KR20140045423A

KR20140045423A - 아스로박터 글로비포미스가 생산하는 효소

Info

Publication number: KR20140045423A
Application number: KR1020137033679A
Authority: KR
Inventors: 겐 이즈모리; 프시파 키란 굴라팔리; 도모야 신타니; 료 깃카와
Original assignee: 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤; 가부시키가이샤 기쇼토 세이산 기쥬츠 겐큐쇼
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2014-04-16
Also published as: CN103946379B; EP2730652A4; WO2013005800A1; US9057062B2; JP5997693B2; US20140186925A1; KR101944027B1; CN103946379A; EP2730652A1; EP2730652B1; JPWO2013005800A1

Abstract

과제: 식품 산업에서 사용할 수 있는, 안정성이 높은 에피머라제 및 케토오스의 제조 방법의 제공. 해결 수단: 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기의 기질 특이성을 가지는 케토오스 3-에피머라제: (1) D- 또는 L-케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스를 생성한다. (2) D- 또는 L-케토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높다.

Description

아스로박터 글로비포미스가 생산하는 효소{ENZYME PRODUCED BY ARTHROBACTER GLOBIFORMIS}

본 발명은, 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물이 생산하는 효소(케토오스 3-에피머라제), 및 그 효소를 사용하는 케토오스의 제조 방법에 관한 것이며, 상세하게는, 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물, 바람직하게는 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) M30(수탁 번호 NITE BP-1111)으로부터 얻을 수 있고, 하기 (A) 및 (B)의 기질(基質) 특이성을 가지는 케토오스 3-에피머라제, 나아가서는 그 효소를 사용한 케토오스의 제조 방법에 관한 것이다.

(A) D- 또는 L-케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스를 생성한다.

(B) D- 또는 L-케토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높다.

D-프시코오스는, D-프룩토오스의 에피머로서, 감미의 강도 및 종류의 면에 있어서, D-프룩토오스와 극히 유사하다. 그러나, D-프시코오스는, D-프룩토오스와 달리, 체내 흡수 시에 거의 대사되지 않아, 열량 기여가 낮다. 특허 문헌 1에는, D-프시코오스가 저칼로리 감미료로서 저칼로리 음식물의 제조에 유리하게 이용할 수 있는 것에 대하여 기재되어 있다. 즉, D-프시코오스는, 다이어트 식품의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 비설탕 감미료로서 널리 이용되고 있는 당 알코올류는, 규정량을 초과하여 섭취하면 설사 등의 부작용을 일으키지만, D-프시코오스는, 이와 같은 부작용이 적다. 또한, D-프시코오스는, 인체 내에서 거의 대사되지 않기 때문에, 열량치는 거의 제로에 가까우며, 지방질 합성 효소의 활성을 억제함으로써 복부 지방을 감소시키는 기능을 가지고 있다. 그러므로, D-프시코오스는, 체중 감소에 유익한 감미료로서도 사용할 수 있다(예를 들면, 비특허 문헌 1 및 2 참조). 또한, 특허 문헌 2에는, D-프시코오스가 혈당 상승 억제 작용을 가지고 있으므로, 건강식품, 당뇨병 환자용 음식물, 다이어트용 음식물 등에 유리하게 이용할 수 있는 것에 대하여 기재되어 있다. 이와 같은 관점에서, D-프시코오스는, 건강식품, 다이어트 감미료로서 많은 관심을 모으고 있으며, 식품 산업에 있어서, D-프시코오스의 효율적이며 안전한 생성 방법의 개발에 대한 필요성이 높아지고 있다.

한편, 비특허 문헌 3에는 슈도모나스 치코리이(Pseudomonas cichorii) ST-24 유래의 D-케토오스 3-에피머라제가 개시되어 있고, 이 효소를 이용함으로써 D-프룩토오스로부터 D-프시코오스를 제조할 수 있는 것에 대하여 기재되어 있다. 그러나, 이 효소는 별명 D-타가토스 3-에피머라제로 불리우는 바와 같이, D-타가토스에 대한 특이성이 가장 높고, D-프룩토오스에 대한 작용은 비교적 약한 것으로 알려져 있다. 또한, 슈도모나스 치코리이는 식물 병원성 미생물이며, D-케토오스 3-에피머라제 생산능이 매우 낮기 때문에, 공업적으로 이용하기 위해서는 적합하다고는 할 수 없다. 슈도모나스속에 속하는 미생물과는 상이한 케토오스 3-에피머라제 생산능이 높고 식품 생산의 안전성에 문제가 없는 미생물, 및 D-프룩토오스에 대한 특이성이 높고, D-프시코오스의 제조에 적합한 신규 케토오스 3-에피머라제가 요구되고 있다.

이에, 특허 문헌 3에는, 신규한 케토오스 3-에피머라제와 그 제조 방법, 상기 효소를 코딩하는 DNA, 이것을 포함하여 이루어지는 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 상기 효소를 사용한 케토오스의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 하고, 리조비움속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 케토오스 3-에피머라제와 그 제조 방법, 상기 효소를 코딩하는 DNA와 이것을 포함하여 이루어지는 재조합 DNA 및 형질 전환체, 및 상기 효소를 이용하여, D- 또는 L-케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스를 제조하는 방법을 제공함으로써 상기 문제점을 해결하고 있다. 또한, 특허 문헌 4에는 아그로박테리움·튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 D-프시코오스에피머라제(이하, 프시코오스 3-에피머라제라고 함)를 사용하는 D-프시코오스의 생성 방법이 개발되어 있다.

이상과 같이, 전술한 바와 같은 문제에 대처하기 위하여, D-프룩토오스를 기질로서 사용하여, D-프시코오스를 효소적으로 생성하는 방법에 대한 연구가 행해지고 있다. 그러나, 현재까지 개발된 방법은, 식품으로서의 D-프시코오스의 생산에 이용하기에는 안전성의 면에서 문제점이 많다.

일본 특허출원 공개번호 2001-011090호 공보 일본 특허출원 공개번호 2005-213227호 공보 WO2007/058086호 공보 일본 특허출원 공표번호 2008-541753호 공보

Matsuo, T., Y. Baba, M. Hashiguchi, K. Takeshita, K. Izumori and H. Suzuki, Asia Pac. J. Clin. Nutr., 10: 233-237(2001) Matsuo, T. and K. Izumori, Asia Pac. J. Clin. Nutr., 13: S127(2004) Ken Izumori et. al., Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1037-1039(1993)

본 발명은, 식품을 제조할 때 사용이 인정되는 기존 첨가물 명부 수재(收載) 리스트에 수재되어 있는 균종으로서 독성이 거의 없는 균종으로부터, 높은 수율로 D-프룩토오스로부터 D-프시코오스로의 이성화(異性化)를 촉매하는 신규한 케토오스 3-에피머라제를 취득하는 것, 및 그 효소를 사용한 케토오스의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은, 기회가 될 때마다 각지의 토양을 채취하고, 그것으로부터, 미생물을 분리하고, 케토오스 3-에피머라제 생산능을 가지는 슈도모나스속에 속하는 미생물 이외의 미생물의 탐색을 계속하여 왔다. 전술한 일본의 기존 첨가물 명부 수재 리스트 이외에도 유럽 및 미국에 있어서 식품으로서 사용이 인정되는 리스트에 실려 있는 균종에서 독성이 거의 없는 균종에 착안하여, 탐색을 계속하여 왔다.

