WO2014109254A1 - アルスロバクター グロビホルミスの生産するケトース３－エピメラーゼ - Google Patents

アルスロバクター グロビホルミスの生産するケトース３－エピメラーゼ Download PDF

Info

Publication number
WO2014109254A1
WO2014109254A1 PCT/JP2013/084978 JP2013084978W WO2014109254A1 WO 2014109254 A1 WO2014109254 A1 WO 2014109254A1 JP 2013084978 W JP2013084978 W JP 2013084978W WO 2014109254 A1 WO2014109254 A1 WO 2014109254A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ketose
enzyme
activity
epimerase
psicose
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/084978
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
何森　健
プシュパ キラン グラッパリ
知也 新谷
諒 吉川
Original Assignee
松谷化学工業株式会社
株式会社希少糖生産技術研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 松谷化学工業株式会社, 株式会社希少糖生産技術研究所 filed Critical 松谷化学工業株式会社
Priority to CN201380069857.2A priority Critical patent/CN104919045A/zh
Priority to JP2014556386A priority patent/JP5848834B2/ja
Priority to EP13870446.5A priority patent/EP2944691A4/en
Priority to US14/759,620 priority patent/US9932617B2/en
Priority to KR1020157021500A priority patent/KR102132381B1/ko
Publication of WO2014109254A1 publication Critical patent/WO2014109254A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a ketose 3-epimerase having a specific amino acid sequence, and a method for producing ketose using the enzyme, and in particular, has a specific amino acid sequence and has a specific amino acid sequence, Arthrobacter globiformis M30 (consignment)
  • the present invention relates to a ketose 3-epimerase which can be obtained from No. NITE BP-1111) and has the following substrate specificities (A) and (B), and further to a method for producing ketose using the enzyme.
  • A Epimerize position 3 of D- or L-ketose to produce the corresponding D- or L-ketose.
  • B The substrate specificity for D-fructose and D-psicose is the highest in D- or L-ketose.
  • D-psicose is an epimer of D-fructose and is very similar to D-fructose in terms of sweetness intensity and type. However, unlike D-fructose, D-psicose is hardly metabolized at the time of absorption in the body and has a low caloric contribution.
  • Patent Document 1 describes that D-psicose can be advantageously used as a low-calorie sweetener in the production of low-calorie foods and drinks. That is, D-psicose can be used as an active ingredient in diet foods. Sugar alcohols widely used as non-sugar sweeteners cause side effects such as diarrhea when ingested in excess of the prescribed amount, but D-psicose has few such side effects.
  • D-psicose is hardly metabolized in the human body, the calorific value is almost zero, and has a function of reducing abdominal fat by suppressing the activity of lipid synthase. Therefore, D-psicose can also be used as a sweetener useful for weight loss (see, for example, Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 2 describes that D-psicose has an effect of suppressing blood sugar elevation and can be advantageously used for health foods, foods and drinks for diabetics, and foods for slimming. From this point of view, D-psicose has attracted much interest as a health food and diet sweetener, and there is an increasing need for the development of an efficient and safe production method of D-psicose in the food industry. .
  • Non-Patent Document 3 discloses a Pseudomonas chicory (Pseudomonas cichorii) ST-24-derived D- ketose 3-epimerase, described that can be produced is D- psicose from D- fructose by utilizing this enzyme Has been.
  • this enzyme has the highest specificity for D-tagatose and its action on D-fructose is relatively weak, as is also called D-tagatose 3-epimerase.
  • Pseudomonas chicory is a phytopathogenic microorganism and has a very low ability to produce D-ketose 3-epimerase, and thus cannot be said to be suitable for industrial use.
  • ketose 3-epimerase producing ability is high and there is no problem in safety in food production, and a novel ketose 3- having high specificity for D-fructose and suitable for producing D-psicose There is a need for epimerases.
  • Patent Document 3 describes a novel ketose 3-epimerase and a method for producing the same, DNA encoding the enzyme, recombinant DNA and transformant containing the DNA, and a method for producing ketose using the enzyme.
  • a ketose 3-epimerase that can be obtained from a microorganism belonging to the genus Rhizobium, a method for producing the same, a DNA encoding the enzyme, a recombinant DNA and a transformant containing the enzyme, and the enzyme
  • the above problem is solved by providing a method for epimerizing the 3-position of D- or L-ketose to produce the corresponding D- or L-ketose.
  • Patent Document 4 has developed a method for producing D-psicose using D-psicose epimerase derived from Agrobacterium tumefaciens (hereinafter referred to as psicose 3-epimerase). As described above, in order to cope with the above problems, research has been conducted on a method for enzymatically producing D-psicose using D-fructose as a substrate. However, the methods developed so far have many problems in terms of safety when used for the production of D-psicose as food.
  • the present invention provides a high yield of D-fructose from D-fructose from those that are listed on the existing additive list that is approved for use in the production of foods and that are considered to be almost non-toxic.
  • An object of the present invention is to obtain a novel ketose 3-epimerase that catalyzes isomerization to psicose and to provide a method for producing ketose using the enzyme.
  • the present inventors have collected soils from various places every time there is an opportunity, and then separated microorganisms, and have continued to search for microorganisms other than those belonging to the genus Pseudomonas having the ability to produce ketose 3-epimerase.
  • a microorganism belonging to the genus Arthrobacter that produces a novel ketose 3-epimerase was found among many isolated strains.
  • the novel ketose 3-epimerase derived from the microorganism has a wide substrate specificity that acts at the 3-position of D or L-ketose and catalyzes the epimerization to the corresponding D- or L-ketose.
  • the substrate specificity for D-fructose and D-psicose is the highest among D- or L-ketoses and is suitable for the production of D-psicose from D-fructose.
  • the present invention provides a ketose 3-epimerase obtainable from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter , and uses the enzyme to epimerize the 3-position of D- or L-ketose, It is an object to provide a method for producing the corresponding D- or L-ketose.
  • Microorganisms belonging to the genus Arthrobacter have a relatively high ability to produce a novel ketose 3-epimerase and, unlike Pseudomonas chicory, have no phytopathogenicity.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention that can be obtained from the microorganism is particularly useful for the production of D-psicose from D-fructose because it well catalyzes the interconversion between D-psicose and D-fructose. is there.
  • the gist of the present invention is the ketose 3-epimerase described in the following (1) to (5).
  • Arthrobacter globiformis M30 (Accession number NITE BP-1111) derived from a microorganism, the partial amino acid sequence includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the following (A) and (B) A ketose 3-epimerase having substrate specificity and having the following physicochemical properties (A) to (B): (A) Epimerize position 3 of D- or L-ketose to produce the corresponding D- or L-ketose.
  • the relative activity when D-fructose is used as a substrate is 43.8%, 2. 100% activity when D-psicose is used as a substrate, 3.
  • the relative activity when using D-sorbose as a substrate is 1.13%, 4).
  • the relative activity when D-tagatose is used as a substrate is 18.3%, 5.
  • the relative activity when using L-fructose as a substrate is 0.97%, 6).
  • the relative activity when L-psicose is used as a substrate is 21.2%, 7).
  • the relative activity when using L-sorbose as a substrate is 16.6%, 8.
  • the relative activity is 44.0% when L-tagatose is used as a substrate.
  • the activity for each ketose is shown as a relative activity, where the epimerization activity of D-psicose is 100.
  • the gist of the present invention is a ketose 3-epimerase encoded by a gene having a base sequence described below.
  • the corresponding D- or L-ketose obtained by epimerizing position 3 of D- or L-ketose encoded by a nucleotide sequence in which one or more nucleotide sequences are deleted, substituted or added, or a complementary nucleotide sequence thereto Produced ketose 3-epimerase.
  • the gist of the present invention is the ketose conversion method described in the following (6) and the ketose production method described in the following (7).
  • a ketose 3-epimerase according to any one of the above (1) to (5) is allowed to act on a solution containing one or more selected from D- or L-ketose to position 3 of the ketose
  • a ketose conversion method characterized by epimerization is allowed to act on a solution containing one or more selected from D- or L-ketose to place the ketose at position 3 as an epimer And producing a corresponding ketose and collecting the ketose.
