JPWO2013005800A1 - アルスロバクターグロビホルミスの生産する酵素 - Google Patents
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Abstract
課題：食品産業で用いることができる安全性の高いエピメラーゼおよびケトースの製造方法の提供。
解決手段：アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることができ、下記の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ：
（１）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（２）Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
解決手段：アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることができ、下記の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ：
（１）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（２）Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
Description
本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物が生産する酵素（ケトース３−エピメラーゼ）、ならびに、その酵素を用いるケトースの製造方法に関し、詳細には、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、好ましくはアルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）から得ることができ、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ、さらにはその酵素を用いたケトースの製造方法に関するものである。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトース中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトース中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
Ｄ−プシコースは、Ｄ−フルクトースのエピマーであって、甘味の強度および種類の面において、Ｄ−フルクトースに極めて類似している。しかし、Ｄ−プシコースは、Ｄ−フルクトースと異なり、体内吸収時にほとんど代謝されず、熱量寄与が低い。特許文献１には、Ｄ−プシコースが低カロリー甘味料として、低カロリー飲食品の製造に有利に利用できることが記載されている。すなわち、Ｄ−プシコースは、ダイエット食品の有効成分として用いることができる。非砂糖甘味料として広く利用されている糖アルコール類は、規定量を超えて摂取すると下痢などの副作用を起こすが、Ｄ−プシコースは、そのような副作用が少ない。さらに、Ｄ−プシコースは、人体内でほとんど代謝されないため、熱量値はほぼゼロに近く、脂質合成酵素の活性を抑制することで腹部脂肪を減少させる機能を有している。そのため、Ｄ−プシコースは、体重減少に有益な甘味料としても使用することができる（たとえば、非特許文献１および２参照）。また、特許文献２には、Ｄ−プシコースが血糖上昇抑制作用を有していることから、健康食品、糖尿病患者用飲食品、痩身用飲食品などに有利に利用できることが記載されている。このような観点から、Ｄ−プシコースは、健康食品、ダイエット甘味料として多くの関心を集めており、食品産業において、Ｄ−プシコースの効率的で安全な生成方法の開発に対する必要性が高まっている。
一方、非特許文献３にはシュードモナス チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）ＳＴ−２４由来のＤ−ケトース３−エピメラーゼが開示されており、この酵素を利用することによりＤ−フラクトースからＤ−プシコースが製造できることが記載されている。しかしながら、この酵素は別名Ｄ−タガトース３−エピメラーゼとも呼ばれるように、Ｄ−タガトースへの特異性が最も高く、Ｄ−フラクトースへの作用は比較的弱いことが知られている。また、シュードモナス チコリは植物病原性微生物であり、Ｄ−ケトース３−エピメラーゼ産生能が非常に低いため、工業的に利用する上で適しているとは言えない。シュードモナス属に属する微生物とは異なるケトース３−エピメラーゼ産生能が高く食品生産に安全性に問題のない微生物、およびＤ−フラクトースへの特異性が高く、Ｄ−プシコースの製造に適した新規ケトース３−エピメラーゼが求められている。
そこで、特許文献３には、新規なケトース３−エピメラーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡおよび形質転換体、ならびに当該酵素を用いたケトースの製造方法を提供することを課題とし、リゾビウム属に属する微生物から得ることのできるケトース３−エピメラーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡおよび形質転換体、ならびに該酵素を利用して、Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを製造する方法を提供することにより上記課題を解決している。また、特許文献４にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＤ−プシコースエピメラーゼ（以下、プシコース３−エピメラーゼという）を用いるＤ−プシコースの生成方法が開発されている。
以上のとおり、上記のような問題に対処するために、Ｄ−フルクトースを基質として用いて、Ｄ−プシコースを酵素的に生成する方法について研究が行なわれている。しかし、現在までに開発された方法は、食品としてのＤ−プシコースの生産に利用するには安全性の点で問題点が多い。
以上のとおり、上記のような問題に対処するために、Ｄ−フルクトースを基質として用いて、Ｄ−プシコースを酵素的に生成する方法について研究が行なわれている。しかし、現在までに開発された方法は、食品としてのＤ−プシコースの生産に利用するには安全性の点で問題点が多い。
Matsuo,T.,Y.Baba,M.Hashiguchi,K.Takeshita,K.Izumori and H.Suzuki,Asia Pac. J.Clin. Nutr., 10:233-237(2001)
Matsuo,T.and K.Izumori,Asia Pac.J.Clin. Nutr., 13:S127(2004)
Ken Izumoriら、Biosci. Biotech. Biochem.,57,1037-1039(1993)
本発明は、食品を製造する際に使用が認められる既存添加物名簿収載リストに収載されている菌種であって毒性がほとんどないとされる菌種から、高い収率でＤ−フラクトースからＤ−プシコースへの異性化を触媒する新規なケトース３−エピメラーゼを取得すること、ならびに、その酵素を用いたケトースの製造方法を提供することを課題とする。
本発明者等は、機会ある毎に各地の土壌を採取し、それから微生物を分離し、ケトース３−エピメラーゼ産生能を有するシュードモナス属に属する微生物以外の微生物の探索を続けてきた。上述した日本の既存添加物名簿収載リスト以外にもヨーロッパおよびアメリカにおいて食品として使用が認められるリストに載っている菌種で毒性がほとんどないとされる菌種に着目して、鋭意探索を続けてきた。
その結果、数多く単離した菌株の中に新規なケトース３−エピメラーゼを産生するアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を見出した。また、当該微生物由来の新規なケトース３−エピメラーゼは、ＤまたはＬ−ケトースの３位に作用し、対応するＤ−またはＬ−ケトースへのエピマー化を触媒する幅広い基質特異性を有しており、意外にも、Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高く、Ｄ−フラクトースからのＤ−プシコースの製造に適していることを見出した。そして、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物より得ることのできる新規ケトース３−エピメラーゼとその製造方法を確立するとともに、該酵素を利用したケトースの変換方法ならびにケトースの製造方法を確立して本発明を完成した。
その結果、数多く単離した菌株の中に新規なケトース３−エピメラーゼを産生するアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を見出した。また、当該微生物由来の新規なケトース３−エピメラーゼは、ＤまたはＬ−ケトースの３位に作用し、対応するＤ−またはＬ−ケトースへのエピマー化を触媒する幅広い基質特異性を有しており、意外にも、Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高く、Ｄ−フラクトースからのＤ−プシコースの製造に適していることを見出した。そして、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物より得ることのできる新規ケトース３−エピメラーゼとその製造方法を確立するとともに、該酵素を利用したケトースの変換方法ならびにケトースの製造方法を確立して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることのできるケトース３−エピメラーゼの提供、ならびに、その酵素を利用して、Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを製造する方法を提供すること、を目的とする。
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物は、新規なケトース３−エピメラーゼ産生能が比較的高く、シュードモナス チコリとは異なり植物病原性も有していない。また、当該微生物から得ることのできる本発明のケトース３−エピメラーゼは、とりわけＤ−プシコースおよびＤ−フラクトース間の相互変換を良く触媒することから、Ｄ−フラクトースからのＤ−プシコースの製造に有用である。
本発明は、下記（１）ないし（６）に記載されたケトース３−エピメラーゼを要旨とする。
（１）アルスロバクター属に属する微生物から得ることができ、下記（Ａ）、（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
（２）アルスロバクター属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミスである上記（１）記載のケトース３−エピメラーゼ。
（３）アルスロバクター属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミス Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）である上記（１）記載のケトース３−エピメラーゼ。
（１）アルスロバクター属に属する微生物から得ることができ、下記（Ａ）、（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。
