CN107955825B - 一种以d-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以D‑阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，包括如下步骤：(a)制备D‑阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；(b)粗酶制剂与葡萄糖异构酶混合均匀，然后加入到海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到氯化钙溶液中，制备固定化酶；(c)配制葡萄糖溶液，添加氯化钴，通过添加固定化酶的柱子，制得含有D‑阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；(d)经脱色、过滤、离交后，经过浓缩、干燥，制得D‑阿洛酮糖。本发明通过培养基的优化提高了D‑阿洛酮糖差向异构酶的酶活，经该方法制备的甜味剂组合物甜度类似蔗糖，解决了食品中因广泛添加蔗糖所造成的肥胖等问题，可广泛应用于食品、保健品、药品、化妆品中。

Description

一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，属于食品添加剂制备技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖是一种重要的稀有糖，在自然界中极少量地存在于甘蔗糖蜜、水果干、糖制品、小麦和鼠刺属植物中。其名称起源于从抗菌素D-阿洛酮糖腺苷中也可以分离到少量的D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖在人体内是通过小肠吸收进入血液循环中，在小肠吸收后不会被代谢成能量，且对于肠道微生物具有较低的发酵利用度。D-阿洛酮糖具有多种重要的生理功能：神经保护作用，将血糖、减脂，清除活性氧簇，抗氧化，抑制癌细胞增殖，低卡路里甜味剂等。

D-阿洛酮糖可通过提高细胞内谷胱甘肽水平，起到保护神经的作用，降血糖、减脂、改善产品品质、较高的抗氧化功能；作为甜味剂，D-阿洛酮糖甜度相当于果糖的70％，能量只有蔗糖的0.3％，对生长小鼠几乎不产生能量，没有毒性；与果糖相比，D-阿洛酮糖能抑制小鼠肝脏脂肪合成酶活性，减少腹脂积累，可以作为一种甜味剂在辅助减肥中使用；D-阿洛酮糖显示出较强的清除活性氧簇的功能，使其在多种疾病预防和治疗中显示出潜在的医疗价值。

当前以蔗糖为主的添加剂给人们的身体健康产生了很多问题，人们迫切需要一种既能保证甜味又能不给身体健康带来问题的健康甜味剂，D-阿洛酮糖在这方面具有非常好的前景，然而目前D-阿洛酮糖的应用仍以单纯添加到食品中为主，成本很高，复合添加时以简单的混合方式进行添加，造成了混合不均匀的问题，大大限制了D-阿洛酮糖的应用领域，产品本身特性难以有效发挥。

中国专利文献CN107109448A(申请号201680005235.7)公开了通过将葡萄糖异构酶及D-阿洛酮糖表异构酶固定化，按照固定化葡萄糖异构酶与固定化D-阿洛酮糖表异构酶的活性比率成为1.49：1～5.61：1的方式填充到柱中，向该柱中通液葡萄糖溶液，能够连续且有效地制造包含葡萄糖、果糖及D-阿洛酮糖、并且D-阿洛酮糖的含有比率高的甜味料组合物。

中国专利文献CN103997913A(申请号201280063694.2)公开了使用含有D-阿洛酮糖的蔗糖混合物的饮食物、或者药品或准药品、或化妆品。构成：本发明的糖组合物的特征在于，其含有蔗糖和D-阿洛酮糖，所述D-阿洛酮糖以晶体或无定形状态涂布于所述蔗糖的晶体上。D-阿洛酮糖的含量相对于蔗糖与D-阿洛酮糖的总重量100重量份为1重量份以上且50重量份以下。

中国专利文献CN105338827A(申请号201480036881.0)公开了D-阿洛酮糖/赤藓糖醇组合物组合地包含D-阿洛酮糖和赤藓糖醇作为甜味剂以及一种或多种其它可食用的成分。提供了食品，包括饮料产品和其它食物产品，其包含新型D-阿洛酮糖/赤藓糖醇组合物。D-阿洛酮糖和赤藓糖醇可各自以足以彼此独立地使组合物可感知地增甜的浓度存在于食品中。另外的甜味剂组分和其它成分可包括在配方中。