  • the present invention has the following effects.
  • the greatest feature of using this enzyme derived from Arthrobacter globiformis in the food industry is the safety of bacteria.
  • the optimum pH of the enzyme according to this strain is between 6 and 8, and D-psicose production is possible even at a pH of 7 or less with little coloration. 3.
  • Rhizobium increases activity with Mn 2+ , Mg 2+ , Agrobacterium with Co 2+ , and Mn 2+ . .
  • an increase in activity is observed due to Mn 2+ and Co 2+ .
  • the activity is also increased by Mg 2+ and Ca 2+ . 4).
  • reactions in a wide temperature range are possible. 5.
  • the reaction activity from L-tagatose to L-sorbose is large. 6). Even when the amount of D-psicose added to the medium is as low as 0.15%, active cells can be obtained. 7). Even water has enzyme activity, and the reaction from fructose to psicose proceeds.
  • Ketose 3-epimerase containing the nucleotide sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing has an enzyme activity of about 30-37 times.
  • D-fructose can be obtained from D-fructose in a high yield from bacterial species that are listed on the existing additive list that is approved for use in the production of foods and that have almost no toxicity.
  • a novel ketose 3-epimerase that catalyzes isomerization to psicose can be obtained.
  • the manufacturing method of the ketose using the enzyme can be provided. That is, the present invention provides a ketose 3-epimerase obtainable from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter , and uses the enzyme to epimerize the 3-position of D- or L-ketose, A method for producing the corresponding D- or L-ketose can be provided.
  • ketose 3-epimerase of the present invention that can be obtained from the microorganism is particularly useful for the production of D-psicose from D-fructose because it well catalyzes the interconversion between D-psicose and D-fructose.
  • the present invention relates to a ketose 3-epimerase that can be obtained from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter and has the following substrate specificity.
  • Arthrobacter is an enzyme-based microorganism such as “ ⁇ -amylase, isomaltodextranase, invertase, urease, glucanase, ⁇ -glucosyltransferase, fructosyltransferase”, trehalose and vitamin K ( Menaquinone) is listed on the food additive list as a producer. It is surprising that no epimerase enzyme has been found due to this bacterial species despite the long use in Japan, the US and Europe.
  • the present invention has the following features.
  • the optimum pH of D-psicose producing bacteria is 7-9 for Pseudomonas, 9-9.5 for Rhizobium, and 7-8 for Agrobacterium.
  • the optimum pH of the enzyme according to this strain is between 6-8, and D-psicose production is possible even at a pH of 7 or less with little coloration.
  • the activity of Rhizobium is increased by Mn 2+ and Mg 2+ and that of Agrobacterium is Co 2+ and Mn 2+ .
  • an increase in activity is observed due to Mn 2+ and Co 2+ .
  • D-psicose production by this strain using Mg 2+ or the like is possible.
  • the present inventors have found a microorganism M30 strain producing a novel ketose 3-epimerase among many isolated strains, and the M30 strain belongs to Arthrobacter globiformis by phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene base sequence homology. There was found. Identification of strain (1) 16S rRNA gene base sequence homology The 16S rRNA gene region was analyzed and the number of bases 734 was specified. (2) Homology search The base sequence of the 16S rRNA gene of this strain was searched for homology with known bacterial species by BLAST search (Japan DNA Data Bank).
  • the microorganism of the M30 strain was determined to be Arthrobacter globiformis based on the strain name and homology (%) values having a homology of 97% or more with respect to the identified base sequence of 734 bases. It was.
  • Arthrobacter globiformis M30 a strain having ketose 3-epimerase activity of the present invention, is an independent administrative agency product evaluation technology located in 2-5-8, Kazusa Kamashi, Kisarazu City, Chiba Prefecture on June 22, 2011. Fundamental Organization Deposited at the Patent Microorganism Deposit Center, it was first received as receipt number NITE AP-1111 and deposited as deposit number NITE P-1111.
  • the ketose referred to in the present invention is a hexose having a ketose structure, specifically means fructose, psicose, tagatose and sorbose, and D- or L-ketose represents these D-form and L-form. means.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention has an activity of epimerizing the 3-position of D- or L-ketose to produce the corresponding D- or L-ketose, and D- or L-fructose and D- or L- It catalyzes interconversion between psicose and interconversion between D- or L-tagatose and D- or L-sorbose.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention is the enzyme having the highest substrate specificity for D-fructose and D-psicose among D- or L-ketoses.
  • the enzyme of the present invention can be obtained from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter described later.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention belongs to the genus Arthrobacter , cultivates a microorganism having the ability to produce ketose 3-epimerase, and collects the ketose 3-epimerase from the cells grown in the culture solution. Can be prepared.
  • the microorganism belonging to the genus Arthrobacter for example, the Arthrobacter globiformis M30 (accession number NITE BP-1111) strain and mutants thereof can be advantageously used.
  • the M30 strain has a relatively high ability to produce ketose 3-epimerase and is suitable for obtaining the enzyme of the present invention.
  • the M30 strain is based on NITE P-1111 deposited on June 22, 2011 at the Japan Patent Evaluation Depositary Center for Product Evaluation Technology (2-5-8 Higashi Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba, Japan). A transfer to the deposit under the Budapest Treaty was requested on May 2, 2012, and the deposit was made internationally under the deposit number NITE BP-1111.
  • the activity of the enzyme before purification, ketose 3-epimerase can be measured by measuring the amount of D-psicose produced using D-fructose as a substrate.
  • the composition of the enzyme reaction solution was 200 ml of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 375 ⁇ l of 0.2M D-fructose, 100 ⁇ l of enzyme solution, and 75 ⁇ l of 10 mM manganese chloride, and reacted at 55 ° C. for 30 minutes. The reaction is stopped by boiling for 2 minutes and the liquid composition after the reaction is measured by HPLC.
  • One unit of enzyme activity is defined as the amount of enzyme that epimerizes D-fructose to produce 1 ⁇ mol of D-psicose per minute under the above conditions.
  • the enzyme unit that epithelates from D-psicose to D-fructose, which is a reverse reaction, is also measured and defined in the same manner.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention may have the following physicochemical properties.
  • A Optimum pH Reaction at 55 ° C. for 30 minutes, 6.0 to 10 in the presence of 1 mM divalent cobalt ion (Co 2+ ).
  • B Optimal temperature pH 7.0, reaction for 30 minutes, about 50 ° C. to about 70 ° C.
  • the ketose conversion reaction is usually carried out under the following conditions.
  • the substrate concentration is 1 to 60% (w / v), preferably about 5 to 50% (w / v), the reaction temperature is 10 to 70 ° C, preferably about 30 to 60 ° C, and the reaction pH is 5 to 10%.
  • the enzyme activity is selected from the range of 1 unit or more per gram of substrate, preferably 50 to 5,000 units.
  • the reaction time can be selected as appropriate, in the case of batch reaction, a range of 5 to 50 hours is usually selected in relation to economy.
  • the reaction solution obtained by conversion in this way contains the raw material ketose and the newly produced ketose, and this is used as it is as a sweetener, humectant, crystal precipitation inhibitor, shine imparting agent, and the like. This can also be advantageously carried out.
  • the reaction solution is decolorized using activated carbon according to a conventional method, and desalted and concentrated using H-type and OH-type ion conversion resins to obtain a syrup-like product.
  • the concentrated liquid is further purified by separating and purifying the newly produced ketose and the raw material ketose by column chromatography using, for example, an alkali metal type or alkaline earth metal type strongly acidic cation exchange resin.
  • the produced ketose-rich fraction can be concentrated to obtain a syrup-like product.
  • a ketose that can be crystallized it can be advantageously crystallized to obtain a crystal product.
  • the separated raw material ketose can be advantageously used again as a raw material for the conversion reaction.