（２）アルスロバクター属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミスである上記（１）記載のケトース３−エピメラーゼ。
（３）アルスロバクター属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミス Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）である上記（１）記載のケトース３−エピメラーゼ。
（４）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法による分子量が１２０ｋＤａである、サブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造である上記（１）から（３）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
（５）下記の理化学的性質（ａ）〜（ｅ）を有する上記（１）から（４）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
（ａ）至適ｐＨ
３０℃、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６ないし１１。
（ｂ）至適温度
ｐＨ７．５、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６０ないし８０℃。
（ｃ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、少なくともｐＨ５ないし１１の範囲で安定。
（ｄ）熱安定性
ｐＨ７．５、１時間保持、４ｍＭのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下の条件で、約５０℃以下で安定。マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の非存在下の条件で、約４０℃以下で安定。
（ｅ）金属イオンによる活性化
二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）により活性化される。
（６）下記の基質特異性１．〜８．を有する上記（１）から（５）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
記
１．D-フルクトースを基質としたときの相対活性が４３．８％、
２．D-プシコースを基質としたときの活性が１００％、
３．D-ソルボースを基質としたときの相対活性が１．１３％、
４．D-タガトースを基質としたときの相対活性が１８．３％、
５．L-フルクトースを基質としたときの相対活性が０．９７％、
６．L-プシコースを基質としたときの相対活性が２１．２％、
７．L-ソルボースを基質としたときの相対活性が１６．６％、
８. L-タガトースを基質としたときの相対活性が４４．０％。
ただし、Ｄ−プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を相対活性として示している。
（５）下記の理化学的性質（ａ）〜（ｅ）を有する上記（１）から（４）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
（ａ）至適ｐＨ
３０℃、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６ないし１１。
（ｂ）至適温度
ｐＨ７．５、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６０ないし８０℃。
（ｃ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、少なくともｐＨ５ないし１１の範囲で安定。
（ｄ）熱安定性
ｐＨ７．５、１時間保持、４ｍＭのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下の条件で、約５０℃以下で安定。マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の非存在下の条件で、約４０℃以下で安定。
（ｅ）金属イオンによる活性化
二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）により活性化される。
（６）下記の基質特異性１．〜８．を有する上記（１）から（５）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
記
１．D-フルクトースを基質としたときの相対活性が４３．８％、
２．D-プシコースを基質としたときの活性が１００％、
３．D-ソルボースを基質としたときの相対活性が１．１３％、
４．D-タガトースを基質としたときの相対活性が１８．３％、
５．L-フルクトースを基質としたときの相対活性が０．９７％、
６．L-プシコースを基質としたときの相対活性が２１．２％、
７．L-ソルボースを基質としたときの相対活性が１６．６％、
８. L-タガトースを基質としたときの相対活性が４４．０％。
ただし、Ｄ−プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を相対活性として示している。
また、本発明は、下記（７）に記載されたケトースの変換方法、ならびに、下記（８）に記載されたケトースの製造方法を要旨とする。
（７）Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上のケトースを含有する溶液に、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを作用させて、該ケトースの３位をエピマー化することを特徴とするケトースの変換方法。
（８）Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上のケトースを含有する溶液に、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを作用させて該ケトースの３位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
（７）Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上のケトースを含有する溶液に、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを作用させて、該ケトースの３位をエピマー化することを特徴とするケトースの変換方法。
（８）Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上のケトースを含有する溶液に、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを作用させて該ケトースの３位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
本発明は以下の効果を奏する。
１．アルスロバクター グロビホルミス由来の本酵素を食品産業で用いる最も大きな特長としては菌の安全性にある。
２．Ｄ−プシコース生産菌の最適なｐＨは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）は７〜９、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は９〜９．５、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は７〜８である。一方で、本菌株による酵素の最適ｐＨは６〜８の間にあり、着色の少ない７以下のｐＨにおいてもＤ−プシコース生産は可能である。
３．３０分間の酵素活性を測定した結果からは、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）はＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）はＣｏ２＋、Ｍｎ２＋で活性が増加することが報告されている。本酵素の場合は、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋によって活性増加が認められる。また、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋によっても活性が増加する。
４．従来の酵素と比較して幅広い温度帯での反応が可能である。
５．Ｌ−タガトースからＬ−ソルボースへの反応活性が大きい。
６．培地に添加するＤ−プシコースが０．１５％と少なくても活性のある菌体が得られる。
７．水でも酵素活性があり、フルクトースからプシコースへの反応が進行する。
８．シュードモナス チコリよりも増殖速度が大きい。
１．アルスロバクター グロビホルミス由来の本酵素を食品産業で用いる最も大きな特長としては菌の安全性にある。
２．Ｄ−プシコース生産菌の最適なｐＨは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）は７〜９、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は９〜９．５、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は７〜８である。一方で、本菌株による酵素の最適ｐＨは６〜８の間にあり、着色の少ない７以下のｐＨにおいてもＤ−プシコース生産は可能である。
３．３０分間の酵素活性を測定した結果からは、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）はＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）はＣｏ２＋、Ｍｎ２＋で活性が増加することが報告されている。本酵素の場合は、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋によって活性増加が認められる。また、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋によっても活性が増加する。
４．従来の酵素と比較して幅広い温度帯での反応が可能である。
５．Ｌ−タガトースからＬ−ソルボースへの反応活性が大きい。
６．培地に添加するＤ−プシコースが０．１５％と少なくても活性のある菌体が得られる。
７．水でも酵素活性があり、フルクトースからプシコースへの反応が進行する。
８．シュードモナス チコリよりも増殖速度が大きい。
本発明により、食品を製造する際に使用が認められる既存添加物名簿収載リストに収載されている菌種であって毒性がほとんどないとされる菌種から、高い収率でＤ−フラクトースからＤ−プシコースへの異性化を触媒する新規なケトース３−エピメラーゼを取得することができる。さらに、その酵素を用いたケトースの製造方法を提供することができる。
すなわち、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることのできるケトース３−エピメラーゼの提供、ならびに、その酵素を利用して、Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを製造する方法を提供することができる。当該微生物から得ることのできる本発明のケトース３−エピメラーゼは、とりわけＤ−プシコースおよびＤ−フラクトース間の相互変換を良く触媒することから、Ｄ−フラクトースからのＤ−プシコースの製造に有用である。