그 결과, 단리한 수많은 균주 중에서 신규한 케토오스 3-에피머라제를 생산하는 아스로박터(Arthrobacter)속에 속하는 미생물을 발견하였다. 또한, 상기 미생물 유래의 신규한 케토오스 3-에피머라제는, D- 또는 L-케토오스의 3번 위치에 작용하고, 대응하는 D- 또는 L-케토오스로의 에피머화를 촉매하는 폭 넓은 기질 특이성을 가지고 있으며, 의외로, D- 또는 L-케토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높고, D-프룩토오스로부터의 D-프시코오스의 제조에 적합한 것을 발견하였다. 그리고, 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 신규 케토오스 3-에피머라제와 그 제조 방법을 확립하는 동시에, 상기 효소를 이용한 케토오스의 변환 방법 및 케토오스의 제조 방법을 확립하여 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은, 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 케토오스 3-에피머라제의 제공, 및 그 효소를 이용하여, D- 또는 L-케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물은, 신규한 케토오스 3-에피머라제 생산능이 비교적 높고, 슈도모나스 치코리이와는 달리 식물 병원성도 가지고 있지 않다. 또한, 상기 미생물로부터 얻을 수 있는 본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, 특히 D-프시코오스 및 D-프룩토오스 사이의 상호 변환을 양호하게 촉매하므로, D-프룩토오스로부터의 D-프시코오스의 제조에 유용하다.

본 발명은, 하기 (1) 내지 (6)에 기재된 케토오스 3-에피머라제를 요지로 한다.

(1) 아스로박터속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기 (A), (B)의 기질 특이성을 가지는 케토오스 3-에피머라제.

(2) 아스로박터속에 속하는 미생물이, 아스로박터 글로비포미스인 상기 (1)에 기재된 케토오스 3-에피머라제.

(3) 아스로박터속에 속하는 미생물이, 아스로박터 글로비포미스 M30(수탁 번호 NITE BP-1111)인 상기 (1)에 기재된 케토오스 3-에피머라제.

(4) SDS-PAGE에 의한 서브 유닛의 분자량이 약 32 kDa이며, 겔 여과법에 의한 분자량이 120 kDa인, 서브 유닛의 분자량이 32 kDa인 호모테트라머 구조인 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 케토오스 3-에피머라제.

(5) 하기 이화학적 성질 (a)∼(e)를 가지는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 케토오스 3-에피머라제.

(a) 최적 pH

30℃, 30분간 반응, 20mM의 마그네슘(Mg² ^＋) 존재 하의 조건에서, 6 내지 11.

(b) 최적 온도

pH 7.5, 30분간 반응, 20mM의 마그네슘(Mg² ^＋) 존재 하의 조건에서, 60 내지 80℃.

(c) pH 안정성

4℃, 24시간 유지의 조건 하에서, 적어도 pH 5 내지 11의 범위에서 안정.

(d) 열안정성

pH 7.5, 1시간 유지, 4mM의 마그네슘 이온(Mg² ^＋)의 존재 하의 조건에서, 약 50℃ 이하에서 안정. 마그네슘 이온(Mg² ^＋) 비존재의 조건에서, 약 40℃ 이하에서 안정.

(e) 금속 이온에 의한 활성화

2가 망간 이온(Mn² ^＋), 2가 코발트 이온(Co² ^＋), 칼슘(Ca² ^＋) 및 마그네슘 이온(Mg² ^＋)에 의해 활성화된다.

(6) 하기의 기질 특이성 1.∼8.을 가지는 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 케토오스 3-에피머라제.

기질 특성

1. D-프룩토오스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 43.8%,

2. D-프시코오스를 기질로 했을 때의 활성이 100%,

3. D-소르보스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 1.13%,

4. D-타가토스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 18.3%,

5. L-프룩토오스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 0.97%,

6. L-프시코오스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 21.2%,

7. L-소르보스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 16.6%,

8. L-타가토스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 44.0%.

단, D-프시코오스의 에피머화 활성을 100으로 하여 각각의 케토오스에 대한 활성을 상대 활성으로서 나타내고 있다.

또한, 본 발명은, 하기 (7)에 기재된 케토오스의 변환 방법, 및 하기 (8)에 기재된 케토오스의 제조 방법인 것을 요지로 한다.

(7) D- 또는 L-케토오스로부터 선택되는 1종 이상의 케토오스를 함유하는 용액에, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 케토오스 3-에피머라제를 작용시켜, 상기 케토오스의 3번 위치를 에피머화하는 것을 특징으로 하는 케토오스의 변환 방법.

(8) D- 또는 L-케토오스로부터 선택되는 1종 이상의 케토오스를 함유하는 용액에, 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 케토오스 3-에피머라제를 작용시켜 상기 케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 케토오스를 생성하게 하고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 케토오스의 제조 방법.

본 발명은 다음과 같은 효과를 가진다.

1. 아스로박터 글로비포미스 유래의 본 효소를 식품 산업에서 사용하는 가장 큰 장점으로서는 균의 안전성에 있다.

2. D-프시코오스 생산균에 최적힌 pH는, 슈도모나스속(Pseudomonas)은 7∼9, 리조비움속(Rhizobium)은 9∼9.5, 아그로박테리움속(Agrobacterium)은 7∼8이다. 한편, 본 균주에 의한 효소의 최적 pH는 6∼8의 사이에 있으며, 착색이 적은 7 이하의 pH에 있어서도 D-프시코오스의 생산은 가능하다.

3. 30분간의 효소 활성을 측정한 결과에 따르면, 리조비움속(Rhizobium)은 Mn^2＋, Mg² ^＋, 아그로박테리움속(Agrobacterium)은 Co² ^＋, Mn² ^＋에서 활성이 증가하는 것이 보고되어 있다. 본 효소의 경우에는, Mn² ^＋, 및 Co² ^＋에 의해 활성 증가가 인정된다. 또한, Mg² ^＋, Ca² ^＋에 의해서도 활성이 증가한다.

4. 종래의 효소와 비교하여 폭 넓은 온도대에서의 반응이 가능하다.

5. L-타가토스로부터 L소르보스로의 반응 활성이 크다.

6. 배지에 첨가하는 D-프시코오스가 0.15%로 적어도, 활성이 있는 균체를 얻을 수 있다.

7. 물에서도 효소 활성이 있으며, 프룩토오스로부터 프시코오스로의 반응이 진행된다.

8. 슈도모나스 치코리이보다 증식 속도가 크다.

본 발명에 의하여, 식품을 제조할 때 사용이 인정되는 기존 첨가물 명부 수재 리스트에 수재되어 있는 균종으로서 독성이 거의 없는 균종으로부터, 높은 수율로 D-프룩토오스로부터 D-프시코오스로의 이성화를 촉매하는 신규한 케토오스 3-에피머라제를 취득할 수 있다. 또한, 그 효소를 사용한 케토오스의 제조 방법을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명은, 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있는 케토오스 3-에피머라제의 제공, 및 그 효소를 이용하여, D- 또는 L-케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스를 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 미생물로부터 얻을 수 있는 본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, 특히 D-프시코오스 및 D-프룩토오스 사이의 상호 변환을 양호하게 촉매하므로, D-프룩토오스로부터의 D-프시코오스의 제조에 유용하다.