  • the ketose obtained in this way is suitable as a sweetener, and is advantageous for sweetening oral foods such as foods and drinks, feeds, foods, tooth brushes, mouth-in-mouth pills, sublingual tablets, oral medicines, and improving palatability. Available. Further, it can be advantageously used as a carbon source for fermentation, a reagent, a raw material for chemicals and pharmaceuticals, an intermediate, and the like.
  • D-psicose 3-epimerase activity for converting D-psicose to D-fructose was measured by the above-described activity measurement method and expressed as ketose 3-epimerase activity.
  • the present invention relates to a ketose that epimerizes position 3 of D- or L-ketose encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 in the sequence listing to generate the corresponding D- or L-ketose.
  • 3-epimerase not only 3-epimerase but also one or more nucleotide sequences in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 in the sequence listing are deleted, substituted or added as long as the activity of the encoded enzyme is maintained. Also included is a ketose 3-epimerase which is encoded by a base sequence or a base sequence complementary thereto and which epimerizes position 3 of D- or L-ketose to produce the corresponding D- or L-ketose.
  • ⁇ Experiment 2 Culture of Arthrobacter Globiformis M30 (Accession Number NITE BP-1111) Strain and Extraction of Crude Enzyme> The cells were collected from the culture solution by centrifugation. The collected cells were washed with 1 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0). Next, the cells were suspended in 10 ml of 1 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), and the cells were disrupted with an ultrasonic homogenizer (SONICS & MATERIALS) while cooling in ice water. The crushed material was centrifuged at 12000 rpm for 20 minutes, and the centrifuged supernatant was used as a crude enzyme.
  • an ultrasonic homogenizer SONICS & MATERIALS
  • ketose 3-epimerase> 1 Effect of carbon source and its concentration on activity 0.05-1% D-psicose (Dp), 1% D-fructose (Df), 1% D-tagatose (Dt), MSM containing 0.1% fructose (Df) and 0.1% D-psicose (Dp), 1% D-psicose (Dp) and 0.1% D-tagatose (Dt)
  • Arthrobacter globiformis M30 acces number NITE BP-1111
  • the medium was cultured for 16 hours at 30 ° C. in three different mediums (minimum inorganic salt (MSM) medium, TSB medium, and yeast extract (YE) medium), and crudely treated in the same manner as above. The enzyme was obtained. As a result (FIG. 2), it was clarified that the enzyme had the highest enzyme activity when D-psicose was added to the cheapest and minimal inorganic salt medium.
  • MSM minimum inorganic salt
  • TSB medium TSB medium
  • yeast extract (YE) medium yeast extract
  • thermo stability Effect of temperature on D-PE activity (thermal stability) The thermal stability was examined for the presence and absence of cobalt ions. In the presence of 1 mM cobalt ions, heat treatment was performed at 10-80 ° C. for 10 minutes at pH 7.0, and the residual activity was measured. The result is shown in FIG. Thus, it was found that when cobalt ions are present, the temperature is stable up to 70 ° C., and when no cobalt ions are present, the temperature is stable up to 60 ° C.
  • Substrate specificity of D-PE Eight kinds of hexasaccharides (ketose) were used to examine the substrate specificity of the enzyme before purification. As shown in Table 4, the enzyme reaction composition was produced by epimerizing from each sugar by HPLC analysis with each substrate 0.2M 350 ⁇ l, enzyme solution 350 ⁇ l (Tris buffer pH 7.0), reaction at 55 ° C. for 30 minutes. Ketose was measured. The result was as follows. The activity for each ketose is shown as a relative activity, with the epimerization activity of D-psicose being 100.
  • DPE D-psicose 3 epimerase
  • DTE Pseudomonas chicory D-tagatose 3-epimerase
  • the enzyme of the present invention was further purified to a pure state to measure physicochemical properties.
  • Enzyme purification, activity measurement of purified enzyme, and protein measurement For the measurement of enzyme activity, an enzyme reaction was performed using the enzyme reaction solution composition shown in Table 6. The enzyme reaction was carried out at 30 ° C. for 30 minutes, and the amount of enzyme that produced 1 ⁇ mole of D-fructose per minute under these conditions was defined as 1 unit. After the reaction, the reaction solution was put into a boiling solution for 3 minutes to stop the reaction. After deionization treatment, D-fructose produced by HPLC analysis was measured. The protein was measured by Bradford method after adding 5 ⁇ L of enzyme solution to 250 ⁇ L of Bradford solution and stirring uniformly.
  • This purified enzyme was found to be an epimerase having a homotetramer structure in which the molecular weight of the subunit by SDS-PAGE is about 32 kDa and the molecular weight by gel filtration is 120 kDa.
  • the enzyme was present in the supernatant without precipitation even at a PEG concentration of 40%. PEG must be removed in order for the supernatant enzyme to proceed to the next purification step. PEG was removed using the property that PEG does not adsorb to the ion exchange resin. Specifically, the enzyme was adsorbed onto the ion exchange resin to wash out the PEG, and then the adsorbed enzyme was eluted from the resin with a high concentration of NaCl to remove the PEG. The specific method of PEG removal is shown below.
  • the PEG fraction enzyme solution was purified by ion chromatography separation.
  • the column used was Q-Sepharose High Performance, and fractionation was carried out by dividing 35% to 60% into 5 ml fractions with a 1M NaCl concentration gradient at a flow rate of 1.5 ml / min using an AKTA system.
  • Enzyme activity was eluted in the arrowed fraction shown in FIG. This was recovered and a purified enzyme was obtained by ion exchange chromatography separation.
  • FIG. 8 shows an ion exchange chromatographic separation elution diagram. Since the enzyme activity was present in the portion indicated by the arrow in the center of FIG. 8 of protein elution, this portion was recovered.
  • the enzyme purified by ion exchange chromatography separation was further purified by hydrophobic chromatography separation.
  • the column used is RESOURCE PHE 6 ml.
  • the enzyme solution was dissolved by adding ammonium sulfate to 2M.
  • the elution was carried out at a flow rate of 3 ml / min while decreasing the concentration from 2% ammonium sulfate 100% to 0%, and fractionated in 5 mL portions.
  • Enzyme activity was eluted in the large peak of the arrow in FIG.
  • the fraction was dialyzed to remove ammonium sulfate, and a hydrophobic chromatographic separation and purification enzyme was obtained. There was activity in the second large peak of protein elution.
  • the arrows in FIG. 9 indicate the collected fractions.
  • Purity of the purified enzyme was confirmed using SDS PAGE (gel concentration 15%) according to a conventional method.
  • the left is a standard protein, and the next two lanes are enzymes after purification using hydrophobic chromatography. As a result, a single band was confirmed between 29 and 45 kDa. This confirmed that the enzyme was purely purified.
  • Thermal stability of the purified enzyme was examined in the presence or absence of Mg 2+ ions. In the presence and absence of Mg 2+ ions, the thermal stability changed significantly, and the Mg 2+ ions increased the thermal stability of the enzyme. It was stable at 50 ° C. for 1 hour in the presence of Mg 2+ ions. On the other hand, in the absence of Mg 2+ ions, the overall thermal stability was about 10 ° C. lower. The optimal reaction temperature is 70 ° C., and this result indicates that the stability of the enzyme increases due to the presence of the substrate. That is, it is considered that the stability of the ES complex is high.
  • the activity of the enzyme not subjected to heat treatment is expressed as a relative activity with 100 as the activity.
  • the heat treatment conditions were a purified enzyme solution 40 ⁇ l, a buffer solution (10 mM, Tris-HCl, pH 7.5) 160 ⁇ l, 4 mM MgCl 2 (water in the case of no Mg 2+ ions) 100 ⁇ l, and a total volume of 300 ⁇ l. After holding for 1 hour and cooling in ice water for 10 minutes, the remaining enzyme activity was measured according to a conventional method.
  • FIG. 15 shows the relationship between the migration distance and the molecular weight.
  • FIG. 15 shows the relationship between the migration distance cm of the marker protein and the molecular weight kDa. Since the movement distance of the purified enzyme was about 4.1 cm, the subunit of this enzyme was estimated to be about 32 kDa.