中国专利文献CN105163603A(申请号201480020243.X)公开了一种克服了由于摄取异构化糖而造成的疾病患病风险、以及含有稀少糖的糖浆的制造工序上或味道上的缺点的新型的甜味料及其制造方法、以及其用途。该甜味料组合物的制造方法为在特定的条件下使酸和/或酶作用于砂糖从而有效地分解为葡萄糖和果糖之后，进一步在特定的条件下使用碱和/或酶将其异构化，在该异构化生成物中作为稀少糖主要含有D-阿洛酮糖，由此成为以特定的组成比例含有砂糖、D-葡萄糖、D-果糖以及至少包含D-阿洛酮糖的稀少糖，或者成为以特定的组成比例含有D-葡萄糖、D-果糖以及至少包含D-阿洛酮糖的稀少糖。

中国专利文献CN107006861A(申请号201710101418.5)公开了一种甜组合物在制备预防高血糖与低血糖症状的食品中的应用，包括将所述甜组合物投予至个体，其中所述甜组合物含有D-阿洛酮糖以及可缓慢消化多糖或抗消化多糖作为活性成分。所述食品预防糖尿病患者的血糖水平急剧增高的高血糖症状，同时预防对糖尿病患者为致命性的低血糖症状。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法。

本发明技术方案如下：

一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，包括如下步骤：

(a)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005经发酵培养基发酵培养，制得发酵液，发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；

所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，萘乙酸0.08～0.12％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2；

(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:(1～5)(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比20％～60％的比例加入到质量浓度为1％～3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％～3％的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时，制得固定化酶；

(c)配制质量浓度为20％～80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％～0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；

(d)收集步骤(c)制得的混合液，经脱色、过滤、离交后，经过浓缩、干燥，制得D-阿洛酮糖。

根据本发明优选的，所述步骤(a)中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.13152，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

根据本发明优选的，所述步骤(a)中，发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH6.8～7.2。

根据本发明优选的，所述步骤(a)中，发酵培养步骤如下：

按照体积百分比1～2％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.04～0.06Mpa，通风比1.8～2.2vvm，转速250～400rpm，溶氧30％～40％的条件下，发酵培养34～38h，制得发酵液。

根据本发明优选的，所述步骤(a)中，洗涤菌体采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。

根据本发明优选的，所述步骤(a)中的离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。

根据本发明优选的，所述步骤(b)中，葡萄糖异构酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

根据本发明优选的，所述步骤(d)中，脱色步骤如下：

将步骤(d)制得的混合溶液，按质量百分比0.5～1％的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。

根据本发明优选的，所述步骤(d)中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h。

根据本发明优选的，所述步骤(d)中，离交步骤如下：

将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在35～55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％。处理后的料液清澈透明，无异味。

根据本发明优选的，所述步骤(d)中，浓缩采用四效降膜蒸发器，真空度为0.06-0.09Mpa，料液温度50～85℃，浓缩至原体积的60～75％。

根据本发明优选的，所述步骤(d)中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：

浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。

有益效果

本发明改变了传统D-阿洛酮糖的制备方法，通过培养基的优化提高了D-阿洛酮糖差向异构酶的酶活，通过D-阿洛酮糖差向异构酶与葡萄糖异构酶混合固定化，简化了生产工艺，提高了转化率，经该方法制备的甜味剂组合物甜度类似蔗糖，而且还具有低成本和减少脂肪形成等优势，解决了食品中因广泛添加蔗糖所造成的肥胖等问题，还克服了传统添加所带来的混合不均匀的问题，可广泛应用于食品、保健品、药品、化妆品中。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC No.13152；

实施例中所述葡萄糖异构酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。

实施例1

一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，包括如下步骤：

(a)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005按照体积百分比2％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度35℃、pH7.2，罐压0.04Mpa，通风比2.2vvm，转速250rpm，溶氧40％的条件下，发酵培养34h，制得发酵液，发酵液经4℃、10000r/min条件下离心10min，采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，在4℃、10000r/min条件下，二次离心10min，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；

所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉5％，葡萄糖1％，萘乙酸0.1％，七水硫酸镁0.02％，磷酸氢二铵0.015％，硫酸锰0.018％，硫酸铜0.016％，氯化铁0.1％，余量水，pH7.0；

(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:5(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比20％的比例加入到质量浓度为1％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为3％的氯化钙溶液中，4℃固定12小时，制得固定化酶；

(c)配制质量浓度为80％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；

(d)收集步骤(c)制得的混合液，按质量百分比1％的比例加入活性炭，80搅拌40min进行脱色；然后在过滤压力0.2Mpa、水流量6.0t/h的条件下采用板框过滤，离交后，采用四效降膜蒸发器在真空度为0.06Mpa、料液温度85℃的条件下浓缩至原体积的60％，干燥后，制得D-阿洛酮糖。