도 1은 무기염 배지를 사용한 각종 탄소원의 효소 생산량에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 2는 각종 배지에서의 효소 생산량에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 3은 금속 이온의 D-PE 활성에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 4는 최적 온도를 나타낸 도면이다.
도 5는 열안정성을 나타낸 도면이다.
도 6은 최적 pH를 나타낸 도면이다.
도 7은 pH 안정성을 나타낸 도면이다.
도 8은 이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리 용출을 나타낸 도면이다.
도 9는 소수(疏水) 크로마토그래피에 의한 분리 용출을 나타낸 도면이다.
도 10은 순도를 확인하기 위한 SDS-PAGE 사진이다.
도 11은 최적 pH의 범위를 나타낸 도면이다.
도 12는 최적 온도의 범위를 나타낸 도면이다.
도 13은 안정적인 pH 범위를 나타낸 도면이다.
도 14는 안정적인 온도 범위를 나타낸 도면이다.
도 15는 영동 거리와 분자량의 관계를 나타낸 도면이다.
도 16은 표준 단백질의 이동 거리의 관계도와 분자량의 관계를 나타낸 도면이다.

본 발명은, 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기의 기질 특이성을 가지는 케토오스 3-에피머라제에 관한 것이며, 식품공업에서 사용할 수 있는 균의 안전성, 낮은 최적 pH, 열안정성 및 금속 요구성에 있어서 특징적인 것이다.

[안전성]

본 효소, 아스로박터·글로비포미스를 식품 산업에서 사용하는 가장 큰 장점으로서는, 균의 안전성에 있다. 이 균종은 먼저 미국에서, FDA에 의한 EAFUS(Everything Added to Food in the United States): A Food Additive Database에 "Glucose isomerase from i㎜obilized arthrobacter globiformis"로서 수재되어 있다. 이 사용법은, 균체를 그대로 고정화하는 것으로서, 균체 자체의 안전성이 매우 높은 것을 증명하는 것이다.

또한 유럽에서는, EFFCA(The European food & feed cultures association)와 IFD(International Federation for the Roofing Trade)에 의한 "Inventory of Microorganisms with a documented history of use in food"에 있어서 "Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness"로서 사용되고 있다고 그 취지가 기재되어 있다. 이것은, 효모 등과 마찬가지로, 이 균종은 발효에 사용되고 있는 것을 나타낸 것이며, 극히 안전성이 높은 것을 나타낸다. 일본에서는, 아스로박터속은 "α-아밀라아제, 이소말토덱스트라나제, 인버타아제, 우레아제, 글루카나제, α-글루코실트랜스퍼라제, 프룩토실트랜스퍼라아제" 등의 효소기원 미생물로서, 또한, 트레할로스나 비타민 K(메나퀴논) 생산균으로서 식품첨가물 리스트에 수재되어 있다.

이와 같이 일본, 미국, 유럽에서 장기간 사용 실적이 있음에도 불구하고, 이 균종에 의한 에피머라제 효소가 발견되지 않았다는 것은 놀랄 만한 것이다.

한편, 지금까지 알려져 있는 D-프시코오스의 생산 효소로서는, 슈도모나스속(Pseudomonas), 아그로박테리움속(Agrobacterium), 리조비움속(Rhizobium) 등에 의한 것이 있다. 이들은 상기 미국 및 유럽의 리스트에는 수재되어 있지 않은, 기회균으로서, 식물세포 감염 등에 대한 보고도 있다.

또한, 당질 효소의 대표적인 것인 글루코오스이소머라제에 의한 포도당으로부터 과당의 생산에는 많은 균주가 보고되어 있지만(60종 이상), 실용화된 것은, 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 바실루스속(Bacillus), 악티노플라네스속(Actinoplanes), 아스로박터속 등 소수의 속에서의 이용되고 있는 것에 지나지 않는다. 이와 같이, 아스로박터속은 식(食)실적이 있는 안정성이 높은 균종이다.

[최적 pH 및 금속 요구성]

또한, 본 발명의 장점으로서는 이하의 사항에 있다.

D-프시코오스 생산균의 최적인 pH는, 슈도모나스속은 7∼9, 리조비움속은 9∼9.5, 아그로박테리움속은 7∼8이다. 한편, 본 균주에 의한 효소의 최적 pH는 6-8의 사이이며, 착색이 적은 7 이하의 pH에 있어서도 D-프시코오스 생산은 가능하다.

또한, 30분간의 효소 활성을 측정한 결과로부터는, 리조비움속은 Mn² ^＋, Mg² ^＋, 아그로박테리움속은 Co² ^＋, Mn² ^＋에서 활성이 증가하는 것이 보고되어 있다. 본 효소의 경우에는, Mn² ^＋, 및 Co² ^＋에 의해 활성 증가가 인정된다. 또한, Mg² ^＋, Ca² ^＋에 의해서도 활성이 증가하므로, Mg² ^＋ 등을 사용한 본 균주에 의한 D-프시코오스 생산이 가능하다.

[균주의 유래 및 동정]

본 발명자 등은 단리한 수많은 균주 중에서 신규한 케토오스 3-에피머라제를 생산하는 미생물 M30주를 발견하고, M30주는 16SrRNA 유전자 염기 서열 상동성에 기초한 계통 해석에 의하여, 아스로박터 글로비포미스에 속하는 것이 판명되었다.

균주의 동정

(1) 16SrRNA 유전자 염기 서열 상동성

16SrRNA 유전자 영역을 해석하여 염기수 734를 특정했다.

(2) 상동성 검색

이 균주의 16SrRNA 유전자의 염기 서열에 대하여, BLAST 서치(일본 DNA 데이터 뱅크)에 의해 기존의 균종과의 상동성 검색을 행하였다. 상기 특정한 염기수 734의 염기 서열에 대하여 상동성 97% 이상인 균주명과 상동성(%)의 값으로부터 M30주의 미생물은, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis)인 것이 결정되었다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라제 활성을 가지는 균주인 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) M30은 2011년 6월 22일자로 지바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8 소재의 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터에 기탁하고, 먼저 수령 번호 NITE AP-1111로서 수령되었고, 수탁 번호 NITEP-1111로서 기탁되었다.

본 발명에서 말하는 케토오스란, 케토오스 구조를 가지는 6탄당이며, 구체적으로는 프룩토오스, 프시코오스, 타가토스 및 소르보스를 의미하고, D- 또는 L-케토오스는 이들의 D-체 및 L-체를 의미한다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, D- 또는 L-케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스를 생성하는 활성을 가지고, D- 또는 L-프룩토오스와 D- 또는 L-프시코오스 사이의 상호 변환, 및 D- 또는 L-타가토스와 D- 또는 L-소르보스 사이의 상호 변환을 촉매한다. 본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, D- 또는 L-케토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높은 효소이다. 본 발명의 효소는 후술하는 아스로박터속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하며, 케토오스 3-에피머라제 생산능을 가지는 미생물을 배양하고, 배양액 중에서 생육한 균체내로부터 케토오스 3-에피머라제를 채취함으로써 조제할 수 있다. 아스로박터(Arthrobacter) 속에 속하는 미생물로서는, 예를 들면, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) M30(수탁 번호 NITE BP-1111) 주 및 이들의 변이주 등을 유리하게 이용할 수 있다. M30주는 케토오스 3-에피머라제의 생산능이 비교적 높고, 본 발명의 효소를 얻는 데 있어서 매우 적합하다. M30주는, 금번 국제 출원을 행하는 데 있어서, 일본국 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터(일본국 지바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)에 2011년 6월 22일에 원기탁된 NITEP-1111로부터 부다페스트 조약에 따른 기탁으로의 이관을 2012년 5월 2일에 청구하였고, 수탁 번호 NITE BP-1111로 국제 기탁되었다.