  • the electrophoretogram is shown in FIG.
  • the molecular weight of the enzyme was measured using gel filtration chromatography. That is, the relational diagram 16 of the standard protein and the movement distance was obtained and calculated from the movement distance of this enzyme. As a result, it was revealed that the molecular weight of the enzyme was about 120 kDa.
  • Superdex 200 pg 16/600 was used as a column for gel filtration chromatography.
  • the running buffer composition used was 10 mM Tris-HCl pH 7.5, NaCl 200 mM, MgCl 2 1 mM.
  • the following five types of standard proteins (markers) were used.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention is an isomerization reaction that does not require a coenzyme, like other epimerases and isomerases. Accordingly, the enzyme can be used after being immobilized, and an immobilized enzyme having high activity can be obtained by various immobilization methods. By using an immobilized enzyme, it is possible to carry out a continuous and large amount of epimerization reaction. Being industrially immobilizable, the target ketose can be mass-produced.
  • This microorganism was grown in a minimal inorganic salt medium using D-psicose as a carbon source, and the equilibrium ratio between D-psicose and D-fructose was examined using an enzyme obtained from the growing cells.
  • a reaction solution composition 200 ⁇ l of 50 mM Tris buffer, 0.2 M D-psicose or D-fructose, enzyme solution 100 ⁇ l, 10 mM CoCl 2 75 ⁇ l were used. The reaction temperature was 50 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the amounts of D-fructose and D-psicose in the reaction solution were measured using HPLC.
  • the purified enzyme was used to study the equilibrium of epimerization between D-psicose and D-fructose.
  • the D-psicose: D-fructose in the equilibrium state was 25:75 at 40 ° C. and 30:70 at 70 ° C.
  • Genome gene information was obtained from the amino acid sequence, PCR primers for amplification (AglDPE_F: 5'-ATGAAAATTGGTTGCCATG-3 ', AglDPE_R: 5'-TTAGTGCAGTTCGATGGT-3') were designed, and the DPE gene was amplified from the genome of AgM30 strain .
  • the 870 bp gene sequence shown in the following sequence 11 SEQ ID NO: 3
  • the 15th cytosine shown underlined in sequence 12 SEQ ID NO: 4
  • Two base sequences of the gene sequence consisting of the sequence in which (C) was replaced with thymine (T) were obtained.
  • E. coli expression system An E. coli expression system was constructed based on the sequence 11 (SEQ ID NO: 3).
  • a DPE gene derived from the AgM30 strain was incorporated into a pET vector (clontech), and Escherichia coli for expression was transformed.
  • the induced protein was confirmed in the soluble fraction.
  • DPE activity was also confirmed, but the activity was the same as that of the wild type per 1 mL of the culture solution.
  • the DPE gene derived from the AgM30 strain was incorporated into pRSET vector (Invitrogen) and pCold vector (Takara Bio) in order to improve the activity in the E.
  • the pRSET vector system showed the same activity as that of the wild type per mL of the culture solution, and the pCold vector system showed an activity about 10 times that of the wild type.
  • the DPE gene derived from AgM30 strain was incorporated into pQE60 vector (qiagen), and its host E. coli M15 [pREP4] (qiagen) was transformed, and the expression product was analyzed.
  • electrophoresis by SDS-PAGE gel concentration: 12%) was performed, a protein as an expression product was confirmed in a soluble fraction in the vicinity of about 30 kD showing almost the same molecular weight as that of the wild type protein as shown in FIG.
  • the DPE enzyme activity of 1 mL of the culture broth was measured and found to be 55.2 U ( ⁇ mol / min).
  • the enzyme activity of DPE roughly purified from Arthrobacter globiformis strain M30 is 1.5-1.8 U ( ⁇ mol / min) per 1 mL of the culture solution, and the enzyme activity increased by about 30-37 times.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention acts on free D- or L-ketose, D- or L-ketopentose to epimerize the 3-position of these ketoses, and the corresponding D- or L-ketose, D- or Easily produces L-ketose.
  • This reaction opens the way for mass production of various ketoses, especially D-psicose using D-fructose as a raw material.
  • the ketose 3-epimerase of the present invention can obtain an immobilized enzyme having high activity by various immobilization methods. By using the immobilized enzyme, it is possible to perform a continuous and large amount of epimerization reaction. It is. Being industrially immobilizable, the target ketose can be mass-produced.
  • the establishment of the ketose 3-epimerase of the present invention and the production method thereof has an extremely significant industrial significance not only in the sugar industry but also in the food, cosmetics and pharmaceutical industries.
  • the greatest feature of using Arthrobacter globforis in the food industry, which produces this enzyme, is the safety of bacteria.