すなわち、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることのできるケトース３−エピメラーゼの提供、ならびに、その酵素を利用して、Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを製造する方法を提供することができる。当該微生物から得ることのできる本発明のケトース３−エピメラーゼは、とりわけＤ−プシコースおよびＤ−フラクトース間の相互変換を良く触媒することから、Ｄ−フラクトースからのＤ−プシコースの製造に有用である。
本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることができ、下記の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼに関すものであり、食品工業で使用できる菌の安全性、低い最適ｐＨ、熱安定性および金属要求性において特徴的なものである。
［安全性］
本酵素、アルスロバクター・グロビフォルミスを食品産業で用いる最も大きな特長としては、菌の安全性にある。この菌種はまずアメリカにおいて、ＦＤＡによるＥＡＦＵＳ（Everything Added to Food in the United States）：A Food Additive Databaseに“Glucose isomerase from immobilized arthrobacter globiformis”として収載されている。この使用法は、菌体をそのまま固定化するもので、菌体自体の安全性が非常に高いことを証明するものである。
また欧州においては、ＥＦＦＣＡ(The European food & feed cultures association)とIFD（International Federation for the Roofing Trade）による“Inventory of Microorganisms with a documented history of use in food”において“Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness”として使用されている旨が記載されている。これは、酵母等と同様に、この菌種は発酵に使われていることを示すもので、極めて安全性が高いことを示す。日本においては、アルスロバクター属は“α-アミラーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、グルカナーゼ、α-グルコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ”などの酵素基原微生物として、また、トレハロースやビタミンK（メナキノン）生産菌として食品添加物リストに収載されている。
このように日米欧において長い使用実績があるにも関わらず、この菌種によるエピメラーゼ酵素が見出されてこなかったことは驚くべきことである。
本酵素、アルスロバクター・グロビフォルミスを食品産業で用いる最も大きな特長としては、菌の安全性にある。この菌種はまずアメリカにおいて、ＦＤＡによるＥＡＦＵＳ（Everything Added to Food in the United States）：A Food Additive Databaseに“Glucose isomerase from immobilized arthrobacter globiformis”として収載されている。この使用法は、菌体をそのまま固定化するもので、菌体自体の安全性が非常に高いことを証明するものである。
また欧州においては、ＥＦＦＣＡ(The European food & feed cultures association)とIFD（International Federation for the Roofing Trade）による“Inventory of Microorganisms with a documented history of use in food”において“Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness”として使用されている旨が記載されている。これは、酵母等と同様に、この菌種は発酵に使われていることを示すもので、極めて安全性が高いことを示す。日本においては、アルスロバクター属は“α-アミラーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、グルカナーゼ、α-グルコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ”などの酵素基原微生物として、また、トレハロースやビタミンK（メナキノン）生産菌として食品添加物リストに収載されている。
このように日米欧において長い使用実績があるにも関わらず、この菌種によるエピメラーゼ酵素が見出されてこなかったことは驚くべきことである。
一方で、これまで知られているＤ−プシコースの生産酵素としては、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などによるものがある。これらは上記米欧のリストには収載されていない、日和見菌としてや、植物細胞感染などの報告もある。
また、糖質酵素の代表的なものであるグルコースイソメラーゼによるぶどう糖から果糖の生産には多くの菌株が報告され（６０種以上）ているが、実用化されたものは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）, バシルス属（Bacillus）, アクチノプラーネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）, アルスロバクター属など少数の属での利用がなされているに過ぎない。このように、アルスロバクター属は食実績のある安全性の高い菌種である。
また、糖質酵素の代表的なものであるグルコースイソメラーゼによるぶどう糖から果糖の生産には多くの菌株が報告され（６０種以上）ているが、実用化されたものは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）, バシルス属（Bacillus）, アクチノプラーネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）, アルスロバクター属など少数の属での利用がなされているに過ぎない。このように、アルスロバクター属は食実績のある安全性の高い菌種である。
［至適ｐＨおよび金属要求性］
さらに、本発明の特長としては以下の事項にある。
Ｄ−プシコース生産菌の最適なｐＨは、シュードモナス属は７〜９、リゾビウム属は９〜９．５、アグロバクテリウム属は７〜８である。一方で、本菌株による酵素の最適ｐＨは６−８の間にあり、着色の少ない７以下のｐＨにおいてもＤ−プシコース生産は可能である。
また、３０分間の酵素活性を測定した結果からは、リゾビウム属はＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、アグロバクテリウム属はＣｏ２＋、Ｍｎ２＋で活性が増加することが報告されている。本酵素の場合は、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋によって活性増加が認められる。また、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋によっても活性が増加することから、Ｍｇ２＋などを用いた本菌株によるＤ−プシコース生産が可能である。
さらに、本発明の特長としては以下の事項にある。
Ｄ−プシコース生産菌の最適なｐＨは、シュードモナス属は７〜９、リゾビウム属は９〜９．５、アグロバクテリウム属は７〜８である。一方で、本菌株による酵素の最適ｐＨは６−８の間にあり、着色の少ない７以下のｐＨにおいてもＤ−プシコース生産は可能である。
また、３０分間の酵素活性を測定した結果からは、リゾビウム属はＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、アグロバクテリウム属はＣｏ２＋、Ｍｎ２＋で活性が増加することが報告されている。本酵素の場合は、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋によって活性増加が認められる。また、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋によっても活性が増加することから、Ｍｇ２＋などを用いた本菌株によるＤ−プシコース生産が可能である。
［菌株の由来および同定］
本発明者等は数多く単離した菌株の中に新規なケトース３−エピメラーゼを産生する微生物Ｍ３０株を見出し、Ｍ３０株は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性に基づく系統解析により、アルスロバクター グロビホルミスに属することが判明した。
菌株の同定
（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を解析し塩基数７３４を特定した。
（２）相同性検索
この菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数７３４の塩基配列に対し相同性９７％以上であった菌株名と相同性（％）の値からＭ３０株の微生物は、アルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）であることが決定された。
本発明のケトース３−エピメラーゼ活性を有する菌株であるアルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０は２０１１年６月２２日付で千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し、まず受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１１１１として受領され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１１１として寄託された。
本発明者等は数多く単離した菌株の中に新規なケトース３−エピメラーゼを産生する微生物Ｍ３０株を見出し、Ｍ３０株は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性に基づく系統解析により、アルスロバクター グロビホルミスに属することが判明した。
菌株の同定
（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を解析し塩基数７３４を特定した。
（２）相同性検索
この菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数７３４の塩基配列に対し相同性９７％以上であった菌株名と相同性（％）の値からＭ３０株の微生物は、アルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）であることが決定された。
本発明のケトース３−エピメラーゼ活性を有する菌株であるアルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０は２０１１年６月２２日付で千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し、まず受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−１１１１として受領され、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１１１として寄託された。
