WO2022234671A1 - Ｄ－アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法 - Google Patents

Ｄ－アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法 Download PDF

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和也 秋光
健 何森
明秀 吉原
晴造 高岡
志郎 加藤
進 望月
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国立大学法人香川大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for mass-producing a sweetener containing three sugars consisting of D-glucose, D-fructose and D-allulose (D-psicose) and having the functionality of D-allulose and a taste similar to that of sugar.
  • low-cost isomerized sugar or invert sugar which is a mixed sugar containing D-glucose and D-fructose, is an excellent physiological method that maintains or improves taste and does not cause illness with continuous intake.
  • the present invention relates to a method for improving isomerized sugar or invert sugar, which converts isomerized sugar or invert sugar into a sweetener having the functionality of D-allulose, which imparts an effective function.
  • Carbohydrates which are extremely important as an energy source for living things, especially for "zero hunger", are the most abundant organic compounds on earth, and their main constituents are monosaccharides. These monosaccharides typically have a structure in which carbon atoms of 3 to 8 carbon atoms are linked in a ring, and are structurally divided into two types, aldoses and ketoses. Aldoses and ketoses are classified as trioses, tetrose, pentoses and hexoses, respectively, according to the number of said carbon atoms.
  • an example of an industrially performed reaction is a reaction in which D-glucose is isomerized to D-fructose to produce isomerized sugar.
  • a typical method is made from starch such as corn starch. Due to the increase in corn production, isomerized sugar was made cheaply in large quantities by using the large amount of cornstarch on the market. .
  • sugar which is a disaccharide
  • sugar was expensive before isomerized sugar became popular, so it has continued to be replaced by isomerized sugar. t, and the price has become relatively stable.
  • sugar By using sugar as a raw material, the good sweetness of sugar can be used, and since sugar is a disaccharide in which glucose and fructose are combined, it can also be used as a raw material for supplying glucose and fructose. Depending on the situation, it is considered that the cost is lower than that of isomerized sugar.
  • sweeteners containing rare sugars made from sugar have the advantage of less off-taste than sweeteners made from isomerized sugar (Patent Document 1).
  • a typical method for producing isomerized sugar is to add water and a liquefying enzyme (alpha-amylase) to starch such as corn starch, and hydrolyze the mixture at around 95° C. to produce dextrin. This is called liquefaction, and after liquefaction, it is cooled to about 55° C., and a saccharifying enzyme (glucoamylase) is added to further decompose it into smaller D-glucose, ie, a saccharified solution.
  • This saccharified solution contains some oligosaccharides in addition to D-glucose.
  • the saccharified solution saccharified with glucoamylase is continuously passed through an immobilized enzyme in which isomerase (glucose isomerase) produced by bacteria belonging to the genus Streptomyces or the like is immobilized by various methods, D-glucose is isomerized to D-fructose.
  • the isomerization is an equilibrium reaction in which the equilibrium point exists near 1, and at the time of reaching equilibrium, about 50% of D-glucose can be isomerized to D-fructose at a reaction temperature of about 60 ° C.
  • the reaction is terminated when the isomerization progresses until the content of D-fructose reaches about 42%. Then, by refining and concentrating, a high fructose liquid sugar with a fructose content of 42% can be obtained. All of the enzymes used for their production are produced by safe microorganisms. That is, the isomerization reaction of D-glucose to D-fructose by glucose isomerase is an equilibrium reaction, and the ratio of D-glucose to D-fructose in isomerized sugar is usually about 58:42. The sweetness of the high-fructose corn syrup with a D-fructose content of 42% is 70-90 when the sweetness of sugar (strength of sweetness) is 100.
  • chromatography a separation device called chromatography
  • continuous sugar separation using a large-scale facility such as a reaction tower filled with a cation exchange resin is first performed to reduce the D-fructose content.
  • An approximately 95% D-fructose liquid is obtained, and then this D-fructose liquid is mixed with the 42% isomerized sugar.
  • refined D-fructose may be added to compensate for the lack of sweetness, but in these cases the final ratio of D-glucose to D-fructose is usually about 45:55.
  • the sweetness of the fructose corn syrup with a D-fructose content of 55% is 100-120, where the sweetness of sugar (intensity of sweetness) is 100. Assuming that the sweetness (intensity of sweetness) of sugar is 100, the sweetness of D-glucose is 65-80 and the sweetness of D-fructose is 120-170.
  • the intensity of sweetness is in the order of D-fructose (fructose) > sucrose (sugar) > D-glucose (glucose). is almost the same as sucrose, and unless the temperature is below that, it becomes sweeter than sucrose, so the sweetness of isomerized sugar is greatly affected by temperature.
  • HFCS High-fructose corn syrup
  • Isomerized sugar or invert sugar which is a mixed sugar mainly composed of D-glucose and D-fructose, is widely used due to its economic merits. It is suspected as a cause of overweight (obesity) (“metabolic syndrome”) (Non-Patent Document 1). Compared to D-glucose, the metabolism of D-fructose in the liver is likely to promote lipogenesis and induce hyperlipidemia and obesity. Attention has been focused on the relationship with an increase in the number of people (lifestyle-related diseases). Also, as mentioned above, the sweetness and sweetness of isomerized sugar differ from those of commonly used sugar. However, it cannot be said that a satisfactory product has been established. Based on these assimilable sugars, which are very important as an energy source for organisms, several developments are underway toward the marketing of sweeteners that are excellent in terms of sweetness and physical properties and that do not cause these diseases. .
  • D-allulose which has zero energy and various functionalities, is attracting attention for improving the functional aspects of assimilable sugars.
  • D-allulose is a kind of rare sugar, and when D-fructose is treated with D-ketohexose 3-epimerase (Patent Document 2), it is produced from D-fructose at a yield of 20-25%. It is also reported that D-allulose is produced with a yield of 40% when D-allulose 3-epimerase (Non-Patent Document 2) is used.
  • the rare sugar D-allulose can be obtained by allowing epimerase to act on D-fructose to create a mixture of D-fructose and D-allulose, and then separating and purifying the mixture to produce D-allulose in the form of powder crystals.
  • D-allulose has zero kcal (Non-Patent Document 3), postprandial blood sugar suppressing effect (Non-Patent Document 4), suppressing effect on rapid blood sugar level rise caused by D-glucose, which constitutes digestible sugar ingested from food and beverages ( It has been clarified that it exhibits characteristics as a material for preventing lifestyle-related diseases such as an anti-obesity effect (Patent Document 3) and an anti-obesity effect (Non-Patent Document 5).
  • This D-allulose itself has uses such as sweeteners and pharmaceuticals, and has been mass-produced and sold all over the world. This D-allulose is zero energy and has various functionalities, so it is especially sold as a sweetener.
  • the production of D-allulose is carried out in separate processes. At present, there are many problems to be solved in terms of economy in mass production.
  • the rare sugar D-allulose also called D-psicose, is an epimer of D-fructose and resembles D-fructose in its sweet taste qualities. However, it is about 70% sweeter than sugar, and it is necessary to bring the sweetness closer to that of sugar.
  • a technology has been developed for mixing isomerized sugar with rare sugar D-allulose, which exhibits the effect of suppressing a rapid rise in blood sugar level due to D-glucose, which constitutes the digestible sugar contained in food and beverages, when taken with food and beverages. ing.
  • the second purpose is to solve the problem that fructose-glucose liquid sugar used as a conventional sweetener differs from sugar in both sweetness and quality, and to create a sweetener that is very close to the sweetness and taste of sugar.
  • D-allulose is 9 parts by weight or more for a total of 100 parts by weight of D-glucose and D-allulose, and a total of 100 parts by weight of D-fructose, D-glucose and D-allulose , D-fructose is 34 to 55 parts by weight, and the total of D-glucose and D-allulose is 66 to 45 parts by weight with respect to the total of 100 parts by weight of D-fructose, D-glucose and D-allulose A sweetener has been developed (Patent Document 5).
  • Japanese Patent No. 6250946 JP-A-6-125776 Japanese Patent No. 5171249 Japanese Patent No. 5715046 Japanese Patent No. 5639759 Japanese Patent No. 5997693 Japanese Patent No. 5922880 JP 2017-36276 A Japanese Patent No. 4009720 JP 2007-91696 A
  • the target product produced by the above two methods is isomerized sugar that exhibits excellent physiological effects, but it is price competitive for mass production on a global scale. do not have.
  • the challenge is how to reduce costs. As we face the new challenge of reducing CO 2 emissions these days, CO 2 emissions are a cost, and it is expected that they will become more important in the cost structure. Development of new manufacturing processes that can reduce CO 2 emissions is required. We believe that the establishment of a new manufacturing process that can compete on a global level by efficiently realizing "manufacturing" that is theoretically possible by the above two methods is the cost reduction that will produce a large impact. Corn and sugar cane have ideal properties as biomass.
  • Bio-polyethylene is replacing some or all of fossil-fuel polyethylene as it can appeal to consumers that it uses materials that are friendly to global warming.
  • the rapid increase in demand for ethanol from corn could lead to shortages and price hikes.
  • all the harvested sugar cane is collected in a sugar factory and processed into sugar, and a collection system has already been established, which is the biggest problem in using biomass. Due to its productivity and versatility, sugar cane has great advantages as a biomass crop, which is unmatched by other crops. While biomass is attracting attention as part of global warming countermeasures, ethanol production using sugar cane is being carried out, and sugar cane with high biomass productivity is becoming a trump card for global warming countermeasures. As with cornstarch, there is concern about rising prices due to product shortages.
  • sweeteners based on these assimilable sugars which have excellent sweetness and do not cause these diseases, can serve as an energy source for "zero hunger."
  • it is a sweetener very close to the sweetness and taste of sugar containing D-allulose, which has the effect of suppressing the rapid rise in blood sugar level caused by D-glucose, which constitutes the digestible sugar ingested through food and beverages.
  • D-glucose which constitutes the digestible sugar ingested through food and beverages.
  • Another object of the present invention is to provide foods, beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics using a sweetener containing D-allulose produced at low cost, which has excellent sweetness and does not cause illness even when ingested for a long period of time.
  • the inventors of the present invention produced D - allulose and studied rare sugars that have focused only on its efficacy. I came up with the idea of circulating the starch of things, the disaccharide of glucose and fructose, on the flow of this energy that flows to human beings. Sugar plays an important role as an energy source, is essential for human beings and living things, and has many problems to be solved. However, this familiar glucose is converted to isomerized sugar by isomerase such as D-xylose isomerase (glucose isomerase), and sugar is converted to glucose and fructose by invertase. It is starting to be used not only as a sweetener but also as a raw material in many inexpensive organic chemistry fields.
  • Ketose 3-epimerase converts D-fructose to functional D-allulose.
  • Any sugar containing D-fructose can be used as a raw material in the present invention.
  • Typical examples are isomerized sugar and invert sugar.
  • the composition is D-glucose, D-fructose, and D-allulose, and ketose 3-epimerase alone can produce sugars of the expected composition.
  • the isomerization of grapes and the hydrolysis of sugar are already carried out on a large scale at factories, and the addition of a new bioreactor for ketose 3-epimerase alone is extremely simple. found a way.
  • Arthrobacter histidinolovorans Y586-1 strain which is a microorganism of the genus Arthrobacter, and produces a novel ketose 3-epimerase with high activity and high thermostability.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive research in order to solve the above problems.
  • D-allulose needs to be inexpensive raw materials containing D-fructose.
  • D-glucose produced from starch can be used because it can be easily produced from D-glucose by xylose isomerase;
  • Sugar is an inexpensive sweetener in which D-glucose is bound to D-fructose, is easily decomposed by invertase, and can therefore be used for bioethanol production. I thought it could be a cheap raw material.
  • the raw materials for production should be D-glucose or D-fructose.
  • the gist of the present invention is the following (1) to (10) methods for mass-producing a sweetener having the functionality of D-allulose and having a taste similar to that of sugar.
  • (1) A method for mass-producing a sweetener containing three kinds of sugars consisting of D-glucose, D-fructose and D-allulose and having the functionality of D-allulose and a taste similar to that of sugar Using an inexpensive composition containing D-glucose and D-fructose as raw materials, D-allulose 3-epimerase is allowed to act to isomerize the D-fructose in the raw material through the isomerization reaction between D-fructose and the rare sugar D-allulose, and the desired rare sugar D- The reaction is terminated when the allulose content is reached, In a composition comprising rare sugars D-allulose, D-glucose and D-fructose, the content of D-fructose compensates for the
  • a method characterized in that a target product is obtained in a range that gives a similar taste.
  • D-glucose is important as an energy source in the target product, but is 65-80 when the intensity of sweetness of sugar is 100; D-fructose has a sweetness intensity of 120-170 and is important for providing sweetness. Together with D-allulose and D-glucose, it gives a taste similar to that of sugar. that there are issues, D-allulose has a sweetness strength of 70, and the content of each component is determined considering the characteristics of each component that it can impart the physiological function of suppressing rapid blood sugar level increase due to anti-obesity and digestive sugar.
  • the raw material is produced by causing D-xylose isomerase to act on D-glucose produced from starch to promote isomerization through an equilibrium reaction between D-glucose and D-fructose, or sugar
  • the method according to (1) or (2) above which is a composition containing D-glucose and D-fructose produced by decomposing by invertase.
  • the raw material is low-cost isomerized sugar or invert sugar, and the target product has the functionality of D-allulose, has a taste similar to that of sugar, and exhibits excellent physiological effects that do not cause disease with continuous intake.
  • the method according to any one of (1) to (3) above which is an improved isomerized sugar or invert sugar.
  • the method according to (4) above wherein high-fructose corn syrup and/or high-fructose corn syrup is used as the inexpensive isomerized sugar.
  • the isomerization reaction is a reaction performed by passing a substrate solution through an immobilized enzyme column, and the flow rate of the substrate, the reaction time with the substrate, the reaction temperature, the pH of the substrate solution, and the enzyme.
  • D-fructose (fructose) has the advantage of being sweet and delicious, but its drawback is that long-term continuous intake has a negative effect on the accumulation of triglycerides. is. D-fructose is adjusted to an amount that does not cause shortcomings in long-term continuous intake, and the composition is adjusted to bring out the advantage that D-fructose is sweet.
  • the rare sugar-containing composition of the present invention having the same taste as sugar is a composition of D-glucose, D-fructose and D-allulose, foods, beverages, especially functional foods (prevention of obesity, etc.)
  • it can be used for pharmaceuticals, cosmetics, feeds, agricultural chemicals (plant growth regulators, plant disease resistance enhancers, etc.), and industrial applications.
  • adding something by adding a raw material and one enzymatic reaction, optionally adding a second enzymatic reaction, and/or further optionally adding an enzymatic reaction to the raw material production is possible to provide a method for mass-producing a sweetener having the functionality of D-allulose and a taste close to that of sugar in a simple and easy manner. It does not require new capital investment costs, and can be completed by reacting epimerase and, if necessary, isomerase under suitable conditions. It is possible to provide a manufacturing method characterized by total productivity derived from high durability (lifetime).
  • FIG. 1 is a drawing explaining a method of terminating the reaction when the content of the rare sugar D-allulose is reached and obtaining a desired product having a composition consisting of the rare sugar D-allulose, D-glucose and D-fructose.
  • D-glucose When D-glucose is used as a raw material (2), a composition containing D-glucose and D-fructose (isomerized sugar) produced by a typical method for producing isomerized sugar is subjected to a separation device called chromatography. First, a D-fructose liquid is obtained by separating D-glucose and D-fructose, then this D-fructose liquid is mixed with the isomerized sugar, and various isomerizations are performed depending on the amount of D-fructose added. Making sugar, using it as a raw material, and applying DAE to isomerize the D-fructose in the raw material to the rare sugar D-allulose.
  • FIG. 2 is a drawing explaining a method for obtaining a desired product by promoting isomerization through an equilibrium reaction between D-fructose and rare sugar D-allulose.
  • the left end shows the same production method as in FIG. 1 above, the middle shows the same production method as in FIG.
  • the right end shows the production method using high fructose liquid sugar as a raw material.
  • the D-allulose 3-epimerase is allowed to act to isomerize D-fructose in the raw material through an isomerization reaction between D-fructose and the rare sugar D-allulose.