[정제 전의 본 효소의 이화학적 성질]

정제 전의 효소, 케토오스 3-에피머라제의 활성은, D-프룩토오스를 기질로 하여, D-프시코오스의 생성량을 측정함으로써 측정할 수 있다. 구체적으로는, 효소 반응액 조성은, 50mM 트리스 HCl 완충액(pH 7.0) 200ml, 0.2M D-프룩토오스 375μl, 효소액 100μl, 10mM 염화 망간 75μl를 사용하고, 55℃에서 30분간 반응시키고, 2분간 끓임(boiling)으로써 반응을 멈추게 하고, HPLC에 의해 반응 후의 액 조성을 측정하였다. 효소 활성 1단위는, 상기 조건 하에서, D-프룩토오스를 에피머화하고 1분간에 1㎛ol의 D-프시코오스를 생성하는 효소량으로 정의한다. 역반응인 D-프시코오스로부터 D프룩토오스로 에피머화하는 효소 단위에 대해서도 마찬가지의 조건에서 측정하고 마찬가지로 정의한다.

본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, 하기의 이화학적 성질을 가지는 경우가 있다.

(a) 최적 pH

55℃, 30분간 반응, 1mM의 2가 코발트 이온(Co² ^＋) 존재 하의 조건 하에서, 6.0 내지 10.

(b) 최적 온도

pH 7.0, 30분간 반응, 1mM의 2가 코발트 이온(Co² ^＋) 존재 하의 조건 하에서, 약 50℃ 내지 약 70℃.

(c) pH 안정성

4℃, 24분간 유지, 적어도 pH 5.5 내지 11의 범위에서 안정.

(d) 열안정성

pH 7.0, 10분간 유지, 1mM의 2가 코발트 이온(Co² ^＋) 존재 하의 조건 하에서, 약 70℃ 이하에서 안정되며, 1mM의 2가 코발트 이온(Co² ^＋) 비존재의 조건에서 약 60℃ 이하에서 안정됨.

(e) 금속 이온에 의한 활성화

2가 망간 이온(Mn² ^＋) 또는 2가 코발트 이온(Co² ^＋)에 의해 활성화된다.

케토오스의 변환 반응은, 통상, 다음의 조건에서 행해진다. 기질 농도는 1 내지 60 %(w/v), 바람직하게는, 약 5 내지 50 %(w/v), 반응 온도는 10 내지 70 ℃, 바람직하게는, 약 30 내지 60 ℃, 반응 pH는 5 내지 10, 바람직하게는, 약 7 내지 10, 효소 활성은 기질 1그램당 1단위 이상, 바람직하게는, 50 내지 5,000 단위의 범위로부터 선택된다. 반응 시간은, 적절하게 선택할 수 있지만, 경제성을 고려하여, 배치(batch) 반응의 경우에는, 통상, 5 내지 50 시간의 범위가 선택된다.

이와 같이 하여 변환시켜 얻어지는 반응 용액은, 원료의 케토오스와 새롭게 생성된 케토오스를 함유하고 있고, 이것을 그대로 감미료, 보습제, 결정 석출 방지제, 윤기 부여제 등으로서 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 통상, 반응 용액은, 통상적인 방법에 따라, 활성탄을 사용하여 탈색하고, H형 및 OH형 이온 변환 수지를 사용하여 탈염, 농축하여 시럽상(狀) 제품을 얻는다.

필요하면, 또한 이 농축액을, 예를 들면, 알칼리 금속형 또는 알칼리 토류 금속형 강산성 양이온 교환 수지를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해, 새롭게 생성된 케토오스와 원료 케토오스를 분리 정제하고, 새롭게 생성된 케토오스 고함유 획분(劃分)을 농축하고, 시럽상 제품을 얻는 것도, 또한 결정화할 수 있는 케토오스의 경우에는, 정출(晶出)시켜, 결정 제품을 얻는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 이 분리된 원료의 케토오스를, 다시, 변환 반응의 원료에 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 케토오스는, 감미료로서 매우 적합하고, 음식물, 사료, 사료, 치약, 구중향정(cashou), 설하정(舌下錠), 내복약 등 경구 섭취물의 감미 부여, 기호성 향상 등에 유리하게 이용할 수 있다. 또한, 발효용 탄소원, 시약, 화학품·의약품의 원료, 중간체 등으로서도 유리하게 이용할 수 있다.

이하에서, 실험에 의해 본 발명을 상세하게 설명한다. 그리고, 이하의 실험에 있어서는 D-프시코오스를 D-프룩토오스로 변환하는 D-프시코오스 3-에피머라제 활성을 전술한 활성 측정법에 의해 측정하고, 케토오스 3-에피머라제 활성으로 표기했다.

<실험 1: 아스로박터 글로비포미스 M30(수탁 번호 NITE BP-1111) 주의 배양>

D-프시코오스 0.2%를 탄소원으로 하고 황산암모늄을 질소원으로 하는 무기염 배지에, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) M30(수탁 번호 NITE BP-1111) 주의 종배양액(種培養液) 1%(v/v)를 무균적으로 첨가하고, 통기 교반하면서 30℃에서 16시간 배양했다. 얻어진 배양액 중의 케토오스 3-에피머라제 활성은 약 14단위/100ml 배양액이었다.

<실험 2: 아스로박터 글로비포미스 M30(수탁 번호 NITE BP-1111) 주의 배양의 배양과 조효소(粗酵素)의 추출>

원심분리에 의해 배양액으로부터 균체를 회수했다. 회수한 균체는 1mM 트리스 HCl 완충액(pH 7.0)을 사용하여, 세정하였다. 이어서, 균체를 10ml의 1mM 트리스 HCl 완충액(pH 7.0)에 현탁한 후, 그 균체 현탁액을 얼음 물 중에서 냉각하면서 초음파 호모지나이저(가부시키가이샤 SONICS & MATERIALS)로 세포 파쇄했다. 파쇄물을 12000rpm으로 20분 원심분리하고, 그 원심분리된 상청액(supernatant)을 조효소로 하였다.

<실험 3: 조효소의 투석>

Cellulose Ester Dialysis Membrane(SPECTRUM Laboratory사)에 조효소를 넣고, 멤브레인 전체를 20mM EDTA를 포함하는 10mM 트리스 HCl 완충액에 12시간 담그어서 투석(透析)했다. 멤브레인을 10mM 트리스 HCl(pH 7.0) 완충액으로 2회 세정한 후, 멤브레인으로부터 조효소액을 인출하였다.