本発明でいうケトースとは、ケトース構造を有する六炭糖であり、具体的にはフラクトース、プシコース、タガトースおよびソルボースを意味し、Ｄ−またはＬ−ケトースはこれらのＤ−体およびＬ−体を意味する。
本発明のケトース３−エピメラーゼは、Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する活性を有し、Ｄ−またはＬ−フラクトースとＤ−またはＬ−プシコース間の相互変換、および、Ｄ−またはＬ−タガトースとＤ−またはＬ−ソルボース間の相互変換を触媒する。本発明のケトース３−エピメラーゼは、Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い酵素である。本発明の酵素は後述するアルスロバクター属に属する微生物から得ることができる。
本発明のケトース３−エピメラーゼは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、ケトース３−エピメラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生育した菌体中からケトース３−エピメラーゼを採取することにより調製することができる。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては、例えば、アルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）株およびこれらの変異株などが有利に利用できる。Ｍ３０株はケトース３−エピメラーゼの産生能が比較的高く、本発明の酵素を得る上で好適である。Ｍ３０株は、このたび国際出願をするに際し、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市東かずさ鎌足２−５−８）に２０１１年６月２２日原寄託されたＮＩＴＥ Ｐ−１１１１からブタペスト条約に基づく寄託への移管を２０１２年５月２日に請求し、受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１して国際寄託された。
［精製前の本酵素の理化学的性質］
精製前の酵素、ケトース３−エピメラーゼの活性は、Ｄ−フラクトースを基質とし、Ｄ−プシコースの生成量を測定することにより測定することができる。具体的には、酵素反応液組成は、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０) ２００ ｍｌ, ０．２Ｍ Ｄ−フラクトース３７５μl、酵素液１００μｌ、１０ｍＭ 塩化マンガン７５μｌを用い、５５℃３０分間反応し、２分間ボイルすることで反応を止めHPLCによって反応後の液組成を測定する。酵素活性１単位は、上記条件下において、Ｄ−フラクトースをエピマー化し１分間に１μｍｏｌのＤ−プシコースを生成する酵素量と定義する。逆反応であるＤ−プシコースからＤ−フラクトースへエピ化する酵素単位についても同様の条件で測定し同様に定義する。
本発明のケトース３−エピメラーゼは、下記の理化学的性質を有している場合がある。
（ａ）至適ｐＨ
５５℃、３０分間反応、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、６．０ないし１０。
（ｂ）至適温度
ｐＨ７．０、３０分間反応、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、約５０℃ないし約７０℃。
（ｃ）ｐＨ安定性
４℃、２４分間保持、少なくともｐＨ５．５ないし１１の範囲で安定。
（ｄ）熱安定性
ｐＨ７．０、1０分間保持、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、約７０℃以下で安定、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）非存在下の条件下で約６０℃以下で安定。
（ｅ）金属イオンによる活性化
二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）または二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）により活性化される。
精製前の酵素、ケトース３−エピメラーゼの活性は、Ｄ−フラクトースを基質とし、Ｄ−プシコースの生成量を測定することにより測定することができる。具体的には、酵素反応液組成は、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０) ２００ ｍｌ, ０．２Ｍ Ｄ−フラクトース３７５μl、酵素液１００μｌ、１０ｍＭ 塩化マンガン７５μｌを用い、５５℃３０分間反応し、２分間ボイルすることで反応を止めHPLCによって反応後の液組成を測定する。酵素活性１単位は、上記条件下において、Ｄ−フラクトースをエピマー化し１分間に１μｍｏｌのＤ−プシコースを生成する酵素量と定義する。逆反応であるＤ−プシコースからＤ−フラクトースへエピ化する酵素単位についても同様の条件で測定し同様に定義する。
本発明のケトース３−エピメラーゼは、下記の理化学的性質を有している場合がある。
（ａ）至適ｐＨ
５５℃、３０分間反応、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、６．０ないし１０。
（ｂ）至適温度
ｐＨ７．０、３０分間反応、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、約５０℃ないし約７０℃。
（ｃ）ｐＨ安定性
４℃、２４分間保持、少なくともｐＨ５．５ないし１１の範囲で安定。
（ｄ）熱安定性
ｐＨ７．０、1０分間保持、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、約７０℃以下で安定、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）非存在下の条件下で約６０℃以下で安定。
（ｅ）金属イオンによる活性化
二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）または二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）により活性化される。
ケトースの変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は１ないし６０％（ｗ／ｖ）、望ましくは、約５ないし５０％（ｗ／ｖ）、反応温度は１０ないし７０℃、望ましくは、約３０ないし６０℃、反応ｐＨは５ないし１０、望ましくは、約７ないし１０、酵素活性は基質１グラム当り１単位以上、望ましくは、５０ないし５，０００単位の範囲から選ばれる。反応時間は、適宜選択できるが、経済性との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５ないし５０時間の範囲が選ばれる。
このようにして変換させて得られる反応溶液は、原料のケトースと新たに生成したケトースとを含有しており、これをそのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止剤、照り付与剤などとして利用することも有利に実施できる。通常、反応溶液は、常法に従い、活性炭を用いて脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン変換樹脂を用いて脱塩、濃縮してシラップ状製品を得る。
必要ならば、更に、この濃縮液を、例えば、アルカリ金属型またはアルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、新たに生成したケトースと原料ケトースとを分離精製し、新たに生成したケトース高含有画分を濃縮し、シラップ状製品を得ることも、更に、結晶化しうるケトースの場合には、晶出させて、結晶製品を得ることも有利に実施できる。また、この分離された原料のケトースを、再度、変換反応の原料に用いることも有利に実施できる。
このようにして得られたケトースは、甘味料として好適であり、飲食物、飼料、餌料、歯みがき、口中香錠、舌下錠、内服薬など経口摂取物の甘味付け、嗜好性向上などに有利に利用できる。また、発酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原料、中間体などとしても有利に利用できる。
以下、実験により本発明を詳細に説明する。なお、以下の実験においてはＤ−プシコースをＤ−フラクトースに変換するＤ−プシコース３−エピメラーゼ活性を前述した活性測定法により測定し、ケトース３−エピメラーゼ活性と表記した。
＜実験１：アルスロバクター グロビホルミス Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）株の培養＞
Ｄ−プシコース０．２％を炭素源とし硫安を窒素源とする無機塩培地に、アルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）株の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら３０℃で１６時間培養した。得られた培養液中のケトース３−エピメラーゼ活性は約１４単位／１００ｍｌ培養液であった。
Ｄ−プシコース０．２％を炭素源とし硫安を窒素源とする無機塩培地に、アルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）株の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら３０℃で１６時間培養した。得られた培養液中のケトース３−エピメラーゼ活性は約１４単位／１００ｍｌ培養液であった。
＜実験２：アルスロバクター グロビホルミス Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）株の培養の培養と粗酵素の抽出＞
遠心分離により培養液から菌体を回収した。回収した菌体は１ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０)を用いて、洗浄した。次いで、菌体を１０ｍｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(株式会社SONICS&MATERIALS)で細胞破砕した。破砕物を１２０００ｒｐｍで２０分遠心し、その遠心上清を粗酵素とした。
遠心分離により培養液から菌体を回収した。回収した菌体は１ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０)を用いて、洗浄した。次いで、菌体を１０ｍｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(株式会社SONICS&MATERIALS)で細胞破砕した。破砕物を１２０００ｒｐｍで２０分遠心し、その遠心上清を粗酵素とした。
＜実験３：粗酵素の透析＞
Cellulose Ester Dialysis Membrane(SPECTRUM Laboratory社)に粗酵素をいれ、メンブレン全体を２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ緩衝液に１２時間浸して透析した。メンブレンを１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ(ｐＨ ７．０)緩衝液で２回洗浄した後、メンブレンから粗酵素液を取り出した。