  • D-xylose isomerase which does not act on the rare sugar D-psicose, is allowed to act to produce D-fructose and D- It shows a production method characterized by adding a reaction step to promote isomerization by an equilibrium reaction between glucoses and adjusting the content of D-fructose to the target product.
  • D-fructose is used as a raw material, it is a method that has been filed separately (PCT/JP2019/043722).
  • D-fructose is converted to D-glucose using D-xylose isomerase (DXI), which does not act on D-allulose.
  • DXI D-xylose isomerase
  • the raw material is a composition mainly composed of D-glucose and D-fructose, which is produced by decomposing sugar by the action of invertase (produced by a typical production method of invert sugar).
  • D-allulose 3-epimerase (DAE) is used to isomerize the D-fructose in the raw material to the rare sugar D-allulose.
  • D-fructose can be easily produced from D-glucose by D-xylose isomerase
  • D-glucose produced from starch can be used (see FIGS. 1 and 2).
  • D-glucose is allowed to act on D-xylose isomerase (DXI) to cause isomerization by an equilibrium reaction between D-glucose and D-fructose.
  • DXI D-xylose isomerase
  • D-allulose 3-epimerase D-allulose 3-epimerase (DAE ) to isomerize the D-fructose in the raw material to the rare sugar D-allulose.
  • the reaction can be terminated to obtain the desired product composed of the rare sugars D-allulose, D-glucose and D-fructose (Fig. 1).
  • D-glucose as a raw material is to apply a separation device called chromatography to a composition (isomerized sugar) containing D-glucose and D-fructose produced by a typical method for producing isomerized sugar.
  • Figure 3 shows the production process of various isomerized sugars (high-fructose corn syrup, high-fructose corn syrup, high-fructose corn syrup) according to Japanese Agricultural Standards, and the various isomerized sugars obtained as raw materials that are treated with DAE.
  • the left end shows the production method using the same high fructose fructose liquid sugar with about 42% fructose as the raw material in FIG.
  • the middle shows the same production method as in FIG.
  • the right end is a manufacturing method using high fructose liquid sugar with about 92% fructose as a raw material.
  • D-fructose must be converted to D-glucose when it is necessary to adjust the amount so that it is difficult for intake defects to occur.
  • D-allulose 3-epimerase is allowed to act to isomerize the D-fructose in the raw material through the isomerization reaction between D-fructose and the rare sugar D-allulose, and the desired rare sugar D-
  • D-xylose isomerase which does not act on the rare sugar D-psicose, is allowed to act, and isomerization proceeds through the equilibrium reaction between D-fructose and D-glucose.
  • a manufacturing method is adopted in which steps are added to adjust the D-fructose content of the target product to the target. Such a two-step production method is similar to the production method (FIG.
  • D-fructose is mixed with D-allulose with ketose 3-epimerase (DAE), and in the second step, D -Conversion of D-fructose to D-glucose using D-xylose isomerase (DXI), which does not act on allulose, to obtain a new composition of the target product of D-glucose, D-fructose and D-allulose
  • DXI D-xylose isomerase
  • D-allulose 3-epimerase D-allulose 3-epimerase (DAE) is allowed to act on the composition to isomerize D-fructose in the raw material to rare sugar D-allulose Isomerization by equilibrium reaction between D-fructose and rare sugar D-allulose and the reaction is terminated when the content of the target rare sugar D-allulose of the target product is reached to obtain the target product having a composition consisting of the rare sugar D-allulose, D-glucose and D-fructose. be able to.
  • isomerized sugar or invert sugar which is a mixed sugar mainly composed of D-glucose and D-fructose, as a raw material.
  • Isomerized sugar is sugar composed mainly of D-fructose and D-glucose, which is isomerized by enzymes or alkalinization of corn syrup, which is mainly composed of D-glucose.
  • HFCS high-fructose corn syrup
  • sugar-mixed isomerized liquid sugar the above liquid sugar with 10% or more sugar added.
  • isomerized sugar is produced by an already established method. To produce isomerized sugar from starch, three enzymatic reactions, purification, and concentration are required as described below.
  • Liquefaction Add water and alpha-amylase, which is a hydrolytic enzyme, to starch and heat to about 95°C. As a result, the high-molecular starch is degraded to some extent.
  • Saccharification After liquefaction, cool to about 55°C and add glucoamylase. In this reaction, the sugar is broken down further into glucose.
  • Isomerization An isomerase, glucose isomerase, is added at 60° C. to convert about half of the glucose into fructose. The name isomerized sugar comes from this reaction (the reaction in which glucose isomerizes to fructose).
  • the liquid sugar is purified with a filter or an ion exchange device, and concentrated by evaporating water to obtain a high-fructose high-fructose liquid sugar with a fructose content of 42%.
  • high fructose liquid sugar with a fructose content of 90-95% can be produced by increasing the fructose purity by chromatography.
  • a high-fructose high-fructose liquid with a fructose content of 55% is produced.
  • the D-allulose 3-epimerase is acted to isomerize D-fructose in the raw material between D-fructose and rare sugar D-allulose. Isomerization is allowed to proceed through the reaction, and after terminating the reaction when the content of the target product reaches the target rare sugar D-allulose content, D-xylose isomerase, which does not act on the rare sugar D-psicose, is allowed to act. , it may be necessary to add a reaction step to proceed with isomerization by an equilibrium reaction between D-fructose and D-glucose.
  • invert sugar used as raw material It is a sweetener obtained by hydrolyzing sugar (sucrose) into fructose and glucose by acid or enzyme (invertase). It is sweeter than the same amount of sucrose, so it is possible to reduce the amount of sugar by inverting the sugar. It is also hygroscopic, which keeps the confection moist and prevents the sugar from crystallizing. Sucrose and glucose have weak right-handed rotation, and fructose has strong left-handed light. Therefore, a solution of glucose and fructose having the same number of molecules exhibits weak left-handed light, while sucrose has weak right-handed light. It was named invert sugar because the plane of rotation for polarized light is reversed.
  • Sucrose does not show reducing properties, but invert sugar shows reducing properties derived from glucose.
  • Invertase is a yeast-derived enzyme that makes invert sugar by breaking down (inverting) sugar (sucrose) into glucose and fructose.
  • Inverted sugar is characterized by its refined sweetness and mellow flavor, which is typified by honey.
  • Inverted liquid sugar is produced by, for example, keeping a 70% sucrose solution (warm water 300g, sucrose 700g) at 60°C, adding 4.2g of invertase (0.6% to sucrose), and reacting for about half a day while stirring. do.
  • D-allulose 3-epimerase (DAE) used in the present invention will be described together with D-xylose isomerase (DXI) used if necessary.
  • DAE D-allulose 3-epimerase
  • DXI D-xylose isomerase
  • Epimerase is an enzyme that, in the case of monosaccharides, moves the position of -OH attached to C to the opposite side, catalyzing the "reaction in which the chemical formula C6H12O6 does not change".
  • Epimerase is therefore an enzyme that belongs to the class of isomerases. Isomerase catalyzes a reaction in which the chemical formula does not change. Isomerases acting on hexoses catalyze a "reaction in which the chemical formula C6H12O6 is unchanged".
  • aldose isomerase catalyzes "intramolecular hydrogen transfer” and drives the redox reaction between C1 and C2 .
  • Isomerase is higher than epimerase. That is, the enzyme "isomerase” is well known in the art and includes, for example, ketose 3-epimerase (D-allulose 3-epimerase), D-xylose isomerase and glucose isomerase.
  • glucose isomerase is not the official scientific name. The enzyme name glucose isomerase is not included in the EC numbers registered with the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. This is not a "scientific enzyme name".
  • D-xylose isomerase is the scientific name and glucose isomerase is the only commonly used commercial name.
  • D-xylose isomerase acts on structurally similar D-glucose "only for humans", and D-glucose is not converted into D-fructose for use in the natural world.
  • Epimerase is included among isomerases. Therefore, it can be expressed as (a) "enzyme that isomerizes D-glucose to D-fructose" and (b) "enzyme that isomerizes D-fructose to D-allulose".
  • L-rhamnose isomerase of a certain microorganism acts on D-glucose and converts it to D-fructose. Also included is the L-rhamnose isomerase, if any. It also includes all proteins that convert D-glucose to D-fructose in organisms such as microorganisms, plants, and animals. In addition, when high fructose liquid sugar with a fructose content of 90-95% is used as a raw material, the rare sugar D-psicose is used as necessary to adjust the D-fructose content of the target product.
  • D-xylose isomerase used in the reaction step of allowing D-xylose isomerase, which does not act, to act on D-fructose to promote isomerization through an equilibrium reaction between D-fructose and D-glucose is also included.
  • enzymes that isomerize D-fructose to D-allulose are included in this even when proteins produced by all organisms convert D-fructose to D-allulose. Therefore, it includes all enzymes belonging to the EC number "EC.5.-(isomerase)". It is meant to include even newly discovered enzymes, other classes of isomerases, that have even the slightest ability to catalyze these reactions.
  • the term "isomerase” used in the present invention includes a wide group of enzymes.
  • ketohexose 3-epimerase (D-allulose 3-epimerase) Isomerization proceeds through the equilibrium reaction between D-fructose and rare sugar D-allulose, which isomerizes D-fructose in the raw material to rare sugar D-allulose, and the desired rare sugar D-allulose content of the target product It is used to terminate the reaction when reaching
  • This ketohexose 3-epimerase can be of any origin and any classification name as long as it is an enzyme that isomerizes D-fructose to D-allulose.
  • D-ketohexose 3-epimerase Patent Document 6 and non Patent Document 2 is exemplified.
  • the M30 strain is from NITE P-1111, which was originally deposited on June 22, 2011 at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Organism Depositary Center (2-5-8 Higashikazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). Transfer to deposit under the Budapest Treaty was requested on May 2, 2012, and the international deposit was made under accession number NITE BP-1111.
  • ketose 3-epimerase derived from Arthrobacter histidinolovorans strain Y586-1 International deposit number NITE BP-02813
  • International application designation PCT/JP2019/045672 International application designation PCT/JP2019/045672 .
  • the Y586-1 strain was internationally deposited at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganism Depositary Center located at 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan on November 7, 2018, with the accession number NITE BP. -02813.
  • Strain Y586-1 was originally identified as Arthrobacter protophormiae. After that, in the identification of the Japan Food Research Laboratories, it was determined to be Arthrobacter histidinolovorans, so a sequence search of the whole genome of the Y586-1 strain was performed.
  • the ketose 3-epimerase derived from the Y586-1 strain has about twice the activity of the enzyme produced per culture medium compared to the ketose 3-epimerase derived from Arthrobacter globiformis described in Patent Document 6 above. Therefore, by using it, it is possible to efficiently mass-produce D-allulose.
  • the optimum temperature of the enzyme is as high as 70°C, and even at 80°C, the relative activity is 59.4, which is about 60%, and the activity at 70°C at the optimum temperature is 100, indicating high heat resistance. .
  • the residual activity after incubation at 60°C for 1 hour is 49.4%, which means that it has heat resistance, so that a larger amount of product can be obtained in the reaction at the optimum temperature of 70°C.
  • the excellent heat resistance of this enzyme can be further enhanced by creating amino acid substitution mutants of the enzyme.
  • a mutation is introduced into the ketose 3-epimerase gene derived from the Y586-1 strain, and the corresponding amino acid residue is replaced with another amino acid residue by site-directed mutagenesis to create various amino acid substitutions.
  • an enzyme having higher thermostability than the wild-type enzyme without amino acid substitution can be obtained, and the mutant can be used.
  • the mutant is a protein consisting of (1) the name of the mutant sequence and (2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • D-xylose isomerase As long as D-xylose isomerase is an enzyme capable of isomerizing D-glucose to D-fructose, the origin and name of the enzyme are not limited (eg Patent Documents 5 and 7).
  • An inexpensive composition mainly composed of D-glucose and D-fructose used as raw materials is produced from starch, and D-xylose isomerase is used to act on D-glucose and D-fructose. It can be produced by promoting isomerization by an equilibrium reaction.
  • the rare sugar D-psicose is used as necessary to adjust the D-fructose content of the target product. It can be used in a reaction step in which D-xylose isomerase, which does not act, is allowed to act on D-fructose and isomerization proceeds through an equilibrium reaction between D-fructose and D-glucose (see FIG. 3).
  • D-xylose isomerase Commercially available D-xylose isomerase can be used.
  • These enzymes may be purified enzymes or enzyme-producing microorganisms. In the present invention, the purified enzyme or the enzyme-producing microorganism is used as an immobilized enzyme or immobilized microorganism in which the purified enzyme or the enzyme-producing microorganism is immobilized.
  • Enzyme immobilization By using an immobilized enzyme, it becomes possible to carry out a large-scale epimerization reaction continuously, and if a thermostable enzyme is used as the enzyme, its life span is extended. It is most practical to immobilize the enzyme on an appropriate substrate such as an ion-exchange resin.
  • ion exchange resins for example basic anion exchange resins, either strongly basic anion exchange resins or weakly basic anion exchange resins can be used.
  • weakly basic anion exchange resins include WA30 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), FPA54, and FPA95 (Organo Co., Ltd.).
  • a weakly basic anion exchange resin A111S from Purolite is used.
  • thermostable enzymes can extend their lifespan and further reduce production costs.
  • the overall manufacturing process can be applied in either batch mode or continuous mode.
  • D-glucose produced from starch is used to act on D-xylose isomerase (glucose isomerase) to produce a mixture of D-fructose and D-glucose.
  • An isomerization step of D-fructose using D-allulose 3-epimerase is performed in a series of steps, and glucose isomerase and D-allulose 3-epimerase are immobilized.
  • the epimerization reaction step using a mixture of D-fructose and D-glucose as a raw material and the isomerization step for producing the raw material are carried out in a series of steps, and the enzymes to be used are immobilized and individually used for production. It can be said that the method is a novel manufacturing method that has never existed before. Enzymatic isomerization can be used by immobilizing the enzyme, and various immobilization methods can be used to obtain a stable and easy-to-use immobilized enzyme. By using immobilized enzymes, it is possible to continuously perform large-scale isomerization and isomerization reactions. For example, using immobilized enzymes with an activity of 1000 U/g wet weight resin each.
  • a crude enzyme solution is collected from a solution of disrupted cells obtained by disrupting bacterial cells, and the crude enzyme solution is passed through an ion-exchange resin packed in a column at a low temperature (4 ° C.) to generate ions.
  • An immobilized enzyme can be obtained by binding a crude enzyme protein to an exchange resin and washing it by passing purified water through it.
  • An immobilization system is obtained which can withstand continuous production in terms of stability (retention of activity) which is completely satisfactory for commercial production.
  • the resulting immobilized enzyme can be used to perform a continuous large-scale isomerization reaction (epimerization reaction).
  • the carrier for immobilizing the enzyme any known carrier for immobilization can be used, and the carrier is not limited to the resin carriers exemplified above.
  • the outline of the production method of the present invention is as shown in FIGS. ), the reaction of converting D-fructose contained in the raw material to D-allulose proceeds, and the target product with a new composition of D-glucose, D-fructose and D-allulose is obtained.
  • D-allulose 3-epimerase acts to isomerize D-fructose in the raw material to the rare sugar D-allulose D-fructose and rare sugar D - Isomerization proceeds through the equilibrium reaction between allulose, and the reaction is terminated when the content of the rare sugar D-allulose in the target product, improved isomerized sugar or invert sugar, is reached, and the rare sugar D-allulose is , D-glucose and D-fructose, the content of D-fructose compensates for the sweetness, which is the weak point of D-allulose, and has a taste similar to that of sugar, the function of D-allulose Converted isomerized sugar or invert sugar with a taste similar to that of sugar with a specific property comes out of the column.
  • the resulting rare sugar-containing composition has the optimal range of D-glucose and D-fructose contents as energy sources, and the sweet and delicious D-fructose is added to its shortcomings (neutral fat in long-term continuous intake).