<실험 4: 효소 활성의 검출>

하기의 반응 조건에 의하여, 각각 반응시킨 후, 자비(煮沸)에 의해 반응을 정지했다. 반응액을 이온 교환 수지에 의해 탈염하고, 필터 처리하여 HPLC 샘플을 조제했다. 샘플은, HPLC 시스템(도소)에서 CK08EC(미쓰비시 화학)를 사용하여 크로마토그래피 분석하였다. 크로마토그램의 피크 면적값으로부터, 생성된 각종 당을 산출하였다.

<시험 결과>

<실험 5: 케토오스 3-에피머라제의 성질>

1. 탄소원과 그 농도의 활성에 대한 영향

0.05-1 %의 D-프시코오스(D-p), 1%의 D-프룩토오스(D-f), 1%의 D-타가토스(D-t), 0.1%의 프룩토오스(D-f) 및 0.1%의 D-프시코오스(D-p), 1%의 D-프시코오스(D-p) 및 0.1%의 D-타가토스(D-t)를 포함하는 MSM 배지에서 아스로박터 글로비포미스 M30(수탁 번호 NITE BP-1111) 주를 배양하고, 전술한 바와 동일한 조작으로 얻은 조효소의 각 활성을 조사하였다.

그 결과(도 1), 본 균의 효소는 D-프시코오스가 존재할 때 생산되므로, D-프시코오스에 의한 유도 효소인 것이 밝혀졌고, D-프시코오스 농도가 0.2%일 때 가장 높은 활성을 나타낸다.

2. 배지의 효소 활성에 대한 영향

3종의 상이한 배지(최소 무기염(MSM) 배지, TSB 배지, 및 효모 엑기스(YE) 배지)에서 30℃에서 16시간 배양하고, 전술한 바와 동일한 방법에 의해 조효소를 얻었다. 그 결과(도 2), 효소는 가장 염가의 최소 무기염 배지에 D-프시코오스를 첨가함으로써 가장 효소 활성이 높은 것으로 밝혀졌다.

3. 금속 이온의 D-PE 활성에 대한 영향

실험 3에서 나타낸 EDTA를 포함하는 완충액에 대하여 투석한 효소액을 사용하여, 이하의 표 1에 나타내는 반응 조건 하에서 효소 활성을 측정하였다. 얻어진 결과는 도 3에 나타내었다. EDTA에 대하여 투석함으로써 활성이 소실한다는 것은, 본 효소는 금속 이온을 요구하는 것을 나타내고 있다. 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 측정한 바, MnCl₂, CoCl₂를 첨가함으로써 효소 활성이 증대하였다. 이러한 사실로부터, 본 효소는 Mn² ^＋ 또는 Co² ^＋를 요구하는 것이 확인되었다.

[표 1]

4. 온도의 D-PE 활성에 대한 영향(최적 온도)

10-80 ℃의 다양한 온도에서 반응을 행하여, 최적 온도를 구한 반응 조건은 표 2에 나타냈었다. 측정 결과를 도 4에 나타내었다. 50℃로부터 70℃까지의 온도 범위에서 최적 온도가 존재하였다.

[표 2]

5. 온도의 D-PE 활성에 대한 영향(열안정성)

열안정성에 대하여, 코발트 이온이 존재하는 경우와, 존재하지 않는 경우에 대하여 검토했다. 1mM의 코발트 이온의 존재 하에서, pH 7.0에 있어서 10-80 ℃에서 10분 열처리를 행하고, 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이와 같이 코발트 이온이 존재하는 경우에는 70℃까지 안정되며, 코발트 이온이 존재하지 않는 경우에는 60℃까지 안정되는 것이 밝혀졌다.

6. pH의 D-PE 활성에 대한 영향(최적 pH)

각종 pH에서의 효소 반응을 행하여, 최적 반응 pH를 구하였다. 각각의 pH에서 사용한 완충액은 다음에 나타낸 것이다. pH 3-6의 50mM 시트르산 완충액; pH 6.0-8.0의 50mM 인산 완충액; pH 7.0-9.0의 트리스 HCl 완충액; 및 pH 9.0-11.0의 글리신-수산화 나트륨 완충액을 사용하였다. 반응 조건은 표 3에 나타내었다. 또한, 얻어진 결과는 도 6에 나타내었다. 최적 pH는 6-10의 범위에 있는 것을 알 수 있다.

[표 3]

7. pH의 D-PE 활성에 대한 영향(pH 안정성)

효소를 각각의 pH로 4℃에서 24시간 유지하고, 잔존하는 효소 활성을 55℃에서 30분 반응시킴으로써 구하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 본 효소는 약pH 6으로부터 pH 11까지 폭넓은 pH 안정성을 나타낸다.

8. D-PE의 기질 특이성

8종류의 6탄당(케토오스)을 사용하여 정제 전의 본 효소의 기질 특이성에 대하여 검토했다. 효소 반응 조성은, 표 4에 나타낸 바와 같이 각 기질 0.2M 350μl, 효소액 350μl(트리스 완충액 pH 7.0)에서, 55℃에서 30분 반응하고 HPLC에 의한 분석에 의해 각각의 당으로부터 에피머화되고 생산된 케토오스를 측정하였다. 그 결과는 다음과 같이 되었다. D-프시코오스의 에피머화 활성을 100으로 하여 각각의 케토오스에 대한 활성을, 상대 활성으로서 나타내고 있다.

D-프룩토오스(D-fructose), D-프시코오스(D-psicose), D-소르보스(D-sorbose), D-타가토스(D-tagatose), L-프룩토오스(L-fructose), L-프시코오스(L-psicose), L-소르보스(L-sorbose), L-타가토스(L-tagatose)를 기질로 하여 활성을 상대 활성으로서 표 5에 나타내었다. D-프시코오스에 대한 활성이 가장 강하고, 다음으로, D-프룩토오스였다. 이들 기질 특이성은, 다른 유리(遊離)되는 케토오스 3 에피머라제와 비교하면, D-프시코오스 3 에피머라제(DPE)의 것이라고 할 수 있으며, 슈도모나스 치코리이의 D-타가토스 3-에피머라제(DTE)와는 분명하게 상이한 특이성을 나타낸다.

[표 4]

[표 5]

[효소의 정제와 이화학적 성질의 측정]

다음으로, 본 발명의 효소를 또한 순수한 상태로 정제하고 이화학적인 성질을 측정하였다.

[효소의 정제 시 및 정제 효소의 활성 측정 및 단백질의 측정]

효소 활성의 측정에 대해서는, 표 6에 기재된 효소 반응액 조성을 사용하여 효소 반응을 행하였다. 30℃에서 30분 효소 반응을 행하고, 이 조건 하에서 1분간에 1㎛ole의 D-프룩토오스를 생성하는 효소량을 1단위로 하였다. 반응 후, 반응액을 3분간 비등액 중에 넣음으로써 반응을 정지시키고, 탈이온 처리 후, HPLC 분석에 의해 생성된 D-프룩토오스를 측정하였다. 또한, 단백질의 측정에 대해서는, 브래드포드(Bradford)법에 의하여, 브래드포드액 250μl에 대하여 효소액 5μL를 더하여 균일하게 교반한 후에 측정하였다.

[표 6]

정제한 본 효소는, SDS-PAGE에 의한 서브 유닛의 분자량이 약 32 kDa이며, 겔 여과법에 의한 분자량이 120 kDa인 동형 사중체(homotetramer) 구조를 가지는 에피머라제인 것이 판명되었다.