Cellulose Ester Dialysis Membrane(SPECTRUM Laboratory社)に粗酵素をいれ、メンブレン全体を２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ緩衝液に１２時間浸して透析した。メンブレンを１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ(ｐＨ ７．０)緩衝液で２回洗浄した後、メンブレンから粗酵素液を取り出した。
＜実験４：酵素活性の検出＞
下記の反応条件により、それぞれ反応させた後、煮沸により反応を停止した。反応液をイオン交換樹脂により脱塩し、フィルター処理してＨＰＬＣサンプルを調製した。サンプルは、ＨＰＬＣシステム（東ソー）においてＣＫ０８ＥＣ（三菱化学）を用いてクロマト分析した。クロマトグラムのピーク面積値から、生成した各種糖を算出した。
下記の反応条件により、それぞれ反応させた後、煮沸により反応を停止した。反応液をイオン交換樹脂により脱塩し、フィルター処理してＨＰＬＣサンプルを調製した。サンプルは、ＨＰＬＣシステム（東ソー）においてＣＫ０８ＥＣ（三菱化学）を用いてクロマト分析した。クロマトグラムのピーク面積値から、生成した各種糖を算出した。
＜試験結果＞
＜実験５：ケトース３−エピメラーゼの性質＞
１．炭素源とその濃度の活性への影響
０．０５−１％のＤ−プシコース（Ｄ−ｐ）、１％のＤ−フラクトース（Ｄ−ｆ）、１％のＤ−タガトース（Ｄ−ｔ）、０．１％フラクトース（Ｄ−ｆ）および０．１％Ｄ−プシコース（Ｄ−ｐ）、１％Ｄ−プシコース（Ｄ−ｐ）および０．１％Ｄ−タガトース（Ｄ−ｔ）を含むＭＳＭ培地でアルスロバクター グロビホルミス Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）株を培養し、上記と同様の操作で得た粗酵素の各活性を調べた。
＜実験５：ケトース３−エピメラーゼの性質＞
１．炭素源とその濃度の活性への影響
０．０５−１％のＤ−プシコース（Ｄ−ｐ）、１％のＤ−フラクトース（Ｄ−ｆ）、１％のＤ−タガトース（Ｄ−ｔ）、０．１％フラクトース（Ｄ−ｆ）および０．１％Ｄ−プシコース（Ｄ−ｐ）、１％Ｄ−プシコース（Ｄ−ｐ）および０．１％Ｄ−タガトース（Ｄ−ｔ）を含むＭＳＭ培地でアルスロバクター グロビホルミス Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）株を培養し、上記と同様の操作で得た粗酵素の各活性を調べた。
その結果（図１）、本菌の酵素はＤ−プシコースが存在する時に生産されることから、Ｄ−プシコースによる誘導酵素であることがあきらかとなり、Ｄ−プシコース濃度が０．２％のときに最も高い活性を示した。
２. 培地の酵素活性への影響
３種の異なる培地（最少無機塩(ＭＳＭ)培地, ＴＳＢ培地, および酵母エキス(ＹＥ)培地) で ３０℃で１６時間培養し、上記と同様の方法で粗酵素を得た。
その結果（図２）、酵素は最も安価な最少無機塩培地にＤ−プシコースを添加することで一番酵素活性が高いことが明らかになった。
３種の異なる培地（最少無機塩(ＭＳＭ)培地, ＴＳＢ培地, および酵母エキス(ＹＥ)培地) で ３０℃で１６時間培養し、上記と同様の方法で粗酵素を得た。
その結果（図２）、酵素は最も安価な最少無機塩培地にＤ−プシコースを添加することで一番酵素活性が高いことが明らかになった。
３． 金属イオンの D-PE 活性への影響
実験３で示したEDTAを含む緩衝液に対して透析した酵素液を用い、以下の表１に示す反応条件下で酵素活性を測定した。得られた結果は図３に示す。
ＥＤＴＡに対して透析することで活性が消失するということは、本酵素は金属イオンを要求することを示している。酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を測定したところ、ＭｎＣｌ２，ＣｏＣｌ２を添加することで酵素活性が増大した。このことから、本酵素はＭｎ２＋またはＣｏ２＋を要求することが確認された。
実験３で示したEDTAを含む緩衝液に対して透析した酵素液を用い、以下の表１に示す反応条件下で酵素活性を測定した。得られた結果は図３に示す。
ＥＤＴＡに対して透析することで活性が消失するということは、本酵素は金属イオンを要求することを示している。酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を測定したところ、ＭｎＣｌ２，ＣｏＣｌ２を添加することで酵素活性が増大した。このことから、本酵素はＭｎ２＋またはＣｏ２＋を要求することが確認された。
４． 温度の D-PE 活性への影響（至適温度）
１０−８０℃の様々な温度での反応を行い。至適温度を求めた反応条件は表２に示す。測定結果を図４に示す。５０℃から７０℃の温度範囲に至適温度が存在した。
１０−８０℃の様々な温度での反応を行い。至適温度を求めた反応条件は表２に示す。測定結果を図４に示す。５０℃から７０℃の温度範囲に至適温度が存在した。
５． 温度の D-PE 活性への影響（熱安定性）
熱安定性について、コバルトイオンの存在する場合と、存在しない場合について検討した。１ｍＭのコバルトイオンの存在下で、ｐＨ７．０において１０−８０℃で１０分熱処理を行い、残存活性を測定した。その結果を図５に示す。このようにコバルトイオンが存在する場合は７０℃まで安定であり、コバルトイオンが存在しない場合は６０℃まで安定であることが明らかとなった。
熱安定性について、コバルトイオンの存在する場合と、存在しない場合について検討した。１ｍＭのコバルトイオンの存在下で、ｐＨ７．０において１０−８０℃で１０分熱処理を行い、残存活性を測定した。その結果を図５に示す。このようにコバルトイオンが存在する場合は７０℃まで安定であり、コバルトイオンが存在しない場合は６０℃まで安定であることが明らかとなった。
6. ｐＨの D-PE 活性への影響(最適ｐＨ)
各種ｐＨでの酵素反応を行い、至適反応 ｐＨ を求めた。それぞれのｐＨで用いた緩衝液は次に示すものである。ｐＨ３−６の５０ｍＭクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０−８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液；ｐＨ７．０−９．０のトリス-ＨＣｌ緩衝液；およびｐＨ９．０−１１．０のグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。反応条件は表３に示す。得られた結果は図６に示す。最適ｐＨは６−１０の範囲であることがわかった。
各種ｐＨでの酵素反応を行い、至適反応 ｐＨ を求めた。それぞれのｐＨで用いた緩衝液は次に示すものである。ｐＨ３−６の５０ｍＭクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０−８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液；ｐＨ７．０−９．０のトリス-ＨＣｌ緩衝液；およびｐＨ９．０−１１．０のグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。反応条件は表３に示す。得られた結果は図６に示す。最適ｐＨは６−１０の範囲であることがわかった。
７．ｐＨのD-PE 活性への影響（ｐＨ安定性）
酵素をそれぞれのｐＨに４℃で２４時間保持し、残存する酵素活性を５５℃で３０分反応することで求めた。その結果を図７に示した。本酵素は約ｐＨ６からｐＨ１１まで幅広いｐＨ安定性を示した。
酵素をそれぞれのｐＨに４℃で２４時間保持し、残存する酵素活性を５５℃で３０分反応することで求めた。その結果を図７に示した。本酵素は約ｐＨ６からｐＨ１１まで幅広いｐＨ安定性を示した。
８．Ｄ−ＰＥの基質特異性
８種類の六単糖(ケト―ス)を用いて精製前の本酵素の基質特異性について検討した。酵素反応組成は、表４に示したように各基質０．２Ｍ３５０μl、酵素液３５０μl（トリス緩衝液 ｐＨ７．０）で、５５℃３０分反応しHPLCによる分析によりそれぞれの糖からエピ化され生産されたケトースを測定した。その結果は以下のようになった。Ｄ−プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を、相対活性として示している。
Ｄ−フルクトース(Ｄ-fructose)、Ｄ−プシコース(Ｄ-psicose)、Ｄ−ソルボース(Ｄ-sorbose)、Ｄ−タガトース(Ｄ-tagatose)、Ｌ−フルクトース(Ｌ-fructose)、Ｌ−プシコース(Ｌ-psicose)、Ｌ−ソルボース(Ｌ-sorbose)、Ｌ−タガトース(Ｌ-tagatose)を基質として活性を相対活性として表５に示す。最もＤ−プシコースに対する活性が強く、次いでＤ−フラクトースであった。これらの基質特異性は他の遊離のケトース３エピメラーゼと比較すると、Ｄ−プシコース３エピメラーゼ（DPE）と言えるものであり、シュードモナス チコリのＤ−タガトース３−エピメラーゼ（ＤＴＥ）とは明らかに異なる特異性を示した。
８種類の六単糖(ケト―ス)を用いて精製前の本酵素の基質特異性について検討した。酵素反応組成は、表４に示したように各基質０．２Ｍ３５０μl、酵素液３５０μl（トリス緩衝液 ｐＨ７．０）で、５５℃３０分反応しHPLCによる分析によりそれぞれの糖からエピ化され生産されたケトースを測定した。その結果は以下のようになった。Ｄ−プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を、相対活性として示している。
Ｄ−フルクトース(Ｄ-fructose)、Ｄ−プシコース(Ｄ-psicose)、Ｄ−ソルボース(Ｄ-sorbose)、Ｄ−タガトース(Ｄ-tagatose)、Ｌ−フルクトース(Ｌ-fructose)、Ｌ−プシコース(Ｌ-psicose)、Ｌ−ソルボース(Ｌ-sorbose)、Ｌ−タガトース(Ｌ-tagatose)を基質として活性を相対活性として表５に示す。最もＤ−プシコースに対する活性が強く、次いでＤ−フラクトースであった。これらの基質特異性は他の遊離のケトース３エピメラーゼと比較すると、Ｄ−プシコース３エピメラーゼ（DPE）と言えるものであり、シュードモナス チコリのＤ−タガトース３−エピメラーゼ（ＤＴＥ）とは明らかに異なる特異性を示した。
［酵素の精製と理化学的性質の測定］
次に、本発明の酵素をさらに純粋な状態に精製して理化学的な性質を測定した。
［酵素の精製時および精製酵素の活性測定および蛋白質の測定］
酵素活性の測定については、表６に記載の酵素反応液組成を用いて酵素反応を行った。３０℃で３０分酵素反応を行い、この条件下で１分間に１μｍｏｌｅのＤ−フラクトースを生成する酵素量を１単位とした。反応後、反応液を３分間沸騰液中にいれることで反応を停止し、脱イオン処理後、ＨＰＬＣ分析により生成したＤ−フラクトースを測定した。また、蛋白質の測定については、ブラッドフォード法により、ブラッドフォード液２５０μｌに対し酵素液５μＬを加え均一に攪拌した後に測定した。
次に、本発明の酵素をさらに純粋な状態に精製して理化学的な性質を測定した。
［酵素の精製時および精製酵素の活性測定および蛋白質の測定］
酵素活性の測定については、表６に記載の酵素反応液組成を用いて酵素反応を行った。３０℃で３０分酵素反応を行い、この条件下で１分間に１μｍｏｌｅのＤ−フラクトースを生成する酵素量を１単位とした。反応後、反応液を３分間沸騰液中にいれることで反応を停止し、脱イオン処理後、ＨＰＬＣ分析により生成したＤ−フラクトースを測定した。また、蛋白質の測定については、ブラッドフォード法により、ブラッドフォード液２５０μｌに対し酵素液５μＬを加え均一に攪拌した後に測定した。