  • the amount is sufficient to compensate for the sweetness, which is the weak point of D-allulose and D-glucose, and the function of D-allulose is A rare sugar-containing composition (sweetener) having the same taste as sugar and containing D-allulose in an amount that exhibits its properties. It may be necessary to minimize the functionality of the sweetener with respect to the content of D-allulose.
  • Sports drinks should have a high content of D-glucose and D-fructose as energy sources.
  • the functionality of D-allulose is to suppress rapid sugar absorption and ensure sustained absorption, and such a function can be exhibited at a content of 5% by mass or more. already backed up.
  • the amount of D-allulose ranges from 5 to 30% by mass, preferably from 10 to 20% by mass.
  • D-fructose in the raw material is reacted with D-allulose 3-epimerase to convert it into the rare sugar D-allulose to obtain a mixture of D-fructose and rare sugar D-allulose.
  • a mixture of D-fructose and rare sugar D-allulose is an equilibrium mixture of D-fructose and rare sugar D-allulose, or a mixture of D-fructose and rare sugar D-allulose adjusted to a desired concentration .
  • D-glucose is converted to D-fructose by the action of D-xylose isomerase, and a mixture of D-glucose and D-fructose is obtained.
  • the mixture of D-glucose and D-fructose is either an equilibrium mixture of D-fructose and D-glucose or a mixture of D-glucose and D-fructose adjusted to the desired concentration. By not allowing the reaction to reach equilibrium, the content of D-glucose in the desired product can be altered.
  • One of the characteristics of sweeteners containing the target products D-glucose, D-fructose and D-allulose is sugar-like taste.
  • D-glucose is an important component as energy, and it is better to contain more for "zero hunger", but its sweetness is 65-80 when sugar is 100, and it is a sugar-like taste.
  • the D-glucose content is determined by the D-fructose and D-allulose content, since the sweetness of D-fructose is required to provide D-fructose has a sweetness of 120 to 170, and is important for giving sweetness, and is a component that gives a sugar-like taste together with D-glucose.
  • long-term continuous intake causes obesity.
  • D-fructose content is determined by the content of D-glucose and D-allulose so that the target product has a sugar-like taste.
  • the amount of D-fructose is adjusted to the extent that it does not adversely affect the accumulation of triglycerides, etc., and the content is adjusted to bring out the advantage that D-fructose is sweet, which compensates for the sweetness, which is the weakness of D-allulose.
  • the sweetness of the target product can be expressed as a calculated value based on past achievements, and can be evaluated as a sweetener with the same taste as sugar. Therefore, in the present invention, expressions such as sugar-like taste, taste similar to sugar, and taste similar to sugar are close to 100, which is expressed as a calculated value based on the sweetness of sugar (strength of sweetness) as 100, or It is equivalent to 100, and is an expression preferably adopted when corroborated by sensory tests.
  • D-glucose and D-fructose are produced by using D-glucose produced from starch and acting on D-xylose isomerase (DXI), or by degrading sugar by acting on invertase. can be used.
  • DXI D-xylose isomerase
  • DAE epimerase
  • Each of the two enzymes can be allowed to proceed under appropriate reaction conditions, and when a decrease in activity occurs, it can be easily dealt with by exchanging them individually.
  • [Feature 4] By performing two enzymatic reactions separately, it is possible to react only the target sugar.
  • the content of D-glucose as an energy source for the target substance is within the optimum range, and the sweet and delicious D-fructose is reduced to its shortcomings (long-term continuous intake is moderate). The amount is adjusted to the extent that it does not cause adverse effects on the accumulation of sexual fat, etc.), but it is a sufficient amount to compensate for the sweetness, which is the weak point of D-allulose, and the functionality of D-allulose.
  • the major feature is that it is a rare sugar-containing composition (sweetener) with the same taste as sugar containing a certain amount of D-allulose.
  • Various isomerized sugars for which mass production technology has been established it can be produced only with an epimerase column, and it is possible to make a product with the desired composition by properly using various types) and inexpensive
  • sugar which is produced and used in large quantities for bioethanol and which has a composition of D-glucose + D-fructose (1:1) is available at low cost
  • the conventional production line can be produced in a pure form without side reaction products by connecting in an appropriate form.
  • novel sweetener obtained in this way can be used in combination with sweeteners such as sucrose, sugar alcohols, aspartame, and stevia, if desired.
  • Sweeteners such as sucrose, sugar alcohols, aspartame, and stevia, if desired.
  • Water-soluble dietary fiber with low sweetness may be added as appropriate to impart body feeling.
  • D-glucose:D-fructose:D-allulose is 58:29.4:12.6 or 45:38.5:16.5 in a rare sugar-containing composition.
  • its content is not particularly limited when it is used by taking advantage of its sweetness and sweetness. It can be adjusted as appropriate depending on the degree of intended function, mode of use, amount of use, and the like.
  • the novel sweetener of the present invention which has the same taste as sugar, contains D-allulose and has an obesity-preventing effect. Moreover, it can be used in combination with other active ingredients for prevention of lifestyle-related diseases.
  • the sweetener composition of the present invention which has the same taste as sugar of rare sugars D-allulose, D-glucose and D-fructose, is a known sweetener composition containing rare sugars of D-glucose, D-fructose and D-allulose. Used for similar purposes.
  • the sweetener composition of the present invention is characterized in that it is a product such as isomerized sugar and invert sugar as raw materials, and is a product that has not undergone a separation operation by simulated migration chromatography.
  • it is characterized by being a product of raw materials such as isomerized sugar and invert sugar, and is liquid sugar itself that has passed through the immobilized enzyme reaction column.
  • Glucose, fructose, and D-allulose are all food products (in terms of approval and certification), and because they are food mixtures, they are extremely safe and easy to handle.
  • sugar compositions containing D-allulose include foods, beverages, especially functional foods (such as obesity prevention), pharmaceuticals, cosmetics, feeds, agricultural chemicals (plant growth regulators, plant disease resistance amplification agents, etc.) and industrial use.
  • Sweeteners with the same taste as sugar are used in foods, health foods, food for patients, food materials, food materials for health use, food materials for patients, food additives, food additives for health use, food additives for patients, and beverages.
  • health drinks, patient drinks, drinking water, health drinking water, patient drinking water, pharmaceuticals, pharmaceutical ingredients, feeds, sick animals and/or sick animal feeds, etc. can be done.
  • the sweetener having the same taste as the sugar of the present invention When used in foods, it can be used as it is, diluted with water, suspended in oil, emulsion, or commonly used in the food industry. You may prepare things, such as the form which added the carrier used.
  • the beverage form is non-alcoholic or alcoholic. Examples of non-alcoholic beverages include carbonated beverages, fruit juice beverages, non-carbonated beverages such as nectar beverages, soft drinks, sports drinks, tea, coffee, cocoa, and the like. 3 beer, sake, plum wine, wine, champagne, liqueur, shochu highball, medicinal liquor, and the like.
  • the form of use of the rare sugar-containing composition of the present invention as a food material or food additive for the purpose of improving the above-mentioned abnormal carbohydrate metabolism and/or abnormal lipid metabolism includes tablets, capsules, powder dissolved in beverages, etc.
  • solid formulations such as granules, semi-solid formulations such as jelly, liquids such as drinking water, and high-concentration solutions used after dilution.
  • a sweetener having the same taste as the sugar of the present invention can be appropriately added to foods to provide health food or sick food for the purpose of improving carbohydrate metabolism abnormality and/or lipid metabolism abnormality.
  • vitamins, carbohydrates, pigments, flavorings, etc. that are usually added to foods can be added as appropriate.
  • Food can be eaten in any form, liquid or solid. It can be eaten as a soft capsule that is encapsulated with gelatin or the like.
  • a capsule is made of a gelatin film prepared, for example, by adding water to raw gelatin to dissolve it, and then adding a plasticizer (glycerin, D-sorbitol, etc.).
  • a sweetener having the same taste as sugar of the present invention can be used as a sweetener for the same purposes as sugar. It can also be used for cooking, tea, coffee, and seasonings (such as mirin).
  • food and drink include the following. Western confectionery (pudding, jelly, gummy candy, candy, drop, caramel, chewing gum, chocolate, pastry, butter cream, custard cream, cream puff, hot cake, bread, potato chips, french fries, popcorn, crackers, pie, sponge cake, Castella, waffles, cakes, donuts, biscuits, cookies, rice crackers, rice crackers, okoshi, manju, candy, etc.), dried noodle products (macaroni, pasta), egg products (mayonnaise, fresh cream), beverages (functional drinks, lactic acid drinks) , lactic acid bacteria drink, concentrated milk drink, fruit juice drink, fruit juice-free drink, pulp drink, clear carbonated drink, carbonated drink with fruit juice, carbonated fruit colored drink), luxury goods (green tea, black tea, instant coffee, cocoa, canned coffee drink ), dairy products (ice cream, yogurt, coffee milk, butter, butter sauce, cheese, fermented milk, processed milk), pastes (marmalade, jam, flour paste, peanut paste, fruit paste, fruit syrup), Meat products (ham
  • the above foods and drinks can be processed and manufactured by blending the composition with ingredients for general foods according to a conventional method.
  • the amount of the composition to be added to the above-mentioned food and drink varies depending on the form of the food and is not particularly limited, but is usually preferably 0.1 to 50% by weight.
  • the above foods and drinks can also be used as functional foods, dietary supplements, or health foods.
  • the form is not particularly limited, and examples of food production include proteins such as milk protein, soybean protein, and egg albumin, which are highly nutritious and have a good amino acid balance, their decomposition products, and egg white oligos.
  • proteins such as milk protein, soybean protein, and egg albumin, which are highly nutritious and have a good amino acid balance, their decomposition products, and egg white oligos.
  • proteins such as milk protein, soybean protein, and egg albumin
  • mixtures of simple amino acids and the like can be used according to conventional methods. It can also be used in forms such as soft capsules and tablets.
  • Examples of nutritional supplements or functional foods include liquid foods, semi-digested nutritional foods, component nutritional foods, drinks, capsules, and oral formulas containing sugars, fats, trace elements, vitamins, emulsifiers, flavorings, etc. Processed forms such as enteral nutrients can be mentioned. Foods and drinks such as sports drinks and nutritional drinks may further contain nutritional additives such as amino acids, vitamins and minerals, as well as sweeteners, spices and flavorings to improve nutritional balance and flavor. , pigments and the like can also be blended.
  • Functional foods are suitable for use in the fields of health foods and preventive medicines that prevent specific diseases (obesity prevention).
  • dyes, perfumes, etc. can be appropriately added.
  • Food can be eaten in any form, liquid or solid. It can be eaten as a soft capsule that is encapsulated with gelatin or the like.
  • a capsule is made of a gelatin film prepared, for example, by adding water to raw gelatin to dissolve it, and then adding a plasticizer (glycerin, D-sorbitol, etc.).
  • the sweetener having the same taste as the sugar of the present invention is used as a food additive
  • its form can be appropriately selected. directly prepared as food, added to other food, or any form commonly used in food or health food, such as capsules and tablets.
  • it is appropriately mixed with excipients, extenders, binders, thickeners, emulsifiers, coloring agents, flavoring agents, food additives, seasonings, etc. It can be molded into powder, granules, tablets, etc., depending on the application. Furthermore, it can be ingested by mixing it with food raw materials to prepare food and commercializing it as a functional food.
  • the sweetener composition of the present invention can be applied as feed for livestock, poultry and pets.
  • it can be incorporated into dry dog food, dry cat food, wet dog food, wet cat food, semi-moist dog food, poultry feed, and livestock feed such as cattle and pigs.
  • the feed itself can be prepared according to a conventional method.
  • These therapeutic and prophylactic agents can be used in animals other than humans, such as livestock mammals such as cattle, horses, pigs and sheep; poultry such as chickens, quail and ostriches; pets such as reptiles, birds and small mammals; It can also be used for farmed fish.
  • agents intended to improve carbohydrate metabolism disorders and/or lipid metabolism disorders, and obesity improvement effects intended to express physiological actions can be used alone or in general.
  • Appropriate additives such as excipients, stabilizers, preservatives, binders, and disintegrants are blended into liquids, granules, fine granules, powders, tablets, capsules, pills, dusting agents, sprays, etc. can be prepared by selecting an appropriate dosage form and administered orally or nasally.
  • compositions of the present invention can be used to prepare the composition of the present invention as a medicament.
  • stabilizers, wetting agents, emulsifiers, and salts for altering the osmotic pressure and maintaining an appropriate pH of the formulation can be appropriately used as auxiliary agents.
  • the dosage form When used as a pharmaceutical composition, a known method can be used for its formulation.
  • the dosage form can be appropriately selected, and examples of such dosage forms include tablets, granules, powders, capsules, coatings, liquids, suspensions, etc. when preparing oral preparations. Forms such as injections, drip infusions, and suppositories can be exemplified in the case of preparations for parenteral administration.
  • the dosage can be appropriately set according to the dosage form, administration method, purpose of use, and the age, body weight, and symptoms of the subject to be administered to which the pharmaceutical composition is applied.
  • a sugar composition containing the active ingredient, the rare sugar D-allulose ( D-psicose), is used not only as such but also as a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Such formulations or pharmaceutical compositions can be administered by oral or parenteral routes, as described above.
  • solid or fluid (gel and liquid) formulations or pharmaceutical compositions for oral administration take the form of tablet, capsule, tablet, pill, powder, granule or gel preparations.
  • a formulation or pharmaceutical composition will vary with its intended use and duration of treatment and will be that amount deemed appropriate by the attending physician or veterinarian. Dosage and dosage can be adjusted as appropriate depending on the form of preparation. Oral solid preparations such as tablets, or oral liquid preparations may be administered once or in several divided doses per day. In addition, for example, in the form of a syrup, troche, chewable tablet, etc., which can be administered to infants as a matter of urgency, acting locally as well as exerting systemic action by oral administration, 1/2 to 1/10 of the daily dose is taken as a single dose. They may be mixed and taken, and in this case the total dose does not have to be less than the daily dose.
  • an amount equivalent to the daily dose may be blended as a single dose, provided that the dose is not unreasonable in view of the form of the formulation.
  • Diluents and excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, coating agents, sustained-release agents, etc. can be used in the preparation of formulations. .
  • solubilizers in addition, solubilizers, buffers, preservatives, solubilizers, tonicity agents, emulsifiers, suspending agents, dispersing agents, thickeners, gelling agents, hardening agents, absorbents, Adhesives, elastic agents, plasticizers, adsorbents, fragrances, colorants, flavoring agents, antioxidants, moisturizing agents, light shielding agents, brightening agents, antistatic agents, and the like can be used.
  • the present invention is known as a skin external preparation, that is, a therapeutic agent, a skin external preparation, a cosmetic, etc., that utilize the skin moisturizing, skin antioxidant and skin anti-aging effects of the rare sugar D-allulose (D-psicose) ( Patent Document 8) It is possible to provide an external preparation for skin that has an effect of improving and preventing rough skin.
  • aqueous Ingredients oily ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, thickeners, UV absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, fragrances, coloring agents, various skin nutrients, etc., as needed can be blended as appropriate.
  • sequestering agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, gluconic acid, caffeine, tannins, verabamil, licorice extract, glabridin, quince fever Water extracts, various crude drugs, drugs such as tocopherol acetate, glycyrrhizic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, ascorbate glucoside, arbutin, kojic acid, D-glucose, D-fructose , sugars such as trehalose, etc., can be added as appropriate.
  • drugs such as tocopherol acetate, glycyrrhizic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, ascorbate glucoside, arbutin, kojic acid, D-gluco
  • sugar compositions containing the rare sugar D-allulose include, for example, oils and fats such as vegetable oils, waxes such as lanolin and beeswax, hydrocarbons, fatty acids, higher alcohols, esters, various Appropriate blend of ingredients used as raw materials for normal external skin preparations, such as surfactants, pigments, fragrances, vitamins, plant and animal extracts, UV absorbers, antioxidants, preservatives, and bactericides. and can be used to manufacture external preparations for skin.
  • oils and fats such as vegetable oils, waxes such as lanolin and beeswax, hydrocarbons, fatty acids, higher alcohols, esters, various Appropriate blend of ingredients used as raw materials for normal external skin preparations, such as surfactants, pigments, fragrances, vitamins, plant and animal extracts, UV absorbers, antioxidants, preservatives, and bactericides. and can be used to manufacture external preparations for skin.