  • the fact that this bacterial species is listed in the EAFUS by the FDA in the United States proves that the safety of the bacterial cell itself is very high.
  • D-psicose-producing enzymes known so far include Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, etc., but these are not listed in the US / European list, but are also opportunistic bacteria.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

課題：食品産業で用いることができる安全性の高いエピメラーゼおよびケトースの製造方法の提供。 解決手段：アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることができ、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列と下記の基質特異性を有するケトース３－エピメラーゼ： （１）Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成する。 （２）Ｄ－またはＬ－ケトースの中ではＤ－フラクトースおよびＤ－プシコースに対する基質特異性が最も高い。　および、配列表における配列番号３または配列番号４で示されるＤ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化して対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成するケトース３－エピメラーゼ。

Description

アルスロバクター　グロビホルミスの生産するケトース３－エピメラーゼ
　本発明は、特定のアミノ酸配列を有するケトース３－エピメラーゼ、ならびに、その酵素を用いるケトースの製造方法に関し、詳細には、特定のアミノ酸配列を有し、アルスロバクター　グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）から得ることができ、下記（Ａ）および（Ｂ）の基質特異性を有するケトース３－エピメラーゼ、さらにはその酵素を用いたケトースの製造方法に関するものである。
（Ａ）Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ－またはＬ－ケトース中ではＤ－フラクトースおよびＤ－プシコースに対する基質特異性が最も高い。
　Ｄ－プシコースは、Ｄ－フルクトースのエピマーであって、甘味の強度および種類の面において、Ｄ－フルクトースに極めて類似している。しかし、Ｄ－プシコースは、Ｄ－フルクトースと異なり、体内吸収時にほとんど代謝されず、熱量寄与が低い。特許文献１には、Ｄ－プシコースが低カロリー甘味料として、低カロリー飲食品の製造に有利に利用できることが記載されている。すなわち、Ｄ－プシコースは、ダイエット食品の有効成分として用いることができる。非砂糖甘味料として広く利用されている糖アルコール類は、規定量を超えて摂取すると下痢などの副作用を起こすが、Ｄ－プシコースは、そのような副作用が少ない。さらに、Ｄ－プシコースは、人体内でほとんど代謝されないため、熱量値はほぼゼロに近く、脂質合成酵素の活性を抑制することで腹部脂肪を減少させる機能を有している。そのため、Ｄ－プシコースは、体重減少に有益な甘味料としても使用することができる（たとえば、非特許文献１および２参照）。また、特許文献２には、Ｄ－プシコースが血糖上昇抑制作用を有していることから、健康食品、糖尿病患者用飲食品、痩身用飲食品などに有利に利用できることが記載されている。このような観点から、Ｄ－プシコースは、健康食品、ダイエット甘味料として多くの関心を集めており、食品産業において、Ｄ－プシコースの効率的で安全な生成方法の開発に対する必要性が高まっている。
　一方、非特許文献３にはシュードモナス チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ）ＳＴ－２４由来のＤ－ケトース３－エピメラーゼが開示されており、この酵素を利用することによりＤ－フラクトースからＤ－プシコースが製造できることが記載されている。しかしながら、この酵素は別名Ｄ－タガトース３－エピメラーゼとも呼ばれるように、Ｄ－タガトースへの特異性が最も高く、Ｄ－フラクトースへの作用は比較的弱いことが知られている。また、シュードモナス チコリは植物病原性微生物であり、Ｄ－ケトース３－エピメラーゼ産生能が非常に低いため、工業的に利用する上で適しているとは言えない。シュードモナス属に属する微生物とは異なるケトース３－エピメラーゼ産生能が高く食品生産に安全性に問題のない微生物、およびＤ－フラクトースへの特異性が高く、Ｄ－プシコースの製造に適した新規ケトース３－エピメラーゼが求められている。
　そこで、特許文献３には、新規なケトース３－エピメラーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡ、これを含んでなる組換えＤＮＡおよび形質転換体、ならびに当該酵素を用いたケトースの製造方法を提供することを課題とし、リゾビウム属に属する微生物から得ることのできるケトース３－エピメラーゼとその製造方法、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡおよび形質転換体、ならびに該酵素を利用して、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを製造する方法を提供することにより上記課題を解決している。また、特許文献４にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のＤ－プシコースエピメラーゼ（以下、プシコース３－エピメラーゼという）を用いるＤ－プシコースの生成方法が開発されている。
　以上のとおり、上記のような問題に対処するために、Ｄ－フルクトースを基質として用いて、Ｄ－プシコースを酵素的に生成する方法について研究が行なわれている。しかし、現在までに開発された方法は、食品としてのＤ－プシコースの生産に利用するには安全性の点で問題点が多い。
特開２００１－０１１０９０号公報 特開２００５－２１３２２７号公報 ＷＯ２００７／０５８０８６号公報 特表２００８－５４１７５３号公報
Matsuo,T.,Y.Baba,M.Hashiguchi,K.Takeshita,K.Izumori and H.Suzuki,Asia Pac. J.Clin. Nutr., 10:233-237(2001) Matsuo,T.and K.Izumori,Asia Pac.J.Clin. Nutr., 13:S127(2004) Ken Izumoriら、Biosci. Biotech. Biochem.,57,1037-1039(1993)
　本発明は、食品を製造する際に使用が認められる既存添加物名簿収載リストに収載されている菌種であって毒性がほとんどないとされる菌種から、高い収率でＤ－フラクトースからＤ－プシコースへの異性化を触媒する新規なケトース３－エピメラーゼを取得すること、ならびに、その酵素を用いたケトースの製造方法を提供することを課題とする。
　本発明者等は、機会ある毎に各地の土壌を採取し、それから微生物を分離し、ケトース３－エピメラーゼ産生能を有するシュードモナス属に属する微生物以外の微生物の探索を続けてきた。上述した日本の既存添加物名簿収載リスト以外にもヨーロッパおよびアメリカにおいて食品として使用が認められるリストに載っている菌種で毒性がほとんどないとされる菌種に着目して、鋭意探索を続けてきた。
　その結果、数多く単離した菌株の中に新規なケトース３－エピメラーゼを産生するアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物を見出した。また、当該微生物由来の新規なケトース３－エピメラーゼは、ＤまたはＬ－ケトースの３位に作用し、対応するＤ－またはＬ－ケトースへのエピマー化を触媒する幅広い基質特異性を有しており、意外にも、Ｄ－またはＬ－ケトースの中ではＤ－フラクトースおよびＤ－プシコースに対する基質特異性が最も高く、Ｄ－フラクトースからのＤ－プシコースの製造に適していることを見出した。そして、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物より得ることのできる新規ケトース３－エピメラーゼとその製造方法を確立するとともに、該酵素を利用したケトースの変換方法ならびにケトースの製造方法を確立して本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることのできるケトース３－エピメラーゼの提供、ならびに、その酵素を利用して、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを製造する方法を提供すること、を目的とする。
　アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物は、新規なケトース３－エピメラーゼ産生能が比較的高く、シュードモナス　チコリとは異なり植物病原性も有していない。また、当該微生物から得ることのできる本発明のケトース３－エピメラーゼは、とりわけＤ－プシコースおよびＤ－フラクトース間の相互変換を良く触媒することから、Ｄ－フラクトースからのＤ－プシコースの製造に有用である。
　本発明は、下記（１）ないし（５）に記載されたケトース３－エピメラーゼを要旨とする。
（１）アルスロバクター　グロビホルミス　Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）である微生物由来である、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、下記（Ａ）、（Ｂ）の基質特異性を有し、且つ、下記（Ａ）～（Ｂ）の理化学的性質を有するケトース３－エピメラーゼ。
（Ａ）Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成する。
（Ｂ）Ｄ－またはＬ－ケトースの中ではＤ－フラクトースおよびＤ－プシコースに対する基質特異性が最も高い。
　（２）下記（ａ）～（ｆ）の理化学的性質を有する上記（１）に記載のケトース３－エピメラーゼ。
　（ａ） 分子量
ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法による分子量が１２０ｋＤａである、サブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造である。
　（ｂ）至適ｐＨ
　３０℃、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６ないし１１。
　（ｃ）至適温度
　ｐＨ７．５、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６０ないし８０℃。
　（ｄ）ｐＨ安定性
　４℃、２４時間保持の条件下で、少なくともｐＨ５ないし１１の範囲で安定。
　（ｅ）熱安定性
　ｐＨ７．５、１時間保持、４ｍＭのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下の条件で、約５０℃以下で安定。マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の非存在下の条件で、約４０℃以下で安定。
　（ｆ）金属イオンによる活性化