[균체의 배양]

[균의 전배양]

본 균을 표 7에 나타내는 배지에 접종하여 전배양을 행하였다. 500ml의 삼각 플라스크에 배지 100ml를 넣고, 30℃·200rpm으로 12시간 진탕 배양을 행하였다.

[표 7]

[본배양]

전배양의 생육 배지 100mL를 표 8에 나타내는 본배양 10l에 접종하고, 30℃에서 통기량 2ml/min, 300rpm으로 통기 교반 배양을 24시간 행하였다.

[표 8]

[효소의 추출]

본배양 10 L로부터 생균체 230 g을 얻었다. 이것을 1 l의 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.5＋1mM MgCl₂)에 현탁하고, 고압 호모지나이저를 사용하여 균체를 파쇄하고, 효소를 추출했다. 파쇄 조건은 20000 psi에서 행하였다. 원심분리(10000rpm, 20min, 4℃)에 의해 불용물을 제거하고 조효소액 1150ml를 얻었다. 효소의 정제에는 이 조효소액 130ml를 사용하였다.

[효소의 정제]

[PEG(폴리에틸렌글리콜)에 의한 분획]

조효소액 130ml에 PEG6000을 26g 첨가하고(농도 20%), 저온에서 교반 용해하였다. 생성된 침전과 상청액을 원심분리(10000rpm, 20min, 4℃)에 의해 분리하였다. 침전은 30mL의 완충액에 용해하였다. 활성을 측정한 결과, 침전 중에는 활성은 존재하지 않았다. 그 다음에, 상청액에 PEG 26g(최종농도 40%)을 첨가하고, 마찬가지로, 생성하는 침전과 상청액으로 나누어서, 활성을 측정하였다. 그 결과 침전 중에 활성은 인정되지 않았다. 상청액에 활성이 인정되었다.

[PEG 제거 방법]

PEG 농도 40%에 있어서도 효소는 침전하지 않고, 상청액에 존재하였다. 상청액의 효소를 다음의 정제 과정으로 진행하기 위해서는, PEG를 제거할 필요가 있다. PEG는 이온 교환 수지에는 흡착하지 않는 성질을 사용하여, PEG를 제거하였다. 구체적으로는, 이온 교환 수지에 효소를 흡착시키고 PEG를 씻어내고, 그 후 흡착한 효소를 고농도의 NaCl로 수지로부터 용출함으로써 PEG를 제거하였다.

PEG 제거의 구체적 방법을 하기에 나타낸다.

완충액(10mM Tris-HCl pH 7.5＋10mM MgCl₂)로 평형화한 Q-Sepharose Fast Flow 58ml에 PEG 40%를 포함하는 효소액을 넣고, 10분간 천천히 교반함으로써 효소를 흡착시켰다. 그 수지를 컬럼(용적 약 50ml)에 충전하고, 완충액(1M NaCl＋10mM Tris-HCl pH 7.5＋10mM MgCl₂) 150ml로 용출하였다. 10ml씩 분획하고 활성이 있는 부분을 회수했다. 그것을 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.5＋10mM MgCl₂)에 대하여 하룻밤 투석함으로써 NaCl를 제거하여, PEG 분획 효소액을 얻었다.

[이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제]

PEG 분획 효소액을 이온 크로마토그래피 분리법에 따라 정제를 행하였다. 사용한 컬럼은 Q-Sepharose HighPerformance이며, AKTA 시스템을 사용하여 유속 1.5ml/min로 1M NaCl의 농도 구배(勾配)로 35%로부터 60%를 5ml씩 프랙션(fraction)으로 나누어 분획했다. 도 8에 나타내는 화살표의 프랙션에 효소 활성이 용출되었다. 그것을 회수하고 이온 교환 크로마토그래피 분리에 의한 정제 효소를 얻었다. 도 8에는 이온 교환 크로마토그래피 분리 용출도를 나타낸다. 단백질 용출의 도 8의 중앙부의 화살표로 나타낸 부분에 효소 활성이 존재하므로, 이 부분을 회수했다.

이온 교환 크로마토그래피 분리에 의해 정제한 효소를 소수 크로마토그래피 분리법에 의해 더욱 정제를 행하였다. 사용한 컬럼은 RESOURCE PHE 6ml이다. 효소액에 2M로 되도록 황산암모늄을 더하여 용해하였다. 유속 3ml/min로 2M의 황산암모늄 100%로부터 0%까지 농도를 저하하고 용출하여 5mL씩 분획했다. 도 9의 화살표로 나타낸 바와 같이 큰 피크로 효소 활성이 용출되었다. 그 획분을 투석하고 황산암모늄을 제거하여 소수 크로마토그래피 분리 정제 효소를 얻었다. 단백질 용출의 두개째의 큰 피크로 활성이 존재하였다. 도 9의 화살표는 회수한 획분을 나타내고 있다.

[정제표]

효소의 정제 과정에 대하여, 조효소, PEG 분획 효소, 이온 교환 크로마토그래피 분리 정제 효소, 소수 크로마토그래피 정제 효소의 각각의 단백질량, 효소 활성 등을 모아서 정제표로서 표 9에 나타내었다. 이 정제에 의해 수율 12%, 정제 배율 31.5배의 정제 효소를 얻었다.

[표 9]

[정제 효소의 순도]

통상적인 방법에 따라 SDS PAGE(겔 농도 15%)를 사용하여 정제 효소의 순도를 확인하였다. 도 10에 있어서는, 좌측이 표준 단백질이며, 다음의 2 레인이 소수 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후의 효소이다. 이 결과는 29∼45 kDa 사이에 단일 밴드에 의해 확인되었다. 이로써, 효소가 순수하게 정제된 것을 확인하였다.

[정제한 효소의 성질]

정제한 효소의 성질에 대하여 검토했다.

[반응 최적 pH]

도 11에 나타낸 바와 같이 pH 6∼11에 있어서 활성을 나타내고, 가장 활성이 높은 pH는 7.5였다.

측정 시에, 반응의 최적 pH에 대하여 D-프시코오스를 기질로서 사용하고, 각종 완충액 pH 4∼11을 사용하여 30℃에서 30분 반응하고, 생성된 D-프룩토오스를, HPLC를 사용하여 측정함으로써 구하였다. 반응액 조성을 표 10에, 사용한 버퍼를 표 11에 나타내었다.

[표 10]

[표 11]

[반응 최적 온도]

반응 온도와 총체 활성을 측정한 결과를 나타낸 도 12로부터, 본 효소의 최적 온도는 Mg² ^＋ 이온 첨가 시에 70℃인 것이 밝혀졌다. Mg² ^＋ 이온의 비존재의 조건에서는 최적 온도가 60℃이며, Mg² ^＋ 이온 존재하에서는 최적 온도가 현저하게 높아지고, 60℃ 내지 80℃에서 높은 활성을 나타낸다. 도 12에서는 Mg² ^＋ 이온 존재하에서 가장 높은 활성을 나타낸 70℃를 100으로 한 상대 활성으로 나타낸다. 반응 조건은 표 12에 나타낸 바와 같이 정제 효소를 pH 7.5에 있어서 각 온도에서 30분 반응하고, 생성되는 D-프룩토오스의 양을 측정하였다. Mg² ^＋ 이온을 첨가하는 경우와 첨가하지 않는 경우(MgCl₂ 대신 물을 첨가)에 대하여 검토했다. 반응은 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ℃에서 30분간 행했다.