所述离交步骤如下：

将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％。处理后的料液清澈透明，无异味；

所述干燥为喷雾干燥，步骤如下：

浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。

经检测，D-阿洛酮糖含量36.1％、果糖含量55.2％、葡萄糖含量8.7％。

实施例2

一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，包括如下步骤：

(a)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005按照体积百分比1％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度37℃、pH6.8，罐压0.06Mpa，通风比1.8vvm，转速400rpm，溶氧30％的条件下，发酵培养38h，制得发酵液，发酵液经4℃、10000r/min条件下离心10min，采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，在4℃、10000r/min条件下，二次离心10min，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；

所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉3％，葡萄糖1.5％，萘乙酸0.08％，七水硫酸镁0.025％，磷酸氢二铵0.01％，硫酸锰0.02％，硫酸铜0.015％，氯化铁0.12％，余量水，pH6.8；

(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:1(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比40％的比例加入到质量浓度为3％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1％的氯化钙溶液中，4℃固定36小时，制得固定化酶；

(c)配制质量浓度为20％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0005％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；

(d)收集步骤(c)制得的混合液，按质量百分比0.5％的比例加入活性炭，85℃搅拌30min进行脱色；然后在过滤压力0.4Mpa、水流量5.0t/h的条件下采用板框过滤，离交后，采用四效降膜蒸发器在真空度为0.09Mpa、料液温度50℃的条件下浓缩至原体积的75％，干燥后，制得D-阿洛酮糖。

所述离交步骤如下：

将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在35℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％。处理后的料液清澈透明，无异味；

所述干燥为喷雾干燥，步骤如下：

浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。

经检测，D-阿洛酮糖含量36.4％、果糖含量55％、葡萄糖含量8.6％。

实施例3

一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，包括如下步骤：

(a)将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLCY-005按照体积百分比1.5％的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度36℃、pH7.0，罐压0.05Mpa，通风比2.0vvm，转速300rpm，溶氧35％的条件下，发酵培养36h，制得发酵液，发酵液经4℃、10000r/min条件下离心10min，采用pH 8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗涤菌体，在4℃、10000r/min条件下，二次离心10min，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；

所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉8％，葡萄糖0.8％，萘乙酸0.12％，七水硫酸镁0.015％，磷酸氢二铵0.02％，硫酸锰0.015％，硫酸铜0.018％，氯化铁0.08％，余量水，pH7.2；

(b)步骤(a)中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以1:3(质量比)的比例混合均匀，然后按质量比60％的比例加入到质量浓度为2％的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为2％的氯化钙溶液中，4℃固定24小时，制得固定化酶；

(c)配制质量浓度为50％的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0003％的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；

(d)收集步骤(c)制得的混合液，按质量百分比0.7％的比例加入活性炭，82℃搅拌35min进行脱色；然后在过滤压力0.3Mpa、水流量5.5t/h的条件下采用板框过滤，离交后，采用四效降膜蒸发器在真空度为0.08Mpa、料液温度65℃的条件下浓缩至原体积的65％，干燥后，制得D-阿洛酮糖。

所述离交步骤如下：

将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在45℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98％。处理后的料液清澈透明，无异味；

所述干燥为喷雾干燥，步骤如下：

浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度140℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。

经检测，D-阿洛酮糖含量36.2％、果糖含量55％、葡萄糖含量8.8％。

由于葡萄糖的含量很低，果糖含量比较高但是不升高血糖，加之D-阿洛酮糖可以抑制葡萄糖的吸收和血脂的形成，因此该甜味剂组合物具有甜味好，混合稳定性好、热量低、甜昧协调性好、吸湿性小、耐受性高等优点，可以弥补传统甜味剂的不足，对改善特殊人群的饮食起到重要作用。

对比例1

采用市场购买的D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖按D-阿洛酮糖含量36.4％、果糖含量55％、葡萄糖含量8.6％比例配制，制得的甜味剂组合物与实施例1相比，混合稳定性差、甜昧协调性差、吸湿性高等缺点，应用于食品、保健品、药品、化妆品使用效果差，使用受到很大的限制。