　二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）により活性化される。
　（３）下記の基質特異性１．～８．を有する請求項１または２に記載のケトース３－エピメラーゼ。
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　記
 
　　　１．D-フルクトースを基質としたときの相対活性が４３．８％、
　　　２．D-プシコースを基質としたときの活性が１００％、
　　　３．D-ソルボースを基質としたときの相対活性が１．１３％、
　　　４．D-タガトースを基質としたときの相対活性が１８．３％、
　　　５．L-フルクトースを基質としたときの相対活性が０．９７％、
　　　６．L-プシコースを基質としたときの相対活性が２１．２％、
　　　７．L-ソルボースを基質としたときの相対活性が１６．６％、
　　　８. L-タガトースを基質としたときの相対活性が４４．０％。
　ただし、Ｄ－プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を相対活性として示している。
　また本発明は、下記に記載された塩基配列が特定された遺伝子でコードされるケトース３－エピメラーゼを要旨とする。
　（４）　配列表における配列番号３または配列番号４に示す塩基配列か、または配列表における配列番号３または配列番号４に示す塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で１個または２個以上の塩基配列が欠失、置換もしくは付加した塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列でコードされる、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化して対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成するケトース３－エピメラーゼ。
　（５）ケトース３－エピメラーゼが、Ｄ－プシコースイソメラーゼである上記（７）に記載のケトース３－エピメラーゼ。
　さらに、本発明は、下記（６）に記載されたケトースの変換方法、ならびに、下記（７）に記載されたケトースの製造方法を要旨とする。
　（６） Ｄ－またはＬ－ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のケトース３－エピメラーゼを作用させて、該ケトースの３位をエピマー化することを特徴とするケトースの変換方法。
　（７） Ｄ－またはＬ－ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載のケトース３－エピメラーゼを作用させて該ケトースの３位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
　本発明は以下の効果を奏する。
　１．アルスロバクター　グロビホルミス由来の本酵素を食品産業で用いる最も大きな特長としては菌の安全性にある。
　２．Ｄ－プシコース生産菌の最適なｐＨは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）は７～９、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）は９～９．５、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は７～８である。一方で、本菌株による酵素の最適ｐＨは６～８の間にあり、着色の少ない７以下のｐＨにおいてもＤ－プシコース生産は可能である。
　３．３０分間の酵素活性を測定した結果からは、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）はＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）はＣｏ２＋、Ｍｎ２＋で活性が増加することが報告されている。本酵素の場合は、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋によって活性増加が認められる。また、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋によっても活性が増加する。
　４．従来の酵素と比較して幅広い温度帯での反応が可能である。
　５．Ｌ－タガトースからＬ－ソルボースへの反応活性が大きい。
　６．培地に添加するＤ－プシコースが０．１５％と少なくても活性のある菌体が得られる。
　７．水でも酵素活性があり、フルクトースからプシコースへの反応が進行する。
　８．シュードモナス　チコリよりも増殖速度が大きい。
　９．配列表における配列番号３および配列番号４示される塩基配列を含むケトース３－エピメラーゼは３０－３７倍程度の酵素活性を有する。
　本発明により、食品を製造する際に使用が認められる既存添加物名簿収載リストに収載されている菌種であって毒性がほとんどないとされる菌種から、高い収率でＤ－フラクトースからＤ－プシコースへの異性化を触媒する新規なケトース３－エピメラーゼを取得することができる。さらに、その酵素を用いたケトースの製造方法を提供することができる。
　すなわち、本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることのできるケトース３－エピメラーゼの提供、ならびに、その酵素を利用して、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを製造する方法を提供することができる。当該微生物から得ることのできる本発明のケトース３－エピメラーゼは、とりわけＤ－プシコースおよびＤ－フラクトース間の相互変換を良く触媒することから、Ｄ－フラクトースからのＤ－プシコースの製造に有用である。
無機塩培地を用いた各種炭素源の酵素生産量への影響を示す図である。 各種培地での酵素生産量への影響を示す図である。 金属イオンのD-PE活性への影響を示す図である。 至適温度を示す図である。 熱安定性を示す図である。 至適ｐＨを示す図である。 ｐＨ安定性を示す図である。 イオン交換クロマトによる分離溶出を示す図である。 疎水クロマトによる分離溶出を示す図である。 純度を確認するためのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ　写真である。 至適ｐＨの範囲を示す図である。 至適温度の範囲を示す図である。 安定なｐＨ範囲を示す図である。 安定な温度範囲を示す図である。 泳動距離と分子量の関係を示す図である。 標準タンパクの移動距離の関係図と分子量の関係を示す図である。 大腸菌発現系を用いたAgM30菌株DPE遺伝子産物の解析結果を示す図である。 大腸菌発現系（pQEベクター）を用いたAgM30菌株DPE遺伝子産物の解析結果を示す図である。
　本発明は、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物から得ることができ、下記の基質特異性を有するケトース３－エピメラーゼに関すものであり、食品工業で使用できる菌の安全性、低い最適ｐＨ、熱安定性および金属要求性において特徴的なものである。
［安全性］
　本酵素、アルスロバクター グロビフォルミスを食品産業で用いる最も大きな特長としては、菌の安全性にある。この菌種はまずアメリカにおいて、ＦＤＡによるＥＡＦＵＳ（Everything Added to Food in the United States）：A Food Additive Databaseに“Glucose isomerase from immobilized arthrobacter globiformis”として収載されている。この使用法は、菌体をそのまま固定化するもので、菌体自体の安全性が非常に高いことを証明するものである。
　また欧州においては、ＥＦＦＣＡ(The European food & feed cultures association)とIFD（International Federation for the Roofing Trade）による“Inventory of Microorganisms with a documented history of use in food”において“Citrus fermentation to remove limonin and reduce bitterness”として使用されている旨が記載されている。これは、酵母等と同様に、この菌種は発酵に使われていることを示すもので、極めて安全性が高いことを示す。日本においては、アルスロバクター属は“α-アミラーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、グルカナーゼ、α-グルコシルトランスフェラーゼ、フルクトシルトランスフェラーゼ”などの酵素基原微生物として、また、トレハロースやビタミンK（メナキノン）生産菌として食品添加物リストに収載されている。
　このように日米欧において長い使用実績があるにも関わらず、この菌種によるエピメラーゼ酵素が見出されてこなかったことは驚くべきことである。
　一方で、これまで知られているＤ－プシコースの生産酵素としては、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などによるものがある。これらは上記米欧のリストには収載されていない、日和見菌としてや、植物細胞感染などの報告もある。
　また、糖質酵素の代表的なものであるグルコースイソメラーゼによるぶどう糖から果糖の生産には多くの菌株が報告され（６０種以上）ているが、実用化されたものは、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）, バシルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）, アクチノプラーネス属（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ）, アルスロバクター属など少数の属での利用がなされているに過ぎない。このように、アルスロバクター属は食実績のある安全性の高い菌種である。
［至適ｐＨおよび金属要求性］
　さらに、本発明の特長としては以下の事項にある。
　Ｄ－プシコース生産菌の最適なｐＨは、シュードモナス属は７～９、リゾビウム属は９～９．５、アグロバクテリウム属は７～８である。一方で、本菌株による酵素の最適ｐＨは６－８の間にあり、着色の少ない７以下のｐＨにおいてもＤ－プシコース生産は可能である。
　また、３０分間の酵素活性を測定した結果からは、リゾビウム属はＭｎ２＋、Ｍｇ２＋、アグロバクテリウム属はＣｏ２＋、Ｍｎ２＋で活性が増加することが報告されている。本酵素の場合は、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋によって活性増加が認められる。また、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋によっても活性が増加することから、Ｍｇ２＋などを用いた本菌株によるＤ－プシコース生産が可能である。
［菌株の由来および同定］
　本発明者等は数多く単離した菌株の中に新規なケトース３－エピメラーゼを産生する微生物Ｍ３０株を見出し、Ｍ３０株は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性に基づく系統解析により、アルスロバクター　グロビホルミスに属することが判明した。
　菌株の同定