精製した本酵素は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法による分子量が１２０ｋＤａであるホモテトラマー構造であるエピメラーゼであることが判明した。
［菌体の培養］
［菌の前培養］
本菌を表７に示す培地に接種し前培養を行った。５００ｍｌ三角フラスコに培地１００ｍｌを入れ、３０℃・２００ｒｐｍにて１２時間振とう培養を行った。
［菌の前培養］
本菌を表７に示す培地に接種し前培養を行った。５００ｍｌ三角フラスコに培地１００ｍｌを入れ、３０℃・２００ｒｐｍにて１２時間振とう培養を行った。
［本培養］
前培養の生育培地１００ｍＬを表８に示す本培養１０ｌに接種し、３０℃にて通気量２ｍｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍで通気撹拌培養を２４時間行った。
前培養の生育培地１００ｍＬを表８に示す本培養１０ｌに接種し、３０℃にて通気量２ｍｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍで通気撹拌培養を２４時間行った。
［酵素の抽出］
本培養１０Ｌから生菌体２３０ｇを得た。これを１ｌの緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて菌体を破砕し、酵素を抽出した。破砕条件は２００００ｐｓｉで行った。遠心分離（１００００ｒｐｍ， ２０ｍｉｎ， ４℃）により不溶物を除去し粗酵素液１１５０ｍｌを得た。酵素の精製にはこの粗酵素液の１３０ｍｌを用いた。
本培養１０Ｌから生菌体２３０ｇを得た。これを１ｌの緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて菌体を破砕し、酵素を抽出した。破砕条件は２００００ｐｓｉで行った。遠心分離（１００００ｒｐｍ， ２０ｍｉｎ， ４℃）により不溶物を除去し粗酵素液１１５０ｍｌを得た。酵素の精製にはこの粗酵素液の１３０ｍｌを用いた。
［酵素の精製］
［ＰＥＧ（ポリエチレン グリコール）による分画］
粗酵素液１３０ｍｌにＰＥＧ６０００を２６ｇ添加し（濃度２０％）、低温にて撹拌溶解した。生成した沈殿と上清とを遠心分離（１００００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により分離した。沈殿は３０ｍＬの緩衝液に溶解した。活性を測定した結果、沈殿中には活性は存在しなかった。ついで上清にＰＥＧ２６ｇ（終濃度４０％）添加し同様に、生成する沈殿と上清に分け、活性を測定した。その結果沈殿中に活性は認められなかった。上清に活性が認められた。
［ＰＥＧ除去の方法］
ＰＥＧ濃度４０％においても酵素は沈殿することなく、上清に存在した。上清の酵素を次の精製過程へ進めるためには、ＰＥＧ を除去する必要がある。ＰＥＧはイオン交換樹脂には吸着しない性質を用いて、ＰＥＧを除去した。具体的には、イオン交換樹脂に酵素を吸着させＰＥＧを洗い流し、その後吸着した酵素を高濃度のＮａＣｌで樹脂から溶出することでＰＥＧを除去した。
ＰＥＧ除去の具体的方法を次に示す。
緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ５８ｍｌにＰＥＧ４０％を含む酵素液を入れ、１０分間ゆっくり撹拌することで酵素を吸着させた。その樹脂をカラム（容積約５０ｍｌ）に詰め、緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）１５０ｍｌで溶出した。１０ｍｌずつ分画し活性のある部分を回収した。それを緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）にたいして一夜透析することでＮａＣｌを除去し、ＰＥＧ分画酵素液を得た。
［ＰＥＧ（ポリエチレン グリコール）による分画］
粗酵素液１３０ｍｌにＰＥＧ６０００を２６ｇ添加し（濃度２０％）、低温にて撹拌溶解した。生成した沈殿と上清とを遠心分離（１００００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により分離した。沈殿は３０ｍＬの緩衝液に溶解した。活性を測定した結果、沈殿中には活性は存在しなかった。ついで上清にＰＥＧ２６ｇ（終濃度４０％）添加し同様に、生成する沈殿と上清に分け、活性を測定した。その結果沈殿中に活性は認められなかった。上清に活性が認められた。
［ＰＥＧ除去の方法］
ＰＥＧ濃度４０％においても酵素は沈殿することなく、上清に存在した。上清の酵素を次の精製過程へ進めるためには、ＰＥＧ を除去する必要がある。ＰＥＧはイオン交換樹脂には吸着しない性質を用いて、ＰＥＧを除去した。具体的には、イオン交換樹脂に酵素を吸着させＰＥＧを洗い流し、その後吸着した酵素を高濃度のＮａＣｌで樹脂から溶出することでＰＥＧを除去した。
ＰＥＧ除去の具体的方法を次に示す。
緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ ５８ｍｌにＰＥＧ４０％を含む酵素液を入れ、１０分間ゆっくり撹拌することで酵素を吸着させた。その樹脂をカラム（容積約５０ｍｌ）に詰め、緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ＋１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）１５０ｍｌで溶出した。１０ｍｌずつ分画し活性のある部分を回収した。それを緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）にたいして一夜透析することでＮａＣｌを除去し、ＰＥＧ分画酵素液を得た。
［イオン交換クロマトグラフィーによる精製］
ＰＥＧ分画酵素液をイオンクロマト分離法によって精製を行った。用いたカラムはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅであり、ＡＫＴＡシステムを用い流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで１Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で３５％から６０％を５ｍｌずつのフラクションに分けて分画した。図８に示す矢印のフラクションに酵素活性が溶出された。それを回収しイオン交換クロマト分離による精製酵素を得た。図８にはイオン交換クロマト分離溶出図を示す。蛋白質溶出の図８の中央部の矢印で示した部分に酵素活性が存在したので、この部分を回収した。
イオン交換クロマト分離により精製した酵素を疎水クロマト分離法によりさらに精製を行った。用いたカラムはＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ ６ｍｌである。酵素液に２Ｍとなるように硫安を加えて溶解した。流速３ｍｌ／ｍｉｎで２Ｍの硫安１００％から０％まで濃度を下げて溶出し５ｍＬずつ分画した。図９の矢印の大きなピークに酵素活性が溶出された。その画分を透析し硫安を除去し疎水クロマト分離精製酵素を得た。蛋白質の溶出の二つ目の大きなピークに活性が存在した。図９の矢印は回収した画分を示している。
ＰＥＧ分画酵素液をイオンクロマト分離法によって精製を行った。用いたカラムはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅであり、ＡＫＴＡシステムを用い流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで１Ｍ ＮａＣｌの濃度勾配で３５％から６０％を５ｍｌずつのフラクションに分けて分画した。図８に示す矢印のフラクションに酵素活性が溶出された。それを回収しイオン交換クロマト分離による精製酵素を得た。図８にはイオン交換クロマト分離溶出図を示す。蛋白質溶出の図８の中央部の矢印で示した部分に酵素活性が存在したので、この部分を回収した。
イオン交換クロマト分離により精製した酵素を疎水クロマト分離法によりさらに精製を行った。用いたカラムはＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥ ６ｍｌである。酵素液に２Ｍとなるように硫安を加えて溶解した。流速３ｍｌ／ｍｉｎで２Ｍの硫安１００％から０％まで濃度を下げて溶出し５ｍＬずつ分画した。図９の矢印の大きなピークに酵素活性が溶出された。その画分を透析し硫安を除去し疎水クロマト分離精製酵素を得た。蛋白質の溶出の二つ目の大きなピークに活性が存在した。図９の矢印は回収した画分を示している。
［精製表］
酵素の精製過程について、粗酵素、ＰＥＧ分画酵素、イオン交換クロマト分離精製酵素、疎水クロマトグラフィー精製酵素のそれぞれの蛋白質量、酵素活性などをまとめて精製表として表９に示した。この精製により収率１２％、精製倍率３１．５倍の精製酵素を得た。
酵素の精製過程について、粗酵素、ＰＥＧ分画酵素、イオン交換クロマト分離精製酵素、疎水クロマトグラフィー精製酵素のそれぞれの蛋白質量、酵素活性などをまとめて精製表として表９に示した。この精製により収率１２％、精製倍率３１．５倍の精製酵素を得た。
［精製酵素の純度］
常法に従いＳＤＳ ＰＡＧＥ（ゲル濃度１５％）を用いて精製酵素の純度を確認した。図１０においては、左が標準の蛋白質であり、次の２レーンが疎水クロマトグラフィーを用いて精製した後の酵素である。この結果は２９〜４５ｋＤａの間に単一なバンドが確認された。これにより酵素は純粋に精製されたことを確認した。
常法に従いＳＤＳ ＰＡＧＥ（ゲル濃度１５％）を用いて精製酵素の純度を確認した。図１０においては、左が標準の蛋白質であり、次の２レーンが疎水クロマトグラフィーを用いて精製した後の酵素である。この結果は２９〜４５ｋＤａの間に単一なバンドが確認された。これにより酵素は純粋に精製されたことを確認した。
［精製した酵素の性質］
精製した酵素の性質について検討した。
［反応至適ｐＨ］
図１１で示すようにｐＨ６〜１１において活性を示し、最も活性が高いｐＨは７．５であった。
測定にあたり、反応の至適ｐＨについてＤ−プシコースを基質として用い、各種緩衝液ｐＨ ４〜１１を用いて３０℃で３０分反応し、生成したＤ−フラクトースを、ＨＰＬＣを用いて測定することで求めた。 反応液組成を表１０に、使用したバッファーを表１１に示す。
精製した酵素の性質について検討した。
［反応至適ｐＨ］
図１１で示すようにｐＨ６〜１１において活性を示し、最も活性が高いｐＨは７．５であった。
測定にあたり、反応の至適ｐＨについてＤ−プシコースを基質として用い、各種緩衝液ｐＨ ４〜１１を用いて３０℃で３０分反応し、生成したＤ−フラクトースを、ＨＰＬＣを用いて測定することで求めた。 反応液組成を表１０に、使用したバッファーを表１１に示す。
［反応至適温度］
反応温度と総体活性を測定した結果を示す図１２から、本酵素の至適温度はＭｇ２＋イオン添加時で７０℃であることが明らかとなった。Ｍｇ２＋イオンの非存在下では至適温度が６０°であり、Ｍｇ２＋イオン存在下では至適温度が顕著に高くなり、６０℃ないし８０℃で高い活性を示した。図１２では Ｍｇ２＋イオン存在下で最も高い活性を示した７０℃を１００とした相対活性で示した。 反応条件は表１２に示すように精製酵素をｐＨ７．５において各温度で３０分反応し、生成するＤ−フラクトースの量を測定した。Ｍｇ２＋イオンを添加する場合と添加しない場合（ＭｇＣｌ２のかわりに水を添加）について検討した。反応は２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００℃で３０分間おこなった。