  • the external preparation for skin may be in any form such as ointments, creams, milky lotions, lotions, packs, bath agents, etc., as long as it is in the form used for conventional external preparations for skin, and the dosage form is not particularly limited. That is, when it is used as a skin external preparation, its dosage form can be appropriately selected.
  • formulations obtained by impregnating or coating sheets such as non-woven fabrics can be mentioned.
  • Patent Document 9 Another group of the present inventors, with the aim of providing a substance that has the effect of amplifying the disease resistance of plants, which has the potential to dramatically reduce the amount of pesticides used, Although the invention of a disease resistance amplifying agent has already been registered (Patent Document 9), research and development have progressed dramatically since then, and there are multiple patents.
  • soluble films have come to be used for formulating cosmetics and the like.
  • an edible soluble film is used as a flavor film or the like holding a perfume or the like for the purposes of a change of mood, prevention of bad breath, and the like.
  • Soluble films have been proposed that exhibit excellent solubility and film properties as packaging materials for foods, pharmaceuticals, etc., and as carriers for holding active ingredients of foods, pharmaceuticals, etc., and can be suitably used for these applications. (Patent Document 10), in this way, the sweetener having the sweetness and taste of sugar of the present invention can be applied to pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics.
  • they can be administered orally in the form of capsules, powders, tablets, etc. Since they are soluble in water, administration methods such as intravenous injection and intramuscular injection can be adopted in addition to oral administration.
  • the dosage varies depending on, for example, the severity of symptoms of diabetes, body weight, age, sex, etc., and it is desirable to determine an appropriate dosage according to the symptoms.
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 above was used as the D-allulose 3-epimerase.
  • Weakly basic anion exchange resin A111S manufactured by Purolite was used as an immobilization carrier.
  • D-fructose 50:50
  • D-glucose: D-fructose: D-allulose 51.0: 34.7: 14.3 in equilibrium (Fig. 7)
  • D-glucose: D-fructose 45: 55
  • D-glucose: D-fructose: D-allulose 45.6: 38.8: 15.6 in equilibrium (Fig. 8).

Landscapes

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Abstract

課題：D-アルロースを含有する砂糖の甘味度および味質に非常に近い甘味料を、価格競争力を有する低コスト、かつ、世界的規模で大量生産すること。 解決手段： D-グルコースとD-フラクトースを含む安価な組成物を原料として用い、D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成物において、D-フラクトースの含有量が、D-アルロースの弱点である甘味度を補うとともに、D-アルロースおよびD-グルコースとともに砂糖に近い味質を与える範囲である、目的生成物を得ることを特徴とする、D-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法。

Description

Ｄ－アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法
　本発明は、D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロース（D-プシコース）からなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法に関する。特に、D-グルコースとD-フラクトースを含む混合糖である安価な異性化糖または転化糖を対象に、味質を維持したまま、あるいは改善して、継続摂取で疾病を引き起こさない優れた生理的効果を発揮する機能を付与する、異性化糖あるいは転化糖をD-アルロースの機能性を持つ甘味料へ変換する異性化糖または転化糖の改善方法に関する。
　生物にとってエネルギー源等として、特に「飢餓をゼロに」のために非常に重要であり、地球上に最も多く存在する有機化合物である炭水化物は、単糖類を主な構成要素としている。これら単糖類は、代表的には炭素数３ないし８の炭素原子が環状に連なった構造を有していて、構造的に、アルドースとケトースの２種類に大別される。アルドース及びケトースのそれぞれが、前記炭素原子の数によってトリオース、テトロース、ペントースおよびヘキソースのように分類されている。そして、上記単糖類の反応について、工業的に実施されている反応としては、D-グルコースをD-フラクトースへ異性化し、異性化糖を製造する反応を挙げることができる。代表的な方法はトウモロコシデンプン等のデンプンから製造される。トウモロコシの生産量の増加により、市場に出た大量のコーンスターチを利用して、異性化糖が大量に安価に作られ、砂糖の値段よりも非常に安くなり、砂糖の代わりを担うようになった。
　一方で、二糖類である砂糖は、異性化糖が普及する以前は高価であったことから、異性化糖に取って代わられる傾向が続いてきたが、２０１９年度では世界で１億８千万ｔほど生産されており、価格も比較的安定してきている。砂糖を原料とすることで、砂糖の良質な甘味を利用できるし、また、砂糖は、ぶどう糖と果糖が結合した二糖であるので、ぶどう糖および果糖の供給原料としても利用できるので、砂糖の価格によっては異性化糖よりコスト的に安くなると考えられる。さらに、砂糖を原料とした希少糖を含む甘味料は、異性化糖を原料とした甘味料よりも雑味が少なくなるという利点もあると報告されている（特許文献１）。
　これら資化性糖をベースに、甘味および物性面で優れた甘味料の工業的な大量生産がなされている。
　異性化糖の代表的な製造方法は、トウモロコシデンプン等のデンプンに、水と液化酵素（アルファーアミラーゼ）を加え、９５℃前後で加水分解してデキストリンとする。これは液化といい、液化終了後５５℃程度まで冷却し、糖化酵素（グルコアミラーゼ）を加えて、さらに小さくD-グルコースにまで分解する、すなわち糖化液とする。この糖化液中にはD-グルコースの他にオリゴ糖が若干含まれている。グルコアミラーゼで糖化した糖化液を、例えばストレプトマイセス属等の菌種に属する菌が生産する異性化酵素（グルコースイソメラーゼ）を各種の方法で固定化した固定化酵素中を連続的に通過させ、D-グルコースをD-フラクトースに異性化する。上記異性化は、平衡点が１付近に存在する平衡反応であり、平衡到達時において、約６０℃の反応温度でD-グルコースの約５０％をD-フラクトースへ異性化することができるのであるが、この程度まで異性化を進めるには相当長時間を要し、この長時間の加熱のために反応液が着色してしまい、市販するための精製、濃縮工程でのコストを上昇させてしまうため、D-フラクトースの含有量が約４２％程度にまで異性化が進行した段階で反応を終了させている。その後、精製・濃縮すると、果糖分４２％のぶどう糖果糖液糖を得ることができる。
　これらの製造に使用される酵素は、いずれも安全な微生物の作り出すものである。すなわち、グルコースイソメラーゼによるD-グルコースのD-フラクトースへの異性化反応は平衡反応であり、異性化糖のD-グルコースとD-フラクトースとの比率は通常５８：４２程度である。該D-フラクトース分４２％のぶどう糖果糖液糖の甘味度は、砂糖の甘味度（甘みの強さ）を１００とすると、７０－９０である。
　さらにクロマトグラフィーという分離装置を用いることによって、果糖分５５％のものも作れる。すなわち、上記４２％異性化糖を５５％異性化糖とするには、陽イオン交換樹脂を充填した反応塔のような大掛かりな設備を利用した連続的糖分離をすることによってまずD-フラクトース含量約９５％のD-フラクトース液を得、次いでこのD-フラクトース液と前記４２％異性化糖を混合する。あるいは、甘味不足を解消するために、精製D-フラクトースを添加する場合があるが、これらの場合最終のD-グルコースとD-フラクトースとの比率は通常４５：５５程度である。
　該D-フラクトース分５５％の果糖ぶどう糖液糖の甘味度は、砂糖の甘味度（甘みの強さ）を１００とすると、１００－１２０である。
　砂糖の甘味度（甘みの強さ）を１００とすると、D-グルコースの甘味度は６５－８０、D-フラクトース１２０－１７０である。甘味度の強さはD-フラクトース（果糖） > ショ糖（砂糖） > D-グルコース（ぶどう糖）の順であるが、D-フラクトースは高温ではショ糖の６０％の甘味度しかなく、４０℃でショ糖とほぼ同一、それ以下の温度でないとショ糖よりも甘くならないので、異性化糖の甘さは温度によって大きく左右される。
　１９７０年代後半にクロマトグラフィー果糖濃縮技術の出現により異性化糖の大量生産が可能となり、急速に普及し、異性化糖の消費が増加し砂糖の消費が減少し、砂糖の代わりを担ってきたといえる。甘さをショ糖と同等に調整したD-フラクトース５５％、D-グルコース４２％のhigh-fructose corn syrup （HFCS）５５が、ソフトドリンクに使用されるなど、新しい砂糖といえるほど最も普及している。
　D-グルコースとD-フラクトースを主組成とする混合糖である異性化糖または転化糖は、経済的メリットにより広く使われているが、日本、アメリカなどを始めとする先進国において、高血糖や過体重（肥満）（「メタボリックシンドローム」）などの原因として疑われている（非特許文献１）。D-グルコースと比較してD-フラクトースの肝臓での代謝は脂質生成を促進しやすく、高脂血症や肥満を誘導しやすいことから、果糖ぶどう糖液糖に含まれるD-フラクトース摂取量と肥満者（生活習慣病）の増加の関連について注目されている。
　また、上記のとおり、異性化糖の甘味度や甘味質は、広く一般に使用されている砂糖に比べ、差が見られ、D-グルコースと果糖の比を変えることになどにより、砂糖の甘味度、甘味質に近づける工夫がされているが、満足のいくものが確立しているとまではいえない。
　生物にとってエネルギー源等として非常に重要であるこれら資化性糖をベースに、甘味および物性面で優れ、かつ、これらの疾病を引き起こさない甘味料の上市に向けていくつかの開発が進んでいる。
　資化性糖の機能面の改善にはエネルギーゼロで各種機能性があるD-アルロースが注目されている。
　D-アルロースは、希少糖の一種であるが、D-フラクトースにＤ－ケトヘキソース３－エピメラーゼ（特許文献２）を作用させるとD-フラクトースから収率２０～２５％で生成する。また、Ｄ－アルロース３－エピメラーゼ（非特許文献２）を使用した場合は、４０％の収率でD-アルロースが生成すると報告されている。
　純粋な希少糖D-アルロース（＝D-プシコース）製造は、例えばケトース３－エピメラーゼ（例えば、D-アルロース３－エピメラーゼ）を用いてD-フラクトースを原料として生産している。希少糖D-アルロースはD-フラクトースにエピメラーゼを作用させ、D-フラクトースとD-アルロースの混合物を作り、それを分離精製することで粉末結晶のD-アルロースを作ることができる。D-アルロースは、ゼロキロカロリー（非特許文献３）、食後血糖抑制効果（非特許文献４）、食物および飲料により摂取した消化性糖を構成するＤ－グルコースによる急激な血糖値上昇の抑制効果（特許文献３）、抗肥満効果（非特許文献５）など生活習慣病予防素材としての特質を示すことが明らかにされている。
　このD-アルロースはそれ自身で甘味料、医薬品等の用途があり、世界中で大量生産され販売が始まっている。このD-アルロースはエネルギーゼロで各種機能性があることから、特に甘味料としての販売が先行している。
　しかし、精製D-フラクトースの製造を行ってからD-アルロースの製造を行う場合、別々の工程で行うため、原料、輸送、反応コストやプラント運営コストなどの制約を受け、D-アルロースの工業的大量生産には経済的な面で解決するべき課題が多いのが現状である。
　希少糖D-アルロースはＤ－プシコースともいい、Ｄ－フラクトースのエピマーであり、甘味の質においてＤ－フラクトースに類似している。しかし、砂糖と比較すると約７割の甘味度であり、甘味度を砂糖に近づける必要がある。食物および飲料とともに摂取した場合に、それらに含まれる消化性糖を構成するＤ－グルコースによる急激な血糖値上昇の抑制効果を発揮する希少糖D-アルロースを異性化糖に混合する技術が開発されている。
　一つは、異性化糖を原料とし、化学反応を用いて（塩基性イオン交換樹脂、アルカリ、およびカルシウム塩からなる群から選ばれる一種以上が存在する系で処理することにより）希少糖を含有するシロップ、レアシュガースィ－ト（ＲＳＳ）を生産している（特許文献４）。D-グルコースおよびD-フラクトースを主成分に、希少糖(D-アルロース５．４％、Ｄ-タガトース２．０％、D-アロース１．４％など)が15％程度含まれたシロップである。
　二つ目は、従来の甘味料としての果糖ぶどう糖液糖の甘味質ともに砂糖とは異なっている問題点を解決して、砂糖の甘味度および味質に非常に近い甘味料にすることを目的とするもので、D-フラクトース、D-グルコースおよびD-アルロースよりなる砂糖とほぼ同様の甘味度および味質を有する甘味料であって、かつ、異性化糖の肥満効果を抑制するための甘味料であり、Ｄ－グルコースおよびＤ－アルロースの合計１００重量部に対して、Ｄ－アルロースが９重量部以上であり、Ｄ－フラクトース、Ｄ－グルコースおよびＤ－アルロースの合計１００重量部に対して、Ｄ－フラクトースが３４～５５重量部であり、およびＤ－フラクトース、Ｄ－グルコースおよびＤ－アルロースの合計１００重量部に対して、Ｄ－グルコースおよびＤ－アルロースの合計が６６～４５重量部である甘味料が開発されている（特許文献５）。
特許第６２５０９４６号公報 特開平６－１２５７７６号公報 特許第５１７１２４９号公報 特許第５７１５０４６号号公報 特許第５６３９７５９号公報 特許第５９９７６９３号公報 特許第５９２２８８０号公報 特開２０１７－３６２７６号公報 特許第４００９７２０号公報 特開２００７－９１６９６号公報
Am. J. Clin. Nutr. 2004, 79, 774-9. The 3rd Symposium of International Society of Rare Sugars J. Nutr .Sci. Vitaminol. 48,77-80. J. Nutr. Sci. Vitaminol.59, 191-121. J. Clin. Biochem. Nutr., 30,55-65.
