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0)中，并在冰浴中进行超声波破粹，镜检破粹率达90％以上后于12000rpm离心30min，收集含L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的上清液。

选用Ni-NTA柱(Qiagen公司)，先用结合缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH 8.0)进行平衡，然后将收集的上清液上Ni-NTA柱亲和层析纯化，非结合蛋白用洗涤缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，40mmol/L imidazole，pH 8.0)洗掉，再用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，500mmol/L imidazole，pH 8.0)洗下结合的L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)，收集L-AI酶，4℃保存，备用。

以SDS-PAGE检测L-AI纯度和表观分子量，结果见图1。

4.L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖：

在100ml(50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0)的反应体系中，添加500mmol/L D-半乳糖，5mmol/L Mn²⁺和10mg纯化的L-AI，置60℃水浴中进行反应，反应过程中定时取样分析转化率，D-塔格糖用硫酸半胱氨酸-咔唑法测定，20小时后反应达平衡，D-塔格糖转化率达39.5％(见图2)，以沸水浴5分钟终止反应，收集酶反应液，用于纯化制备D-塔格糖。

5.D-塔格糖的纯化：

选择可代谢D-半乳糖，而不代谢D-塔格糖的酿酒酵母菌。

先将酿酒酵母于酿酒酵母培养基中，30℃预培养，当培养达对数生长期后，10000rpm离心10分钟，收集细胞，无菌水洗涤1-2次，备用。

上述酿酒酵母培养基配方：1000ml培养基中，麦芽浸粉10g，酵母粉10g，pH6.4。

取上述制备的酿酒酵母细胞10g，接种于步骤4中收集的酶反应液中，于30℃培养，20小时后，D-半乳糖被完全代谢掉(见图3)，收集培养物以10000rpm离心10分钟，去掉沉淀物(酿酒酵母细胞)，上清液依次过阳离子和阴离子交换树脂，收集脱除阴阳离子的洗脱液，以常规方式冷冻干燥，得到D-塔格糖干粉。

离子色谱(IC)分析显示，上述方法制备的D-塔格糖纯度达95％以上(见图4)。

上述实施例中涉及的分析方法汇总如下：

1.L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)表达与纯化时的定量分析用Bradford法测定(Bio-Rad Protein Assay reagents，Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，L-AI纯度和表观分子量分析用SDS-PAGE检测。

2.D-塔格糖定量分析用硫酸半胱氨酸-咔唑法测定(Dishe Z.and Broenfreund E.A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto sugarsand trioses.J.Biol.Chem.1951，192：583-587)。

3.总还原糖用斐林试剂法测定。

4.纯化过程中D-塔格糖和D-半乳糖变化的定性分析用TLC法(展开剂：乙酸乙酯∶异丙醇∶水＝6∶3∶1，显色剂：2％(v/v)苯胺，2％(v/v)二苯胺和8.5％磷酸的丙酮溶液，85℃显色)。

5.D-塔格糖的纯度检测用DIONEX Carbopac PA20阴离子交换柱进行离子色谱(IC)分析(条件：色谱柱：CarboPacTM PA20(3×15mm Analytical)，流动相：5mmol/L NaOH，流速：0.4mL/min，柱温：室温，检测器：ED50电化学检测器)。

本发明中涉及的菌种、载体均购自天津生物芯片技术有限责任公司。

Claims (1)

1.一种生物酶法生产塔格糖的方法，步骤是：

(1)L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)工程菌大肠杆菌BL21(pET-15b/AI)构建；

(2)利用构建的工程菌发酵获得含L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的细胞；

(3)L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的分离纯化；

(4)以L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖；

(5)选择可代谢D-半乳糖，而不代谢D-塔格糖的微生物代谢除去D-半乳糖，纯化获得D-塔格糖；

其特征在于：

步骤(1)所述工程菌是克隆来源于Thermoanaerobacter mathranii的L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)基因araA，重组到表达载体pET-15b中，再转化到表达宿主大肠杆菌BL21中得到；

步骤(2)所述工程菌发酵的温度为37℃，用0.5mmol/L的IPTG诱导表达L-阿拉伯糖同分异构酶；

步骤(3)所述L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)的纯化选Ni-NTA柱亲和层析纯化；

步骤(4)所述以L-阿拉伯糖同分异构酶(L-AI)催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖的反应温度为60℃，反应pH值为8.0；

步骤(5)所述可代谢D-半乳糖，而不代谢D-塔格糖的微生物选酿酒酵母菌。

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