对比例2

如实施例1所述的以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，不同之处在于，步骤(a)中，发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉3～8％，葡萄糖0.8～1.5％，乙烯利0.1％，七水硫酸镁0.015～0.025％，磷酸氢二铵0.01～0.02％，硫酸锰0.015～0.02％，硫酸铜0.015～0.018％，氯化铁0.08～0.12％，余量水，pH6.8～7.2。

经检测，D-阿洛酮糖含量22.4％、果糖含量52.3％、葡萄糖含量25.3％，与实施例1相比，D-阿洛酮糖含量较低，葡萄糖含量提高，除甜度、稳定性方面相差不大外，在低热量、甜度、吸湿性、耐受性等方面都不及实施例1。

实验例

热量值使用自动识别氧弹的量热仪进行测量，甜度参照国家标准《GB 8270-1999食品添加剂甜菊糖甙》菊中甜度的测定方法进行测定；

吸湿性(吸湿率)按如下公式计算：

吸湿率＝(吸湿后样品质量-绝干样品质量)/绝干样品质量；

耐受性按腹泻极限摄入量进行评价；

经对实施例2和对比例1、对比例2的产品进行检测，检测结果如表1所示：

表1

结果分析

通过实施例和对比例的检测数据的对比分析可知，本发明实施例2和对比例1、对比例2相比，在热量、稳定性、甜昧协调、吸湿性、耐受性等方面都具有优势。

Claims (10)

1.一种以D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（a）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCY-005经发酵培养基发酵培养，制得发酵液，发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，制得D-阿洛酮糖差向异构酶粗酶制剂；

所述发酵培养基，组分如下，均为质量百分比：

玉米浆粉3～8%，葡萄糖0.8～1.5%，萘乙酸0.08～0.12%，七水硫酸镁0.015～0.025%，磷酸氢二铵0.01～0.02%，硫酸锰0.015～0.02%，硫酸铜0.015～0.018%，氯化铁0.08～0.12%，余量水，pH6.8～7.2；

所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BLCY-005的菌种保藏编号为CGMCCNo.13152；

（b）步骤（a）中粗酶制剂与葡萄糖异构酶以质量比1:（1～5）的比例混合均匀，然后按质量比20%～60%的比例加入到质量浓度为1%～3%的海藻酸钠溶液中，混合均匀，然后滴加到质量浓度为1%～3%的氯化钙溶液中，4℃固定12～36小时，制得固定化酶；

（c）配制质量浓度为20%～80%的葡萄糖溶液，按质量百分比0.0001%～0.0005%的比例添加氯化钴，混合均匀，缓慢通过添加固定化酶的柱子，得到含有D-阿洛酮糖、果糖、葡萄糖的混合液；

（d）收集步骤（c）制得的混合液，经脱色、过滤、离交后，经过浓缩、干燥，制得D-阿洛酮糖为主要成分的甜味剂组合物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中，发酵培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米浆粉5%，葡萄糖1%，萘乙酸0.1%，七水硫酸镁0.02%，磷酸氢二铵0.015%，硫酸锰0.018%，硫酸铜0.016%，氯化铁0.1%，余量水，pH6.8～7.2。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中，发酵培养步骤如下：

按照体积百分比1～2%的接种量将种子接种于发酵培养基中，在温度35～37℃、pH6.8～7.2，罐压0.04～0.06Mpa，通风比1.8～2.2vvm，转速250～400rpm，溶氧30%～40%的条件下，发酵培养34～38h，制得发酵液。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中，洗涤菌体采用pH 8.0、浓度50 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中的离心分离均为在4℃、10000 r/min条件下，离心10 min。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中，脱色步骤如下：

将步骤（d）制得的混合溶液，按质量百分比0.5～1%的比例加入活性炭，80～85℃搅拌30～40min。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中，过滤采用板框过滤，过滤压力0.2～0.4Mpa，水流量5.0～6.0t/h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中，离交步骤如下：

将脱色过滤后的混合溶液以3倍树脂体积/小时的流速，在35～55℃通过连续离子交换系统，进行离交脱盐，离交后料液透光率≥98%。

9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中，浓缩采用四效降膜蒸发器，真空度为0.06～0.09Mpa，料液温度50～85℃，浓缩至原体积的60～75%。

10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（d）中，干燥为喷雾干燥，步骤如下：

浓缩后的糖液进入到干燥塔中，进风温度130～150℃，启动雾化器，液体经喷雾干燥为粉末状固体。