[표 12]

[pH 안정성]

정제 효소의 pH 안정성을 검토한 결과를 도 13에 나타낸 바와 같이 pH 5∼11까지 안정되는 것이 밝혀졌다.

측정 조건은, 각 pH로 4℃·24시간 유지하고, 그 효소를 pH 7.5에 의해 반응시켰다. 잔존 활성의 측정은 pH 7.5, 30℃에서 30분 행하였다. 사용한 완충액은 최적 pH에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하였다.

도 13에서는, 시트르산 완충액 pH 6의 경우의 잔존 활성을 100으로 하고, 각각의 pH에 있어서의 잔존 활성을 상대 활성으로서 나타낸다.

[열안정성]

정제 효소의 열안정성에 대하여, Mg² ^＋ 이온의 존재하 또는 비존재의 조건에서 검토했다. Mg² ^＋ 이온이 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에는, 열안정성이 크게 변화하였고, Mg² ^＋ 이온이 효소의 열안정성을 증대시켰다. Mg² ^＋ 이온 존재하에서는 50℃·1시간으로 안정되었다. 한편, Mg² ^＋ 이온이 존재하지 않는 경우에는, 전체적으로 약 10℃ 낮은 열안정성이었다. 그리고, 최적 반응 온도가 70℃인 것과, 이 결과로부터 본 효소는 기질의 존재에 의해 안정성이 증대하는 것을 나타내고 있다. 즉 ES 복합체의 안정성이 높은 것을 나타내고 있는 것으로 여겨진다. 도 14에서는 열처리를 하지 않는 효소의 활성을 100으로 한 상대 활성으로 나타낸다.

열처리 조건으로서는, 정제 효소액 40μl, 완충액(10mM Tris-HCl pH 7.5) 160μl, 4mM MgCl₂(Mg² ^＋ 이온 비첨가의 경우에는 물) 100μl의 전체량 300μl로 하고, 이것을 각 온도에서 1시간 유지한 후 얼음 물 중 10분간 냉각 후, 잔존하는 효소 활성을 통상적인 방법에 따라 측정하였다.

[금속 이온의 영향]

효소의 금속 이온 요구성에 대하여 검토했다. 정제 효소를 1mM EDTA를 포함하는 10mM Tris-HCl pH 7.5에서 2시간 투석했다. 그 후 EDTA를 포함하지 않는 10mM Tris-HCl 완충액 pH 7.5에서 일주야 투석하여, EDTA 처리 효소를 얻었다. 이 효소를 사용하여, 각종 금속 이온 1mM를 포함하는 조건에서 D-프시코오스를 기질로 하여 그 활성에 대한 영향을 측정하였다. 그 결과를, 무첨가의 효소 활성을 100으로 하고 각 금속 이온 첨가 시의 활성을 상대 활성으로 나타내고, 표 13에 나타내었다. Mg² ^＋, Co^2＋, Mn² ^＋의 각 이온 존재하에서는, 활성이 1.3배 이상이 되고, Mg² ^＋ 이온 존재하에서 가장 높은 활성이 인정되었다. 이 결과로부터, 본 효소는 Mg² ^＋ 이온에 의해 활성화된다. 열안정성에 있어서의 Mg² ^＋ 이온의 큰 영향을 고려하면 본 효소 반응에는 Mg² ^＋ 이온이 중요한 것으로 밝혀졌다.

[표 13]

[기질 특이성]

전체 케토헥소오스에 대하여 본 효소의 반응성에 대하여 검토했다. 반응액 조성은 표 14에 나타내었다. 그 결과, D-프시코오스를 100으로 한 상대 활성으로서 표에 정리하여 나타내었다. 본 효소는 전케토헥소오스에 활성은 나타내지만, D-프시코오스에 가장 높은 활성을 나타내고, D-프시코오스 3-에피머라제인 것이 명확해졌다. 기질 특이성에 대하여는 표 15에 정리하여 나타내었다. D-sorbose, L-fructose는 70℃·120분, 그 이외는 70℃·20분의 조건에서 반응시켜 초속도(初速度)를 구하였다.

[표 14]

[표 15]

[K_m과 V_max]

본 효소의 D-프시코오스와 D-프룩토오스의 K_m 및 V_max를 측정하였다. 측정은 30℃에서 Mg² ^＋ 이온 존재하의 효소 활성 측정의 조건에서 행하였다. 그 결과 D-프시코오스에 대해서는, V_max=168 U/mg, K_m=30.1mM이며, D-프룩토오스에 대해서는, V_max=68.5 U/mg, K_m=31.5mM이었다.

[효소의 분자량]

[서브 유닛의 분자량]

SDS-PAGE(겔 농도 15%)에 의한 정제 효소의 이동 거리와 분자량 마커의 이동 거리를 측정하였다. 그 결과, 본 효소의 서브 유닛의 분자량은 대략 32 kDa인 것이 밝혀졌다.

도 15에 영동 거리와 분자량의 관계를 나타낸다. 도 15는 마커 단백질의 영동 거리 cm와 분자량 kDa의 관계를 나타내고 있다. 정제 효소의 이동 거리는 약 4.1 cm이므로, 본 효소의 서브 유닛은 약 32 kDa인 것으로 추정되었다. 그리고, 영동도는 도 10에 나타내었다.

[효소의 분자량]

겔 여과 크로마토그래피를 사용하여, 본 효소의 분자량을 측정하였다. 즉, 표준 단백질과 이동 거리의 관계도 16을 구하고, 본 효소의 이동 거리로부터 계산했다. 그 결과, 효소의 분자량은 약 120 kDa인 것이 밝혀졌다.

분자량의 측정에는, 겔 여과 크로마토그래피의 컬럼은, Superdex 200pg 16/600을 사용하였다. 사용한 러닝 버퍼 조성은 10mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl 200mM, MgCl₂ 1mM이다.

사용 표준 단백질(마커)은 이하의 5 종류를 사용하였다.

(1) Ovalbumin MW: 44,000

(2) Conalbumin 75,000

(3) Aldolase 158,000

(4) Ferritin 440,000

(5) Tyroglobulin 669,000

본 효소는 72.5ml에 용출되었으므로, 이동 거리와 분자량과의 관계로부터 계산하여, 본 효소의 분자량은 약 120 kDa인 것이 밝혀졌다. SDS-PAGE에 의한 서브 유닛의 분자량은 약 32 kDa이며, 겔 여과법을 이용한 본 효소의 분자량은 약 120 kDa이다. 이러한 사실로부터, 본 효소는 서브 유닛의 분자량이 32 kDa인 동형 사중체 구조인 것으로 여겨진다.

[다른 DPE, DTE와의 비교]

지금까지 보고되어 있는 D-타가토스 3-에피머라제 및 D-프시코오스 3-에피머라제의 성질을 표 16에 정리하여 나타내었다. 본 균주가 생산하는 효소는 다른 미생물 기원의 케토헥소오스 3-에피머라제와 비교하여, 큰 특징은 최적 온도가 높은 것이다.