反応温度と総体活性を測定した結果を示す図１２から、本酵素の至適温度はＭｇ２＋イオン添加時で７０℃であることが明らかとなった。Ｍｇ２＋イオンの非存在下では至適温度が６０°であり、Ｍｇ２＋イオン存在下では至適温度が顕著に高くなり、６０℃ないし８０℃で高い活性を示した。図１２では Ｍｇ２＋イオン存在下で最も高い活性を示した７０℃を１００とした相対活性で示した。 反応条件は表１２に示すように精製酵素をｐＨ７．５において各温度で３０分反応し、生成するＤ−フラクトースの量を測定した。Ｍｇ２＋イオンを添加する場合と添加しない場合（ＭｇＣｌ２のかわりに水を添加）について検討した。反応は２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００℃で３０分間おこなった。
［ｐＨ安定性］
精製酵素のｐＨ安定性を検討した結果を図１３に示すようにｐＨ５〜１１まで安定であることが明らかとなった。
測定条件は、各ｐＨで４℃・２４時間保ち、その酵素をｐＨ７．５によって反応した。残存活性の測定はｐＨ ７．５、３０℃で３０分行った。使用した緩衝液は至適ｐＨに用いたと同じものを用いた。
図１３では、クエン酸緩衝液ｐＨ６の場合の残存活性を１００とし、それぞれのｐＨにおける残存活性を相対活性として表した。
精製酵素のｐＨ安定性を検討した結果を図１３に示すようにｐＨ５〜１１まで安定であることが明らかとなった。
測定条件は、各ｐＨで４℃・２４時間保ち、その酵素をｐＨ７．５によって反応した。残存活性の測定はｐＨ ７．５、３０℃で３０分行った。使用した緩衝液は至適ｐＨに用いたと同じものを用いた。
図１３では、クエン酸緩衝液ｐＨ６の場合の残存活性を１００とし、それぞれのｐＨにおける残存活性を相対活性として表した。
［熱安定性］
精製酵素の熱安定性について、Ｍｇ２＋イオンの存在下あるいは非存在下で検討した。Ｍｇ２＋イオンが存在する場合と存在しない場合では、熱安定性が大きく変化し、Ｍｇ２＋イオンが酵素の熱安定性を増大させた。Ｍｇ２＋イオン存在下では５０℃・１時間で安定であった。一方、Ｍｇ２＋イオンが存在しない場合は、全体として約１０℃低い熱安定性であった。なお、至適反応温度が７０℃であることと、この結果から本酵素は基質の存在により安定性が増大することを示している。すなわちＥＳ複合体の安定性が高いことを示していると考えられる。図１４では熱処理をしない酵素の活性を１００とした相対活性で表した。
熱処理条件としては、精製酵素液４０μｌ、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）１６０μｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２ （Ｍｇ２＋イオン非添加の場合は水）１００μｌの全量３００μｌとし、これを各温度で１時間保持した後氷水中で１０分間冷却後、残存する酵素活性を常法に従って測定した。
精製酵素の熱安定性について、Ｍｇ２＋イオンの存在下あるいは非存在下で検討した。Ｍｇ２＋イオンが存在する場合と存在しない場合では、熱安定性が大きく変化し、Ｍｇ２＋イオンが酵素の熱安定性を増大させた。Ｍｇ２＋イオン存在下では５０℃・１時間で安定であった。一方、Ｍｇ２＋イオンが存在しない場合は、全体として約１０℃低い熱安定性であった。なお、至適反応温度が７０℃であることと、この結果から本酵素は基質の存在により安定性が増大することを示している。すなわちＥＳ複合体の安定性が高いことを示していると考えられる。図１４では熱処理をしない酵素の活性を１００とした相対活性で表した。
熱処理条件としては、精製酵素液４０μｌ、緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）１６０μｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２ （Ｍｇ２＋イオン非添加の場合は水）１００μｌの全量３００μｌとし、これを各温度で１時間保持した後氷水中で１０分間冷却後、残存する酵素活性を常法に従って測定した。
［金属イオンの影響］
酵素の金属イオン要求性について検討した。精製酵素を１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５に２時間透析した。その後ＥＤＴＡを含まない１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に一昼夜透析し、ＥＤＴＡ処理酵素を得た。この酵素を用いて、各種金属イオン１ｍＭを含む条件でＤ−プシコースを基質としてその活性に対する影響を測定した。その結果を、無添加の酵素活性を１００として、各金属イオン添加時の活性を相対活性で表わし、表１３に示した。
Ｍｇ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｎ２＋の各イオン存在下では、活性が１．３倍以上となり、Ｍｇ２＋イオン存在下で最も高い活性が認められた。この結果より、本酵素はＭｇ２＋イオンにより活性化される。熱安定性におけるＭｇ２＋イオンの大きな影響を考慮すると本酵素反応にはＭｇ２＋イオンが重要であることが明らかとなった。
酵素の金属イオン要求性について検討した。精製酵素を１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５に２時間透析した。その後ＥＤＴＡを含まない１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に一昼夜透析し、ＥＤＴＡ処理酵素を得た。この酵素を用いて、各種金属イオン１ｍＭを含む条件でＤ−プシコースを基質としてその活性に対する影響を測定した。その結果を、無添加の酵素活性を１００として、各金属イオン添加時の活性を相対活性で表わし、表１３に示した。
Ｍｇ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｎ２＋の各イオン存在下では、活性が１．３倍以上となり、Ｍｇ２＋イオン存在下で最も高い活性が認められた。この結果より、本酵素はＭｇ２＋イオンにより活性化される。熱安定性におけるＭｇ２＋イオンの大きな影響を考慮すると本酵素反応にはＭｇ２＋イオンが重要であることが明らかとなった。
［基質特異性］
全ケトヘキソースについて本酵素の反応性について検討した。反応液組成は表１４に示した。その結果、Ｄ−プシコースを１００とした相対活性として表に整理した。本酵素は全ケトヘキソースに活性は示すが、Ｄ−プシコースに最も高い活性を示し、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼであることが明確となった。基質特異性については表１５にまとめた。Ｄ−ｓｏｒｂｏｓｅ、Ｌ−ｆｒｕｃｔｏｓｅは７０℃・１２０分、それ以外は７０℃・２０分で反応させて初速度を求めた。
全ケトヘキソースについて本酵素の反応性について検討した。反応液組成は表１４に示した。その結果、Ｄ−プシコースを１００とした相対活性として表に整理した。本酵素は全ケトヘキソースに活性は示すが、Ｄ−プシコースに最も高い活性を示し、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼであることが明確となった。基質特異性については表１５にまとめた。Ｄ−ｓｏｒｂｏｓｅ、Ｌ−ｆｒｕｃｔｏｓｅは７０℃・１２０分、それ以外は７０℃・２０分で反応させて初速度を求めた。
［ＫｍとＶｍａｘ］
本酵素のＤ−プシコースとＤ−フラクトースのＫｍおよびＶｍａｘを測定した。測定は３０℃でＭｇ２＋イオン存在下の酵素活性測定の条件下で行った。その結果Ｄ−プシコースについては、Ｖｍａｘ＝１６８Ｕ／ｍｇ， Ｋｍ＝３０．１ｍＭであり、Ｄ−フラクトースについては、Ｖｍａｘ＝６８．５Ｕ／ｍｇ， Ｋｍ＝３１．５ｍＭであった。
本酵素のＤ−プシコースとＤ−フラクトースのＫｍおよびＶｍａｘを測定した。測定は３０℃でＭｇ２＋イオン存在下の酵素活性測定の条件下で行った。その結果Ｄ−プシコースについては、Ｖｍａｘ＝１６８Ｕ／ｍｇ， Ｋｍ＝３０．１ｍＭであり、Ｄ−フラクトースについては、Ｖｍａｘ＝６８．５Ｕ／ｍｇ， Ｋｍ＝３１．５ｍＭであった。
［酵素の分子量］
［サブユニットの分子量］
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ （ゲル濃度１５％）による精製酵素の移動距離と分子量マーカーの移動距離を測定した。その結果、本酵素のサブユニットの分子量はおよそ３２ｋＤａであることが明らかとなった。
図１５に泳動距離と分子量の関係を示す。図１５はマーカー蛋白質の泳動距離ｃｍと分子量ｋＤａとの関係を示している。精製酵素の移動距離は約４．１ｃｍ であることから、本酵素のサブユニットは約３２ｋＤａであると推定された。なお、泳動図は図１０に示した。
［サブユニットの分子量］
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ （ゲル濃度１５％）による精製酵素の移動距離と分子量マーカーの移動距離を測定した。その結果、本酵素のサブユニットの分子量はおよそ３２ｋＤａであることが明らかとなった。
図１５に泳動距離と分子量の関係を示す。図１５はマーカー蛋白質の泳動距離ｃｍと分子量ｋＤａとの関係を示している。精製酵素の移動距離は約４．１ｃｍ であることから、本酵素のサブユニットは約３２ｋＤａであると推定された。なお、泳動図は図１０に示した。
［酵素の分子量］
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、本酵素の分子量を測定した。すなわち標準蛋白質と移動距離の関係図１６を求め、本酵素の移動距離から計算した。その結果、酵素の分子量は約１２０ｋＤａであることが明らかになった。
分子量の測定には、ゲルろ過クロマトグラフィーのカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ １６／６００ を用いた。使用したランニングバッファー組成は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５， ＮａＣｌ ２００ｍＭ， ＭｇＣｌ２ １ｍＭ である。
使用標準タンパク（マーカー） は以下の５種類を用いた。
（１）Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ＭＷ：４４，０００
（２）Ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ ７５，０００
（３）Ａｌｄｏｌａｓｅ １５８，０００
（４）Ｆｅｒｒｉｔｉｎ ４４０，０００
（５）Ｔｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ６６９，０００
本酵素は７２．５ｍｌに溶出したので、移動距離と分子量との関係より計算し、本酵素の分子量は約１２０ｋＤａであることが明らかとなった。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量は約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法を用いた本酵素の分子量は約１２０ｋＤａである。このことから、本酵素はサブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造であると考えられる。