（１）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子塩基配列相同性
　１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域を解析し塩基数７３４を特定した。
（２）相同性検索
　この菌株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列について、ＢＬＡＳＴサーチ（日本ＤＮＡデータバンク）により既知の菌種との相同性検索を行った。上記特定した塩基数７３４の塩基配列に対し相同性９７％以上であった菌株名と相同性（％）の値からＭ３０株の微生物は、アルスロバクター　グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）であることが決定された。
　本発明のケトース３－エピメラーゼ活性を有する菌株であるアルスロバクター　グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０は２０１１年６月２２日付で千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センターに寄託し、まず受領番号ＮＩＴＥ　ＡＰ－１１１１として受領され、受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－１１１１として寄託された。
　本発明でいうケトースとは、ケトース構造を有する六炭糖であり、具体的にはフラクトース、プシコース、タガトースおよびソルボースを意味し、Ｄ－またはＬ－ケトースはこれらのＤ－体およびＬ－体を意味する。
　本発明のケトース３－エピメラーゼは、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成する活性を有し、Ｄ－またはＬ－フラクトースとＤ－またはＬ－プシコース間の相互変換、および、Ｄ－またはＬ－タガトースとＤ－またはＬ－ソルボース間の相互変換を触媒する。本発明のケトース３－エピメラーゼは、Ｄ－またはＬ－ケトースの中ではＤ－フラクトースおよびＤ－プシコースに対する基質特異性が最も高い酵素である。本発明の酵素は後述するアルスロバクター属に属する微生物から得ることができる。
　本発明のケトース３－エピメラーゼは、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属し、ケトース３－エピメラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養液中に生育した菌体中からケトース３－エピメラーゼを採取することにより調製することができる。アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物としては、例えば、アルスロバクター　グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）株およびこれらの変異株などが有利に利用できる。Ｍ３０株はケトース３－エピメラーゼの産生能が比較的高く、本発明の酵素を得る上で好適である。Ｍ３０株は、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市東かずさ鎌足２－５－８）に２０１１年６月２２日原寄託されたＮＩＴＥ　Ｐ－１１１１からブタペスト条約に基づく寄託への移管を２０１２年５月２日に請求し、受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１して国際寄託された。
［精製前の本酵素の理化学的性質］
　精製前の酵素、ケトース３－エピメラーゼの活性は、Ｄ－フラクトースを基質とし、Ｄ－プシコースの生成量を測定することにより測定することができる。具体的には、酵素反応液組成は、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０) ２００　ｍｌ, ０．２Ｍ Ｄ－フラクトース３７５μl、酵素液１００μｌ、１０ｍＭ 塩化マンガン７５μｌを用い、５５℃３０分間反応し、２分間ボイルすることで反応を止めHPLCによって反応後の液組成を測定する。酵素活性１単位は、上記条件下において、Ｄ－フラクトースをエピマー化し１分間に１μｍｏｌのＤ－プシコースを生成する酵素量と定義する。逆反応であるＤ－プシコースからＤ－フラクトースへエピ化する酵素単位についても同様の条件で測定し同様に定義する。
本発明のケトース３－エピメラーゼは、下記の理化学的性質を有している場合がある。
（ａ）至適ｐＨ
　５５℃、３０分間反応、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、６．０ないし１０。
（ｂ）至適温度
　ｐＨ７．０、３０分間反応、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、約５０℃ないし約７０℃。
（ｃ）ｐＨ安定性
　４℃、２４分間保持、少なくともｐＨ５．５ないし１１の範囲で安定。
（ｄ）熱安定性
　ｐＨ７．０、1０分間保持、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）存在下の条件下で、約７０℃以下で安定、１ｍＭの二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）非存在下の条件下で約６０℃以下で安定。
（ｅ）金属イオンによる活性化
　二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）または二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）により活性化される。
　ケトースの変換反応は、通常、次の条件で行なわれる。基質濃度は１ないし６０％（ｗ／ｖ）、望ましくは、約５ないし５０％（ｗ／ｖ）、反応温度は１０ないし７０℃、望ましくは、約３０ないし６０℃、反応ｐＨは５ないし１０、望ましくは、約７ないし１０、酵素活性は基質１グラム当り１単位以上、望ましくは、５０ないし５，０００単位の範囲から選ばれる。反応時間は、適宜選択できるが、経済性との関係で、バッチ反応の場合には、通常、５ないし５０時間の範囲が選ばれる。
　このようにして変換させて得られる反応溶液は、原料のケトースと新たに生成したケトースとを含有しており、これをそのまま甘味料、保湿剤、結晶析出防止剤、照り付与剤などとして利用することも有利に実施できる。通常、反応溶液は、常法に従い、活性炭を用いて脱色し、Ｈ型およびＯＨ型イオン変換樹脂を用いて脱塩、濃縮してシラップ状製品を得る。
　必要ならば、更に、この濃縮液を、例えば、アルカリ金属型またはアルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、新たに生成したケトースと原料ケトースとを分離精製し、新たに生成したケトース高含有画分を濃縮し、シラップ状製品を得ることも、更に、結晶化しうるケトースの場合には、晶出させて、結晶製品を得ることも有利に実施できる。また、この分離された原料のケトースを、再度、変換反応の原料に用いることも有利に実施できる。
　このようにして得られたケトースは、甘味料として好適であり、飲食物、飼料、餌料、歯みがき、口中香錠、舌下錠、内服薬など経口摂取物の甘味付け、嗜好性向上などに有利に利用できる。また、発酵用炭素源、試薬、化学品・医薬品の原料、中間体などとしても有利に利用できる。
　以下、実験により本発明を詳細に説明する。なお、以下の実験においてはＤ－プシコースをＤ－フラクトースに変換するＤ－プシコース３－エピメラーゼ活性を前述した活性測定法により測定し、ケトース３－エピメラーゼ活性と表記した。
　なお、本発明は、配列表における配列番号３または配列番号４に示す塩基配列でコードされる、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化して対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成するケトース３－エピメラーゼのみならず、配列表における配列番号３または配列番号４に示す塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で１個または２個以上の塩基配列が欠失、置換もしくは付加した塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列でコードされる、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化して対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成するケトース３－エピメラーゼをも包含する。
＜実験１：アルスロバクター　グロビホルミス　Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）株の培養＞
　Ｄ－プシコース０．２％を炭素源とし硫安を窒素源とする無機塩培地に、アルスロバクター　グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）株の種培養液１％（ｖ／ｖ）を無菌的に添加し、通気撹拌しながら３０℃で１６時間培養した。得られた培養液中のケトース３－エピメラーゼ活性は約１４単位／１００ｍｌ培養液であった。
＜実験２：アルスロバクター　グロビホルミス　Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）株の培養の培養と粗酵素の抽出＞
遠心分離により培養液から菌体を回収した。回収した菌体は１ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０)を用いて、洗浄した。次いで、菌体を１０ｍｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ７．０)に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー(株式会社SONICS&MATERIALS)で細胞破砕した。破砕物を１２０００ｒｐｍで２０分遠心し、その遠心上清を粗酵素とした。
＜実験３：粗酵素の透析＞
　Cellulose Ester Dialysis Membrane(SPECTRUM Laboratory社)に粗酵素をいれ、メンブレン全体を２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ緩衝液に１２時間浸して透析した。メンブレンを１０ｍＭ トリス-ＨＣｌ(ｐＨ ７．０)緩衝液で２回洗浄した後、メンブレンから粗酵素液を取り出した。
＜実験４：酵素活性の検出＞
　下記の反応条件により、それぞれ反応させた後、煮沸により反応を停止した。反応液をイオン交換樹脂により脱塩し、フィルター処理してＨＰＬＣサンプルを調製した。サンプルは、ＨＰＬＣシステム（東ソー）においてＣＫ０８ＥＣ（三菱化学）を用いてクロマト分析した。クロマトグラムのピーク面積値から、生成した各種糖を算出した。
　＜試験結果＞
＜実験５：ケトース３－エピメラーゼの性質＞
　１．炭素源とその濃度の活性への影響
　０．０５－１％のＤ－プシコース（Ｄ－ｐ）、１％のＤ－フラクトース（Ｄ－ｆ）、１％のＤ－タガトース（Ｄ－ｔ）、０．１％フラクトース（Ｄ－ｆ）および０．１％Ｄ－プシコース（Ｄ－ｐ）、１％Ｄ－プシコース（Ｄ－ｐ）および０．１％Ｄ－タガトース（Ｄ－ｔ）を含むＭＳＭ培地でアルスロバクター　グロビホルミス　Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）株を培養し、上記と同様の操作で得た粗酵素の各活性を調べた。