[표 16]

본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, 다른 에피머라제나 이소머라제와 마찬가지로, 조효소를 필요로 하지 않는 이성화 반응이다. 따라서, 효소를 고정화하여 이용이 가능하며, 각종 고정화 방법에 의해 활성이 높은 고정화 효소를 얻을 수 있다. 고정화 효소를 사용함으로써, 연속적이며 대량의 에피머화 반응을 행할 수 있다. 공업적으로 고정화할 수 있음으로써, 목적으로 하는 케토오스를 대량으로 생산할 수 있다.

[실시예 1]

본 미생물을 D-프시코오스를 탄소원으로 하는 최소 무기염 배지에 생육시켜, 생육균체 내로부터 얻은 효소를 사용하여, D-프시코오스와 D-프룩토오스의 평형비에 대하여 검토했다. 반응액 조성은, 50mM 트리스 완충액 200μl, 0.2M D-프시코오스 또는 D-프룩토오스, 효소액 100μl, 10mM CoCl₂ 75μl를 사용하였다. 반응 온도는 50℃, 반응시간은 24시간이다. 반응 종료 후 HPLC를 사용하여 반응액 중의 D-프룩토오스와 D-프시코오스의 양을 측정하였다.

그 결과, D-프시코오스를 기질로 한 경우도, D-프룩토오스를 기질로 한 경우도 동일한 평형비에 도달했다.

평형비 D-프시코오스:D-프룩토오스=27:73

이 결과는 D-프룩토오스를 사용하여 반응하면, 그 27%가 D-프시코오스로 변환할 수 있는 것을 나타내며, D-프시코오스를 D-프룩토오스로부터 생산할 수 있는 것을 명확하게 나타내는 결과이다.

[실시예 2]

정제한 효소를 사용하여 D-프시코오스와 D-프룩토오스 사이의 에피머화의 평형에 대하여 검토했다. 그 결과, 평형 상태에서의 D-프시코오스:D-프룩토오스는, 40℃에서는 25:75, 70℃에서는 30:70이었다.

[산업상 이용가능성]

본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, 유리되는 D- 또는 L-케토오스, D- 또는 L-케토펜토스에 작용시켜, 이들 케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스, D- 또는 L-케토오스를 용이하게 생성한다. 이 반응은, 각종 케토오스, 특히 D-프룩토오스를 원료로 한 D-프시코오스의 대량생산의 길을 개척하는 것이다. 또한, 본 발명의 케토오스 3-에피머라제는, 각종 고정화 방법에 의해 활성이 높은 고정화 효소를 얻을 수 있고, 고정화 효소를 사용함으로써, 연속적으로 대량의 에피머화 반응을 행할 수 있다. 공업적으로 고정화할 수 있으므로, 목적으로 하는 케토오스를 대량으로 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명의 케토오스 3-에피머라제와 그 제조 방법의 확립은, 제당 산업뿐만 아니라, 이와 관련된 식품, 화장품, 의약품 산업에 있어서의 공업적 의의가 지극히 크다.

본 효소를 생산하는, 아스로박터 글로비포미스를 식품 산업에서 사용하는 가장 큰 특징으로서는, 균의 안전성에 있다. 이 균종은 미국에서, FDA에 의한 EAFUS에 수재되어 있다는 것은, 균체 자체의 안전성이 매우 높은 것을 증명하는 것이다. 지금까지 알려져 있는 D-프시코오스의 생산 효소로서는, 슈도모나스속, 아그로박테리움속, 리조비움속 등에 의한 것이 있지만, 이들은 미국 및 유럽의 리스트에는 수재되어 있지 않을 뿐만 아니라, 기회균으로서, 식물세포 감염 등의 보고도 있어, 안전성을 확인하기 위해서는 많은 노력이 필요한 미생물이었다. 본 발명에서 균체 자체의 안전성이 매우 높은 균을 사용할 수 있는 것은 큰 기술적 진보이다.

독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터

NITEBP-1111

20110622

Claims

아스로박터(Arthrobacter)속에 속하는 미생물로부터 얻을 수 있고, 하기 (A), 하기 (B)의 기질(基質) 특이성을 가지는 케토오스 3-에피머라제:
(A) D- 또는 L-케토오스의 3번 위치를 에피머화(epimerization)하여, 대응하는 D- 또는 L-케토오스를 생성하고,
(B) D- 또는 L-케토오스 중에서는 D-프룩토오스 및 D-프시코오스에 대한 기질 특이성이 가장 높음.
제1항에 있어서,
아스로박터속에 속하는 미생물이, 아스로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis)인, 케토오스 3-에피머라제.
제1항에 있어서,
아스로박터속에 속하는 미생물이, 아스로박터 글로비포미스 M30(수탁 번호 NITE BP-1111)인, 케토오스 3-에피머라제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
SDS-PAGE에 의한 서브 유닛의 분자량이 약 32 kDa이며, 겔 여과법에 의한 분자량이 120 kDa인, 서브 유닛의 분자량이 32 kDa인 호모테트라머 구조인, 케토오스 3-에피머라제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 이화학적 성질 (a)∼(e)를 가지는 케토오스 3-에피머라제:
(a) 최적 pH
30℃, 30분간 반응, 20mM의 마그네슘(Mg² ^＋) 존재 하의 조건에서, 6 내지 11,
(b) 최적 온도
pH 7.5, 30분간 반응, 20mM의 마그네슘(Mg² ^＋) 존재 하의 조건에서, 60 내지 80℃,
(c) pH 안정성
4℃, 24시간 유지의 조건 하에서, 적어도 pH 5 내지 11의 범위에서 안정,
(d) 열안정성
pH 7.5, 1시간 유지, 4mM의 마그네슘 이온(Mg² ^＋)의 존재 하의 조건에서, 약 50℃ 이하에서 안정되고, 마그네슘 이온(Mg² ^＋) 비존재의 조건에서, 약 40℃ 이하에서 안정되고,
(e) 금속 이온에 의한 활성화
2가 망간 이온(Mn² ^＋), 2가 코발트 이온(Co² ^＋), 칼슘(Ca² ^＋) 및 마그네슘 이온(Mg² ^＋)에 의해 활성화됨.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 기질 특이성 1.∼8.을 가지는 케토오스 3-에피머라제:
1. D-프룩토오스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 43.8%,
2. D-프시코오스를 기질로 했을 때의 활성이 100%,
3. D-소르보스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 1.13%,
4. D-타가토스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 18.3%,
5. L-프룩토오스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 0.97%,
6. L-프시코오스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 21.2%,
7. L-소르보스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 16.6%,
8. L-타가토스를 기질로 했을 때의 상대 활성이 44.0%,
단, D-프시코오스의 에피머화 활성을 100으로 하여 각각의 케토오스에 대한 활성을 상대 활성으로서 나타내고 있음.
D- 또는 L-케토오스로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 케토오스 3-에피머라제를 작용시켜, 상기 케토오스의 3번 위치를 에피머화하는, 케토오스의 변환 방법.
D- 또는 L-케토오스로부터 선택되는 1종 이상을 함유하는 용액에, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 케토오스 3-에피머라제를 작용시켜 상기 케토오스의 3번 위치를 에피머화하여, 대응하는 케토오스를 생성하게 하고, 이것을 채취하는, 케토오스의 제조 방법.