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、本酵素の分子量を測定した。すなわち標準蛋白質と移動距離の関係図１６を求め、本酵素の移動距離から計算した。その結果、酵素の分子量は約１２０ｋＤａであることが明らかになった。
分子量の測定には、ゲルろ過クロマトグラフィーのカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ １６／６００ を用いた。使用したランニングバッファー組成は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５， ＮａＣｌ ２００ｍＭ， ＭｇＣｌ２ １ｍＭ である。
使用標準タンパク（マーカー） は以下の５種類を用いた。
（１）Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ ＭＷ：４４，０００
（２）Ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ ７５，０００
（３）Ａｌｄｏｌａｓｅ １５８，０００
（４）Ｆｅｒｒｉｔｉｎ ４４０，０００
（５）Ｔｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ６６９，０００
本酵素は７２．５ｍｌに溶出したので、移動距離と分子量との関係より計算し、本酵素の分子量は約１２０ｋＤａであることが明らかとなった。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量は約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法を用いた本酵素の分子量は約１２０ｋＤａである。このことから、本酵素はサブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造であると考えられる。
［他のＤＰＥ、ＤＴＥとの比較］
これまで報告されているＤ−タガトース３−エピメラーゼおよびＤ−プシコース３−エピメラーゼの性質を表１６にまとめた。本菌株の生産する酵素は他の微生物起源のケトヘキソース３−エピメラーゼと比較し、至適温度が高いことが大きな特徴である。
これまで報告されているＤ−タガトース３−エピメラーゼおよびＤ−プシコース３−エピメラーゼの性質を表１６にまとめた。本菌株の生産する酵素は他の微生物起源のケトヘキソース３−エピメラーゼと比較し、至適温度が高いことが大きな特徴である。
本発明のケトース３−エピメラーゼは、他のエピメラーゼやイソメラーゼと同様に、補酵素を必要としない異性化反応である。従って酵素を固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができる。固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能である。工業的に固定化できることで、目的とするケトースの大量生産ができる。
本微生物をＤ−プシコースを炭素源とする最少無機塩培地に生育させ、生育菌体中から得た酵素を用いて、Ｄ−プシコースとＤ−フラクトースの平衡比について検討した。反応液組成は、５０ｍＭトリス緩衝液２００μｌ、０．２Ｍ Ｄ−プシコースあるいはＤ−フラクトース、酵素液１００μｌ、１０ｍＭ ＣｏＣｌ２ ７５μｌを用いた。反応温度は５０℃、２４時間反応した。反応終了後ＨＰＬＣを用いて反応液中のＤ−フラクトースとＤ−プシコースの量を測定した。
その結果、Ｄ−プシコースを基質とした場合も、Ｄ−フラクトースを基質とした場合も同じ平衡比に達した。
平衡比 Ｄ−プシコース：Ｄ−フラクトース＝２７：７３
この結果はＤ−フラクトースを用いて反応すると、その２７％がＤ−プシコースへ変換できることを示しており、Ｄ−プシコースをＤ−フラクトースから生産できることを明確に示す結果である。
その結果、Ｄ−プシコースを基質とした場合も、Ｄ−フラクトースを基質とした場合も同じ平衡比に達した。
平衡比 Ｄ−プシコース：Ｄ−フラクトース＝２７：７３
この結果はＤ−フラクトースを用いて反応すると、その２７％がＤ−プシコースへ変換できることを示しており、Ｄ−プシコースをＤ−フラクトースから生産できることを明確に示す結果である。
精製した酵素を使用してＤ−プシコースとＤ−フラクトース間のエピ化の平衡について検討した。その結果、平衡状態でのＤ−プシコース：Ｄ−フラクトースは、４０℃では２５：７５、７０℃では３０：７０であった。
本発明のケトース３−エピメラーゼは、遊離のＤ−又はＬ−ケトース、Ｄ−又はＬ−ケトペントースに作用させて、これらケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−又はＬ−ケトース、Ｄ−又はＬ−ケトースを容易に生成する。この反応は、各種ケトース、とりわけＤ−フラクトースを原料としたＤ−プシコースの大量生産の道を拓くものである。さらに、本発明のケトース３−エピメラーゼは、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができ、固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能である。工業的に固定化できることで、目的とするケトースの大量生産ができる。
従って、本発明のケトース３−エピメラーゼとその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
本酵素を生産する、アルスロバクター グロビフォルミスを食品産業で用いる最も大きな特徴としては、菌の安全性にある。この菌種はアメリカにおいて、FDAによるEAFUSに収載されていることは、菌体自体の安全性が非常に高いことを証明するものである。これまで知られているD-プシコースの生産酵素としては、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属などによるものがあるが、これらは米欧のリストには収載されていないばかりか、日和見菌としてや、植物細胞感染などの報告もあり、安全性を確認するには多くの労力を要する微生物であった。本発明で菌体自体の安全性が非常に高い菌を使用できることは大きな技術の進歩である。
従って、本発明のケトース３−エピメラーゼとその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
本酵素を生産する、アルスロバクター グロビフォルミスを食品産業で用いる最も大きな特徴としては、菌の安全性にある。この菌種はアメリカにおいて、FDAによるEAFUSに収載されていることは、菌体自体の安全性が非常に高いことを証明するものである。これまで知られているD-プシコースの生産酵素としては、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属などによるものがあるが、これらは米欧のリストには収載されていないばかりか、日和見菌としてや、植物細胞感染などの報告もあり、安全性を確認するには多くの労力を要する微生物であった。本発明で菌体自体の安全性が非常に高い菌を使用できることは大きな技術の進歩である。
Claims (8)
- アルスロバクター属に属する微生物から得ることができ、下記（Ａ）、（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３−エピメラーゼ。
（Ａ）Ｄ−またはＬ−ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ−またはＬ−ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ−またはＬ−ケトースの中ではＤ−フラクトースおよびＤ−プシコースに対する基質特異性が最も高い。 - アルスロバクター属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミスである請求項１記載のケトース３−エピメラーゼ。
- アルスロバクター属に属する微生物が、アルスロバクター グロビホルミス Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ−１１１１）である請求項１記載のケトース３−エピメラーゼ。
- ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法による分子量が１２０ｋＤａである、サブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造である請求項１から３のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
- 下記の理化学的性質（ａ）〜（ｅ）を有する請求項１から４のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
（ａ）至適ｐＨ
３０℃、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６ないし１１。
（ｂ）至適温度
ｐＨ７．５、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６０ないし８０℃。
（ｃ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間保持の条件下で、少なくともｐＨ５ないし１１の範囲で安定。
（ｄ）熱安定性
ｐＨ７．５、１時間保持、４ｍＭのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下の条件で、約５０℃以下で安定。マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の非存在下の条件で、約４０℃以下で安定。
（ｅ）金属イオンによる活性化
二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）により活性化される。 - 下記の基質特異性１．〜８．を有する請求項１から５のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼ。
記
１．D-フルクトースを基質としたときの相対活性が４３．８％、
２．D-プシコースを基質としたときの活性が１００％、
３．D-ソルボースを基質としたときの相対活性が１．１３％、
４．D-タガトースを基質としたときの相対活性が１８．３％、
５．L-フルクトースを基質としたときの相対活性が０．９７％、
６．L-プシコースを基質としたときの相対活性が２１．２％、
７．L-ソルボースを基質としたときの相対活性が１６．６％、
８. L-タガトースを基質としたときの相対活性が４４．０％。
ただし、Ｄ−プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を相対活性として示している。 - Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、請求項１ないし６のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを作用させて、該ケトースの３位をエピマー化することを特徴とするケトースの変換方法。
- Ｄ−またはＬ−ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、請求項１ないし６のいずれかに記載のケトース３−エピメラーゼを作用させて該ケトースの３位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
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