　上記二つの方法により製造される目的生成物は、優れた生理的効果を発揮する異性化糖ではあるが、世界的な規模の大量生産をするには価格競争力を有しているとはいえない。いかにコストを削減するかが課題となる。CO2排出の削減という新たな課題が突きつけられている昨今、CO2の排出はコストとなり、コスト構造の中でその重みを増して行くと予想される。CO2の排出削減を可能とする新製造プロセスの開発が求められる。上記二つの方法による原理的に可能な「もの作り」を効率的に実現させる世界レベルで戦える新製造プロセスの創設こそ大きなインパクトを生むコスト削減と考える。
　トウモロコシやさとうきびは、バイオマスとして理想的な特質をもっている。トウモロコシの生産量の増加により、市場に出た大量のコーンスターチを利用して、異性化糖が大量に安価に作られ、砂糖の値段よりも非常に安くなり、砂糖の代わりを担うようになった。しかしながら、トウモロコシの異性化糖への安定的な供給は、異性化糖を改善することによってしか担保され得ないと考える。
　なぜならば、コーンスターチやシロップからはアルコールがつくられ、該バイオエタノールから脱水反応させてエチレンを生成し、いわゆるバイオマス由来のポリエチレンが大量に製造されている。世界のポリエチレン価格はコストの高いナフサベースで決定されているため、バイオポリエチレンは化石燃料ベースのポリエチレンと価格競争力を有していると考えられる。バイオポリエチレンの温暖化ガス削減効果については、石油由来のポリエチレンの５分の１となっている。バイオポリエチレンは、地球温暖化に優しい材料を使っているということを消費者にアピールできるとして、化石燃料のポリエチレンの一部あるいは全部に置き換えられている。こうしたエタノールのトウモロコシ需要急増により、品不足から価格高騰もあり得るのであり、「飢餓をゼロに」のために求められる今を超える大量の異性化糖の原料に回ってくる保証はないのである。
　また、収穫されたさとうきびはすべてが製糖工場に集められ、砂糖に加工され、バイオマスの利用で最大の問題となる収集システムはすでに確立されている。さとうきびは、その生産性と多用途性から、バイオマスとして他の作物には類のない大きな利点をもっている。温暖化対策の一環としてバイオマスが注目されている中で、さとうきびを利用したエタノール生産が行われており、バイオマス生産性の高いさとうきびは、温暖化対策の切り札となりつつある。コーンスターチと同様に品不足による価格高騰が懸念される。
　異性化糖や転化糖の問題点は、継続摂取で肥満などの生活習慣病の原因となることである。異性化糖は、その成分であるD-フラクトースが低温であるほど甘味が強いため、その消費量全体の約７０％が清涼飲料等の飲料に添加され、それ以外は食品全般に利用されている。このように過剰なまでの資化性糖による甘味を安易に得られる時代になったからこそではあるが、異性化糖や砂糖に代表される糖質(資化性糖)は糖尿病や肥満を併発することが昨今問題視されており、これら資化性糖をベースに、甘味が優れ、これらの疾病を引き起こさない甘味料でなければ「飢餓をゼロに」のためのエネルギー源に供し得ない。
　具体的には、食物および飲料により摂取した消化性糖を構成するＤ－グルコースによる急激な血糖値上昇の抑制作用があるD-アルロースを含有する砂糖の甘味度および味質に非常に近い甘味料を、価格競争力を有する低コスト、かつ、世界的規模で大量生産するための製造方法が求められている。また、本発明は、低コストで製造されたD-アルロースを含む甘味が優れ、長期摂取でも疾病を引き起こさない甘味料を用いた飲食物、医薬品もしくは医薬部外品、化粧品を提供することを目的とする。
　本発明者らは、D-アルロースを生産し、その有効性にのみ注目してきた希少糖の研究を、光合成で太陽の光エネルギーを植物が単糖のC6H12O6 のぶどう糖とその重合物のでんぷん、ぶどう糖と果糖の二糖とし、人類へと流れるこのエネルギーの流れに乗せて循環させることを思い付いた。エネルギー源として糖は重要な働きを持つこと、人類、生物にとっては必須のものであること、多くの解決するべき課題も存在すること。しかし、この身近にあるぶどう糖はD-キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）などのイソメラーゼで異性化糖、砂糖はインベルターゼでぶどう糖と果糖へ変換され利用される。甘味料はもとより多くの安価な有機化学分野の原料としても利用され始めている。異性化糖、砂糖（転化糖）が安価で世界中での利用が日常となって、世界の動き、人類が直面している大きな課題を認識して、希少糖の有効性を役に立たせることができることを見いだした。D-アルロースは、異性化糖、砂糖などの問題点を解決するための、全世界で生産を開始された希少糖となると確信したのである。
　D-アルロースの有効性と安価な異性化糖、砂糖（転化糖）との融合は、本発明者らにとって足元にある酵素ケトース３-エピメラーゼ（例えば、特許文献６、ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４５６７２）が担った。既に世界的レベルで利用されている果糖を原料として生産されてきている新たな糖産業であるが、安価な異性化糖、砂糖（転化糖）を、研究者レベルでは足元にあるケトース３-エピメラーゼを駆使して価値ある組成物を安価に作ることを可能とした。
　すなわち、ぶどう糖、果糖、D-アルロースを適切な比率で生産することで、目的物を安価に大量に生産することを可能とした。異性化糖、砂糖等が肥満などの問題点から、人類のエネルギー源としての重要性の認識が低下している。そのため、これらをバイオエタノールなどとして安価に用いられている社会情勢が進んでいる。この糖質に関わる重要課題を解決するために、バイオの力(ケトース３-エピメラーゼ)を利用し、これらの糖の問題点を解消し、人類にとってエネルギー源として適切な糖質へ変換する。本発明はこの「飢餓をゼロに」へ繋げるものとしての発明である。
　ケトース３-エピメラーゼはD-フラクトースを、機能性を持つD-アルロースへ変換する。本発明では原料としてD-フラクトースを含むどのような糖質でも原料として用いることが可能である。代表として、異性化糖、転化糖である。組成はD-グルコース、D-フラクトース、D-アルロースであり、ケトース３-エピメラーゼのみで期待する組成の糖が生産可能である。ぶどう等の異性化、砂糖の加水分解は既に大規模に行われている工場で実施されているものを利用すると位置付けで、新たにケトース３-エピメラーゼのみのバイオリアクターを追加するという、極めてシンプルな方法を見出した。糖工業で行われている反応を本発明の中に取り込んだ構想（＝新製造プロセスの創設）とすることで本発明は完成した。
　さらに、その新製造プロセスのコストパフォーマンスを高めるために酵素ケトース３-エピメラーの高耐久性（寿命）に着目した。本発明者らは、日本だけでなくヨーロッパおよびアメリカにおいて食品として使用が認められている、リストに載っている毒性がほとんどないとされる菌種に着目して、各地の土壌を採取し、そこから微生物を分離し、ケトース３－エピメラーゼ活性を有する微生物の探索を続けた。その結果、数多く単離した菌株の中に新規なケトース３－エピメラーゼを産生する微生物を見出した。それは、アルスロバクター属微生物であるアルスロバクター　ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）　Ｙ５８６－１株であり、活性が高く、かつ高耐熱性の新規なケトース３－エピメラーゼを産生するので、別途国際出願をした〔ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４５６７２（国際出願日２１．１１．２０１９）〕。その高耐熱性と高生産性からは、活性というよりも酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性が約束されると確信した。
　以上のとおりであり、まとめると、本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねてきたその中で、
（A）D-グルコース、D-フラクトース、D-アルロースを含有する甘味料の特徴が（ｉ）D-グルコースがエネルギー源として重要であること、（ii）D-フラクトースが甘味を与えるのに重要であり、かつ、D-グルコースとともに砂糖に近い味質を与えること、一方で長期の継続摂取で肥満の元凶となるなどの糖としての課題があること、および（iii）D-アルロースが抗肥満などの生理機能が存在することにあることを認識した。
　その認識のもとに、（B）３種の糖の組成を適切なものとすることにより目的に応じた組成の安価な甘味料を提供できることを見いだした。
　その生産原料としては、D-アルロースの生産にはD-フラクトースが存在する安価な原料である必要があること、D-フラクトースが存在する安価な原料については、（ｉ）D-フラクトースはD-キシロース イソメラーゼによりD-グルコースから容易に生産可能であるので、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いることができること、（ii）異性化糖はD-グルコース+D-フラクトースとして各種の組成のものが安価に市販されており、原料となり得ること、（iii）砂糖はD-グルコースがD-フラクトースとが結合した安価な甘味料であり、容易にインベルターゼで分解され、したがって、バイオエタノール生産にも使える安価な原料となり得ると考えた。生産原料に関する上記の（ｉ）ないし（iii）の知見から、生産原料はD-グルコースあるいは D-フラクトースであればよいのであり、大量生産技術が確立している各種異性化糖（エピメラーゼカラムのみで生産可能となり、各種のものを使い分けることで期待する組成の生産物を作ることが可能である。）および安価な砂糖（バイオエタノール用として大量に生産され、利用されているものでD-グルコース+D-フラクトース(1：1)の組成のものが安価に利用可能である。）を用いることとした。そうした生産原料を用いると、従来の製造ラインを適切な形で接続することで副反応生成物を含まない純粋な形態で製造できること、特別な精製工程を付加させる必要がない。
　そして、（C）次に、高耐熱性と高生産性のD-アルロース３－エピメラーゼを作用させる酵素反応を用いて酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性を実現し、かつ、擬似移動層クロマトグラフィーは用いることなく生産することで、十分価格競争力を有する世界的な規模の大量生産を可能とした本発明に到達した。
　本発明は、下記の（１）ないし（１０）のD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法を要旨としている。
（１）D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法であって、
D-グルコースとD-フラクトースを含む安価な組成物を原料として用い、
D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、
希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成物において、D-フラクトースの含有量が、D-アルロースの弱点である甘味度を補うとともに、D-アルロースおよびD-グルコースとともに砂糖に近い味質を与える範囲である、目的生成物を得ることを特徴とする、方法。
（２）前記目的生成物において、D-グルコースはエネルギー源として重要であるが、砂糖の甘みの強さを１００とすると６５－８０であること、
D-フラクトースは甘みの強さ１２０－１７０であり甘味を与えるのに重要であり、D-アルロースおよびD-グルコースとともに砂糖に近い味質を与えるが、一方継続摂取により肥満の元凶の糖としての課題があること、
　D-アルロースは、甘みの強さ７０であり、抗肥満および消化性糖による急激な血糖値上昇の抑制の生理機能を付与できることの各成分の特徴を考慮して、各成分の含有量を決定して目的に応じた適切な組成とする、上記（１）に記載の方法。
（３）前記原料が、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いて、D-キシロースイソメラーゼを作用させてD-グルコースとD-フラクトース間の平衡反応により異性化を進行させて生産した、または砂糖にインベルターゼを作用させて分解して生産した、D-グルコースとD-フラクトースを含む組成物である上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記原料が安価な異性化糖または転化糖であり、目的生成物がD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の、継続摂取で疾病を引き起こさない優れた生理的効果を発揮する改善型異性化糖または転化糖である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記の安価な異性化糖としてぶどう糖果糖液糖および／または果糖ぶどう糖液糖を用いる上記（４）に記載の方法。
（６）用いるD-アルロース３-エピメラーゼの酵素活性を調整することで、目的生成物の希少糖D-アルロース含有量にすることを特徴とする上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記異性化反応が、基質溶液を固定化酵素カラムの中を通過させて行う反応であって、かつ、基質の流速、基質との反応時間、反応温度、基質溶液のpH、および酵素量からなる群から選ばれる１以上を調整することで、目的物の組成を目的のものにすることを特徴とする上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の方法。
（８）原料を基質として固定化酵素反応を用い、理論上は副生産物を生産することなく１００％目的生産物として得ることを特徴とする、上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の方法。
（９）目的生成物が、製造工程中に疑似移動クロマトグラフィーによる分離操作で失われることはないことを特徴とする、上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させた後に、
希少糖D-プシコースに作用しないD-キシロースイソメラーゼを作用させて、D-フラクトースとD-グルコース間の平衡反応により異性化を進行させる反応工程を付加させることを特徴とする、上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記原料が安価な異性化糖として、高果糖液糖を用いる上記（１０）に記載の方法。
（１２）用いるD-アルロース３-エピメラーゼの高耐熱性からの該酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性に基づく工業的に実用可能な低コストの製造方法である、上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の方法。
　本発明により、D-グルコースとD-フラクトースを主組成とする混合糖である異性化糖または転化糖を対象に、味質を維持したままあるいは改善して、継続摂取で疾病を引き起こさない優れた生理的効果を発揮する機能を付与する改善方法を提供することができる。
　D-フラクトース（果糖）は甘くて美味しいという利点があるが、長期継続摂取で中性脂肪の蓄積などへと悪い影響を示す欠点から、それを含む異性化糖が肥満などの元凶と言われる所以である。D-フラクトースを長期継続摂取欠点が出にくい量に調整し、D-フラクトースが甘いという利点を引き出す組成に調整され、D-アルロースの弱点である甘味度を補い、かつ、D-アルロースの機能性を持った新たな甘味料を作り出すことができる。本発明の、砂糖と同じ味質の希少糖含有組成物は、D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースの組成の組成物であるから、食品、飲料、特に機能性食品(肥満予防など)はもとより、医薬品、化粧品、飼料、農薬(植物成長調整剤、植物病害抵抗性増幅剤など)、工業用の用途に用いることができる。
　本発明により、原料と酵素反応１つとし、必要により二つ目の酵素反応を付加することで、および／または、さらに必要により原料製造に酵素反応を付加することで、何かを添加することがない簡便な方法でD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料を大量生産する方法を提供することができる。新たな設備投資的なコストはかからず、エピメラーゼ、必要によりイソメラーゼをそれぞれ適した条件で反応することで完成すること、連続あるいは個別の反応を自由に使って製造が可能であること、酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性を特徴とする製造方法を提供することができる。
　従来の糖質甘味料、例えばＨＦＣＳやD-アルロースなどを生産する場合は、疑似移動クロマトグラフィーによる分離操作が必須となる。本発明においては、この分離操作を行わずに原料混合液糖の全てを理論的には収率１００％で生産物へ変換できる。
　また、砂糖と同じ甘味度はD-フラクトース含有量で改善することができ、製造コスト削減は従来の製造ラインに適切な形で接続することで可能となり、D-アルロースの機能は十分に保たれているというこれまでにないシステム構築することで完成した製造方法を提供することができる。
　分離操作を省くことで、分離による濃度の低下が殆ど無く、濃縮操作を省くことができ、酵素反応の生産物の脱イオン操作および濃縮のみで生産物が得られ大幅なコスト削減が期待できる。そのため異性化糖または転化糖のすでに確立した製造方法のメリットをすべて享受でき、それに最も安価な工程の付加のみで、すなわち、食物および飲料により摂取した消化性糖を構成するＤ－グルコースによる急激な血糖値上昇の抑制作用があるD-アルロースを含有する砂糖の甘味度および味質に非常に近い甘味料を、価格競争力を有する低コスト、かつ、世界的規模で大量生産するための製造方法を提供することができる。　
D-グルコースを原料とする場合(１)は、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いて、D-キシロースイソメラーゼ（DXI）を作用させてD-グルコースとD-フラクトース間の平衡反応により異性化を進行させて生産した（=異性化糖の代表的な製造方法により生産した）、D-グルコースとD-フラクトースを含む組成物（異性化糖）を原料として用い、D-アルロース３-エピメラーゼ（DAE）を作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成の目的生成物を得る方法を説明する図面である。 D-グルコースを原料とする場合(２)は、異性化糖の代表的な製造方法により生産したD-グルコースとD-フラクトースを含む組成物（異性化糖）に、クロマトグラフィーという分離装置を用いて、D-グルコースとD-フラクトースに分離をすることによってまずD-フラクトース液を得、次いでこのD-フラクトース液と前記異性化糖を混合し、そのD-フラクトースの添加量により各種の異性化糖を作り、それを原料として用い、DAEを作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ目的生成物を得る方法を説明する図面である。 日本農林規格の各種異性化糖（ぶどう糖果糖液糖、果糖ぶどう糖液糖、高果糖液糖）の製造工程と、得られた各種異性化糖を原料にしてDAEを作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ目的生成物を得る方法を説明する図面である。なお、左端は、上記図１同じ製造方法を、真ん中は図２と同じ製造方法を示し、右端は、高果糖液糖を原料とする製造方法であり、別途出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４３７２２）をした製造方法（図４）と同様に、前記D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させた後に、希少糖D-プシコースに作用しないD-キシロースイソメラーゼを作用させて、D-フラクトースとD-グルコース間の平衡反応により異性化を進行させる反応工程を付加させ目的生成物の目的とするD-フラクトースの含有量になるように調整することを特徴とする製造方法を示している。 D-フラクトースを原料とする場合は、別途出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４３７２２）をした方法であり、その方法は、第一段階で、ケトース３-エピメラーゼ（DAE）でD-フラクトースをD-アルロースとの混合物とし、第二段階でD-アルロースに作用しないD-キシロースイソメラーゼ（DXI）を用いたD-フラクトースをD-グルコースへ変換することで、D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースの新たな組成の目的生産物を得ることを特徴とする方法であることを説明する図面である。 砂糖を原料とする場合は、砂糖にインベルターゼを作用させて分解して生産した（転化糖の代表的な製造方法により生産した）、D-グルコースとD-フラクトースを主組成とする組成物を原料として用い、D-アルロース３-エピメラーゼ（DAE）を作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成の目的生成物を得る方法を説明する図面である。 実施例１の基質にD-グルコース：D-フラクトース＝55:45の糖液を用いた際のバッチ法での糖組成の経時変化を示す折れ線グラフである。 実施例１の基質にD-グルコース：D-フラクトース＝50:50の糖液を用いた際のバッチ法での糖組成の経時変化を示す折れ線グラフである。 実施例１の基質にD-グルコース：D-フラクトース＝45:55の糖液を用いた際のバッチ法での糖組成の経時変化を示す折れ線グラフである。
［生産原料］
　原料として安価なものを用いる必要がある。十分価格競争力を有する世界的な規模の大量生産を可能とするには、まず、用いる原料が安価で、かつ、大量生産に対応可能でなければならない。
　D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を安価に得るためには、D-グルコースあるいはD-フラクトースを含む安価なものであれば、全てが原料となる（図１～５参照）。
　D-アルロースを作る場合、D-アルロースがD-フラクトースから生産可能であるので、D-フラクトースが存在する安価な原料から作る必要があり、その安価な原料として、
　〈１〉D-フラクトースはD-キシロース イソメラーゼによりD-グルコースから容易に生産可能であるので、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いることができる（図１および２参照）。
　例えば、D-グルコースを原料とする例は、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いて、D-キシロースイソメラーゼ（DXI）を作用させてD-グルコースとD-フラクトース間の平衡反応により異性化を進行させて生産した（=異性化糖の代表的な製造方法により生産した）、D-グルコースとD-フラクトースを含む組成物（異性化糖）を原料として用い、D-アルロース３-エピメラーゼ（DAE）を作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成の目的生成物を得ることができる（図１）。
　また、D-グルコースを原料とする他の例は、異性化糖の代表的な製造方法により生産したD-グルコースとD-フラクトースを含む組成物（異性化糖）に、クロマトグラフィーという分離装置を用いて、D-グルコースとD-フラクトースに分離をすることによってまずD-フラクトース液を得、次いでこのD-フラクトース液と前記異性化糖を混合し、そのD-フラクトースの添加量により各種の異性化糖を作り、それを原料として用い、DAEを作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ目的生成物を得ることができる（図２）。
　〈２〉安価に製造する方法が確立している異性化糖はD-グルコースとD-フラクトースの混合物として各種の組成のものが安価に市販されており、原料となる。
　図３には、日本農林規格の各種異性化糖（ぶどう糖果糖液糖、果糖ぶどう糖液糖、高果糖液糖）の製造工程と、得られた各種異性化糖を原料にしてDAEを作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ目的生成物を得る方法が説明されている。図中、左端は、上記図１同じの果糖約４２％のぶどう糖果糖液糖を原料とする製造方法を、真ん中は図２と同じの果糖約５５％の果糖ぶどう糖液糖を原料とする製造方法を示し、右端は、果糖約９２％の高果糖液糖を原料とする製造方法であり、目的生成物中のD-フラクトース含有量を砂糖と同じ味質を呈する最適の範囲内で、長期継続摂取欠点が出にくい量に調整する必要がある時、D-フラクトースをD-グルコースに変換しなければならない。D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させた後に、希少糖D-プシコースに作用しないD-キシロースイソメラーゼを作用させて、D-フラクトースとD-グルコース間の平衡反応により異性化を進行させる反応工程を付加させ目的生成物の目的とするD-フラクトースの含有量になるように調整する製造方法が必要に応じ採用される。そのような２段階の製造方法は、図４に示す、D-フラクトースを原料とする、別途出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４３７２２）をした製造方法（図４）と同様の方法である。図４には、D-フラクトースを原料とする場合における上記別途出願をした、第一段階で、ケトース３-エピメラーゼ（DAE）でD-フラクトースをD-アルロースとの混合物とし、第二段階でD-アルロースに作用しないD-キシロースイソメラーゼ（DXI）を用いたD-フラクトースをD-グルコースへ変換することで、D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースの新たな組成の目的生産物を得ることを特徴とする方法が示されている。
　<３>砂糖はD-グルコースがD-フラクトースと結合した安価な甘味料であり、容易にインベルターゼで分解される。従って、バイオエタノール生産にも使える安価な原料となる（図５参照）。
　砂糖を直接原料とするのではなく、砂糖にインベルターゼを作用させて分解して生産した（転化糖の代表的な製造方法により生産した）、D-グルコースとD-フラクトースを主組成とする組成物を原料として用いる。該組成物にD-アルロース３-エピメラーゼ（DAE）を作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成の目的生成物を得ることができる。
　以上まとめると、D-グルコースとD-フラクトースを主組成とする混合糖である異性化糖または転化糖を原料として用いることが好ましい。
［原料として用いる異性化糖の詳細］
　異性化糖は、主にD-グルコースからなるコーンシロップを、酵素かアルカリ化によって異性化したD-フラクトースとD-グルコースを主成分とする糖をいう。英語ではhigh-fructose corn syrupと表記され、HFCSと略称する。日本の食品の原材料名でよく「果糖ぶどう糖液糖」と表記されるが、異性化糖製品の表記には、ぶどう糖果糖液糖＝果糖含有率（糖のうちの果糖の割合）が５０％未満のもの、果糖ぶどう糖液糖＝果糖含有率が５０％以上９０％未満のもの、高果糖液糖＝果糖含有率が９０％以上のもの、がある。そのほか、砂糖混合異性化液糖＝上記の液糖に１０％以上の砂糖を加えたもの、その液糖がぶどう糖果糖液糖であれば、砂糖混合ぶどう糖果糖液糖と表記される。
　図３に示すように異性化糖はすでに確立した方法で製造される。デンプンから異性化糖を生成するには、以下に述べるように、３回の酵素反応と精製、濃縮が必要である。
（１）液化：デンプンに水と加水分解酵素であるアルファアミラーゼを加え、９５℃程度に加熱する。これにより高分子のデンプンはある程度小さく分解される。
（２）糖化：液化終了後に５５℃程度まで冷却し、グルコアミラーゼを加える。この反応で、糖はさらに細かく分解され、ぶどう糖になる。
（３）異性化：６０℃で異性化酵素のグルコースイソメラーゼを加え、約半分のぶどう糖を果糖に変化させる。異性化糖の名称はこの反応（ぶどう糖が果糖に異性化する反応）に由来している。
（４）精製・濃縮：異性化後、液糖をろ過機やイオン交換装置で精製し、水分を蒸発させて濃縮することにより、果糖分４２％のぶどう糖果糖液糖が得られる。さらに、クロマトグラフィーによって果糖純度を高めることにより、果糖分９０－９５％の高果糖液糖を作ることができる。これを果糖分４２％のぶどう糖果糖液糖とブレンドすることで果糖分５５％の果糖ぶどう糖液などが作られる。
　果糖分９０－９５％の高果糖液糖を原料として用いるときは、前記D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させた後に、希少糖D-プシコースに作用しないD-キシロースイソメラーゼを作用させて、D-フラクトースとD-グルコース間の平衡反応により異性化を進行させる反応工程を付加させることが必要な場合がある。目的生成物の目的とするD-フラクトースの含有量が、継続摂取により肥満の元凶の糖としての課題を克服し、かつ、D-アルロースおよびD-グルコースとともに砂糖に近い味質を与えるために、当該反応工程の付加が必要な場合がある。
［原料として用いる転化糖の詳細］
　酸または酵素（インベルターゼ）によって、砂糖（ショ糖）を果糖およびぶどう糖に加水分解した甘味料である。同量のショ糖よりも甘いため、糖を転化させることによって砂糖の量を控えることが可能である。また、吸湿性があるため、菓子をしっとりとした状態に保ち、砂糖が結晶化しないようにすることが可能である。ショ糖およびぶどう糖は弱い右旋光で、果糖は強い左旋光であるため、ぶどう糖と果糖が等分子数の溶液はショ糖が弱い右旋光に対し、弱い左旋光となる。偏光に対する旋光面が逆転することから転化糖と名付けられた。ショ糖は還元性を示さないが、転化糖はぶどう糖に由来する還元性を示す。
　インベルターゼは、砂糖（ショ糖）を構成するぶどう糖と果糖に分解（転化）することにより、転化糖を作る酵母由来の酵素である。転化糖は、はちみつに代表されるような上品な甘味とまろやかな風味が特長で、食品にしっとり感・やわらかさを与え、色つや・舌ざわりを改善させるはたらきがある。転化液糖は、例えば、70％ショ糖液（温水300g、ショ糖700g）を60℃に保ち、インベルターゼを4.2g（対ショ糖0.6％）を添加し、撹拌しながら半日程度反応させて製造する。
［本発明で用いる酵素］
　本発明で使用する酵素D-アルロース３-エピメラーゼ（DAE）について、併せて、必要により使用するD-キシロースイソメラーゼ（DXI）について説明する。
　エピメラーゼは単糖の場合、Ｃに結合した‐ＯＨの位置を反対側に移動させる酵素であり、「化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は変化しない反応」を触媒する。従ってエピメラーゼはイソメラーゼに属する酵素である。イソメラーゼは「化学式は変化しない反応」を触媒する。ヘキソースに作用するイソメラーゼは「化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は変化しない反応」を触媒する。たとえばアルドースイソメラーゼは「分子内での水素の移動」を触媒し、Ｃ１とＣ２間の酸化還元反応を進める。イソメラーゼがエピメラーゼよりも上位に存在する。すなわち、酵素「イソメラーゼ」とは、この業界で良く知られており、例えばケトース３-エピメラーゼ（D-アルロース３-エピメラーゼ）、D-キシロースイソメラーゼ、グルコースイソメラーゼが挙げられる。ただし、グルコースイソメラーゼは科学的正式名称ではない。酵素の名称としてグルコースイソメラーゼは国際生化学分子生物学連合で登録されているＥＣ番号には入れられていない。これは「科学的な酵素の名称」ではない。D-キシロースイソメラーゼが科学的名称でグルコースイソメラーゼは商業名として一般に使用されているのみである。理由はD-キシロースイソメラーゼが構造類似のD-グルコースに作用するのを「人間が利用しているのみ」であり、自然界ではD-グルコースをD-フラクトースにして利用することはない。
　エピメラーゼはイソメラーゼの中に含まれる。従って、（a）「D-グルコースをD-フラクトースに異性化する酵素」、（ｂ）「D-フラクトースをD-アルロースに異性化する酵素」と表現することができる。
　上記の（a）「D-グルコースをD-フラクトースに異性化する酵素」について、この中には、例えばある微生物のL-ラムノースイソメラーゼがD-グルコースに作用し、D-フラクトースに変換するものがあったとしてもそのL-ラムノースイソメラーゼも含まれる。あらゆる微生物、植物、動物等の生物が持つタンパク質がD-グルコースをD-フラクトースに変換するものも全てが含まれる。
　また、果糖分９０－９５％の高果糖液糖を原料として用いるときに、目的生成物の目的とするD-フラクトースの含有量に調整するために必要により採用される、希少糖D-プシコースに作用しないD-キシロースイソメラーゼをD-フラクトースに作用させて、D-フラクトースとD-グルコース間の平衡反応により異性化を進行させる反応工程で用いるD-キシロースイソメラーゼもこれに含まれる。
　また、（ｂ）「D-フラクトースをD-アルロースに異性化する酵素」について、これにはあらゆる生物の生産するタンパク質がD-フラクトースをD-アルロースへ変換する場合においてもこれに含まれる。
　従って、ＥＣ番号に「ＥＣ.５.-(異性化酵素)」に属する全ての酵素を含む。たとえ新たに発見された酵素、他の異性化酵素に分類されているものがこれらの反応を触媒し得る作用をわずかでも持っていると、それを含むことを意味する。本発明で『イソメラーゼ』を使用するとは、広い酵素群を含むものとして使用している。
（D-アルロース３-エピメラーゼ）
　原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させるために用いる。このケトヘキソース３-エピメラーゼ（D-アルロース３-エピメラーゼ）は、D-フラクトースをD-アルロースへ異性化する酵素であれば、酵素の起源や分類名称が何であってもよい。
　具体的には、シュードモナス属に属する細菌(特許文献５)、アルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０株（国際寄託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－１１１１）由来のD-ケトヘキソース３-エピメラーゼ(特許文献６および非特許文献２)が例示される。Ｍ３０株は、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市東かずさ鎌足２－５－８）に２０１１年６月２２日原寄託されたＮＩＴＥ  Ｐ－１１１１からブダペスト条約に基づく寄託への移管を２０１２年５月２日に請求し、受託番号 ＮＩＴＥ  ＢＰ－１１１１として国際寄託された。
　また、アルスロバクター ヒスチジノロボランス(Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ)Ｙ５８６－１株（国際寄託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２８１３）由来のケトース３－エピメラーゼが好ましいものとして例示される(国際出願の表示　　ＰＣＴ／ＪＰ２０１９／０４５６７２)。
 Ｙ５８６－１株は、２０１８年１１月７日に日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２-５-８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに国際寄託し、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２８１３として寄託された。Ｙ５８６－１株は、当初、アルスロバクター　プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）と同定された。その後、日本食品分析センターの同定では、アルスロバクター　ヒスチジノロボランス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ）と判定されたため、Ｙ５８６－１株の全ゲノムの配列検索を行った結果、アルスロバクター　ヒスチジノロボランスであると確定した。そのため、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８１３の菌株の名称変更を独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに届け出て、２０１９年１０月４日に承認された。
　該Ｙ５８６－１株由来のケトース３－エピメラーゼは、上記特許文献６に記載されたアルスロバクター　グロビフォルミス由来のケトース３－エピメラーゼに比べて、培養液あたりで生産される酵素が約２倍高い活性を有するので、それを用いることで効率よくＤ－アルロースの大量生産が可能になる。また、酵素の至適温度が７０℃と高く、しかも８０℃においても、至適温度での７０℃での活性を１００とした相対活性が５９．４と約６０％あり、高耐熱性である。しかも、６０℃で１時間保温処理した後の残存活性も４９．４％という熱耐性を有することから、至適温度の７０℃での反応において、より多量の生産物を得ることができる。この酵素のもつ優れた耐熱性は、酵素のアミノ酸置換変異体の作成により、さらに高めることができるという特性がある。
　すなわち、該Ｙ５８６－１株由来のケトース３－エピメラーゼの遺伝子に突然変異を導入して、対応するアミノ酸残基を部位特異的変異操作により他のアミノ酸残基に置換して、様々なアミノ酸置換を有する変異体を調製することにより、アミノ酸置換していない野生型酵素より耐熱性の高い酵素を得ることができ、その変異体を用いることができる。反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３－エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）、あるいは、６０℃で１時間保温後の残存活性、という２つの指標で耐熱性を評価した、耐熱性を有する変異体である。それにより用いるD-アルロース３-エピメラーゼの高耐熱性からの該酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性に基づく工業的に実用可能な低コストの製造方法を実現した。
　本発明の実施例では、部位特異的変異操作による塩基置換により変化させて各種のケトース３－エピメラーゼ変異体を作成し、その中から、酵素の寿命を高める上で重要な性質は耐熱性であるという酵素一般の技術常識を考慮して、野生型より耐熱性の高いアミノ酸置換変異体が得られる部位のものを選択し、そのうち親株野生型組換え酵素Ｙ５８６－１株　ＤＡＥ（１．７８）を上回る変異酵素は３７種中２０種得られたところ、当該国際出願の明細書中の表１０の８番目に記載されたアミノ酸置換変異体を用いて実験した。
　当該変異体は、（１）変異配列名と（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
　（１）Y586DAE_V129IA200VS218N
　（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列MKIGCHGLVWTGRFDAEGIRYSVQKTKEAGFDLIEFPLMDPFSFDVATAKSALAEHGLTASASLGLSEATDVSSEDPAIVKAGEELLNRALDVLAELGATDFCGVIYSAMKKYMEPATEQGLSNSKAAIGRVVDRAAGLGINVSLEVVNRYETNVLNTGRQALSYLSDVKRPNLGVHLDTYHMNIEESDMFSPVLDTAEVLKYVHIGESHRGYLGTGNVDFDNFFKALGRIGYDGPVVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWADNEELGAHANAFIRDKLTAIKTIELH
　このような耐熱性を有する変異体を用いることで、高耐熱性と高生産性からは、活性というよりも酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性がもたらされる。
（D-キシロースイソメラーゼ）
　D-キシロースイソメラーゼはD-グルコースをD-フラクトースに異性化する能力がある酵素であれば、酵素の起源や名称に制限はない（例えば特許文献５よび７）。原料として用いるD-グルコースとD-フラクトースを主組成とする安価な組成物を、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いて、D-キシロースイソメラーゼを作用させてD-グルコースとD-フラクトース間の平衡反応により異性化を進行させて生産することができる。
　また、果糖分９０－９５％の高果糖液糖を原料として用いるときに、目的生成物の目的とするD-フラクトースの含有量に調整するために必要により採用される、希少糖D-プシコースに作用しないD-キシロースイソメラーゼをD-フラクトースに作用させて、D-フラクトースとD-グルコース間の平衡反応により異性化を進行させる反応工程で用いることができる（図３参照）。D-キシロースイソメラーゼは市販のものを用いることができる。
　これらの酵素は、精製酵素を使っても良いし、該酵素を生産微生物でも良い。本発明においては、精製酵素または、該酵素生産微生物は、精製酵素または、該酵素生産微生物を固定化した固定化酵素、固定化微生物として用いられる。
［酵素の固定化］
　固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能となり、該酵素として耐熱性の酵素を用いると、その寿命が延びる。
　酵素はイオン交換樹脂などの適切な基材に固定化して用いることがもっとも実用的である。イオン交換樹脂、例えば塩基性陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂あるいは弱塩基性陰交換樹脂のいずれでも用いることができ、たとえば、強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ＨＰＡ２５Ｌ（三菱ケミカル社製）、ＩＲＡ９０４ＣＬ（オルガノ社製）等が挙げられ、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてはＷＡ３０（三菱ケミカル社製）、ＦＰＡ５４、ＦＰＡ９５（オルガノ社製）等が挙げられる。実施例では、ピュロライト社の弱塩基性アニオン交換樹脂 A111Sを用いている。
　弱塩基性陰イオン交換樹脂を担体に用いて固定化酵素を製造した場合、固定化したケトース３－エピメラーゼは、その異性化能が消失したあとに容易に溶離させることができることから、固定化担体の再生を非常に簡便に行うことができ、生産コストを下げることができる。耐熱性の酵素を用いると、その寿命が延び、生産コストをいっそう下げることができる。
　全体の製造工程は、バッチ式または連続式のいずれの方式でも適用することができる。連続式の場合、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いて、D-キシロースイソメラーゼ（グルコースイソメラーゼ）を作用させてD-フラクトースとD-グルコースの混合物を製造する原料製造異性化工程と原料中のD-フラクトースのD-アルロース３－エピメラーゼを用いる異性化反応工程とを一連の工程で行い、さらに、グルコースイソメラーゼとD-アルロース３－エピメラーゼをそれぞれ固定化して行われる。このように、D-フラクトースとD-グルコースの混合物を原料としたエピ化反応工程とその原料製造異性化工程を一連の工程で行い、更に、用いる酵素を固定化して個別に製造に用いた製造法はこれまでになく、新規な製造法といえる。
　酵素による異性化は、酵素を固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって安定で利用しやすい固定化酵素を得ることができる。固定化酵素を用いることで、連続的に大量の異性化および異性化反応を行うことが可能である。たとえば、それぞれ１０００Ｕ／湿重量樹脂（ｇ）の活性を有する固定化酵素を使用して行われる。菌体細胞を破壊するかして得られた破壊細胞の溶液から粗酵素液として採取し、カラム充填したイオン交換樹脂に対し、該粗酵素液を低温（４℃）下で通液させ、イオン交換樹脂に粗酵素タンパク質を結合させ、精製水を通液させて洗浄し、固定化酵素を得ることができる。商業的生産に完全に満足できる安定性（活性維持）の点で連続生産に耐えられる固定化系が得られる。得られた固定化酵素を用いて連続的で大量の異性化反応（エピ化反応）を行うことができる。酵素を固定化する担体としても、固定化担体として公知の任意のものを用いることができ、上記例示された樹脂担体に限定されない。
　本発明の製造方法の概要は図１～３を示すとおりであり、D-グルコースとD-フラクトースを含む安価な組成物を原料として用い、原料を一つのバイオリアクター（固定化エピメラーゼ（DAE）カラム）を通過させることで原料に含まれるD-フラクトースをＤ-アルロースに変換する反応は進行し、D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースの新たな組成の目的生産物が得られる。
　固定化エピメラーゼ（DAE）カラムの反応を説明すると、D-アルロース３-エピメラーゼ（DAE）を作用させて、原料中のD-フラクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、目的生成物である改善された異性化糖または転化糖の希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成において、D-フラクトースの含有量が、D-アルロースの弱点である甘味度を補うとともに、砂糖に近い味質になる範囲である、D-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の変換型の異性化糖または転化糖がカラムから出てくる。
 [目的生産物]
　得られる希少糖含有組成物は、エネルギー源としてのD-グルコースおよびD-フラクトースの含有量が最適の範囲であり、かつ、甘くて美味しいD-フラクトースをその欠点（長期の継続摂取で中性脂肪の蓄積などへと悪い影響）が出ない程度の量に調整されているが、D-アルロースおよびD-グルコースの弱点である甘味度を補うには十分な量であり、しかもD-アルロースの機能性を発揮する量のD-アルロースを含有する、砂糖と同じ味質の希少糖含有組成物（甘味料）である。
　D-アルロースの含有量について、甘味料の機能性を最小限にする必要がある場合がある。スポーツ飲料などは、エネルギー源としてD-グルコースおよびD-フラクトースの含有量が多いほうがいい。その場合の、D-アルロースの機能性は、急激な糖の吸収を抑えて、持続的な吸収を担保することであり、そのような機能は５質量％以上での含有量で発揮することがすでに裏付けられている。肥満症や血糖値の高めのヒトに対しては、治療あるいは予防を目的として摂取せるには、D-アルロースの含有量が高いほど良く、継続使用することが求められる。したがって、D-アルロースの量については５～３０質量％、好ましくは１０～２０質量％と幅を持っている。
　原料中のD-フラクトースにD-アルロース３-エピメラーゼを作用させて希少糖D-アルロースに変換して、D-フラクトースと希少糖D-アルロースの混合物を得る。D-フラクトースと希少糖D-アルロースの混合物が、D-フラクトースおよび希少糖D-アルロースの平衡混合物である、または目的とする濃度に調整されたD-フラクトース及び希少糖D-アルロースの混合物である。平衡まで反応をさせないことで、D-アルロースの目的生産物における含有量を変更することができる。
　原料はD-グルコースにD-キシロースイソメラーゼを作用させてD-フラクトースへと変換し、D-グルコースおよびD-フラクトースの混合物として得られる。D-グルコースおよびD-フラクトースの混合物が、D-フラクトースおよびD-グルコースの平衡混合物である、または目的とする濃度に調整されたD-グルコースおよびD-フラクトースの混合物である。平衡まで反応をさせないことで、D-グルコースの目的生産物における含有量を変更することができる。目的生産物であるD-グルコース、D-フラクトース、D-アルロースを含有する甘味料の特徴の一つが砂糖様味質にある。D-グルコースはエネルギーとして重要な成分であり、「飢餓をゼロに」のためには多く含まれるほうがいが、その甘味度は砂糖を１００とした場合、６５－８０であり、砂糖様味質を与えるためにはD-フラクトースの甘味が必要であるから、D-グルコース含有量は、D-フラクトースとD-アルロースの含有量により決定される。
　D-フラクトースは甘味度が１２０－１７０であり、甘味を与えるのに重要な、かつ、D-グルコースとともに砂糖様味質を与える成分であるが、一方で長期の継続摂取で肥満の元凶となるなどの糖としての課題があることから、D-フラクトース含有量は、目的生産物が砂糖様味質になるように、D-グルコースとD-アルロースの含有量により決定される。D-フラクトースを中性脂肪の蓄積などへと悪い影響が出ない程度の量であって、D-アルロースの弱点である甘味度を補うD-フラクトースが甘いという利点を引き出す含有量に調整される。
　目的生産物の甘味度はこれまでの実績に基づき計算値として表現することで、砂糖と同じ味質の甘味料であると評価することができる。したがって、本発明において、砂糖様味質、砂糖に近い味質、砂糖と同じ味質などの表現は、砂糖の甘味度（甘みの強さ）を１００として計算値として表現した１００に近い、あるいは１００に相当する場合であって、好ましくは官能検査で裏付けられるときに採用される表現である。
[製造方法の特徴及び利点]
[特徴１]D-グルコースとD-フラクトースが存在する安価な原料を用いることができる。でんぷんから生産されるD-グルコースを用いて、D-キシロースイソメラーゼ（DXI）を作用させて生産した、または砂糖にインベルターゼを作用させて分解して生産した、D-グルコースとD-フラクトースを主組成とする組成物を用いることができる。
[特徴２]イソメラーゼ（DXI）とエピメラーゼ（DAE）を、それぞれ固定化反応カラムを分離して反応できるため、目的の反応を適切な条件で進行させることが容易である。
[特徴３]二つの酵素はそれぞれに適正な反応条件で進行させることが可能であり、活性の低下などが起こった場合に個別に交換するなどで、簡易に対応することが可能である。
[特徴４]二つの酵素反応を別々に行うことで、目的とする糖のみを反応させることが可能である。二つの特異性に応じて巧みにコントロールすることで、目的物をエネルギー源としてのD-グルコースの含有量が最適の範囲であり、甘くて美味しいD-フラクトースをその欠点（長期の継続摂取で中性脂肪の蓄積などへと悪い影響）が出ない程度の量に調整されているが、D-アルロースの弱点である甘味度を補うには十分な量であり、しかもD-アルロースの機能性を持った量のD-アルロースを含有する砂糖と同じ味質の希少糖含有組成物（甘味料）であることが大きな特徴である。
[利点１] 大量生産技術が確立している各種異性化糖（エピメラーゼカラムのみで生産可能となり、各種のものを使い分けることで期待する組成の生産物を作ることが可能である。）および安価な砂糖（バイオエタノール用として大量に生産され、利用されているものでD-グルコース+D-フラクトース(1：1) の組成のものが安価に利用可能である。）を用いて、従来の製造ラインを適切な形で接続することで副反応生成物を含まない純粋な形態で製造できる。
[利点２]本希少糖含有組成物を生産するのに必要なエピメラーゼ（DAE）カラムは、一般に異性化糖または転化糖を製造する場合に用いられているイソメラーゼ（DXI）カラムにそのまま接続するのみでよい。そのため非常に安価に製造が可能である。
[利点３]本希少糖含有組成物の組成は、原料生産段階のイソメラーゼ（DXI）、D-アルロース生産段階のエピメラーゼ（DAE）の酵素反応を調整することで、一定にすることも変化させることも容易である。
[利点４]製造工程に分離過程がないことによって、製造工程をシンプルにすることができる。このことでコスト削減は著しいばかりでなく製造工程の管理が容易である。
[利点５]製造工程中に原料や生産物が製造中に、分離操作等で失われることはなく、原理的には原料の全て１００％が生産物として得ることが可能である。
[利点６]二つの酵素活性の調整、あるいは反応カラムを通過する速度を調整することで、生産物の組成比を変更することも可能である。その基質の流速の他に、基質との反応時間、反応温度、基質溶液のpH、および酵素量からなる群から選ばれる１以上を調整することで、目的物の組成を目的のものにすることができる。
[利点７] 用いるD-アルロース３-エピメラーゼの高耐熱性からの該酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性に基づく工業的に実用可能な低コストの製造方法を提供できる。
　このようにして得られた新規甘味料は、好みにより、ショ糖、糖アルコール、アスパルテームやステビアなどの甘味料と併用することもできる。またボディ感の付与などのため、甘味度が低い水溶性食物繊維（ポリデキストロース、イヌリンや難消化性デキストリンなど）を適宜加えても良い。
　本発明の甘味料において、D-グルコース：D-フラクトース：D-アルロースが５８：２９．４：１２．６または４５：３８．５：１６．５の希少糖含有組成物である態様を包含するが、甘味度および甘味質を生かして用いる場合は、その含量は、特に制限されない。目的とする機能の度合い、使用態様、使用量等により適宜調整することができる。
　本発明の砂糖と同じ味質の新規甘味料は、D-アルロースを含有するもので、肥満予防効果を有する。また、生活習慣病予防ということで、他の有効成分と併用混合して用いることもできる。
［用途］
　本発明の、希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースの砂糖と同じ味質の甘味料組成物は、D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースの希少糖含有組成物の既知の用途に同様に用いられる。
　本発明の甘味料組成物は、原料となる異性化糖、転化糖などの生産物であって、かつ、疑似移動クロマトグラフィーによる分離操作を経ていない生産物であることを特徴としている。また、原料となる異性化糖、転化糖などの生産物であって、かつ、固定化酵素反応カラムを通過した液糖そのものであることを特徴としており、D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースの組成物であるから、やはり特許文献７に記載された用途に用いられる。ぶどう糖・果糖・D-アルロースとも、すべて食品（認可認証の面で）であり、食品の混合物だから極めて安全で扱いやすい。D-アルロース（＝D-プシコース）は食品素材に微量に存在し、安全性が高く、大量生産技術が開発された今日、コスト面でも利用価値は高いものである。なお急性経口毒性試験では５，０００ｍｇ／ｋｇ以上であることがすでに知られている。
　D-アルロース（＝D-プシコース）を含む糖組成物の用途としては、食品、飲料、特に機能性食品(肥満予防など)、医薬品、化粧品、飼料、農薬(植物成長調整剤、植物病害抵抗性増幅剤など)、工業用とが例示される。砂糖と同じ味質の甘味料は、食品、保健用食品、患者用食品、食品素材、保健用食品素材、患者用食品素材、食品添加物、保健用食品添加物、患者用食品添加物、飲料、保健用飲料、患者用飲料、飲料水、保健用飲料水、患者用飲料水、薬剤、製剤原料、飼料、患畜および/または患獣用飼料になど甘味を必要とするものすべてに使用することができる。
　本発明の砂糖と同じ味質の甘味料を食品に利用する場合、そのままの形態、水などに希釈した形態、オイルなどに懸濁した形態、乳液状形態食、または食品業界で一般的に使用される担体を添加した形態などのものを調製してもよい。飲料の形態は、非アルコール飲料またはアルコール飲料である。非アルコール飲料としては、例えば、炭酸系飲料、果汁飲料、ネクター飲料などの非炭酸系飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、茶、コーヒー、ココアなど、また、アルコール飲料の形態ではビール、発泡酒、第３ビール、清酒、梅酒、ワイン、シャンパン、リキュール、酎ハイ、薬用酒などの形態を挙げることができる。
　本発明の希少糖含有組成物の、前記糖質代謝異常および/または脂質代謝異常改善を目的とした食品素材あるいは食品添加物としての使用形態としては、錠剤、カプセル剤、飲料などに溶解させる粉末あるいは顆粒などの固形剤、ゼリーなどの半固形体、飲料水などの液体、希釈して用いる高濃度溶液などがある。
　さらに、本発明の砂糖と同じ味質の甘味料を適宜食品に添加して糖質代謝異常および/または脂質代謝異常改善などを目的とした保健食または病人食とすることができる。任意的成分として、通常食品に添加されるビタミン類、炭水化物、色素、香料など適宜配合することができる。食品は液状または固形の任意の形態で食することができる。ゼラチンなどで外包してカプセル化した軟カプセル剤として食することができる。カプセルは、例えば、原料ゼラチンに水を加えて溶解し、これに可塑剤(グリセリン、D-ソルビトールなど)を加えることにより調製したゼラチン皮膜でつくられる。
　本発明の砂糖と同じ味質の甘味料は、甘味料として砂糖と同様な用途で用いることができる。また、調理やお茶、コーヒー、調味料（みりんなど）などにも使用できる。
　飲食物としては、具体的には以下のものを例示することができる。洋菓子類（プリン、ゼリー、グミキャンディー、キャンディー、ドロップ、キャラメル、チューインガム、チョコレート、ペストリー、バタークリーム、カスタードグリーム、シュークリーム、ホットケーキ、パン、ポテトチップス、フライドポテト、ポップコーン、クラッカー、パイ、スポンジケーキ、カステラ、ワッフル、ケーキ、ドーナツ、ビスケット、クッキー、せんべい、おかき、おこし、まんじゅう、あめなど）、乾燥麺製品（マカロニ、パスタ）、卵製品（マヨネーズ、生クリーム）、飲料（機能性飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料、濃厚乳性飲料、果汁飲料、無果汁飲料、果肉飲料、透明炭酸飲料、果汁入り炭酸飲料、果実着色炭酸飲料）、嗜好品（緑茶、紅茶、インスタントコーヒー、ココア、缶入りコーヒードリンク）、乳製品（アイスクリーム、ヨーグルト、コーヒー用ミルク、バター、バターソース、チーズ、発酵乳、加工乳）、ペースト類（マーマレード、ジャム、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、果実のシロップ漬け）、畜肉製品（ハム、ソーセージ、ベーコン、ドライソーセージ、ビーフジャーキー、ラード）、魚介類製品（魚肉ハム、魚肉ソーセージ、蒲鉾、ちくわ、ハンペン、魚の干物、鰹節、鯖節、煮干し、うに、いかの塩辛、スルメ、魚のみりん干し、貝の干物、鮭などの燻製品）、佃煮類（小魚、貝類、山菜、茸、昆布）、カレー類（即席カレー、レトルトカレー、缶詰カレー）、調味料剤（みそ、粉末みそ、醤油、粉末醤油、もろみ、魚醤、ソース、ケチャップ、オイスターソース、固形ブイヨン、焼き肉のたれ、カレールー、シチューの素、スープの素、だしの素、ペースト、インスタントスープ、ふりかけ、ドレッシング、サラダ油）、揚げ製品（油揚げ、油揚げ菓子、即席ラーメン）、豆乳、マーガリン、ショートニングなどを挙げることができる。
　上記飲食物は、組成物を常法に従って、一般食品の原料と配合することにより、加工製造することができる。上記飲食物への組成物の配合量は食品の形態により異なり特に限定されるものではないが、通常は0 . 1～ 5 0重量％ が好ましい。
　上記飲食物は、機能性食品、栄養補助食品或いは健康食品類としても用いることができる。その形態は、特に限定されるものではなく、例えば、食品の製造例としては、アミノ酸バランスのとれた栄養価の高い乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミンなどの蛋白質、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物などの他、アミノ酸単体の混合物などを、常法に従って使用することができる。また、ソフトカプセル、タブレットなどの形態で利用することもできる。
　栄養補助食品或いは機能性食品の例としては、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料などが配合された流動食、半消化態栄養食、成分栄養食、ドリンク剤、カプセル剤、経腸栄養剤などの加工形態を挙げることができる。上記各種食品には、例えば、スポーツドリンク、栄養ドリンクなどの飲食物は、栄養バランス、風味を良くするために、更にアミノ酸、ビタミン類、ミネラル類などの栄養的添加物や甘味料、香辛料、香料、色素などを配合することもできる。
　機能性食品は、特定の疾病などを予防(肥満予防)する健康食品、予防医薬品の分野の利用に適している。特定の疾病を予防する健康食品においては、必須成分である希少糖D-アルロース（＝D-プシコース）を含む糖組成物の他に、任意的成分として、通常食品に添加されるビタミン類、炭水化物、色素、香料など適宜配合することができる。食品は液状または固形の任意の形態で食することができる。ゼラチンなどで外包してカプセル化した軟カプセル剤として食することができる。カプセルは、例えば、原料ゼラチンに水を加えて溶解し、これに可塑剤(グリセリン、D-ソルビトールなど)を加えることにより調製したゼラチン皮膜でつくられる。
　本発明の砂糖と同じ味質の甘味料を食品添加物として用いる場合、その形態は適宜選択することができ、例えば、本発明に係る希少糖D-アルロース（＝D-プシコース）を含む甘味料をそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。また、食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することによって摂取することができる。
　本発明の甘味料組成物は、家畜、家禽、ペット類の飼料用に応用することができる。例えば、ドライドッグフード、ドライキャットフード、ウェットドッグフード、ウェットキャットフード、セミモイストドックフード、養鶏用飼料、牛、豚などの家畜用飼料に配合することができる。飼料自体は、常法に従って調製することができる。
　これらの治療剤および予防剤は、ヒト以外の動物、例えば、牛、馬、豚、羊などの家畜用哺乳類、鶏、ウズラ、ダチョウなどの家禽類、は虫類、鳥類或いは小型哺乳類などのペット類、養殖魚類などにも用いることができる。
　本発明の甘味料の甘味を生かしつつ、生理作用の発現を意図した糖質代謝異常および/または脂質代謝異常改善効果、肥満改善効果を目的とした薬剤は、これらを単独で用いるほか、一般的賦形剤、安定剤、保存剤、結合剤、崩壊剤などの適当な添加剤を配合し、液剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、散布剤、スプレー剤等の適当な剤型を選んで製剤し、経口的、経鼻的に投与することができる。
　経口投与、経鼻投与に適した医薬用の有機又は無機の固体、半固体又は液体の担体、溶解剤もしくは希釈剤を、本発明の組成物を薬剤として調製するために用いることができる。水、ゼラチン、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、動・植物油、ベンジルアルコール、ガム、ポリアルキレングリコール、石油樹脂、ヤシ油、ラノリン、又は医薬に用いられる他のキャリアー(担体)は全て、本発明の組成物を含む薬剤の担体として用いることができる。また、安定剤、湿潤剤、乳化剤や、浸透圧を変えたり、配合剤の適切なp Hを維持するための塩類を補助薬剤として適宜用いることができる。
　医薬組成物として用いられる場合、その製剤化には公知の方法を用いることができる。また、投与形態は適宜選択することができ、そのような投与形態としては、例えば、経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤などの形態を挙げることができ、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬などの形態を挙げることができる。また、その投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的およびこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定することができる。薬剤においては、有効成分である希少糖D-アルロース（＝D-プシコース）を含む糖組成物はそれ自体のみならずそれの薬剤として許容される塩として使用される。該薬剤は、D-アルロース（＝D-プシコース）を含む甘味料組成物を単独で製剤として用いることができるほか、製薬上使用できる担体もしくは希釈剤を加えた製剤組成物に加工したものを用いることもできる。このような製剤または薬剤組成物は、上記のとおり、経口または非経口の経路で投与することができる。例えば、経口投与用の固体または流体(ゲルおよび液体)の製剤または薬剤組成物は、タブレット、カプセル、錠剤、丸剤、粉末、顆粒もしくはゲル調製品の形態をとる。製剤または薬剤組成物の正確な投与量は、その目的とする使用形態および処置時間により変化するため、担当の医師または獣医が適当であると考える量になる。服用および投与用量は製剤形態によって適宜調整できる。錠剤などの経口固形製剤、経口液剤などとして1日服用量を1回ないし数回に分けて服用してもよい。また、例えばシロップやトローチ、チュアブル錠などで幼児頓服して、局所で作用させるとともに内服による全身性作用をも発揮させる製剤形態では１日服用量の１/２～１／１０を1回量として配合し服用すればよく、この場合全服用量が1日量に満たなくてもよい。
　逆に、製剤形態からみて無理な服用容量とならなければ1日服用量に相当する量を1回分として配合してもよい。製剤の調製にあたっては、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、コーティング剤、徐放化剤など、希釈剤や賦形剤を用いることができる。この他、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、保存剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、吸着剤、香料、着色剤、矯味剤、抗酸化剤、保湿剤、遮光剤、光沢剤、帯電防止剤などを使用することができる。
　本発明は、希少糖D-アルロース（D-プシコース）の皮膚保湿、皮膚抗酸化および皮膚抗老化作用を利用する皮膚外用剤、すなわち治療薬、皮膚外用剤、化粧料等が知られている（特許文献８）肌荒れ、荒れ性に対して改善・予防効果を有する皮膚外用剤を提供することができる。本発明の皮膚外用剤には、希少糖D-アルロース（＝D-プシコース）を含む糖組成物を必須成分とし、それ以外に、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば水性成分、油性成分、粉末成分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、紫外線吸収剤、美白剤、防腐剤、酸化防止剤、界面活性剤、香料、色剤、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。その他、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラバミル、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸、トラネキサム酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸クルコシド、アルブチン、コウジ酸、D-グルコース、D-フラクトース、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。すなわち、希少糖D-アルロース（＝D-プシコース）を含む糖組成物に、例えば、植物油などの油脂類、ラノリンやミツロウなどのロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、各種界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物や動物の抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐剤、殺菌剤などの、通常の皮膚外用剤の原料として使用されているものを適宜配合し、皮膚外用剤を製造することができる。また、抗炎症性の皮膚外用剤原料であるグリチルレチン酸などの甘草抽出成分、塩酸ジフェンヒドラミン、アズレン、ｄｌ－α－トコフェロールおよびその誘導体、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６などとともに用いることができる。皮膚外用剤は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、従来の皮膚外用剤に用いられる形態であればいずれでもよく、剤型は特に問わない。すなわち、皮膚外用剤として用いられる場合、その剤型は適宜選択することができ、例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水－油二層系、水－油－粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティックなどの他、不織布などのシートに含浸ないし塗布した製剤などを挙げることができる。
　農薬の使用量を飛躍的に減少させる可能性のある、植物に対して病害抵抗性を増幅する作用の物質を提供することを目的として、本発明者らの別のグループは、希少糖による植物病害抵抗性増幅剤の発明がすでに登録されている（特許文献９）が、その後研究開発が飛躍的に進んでおり、複数の特許が存在する。
　また、歯磨きなどに添加し、甘味料として使用できる。
　さらに、化粧品等の製剤化に、可溶性フィルムが使用されるようになってきている。例えば、香料等を保持させたフレーバーフィルム等として気分転換、口臭予防等を目的として、可食性の可溶性フィルムが使用されている。食品、医薬品等の包装材として、又食品、医薬品等の有効成分を保持する担体として、優れた溶解性とフィルム特性を示し、これらの用途に好適に用いることができる可溶性フィルムが提案されており（特許文献１０）、このようにして、本発明の砂糖の甘味度および味質を有する甘味料を医薬品もしくは医薬部外品、化粧品に適応することができる。
　食品、飲料または化粧品、あるいは飼料における配合量は特に制限されないがD-アルロース（＝D-プシコース）０．０１～１０重量％程度が好ましい。医薬品の場合、カプセルや粉末、錠剤などとして経口投与することができ、水に溶けることから経口投与以外に静脈注射、筋肉注射などの投与方法を採用することが可能である。投与量は例えば糖尿病の症状の度合いや体重、年齢、性別などにより異なるものであり、使用に際して適当な量を症状に応じて決めることが望ましい。医薬品における配合量は特に制限はされないが、体重１ｋｇあたり、経口投与の場合D-アルロース（＝D-プシコース）０．０１～２，０００ｍｇ、静脈注射投与の場合０．０１～１，０００ｍｇ、筋肉注射投与の場合０．０１～１，０００ｍｇ程度が好ましい。
　本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によってなんら限定されるものではない。
　D-アルロース3-エピメラーゼは、上記した配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いた。固定化担体としてはピュロライト社の弱塩基性アニオン交換樹脂 A111Sを用いた。
［バッチ法での新甘味料の生産］
　D-アルロース３-エピメラーゼを固定化した固定化酵素を３ｍｌ量り取り、６０％の糖液を加え６０℃で振盪し酵素反応を行った。基質に用いた糖液は、D-グルコース：D-フラクトース＝５５：４５、D-グルコース：D-フラクトース＝５０：５０およびD-グルコース：D-フラクトース＝４５：５５のものを用いた。
　D-グルコース：D-フラクトース＝５５：４５を用いた際に、平衡状態でD-グルコース：D-フラクトース：D-アルロース＝５５．６：３２．１：１２．３であった（図６）。
　D-グルコース：D-フラクトース＝５０：５０を用いた際に、平衡状態でD-グルコース：D-フラクトース：D-アルロース＝５１．０：３４．７：１４．３であった（図７）。
　また、D-グルコース：D-フラクトース＝４５：５５を用いた際に、平衡状態でD-グルコース：D-フラクトース：D-アルロース＝４５．６：３８．８：１５．６であった（図８）。
［カラム法での新甘味料の生産］
　D-アルロース3-エピメラーゼを固定化した固定化酵素をジャケットカラムに約250 mL充填しバイオリアクターを構築した。基質には６０％の糖液を用いて、ジャケット部に６０℃の温水を循環させSV=１～SV=５まで流速を変化させて酵素反応を行った。基質に用いた糖液は、D-グルコース：D-フラクトース＝５８：４２、D-グルコース：D-フラクトース＝５０：５０およびD-グルコース：D-フラクトース＝４５：５５のものを用いた。
　基質にD-グルコース：D-フラクトース＝５８：４２の糖液を用いSVを変化させた際のカラム法での糖組成の変化結果を、表１に示した。
　基質にD-グルコース：D-フラクトース＝５０：５０の糖液を用いSVを変化させた際のカラム法での糖組成の変化を、表２に示した。
　基質にD-グルコース：D-フラクトース＝４２：５８の糖液を用いSVを変化させた際のカラム法での糖組成の変化を、表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　食品業界等で広く使われても肥満などの生活習慣病の原因とならない砂糖とほぼ同様の甘味度および味質を有する甘味料を十分価格競争力を有する低コストで世界的な規模の大量生産することが期待される。低コストで世界的な規模の大量生産の成功により、D-アルロース（＝D-プシコース）を含む糖組成物の用途が、食品、飲料、特に機能性食品(肥満予防など)、医薬品、化粧品、飼料、農薬(植物成長調整剤、植物病害抵抗性増幅剤など)、工業用として拡大するのみならず「飢餓をゼロに」のためのエネルギー源等として世界に供給されることが期待される。

 

Claims (12)

  1. 　D-グルコース、D-フラクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の大量生産方法であって、
    D-グルコースとD-フラクトースを含む安価な組成物を原料として用い、
    D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させ、
    希少糖D-アルロース、D-グルコースおよびD-フラクトースからなる組成物において、D-フラクトースの含有量が、D-アルロースの弱点である甘味度を補うとともに、D-アルロースおよびD-グルコースとともに砂糖に近い味質を与える範囲である、目的生成物を得ることを特徴とする、方法。
  2. 　前記目的生成物において、D-グルコースはエネルギー源として重要であるが、砂糖の甘みの強さを１００とすると６５－８０であること、
    　D-フラクトースは甘みの強さ１２０－１７０であり甘味を与えるのに重要であり、D-アルロースおよびD-グルコースとともに砂糖に近い味質を与えるが、一方継続摂取により肥満の元凶の糖としての課題があること、
    　D-アルロースは、甘みの強さ７０であり、抗肥満および消化性糖による急激な血糖値上昇の抑制の生理機能を付与できることの各成分の特徴を考慮して、各成分の含有量を決定して目的に応じた適切な組成とする、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記原料が、でんぷんから生産されるD-グルコースを用いて、D-キシロースイソメラーゼを作用させてD-グルコースとD-フラクトース間の平衡反応により異性化を進行させて生産した、または砂糖にインベルターゼを作用させて分解して生産した、D-グルコースとD-フラクトースを含む組成物である請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記原料が安価な異性化糖または転化糖であり、目的生成物がD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の、継続摂取で疾病を引き起こさない優れた生理的効果を発揮する改善型異性化糖または転化糖である、請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記原料が安価な異性化糖として、ぶどう糖果糖液糖および／または果糖ぶどう糖液糖を用いる請求項４に記載の方法。
  6. 　用いるD-アルロース３-エピメラーゼの酵素活性を調整することで、目的生成物の希少糖D-アルロース含有量にすることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記異性化反応が、基質溶液を固定化酵素カラムの中を通過させて行う反応であって、かつ、基質の流速、基質との反応時間、反応温度、基質溶液のpH、および酵素量からなる群から選ばれる１以上を調整することで、目的物の組成を目的のものにすることを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
  8. 　原料を基質として固定化酵素反応を用い、理論上は副生産物を生産することなく１００％目的生産物として得ることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
  9. 　目的生成物が、製造工程中に疑似移動クロマトグラフィーによる分離操作で失われることはないことを特徴とする、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
  10. 　前記D-アルロース３-エピメラーゼを作用させて、原料中のD-フラクトースをD-フラクトースと希少糖D-アルロース間の異性化反応により異性化を進行させ、目的生成物の目的とする希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させた後に、
    希少糖D-アルロースに作用しないD-キシロースイソメラーゼを作用させて、D-フラクトースとD-グルコース間の平衡反応により異性化を進行させる反応工程を付加させることを特徴とする、請求項１ないし９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記原料が安価な異性化糖として、高果糖液糖を用いる請求項１０に記載の方法。
  12. 　用いるD-アルロース３-エピメラーゼの高耐熱性からの該酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性に基づく工業的に実用可能な低コストの製造方法である、請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。

     
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