　　その結果（図１）、本菌の酵素はＤ－プシコースが存在する時に生産されることから、Ｄ－プシコースによる誘導酵素であることがあきらかとなり、Ｄ－プシコース濃度が０．２％のときに最も高い活性を示した。　
２. 培地の酵素活性への影響
　３種の異なる培地（最少無機塩(ＭＳＭ)培地, ＴＳＢ培地, および酵母エキス(ＹＥ)培地) で ３０℃で１６時間培養し、上記と同様の方法で粗酵素を得た。　
　その結果（図２）、酵素は最も安価な最少無機塩培地にＤ－プシコースを添加することで一番酵素活性が高いことが明らかになった。
３． 金属イオンの Ｄ－ＰＥ 活性への影響
　実験３で示したＥＤＴＡを含む緩衝液に対して透析した酵素液を用い、以下の表１に示す反応条件下で酵素活性を測定した。得られた結果は図３に示す。
　ＥＤＴＡに対して透析することで活性が消失するということは、本酵素は金属イオンを要求することを示している。酵素活性に及ぼす金属イオンの影響を測定したところ、ＭｎＣｌ２，ＣｏＣｌ２を添加することで酵素活性が増大した。このことから、本酵素はＭｎ２＋またはＣｏ２＋を要求することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
４． 温度のＤ－ＰＥ活性への影響（至適温度）
１０－８０℃の様々な温度での反応を行い。至適温度を求めた反応条件は表２に示す。測定結果を図４に示す。５０℃から７０℃の温度範囲に至適温度が存在した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
５． 温度のＤ－ＰＥ活性への影響（熱安定性）
　熱安定性について、コバルトイオンの存在する場合と、存在しない場合について検討した。１ｍＭのコバルトイオンの存在下で、ｐＨ７．０において１０－８０℃で１０分熱処理を行い、残存活性を測定した。その結果を図５に示す。このようにコバルトイオンが存在する場合は７０℃まで安定であり、コバルトイオンが存在しない場合は６０℃まで安定であることが明らかとなった。
6.　ｐＨのＤ－ＰＥ活性への影響(最適ｐＨ)
　各種ｐＨでの酵素反応を行い、至適反応 ｐＨ を求めた。それぞれのｐＨで用いた緩衝液は次に示すものである。ｐＨ３－６の５０ｍＭクエン酸緩衝液；ｐＨ６．０－８．０の５０ｍＭリン酸緩衝液；ｐＨ７．０－９．０のトリス-ＨＣｌ緩衝液；およびｐＨ９．０－１１．０のグリシン-水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。反応条件は表３に示す。得られた結果は図６に示す。最適ｐＨは６－１０の範囲であることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
７．ｐＨのＤ－ＰＥ活性への影響（ｐＨ安定性）
酵素をそれぞれのｐＨに４℃で２４時間保持し、残存する酵素活性を５５℃で３０分反応することで求めた。その結果を図７に示した。本酵素は約ｐＨ６からｐＨ１１まで幅広いｐＨ安定性を示した。
８．Ｄ－ＰＥの基質特異性
８種類の六単糖(ケト―ス)を用いて精製前の本酵素の基質特異性について検討した。酵素反応組成は、表４に示したように各基質０．２Ｍ３５０μl、酵素液３５０μl（トリス緩衝液 ｐＨ７．０）で、５５℃３０分反応しＨＰＬＣによる分析によりそれぞれの糖からエピ化され生産されたケトースを測定した。その結果は以下のようになった。Ｄ－プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を、相対活性として示している。
Ｄ－フルクトース(Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ)、Ｄ－プシコース(Ｄ－ｐｓｉｃｏｓｅ）、Ｄ－ソルボース(Ｄ－ｓｏｒｂｏｓｅ)、Ｄ－タガトース(Ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ)、Ｌ－フルクトース(Ｌ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ)、Ｌ－プシコース(Ｌ－ｐｓｉｃｏｓｅ)、Ｌ－ソルボース(Ｌ－ｓｏｒｂｏｓｅ)、Ｄ－タガトース(Ｄ－ｔａｇａｔｏｓｅ)、Ｌ－フルクトース(Ｌ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ)、Ｌ－プシコ)、Ｌ－タガトース(Ｌ－ｔａｇａｔｏｓｅ)を基質として活性を相対活性として表５に示す。最もＤ－プシコースに対する活性が強く、次いでＤ－フラクトースであった。これらの基質特異性は他の遊離のケトース３エピメラーゼと比較すると、Ｄ－プシコース３エピメラーゼ（ＤＰＥ）と言えるものであり、シュードモナス チコリのＤ－タガトース３－エピメラーゼ（ＤＴＥ）とは明らかに異なる特異性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
［酵素の精製と理化学的性質の測定］
　次に、本発明の酵素をさらに純粋な状態に精製して理化学的な性質を測定した。
［酵素の精製時および精製酵素の活性測定および蛋白質の測定］
　酵素活性の測定については、表６に記載の酵素反応液組成を用いて酵素反応を行った。３０℃で３０分酵素反応を行い、この条件下で１分間に１μｍｏｌｅのＤ－フラクトースを生成する酵素量を１単位とした。反応後、反応液を３分間沸騰液中にいれることで反応を停止し、脱イオン処理後、ＨＰＬＣ分析により生成したＤ－フラクトースを測定した。また、蛋白質の測定については、ブラッドフォード法により、ブラッドフォード液２５０μｌに対し酵素液５μＬを加え均一に攪拌した後に測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　精製した本酵素は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法による分子量が１２０ｋＤａであるホモテトラマー構造であるエピメラーゼであることが判明した。
［菌体の培養］
　［菌の前培養］
　本菌を表７に示す培地に接種し前培養を行った。５００ｍｌ三角フラスコに培地１００ｍｌを入れ、３０℃、２００ｒｐｍにて１２時間振とう培養を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［本培養］
　前培養の生育培地１００ｍＬを表８に示す本培養１０ｌに接種し、３０℃にて通気量２ｍｌ／ｍｉｎ、３００ｒｐｍで通気撹拌培養を２４時間行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［酵素の抽出］
　本培養１０Ｌから生菌体２３０ｇを得た。これを１ｌの緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５＋１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に懸濁し、高圧ホモジナイザーを用いて菌体を破砕し、酵素を抽出した。破砕条件は２００００ｐｓｉで行った。遠心分離（１００００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により不溶物を除去し粗酵素液１１５０ｍｌを得た。酵素の精製にはこの粗酵素液の１３０ｍｌを用いた。
［酵素の精製］
［ＰＥＧ（ポリエチレン　グリコール）による分画］
　粗酵素液１３０ｍｌにＰＥＧ６０００を２６ｇ添加し（濃度２０％）、低温にて撹拌溶解した。生成した沈殿と上清とを遠心分離（１００００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ，４℃）により分離した。沈殿は３０ｍＬの緩衝液に溶解した。活性を測定した結果、沈殿中には活性は存在しなかった。ついで上清にＰＥＧ２６ｇ（終濃度４０％）添加し同様に、生成する沈殿と上清に分け、活性を測定した。その結果沈殿中に活性は認められなかった。上清に活性が認められた。
［ＰＥＧ除去の方法］
　ＰＥＧ濃度４０％においても酵素は沈殿することなく、上清に存在した。上清の酵素を次の精製過程へ進めるためには、ＰＥＧ　を除去する必要がある。ＰＥＧはイオン交換樹脂には吸着しない性質を用いて、ＰＥＧを除去した。具体的には、イオン交換樹脂に酵素を吸着させＰＥＧを洗い流し、その後吸着した酵素を高濃度のＮａＣｌで樹脂から溶出することでＰＥＧを除去した。
　ＰＥＧ除去の具体的方法を次に示す。
　緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５＋１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）で平衡化したＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　５８ｍｌにＰＥＧ４０％を含む酵素液を入れ、１０分間ゆっくり撹拌することで酵素を吸着させた。その樹脂をカラム（容積約５０ｍｌ）に詰め、緩衝液（１Ｍ　　ＮａＣｌ＋１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５＋１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）１５０ｍｌで溶出した。１０ｍｌずつ分画し活性のある部分を回収した。それを緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５＋１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２）にたいして一夜透析することでＮａＣｌを除去し、ＰＥＧ分画酵素液を得た。
［イオン交換クロマトグラフィーによる精製］
ＰＥＧ分画酵素液をイオンクロマト分離法によって精製を行った。用いたカラムはＱ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅであり、ＡＫＴＡシステムを用い流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで１Ｍ　ＮａＣｌの濃度勾配で３５％から６０％を５ｍｌずつのフラクションに分けて分画した。図８に示す矢印のフラクションに酵素活性が溶出された。それを回収しイオン交換クロマト分離による精製酵素を得た。図８にはイオン交換クロマト分離溶出図を示す。蛋白質溶出の図８の中央部の矢印で示した部分に酵素活性が存在したので、この部分を回収した。
　イオン交換クロマト分離により精製した酵素を疎水クロマト分離法によりさらに精製を行った。用いたカラムはＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥ　６ｍｌである。酵素液に２Ｍとなるように硫安を加えて溶解した。流速３ｍｌ／ｍｉｎで２Ｍの硫安１００％から０％まで濃度を下げて溶出し５ｍＬずつ分画した。図９の矢印の大きなピークに酵素活性が溶出された。その画分を透析し硫安を除去し疎水クロマト分離精製酵素を得た。蛋白質の溶出の二つ目の大きなピークに活性が存在した。図９の矢印は回収した画分を示している。
［精製表］
　酵素の精製過程について、粗酵素、ＰＥＧ分画酵素、イオン交換クロマト分離精製酵素、疎水クロマトグラフィー精製酵素のそれぞれの蛋白質量、酵素活性などをまとめて精製表として表９に示した。この精製により収率１２％、精製倍率３１．５倍の精製酵素を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［精製酵素の純度］
　常法に従いＳＤＳ　ＰＡＧＥ（ゲル濃度１５％）を用いて精製酵素の純度を確認した。図１０においては、左が標準の蛋白質であり、次の２レーンが疎水クロマトグラフィーを用いて精製した後の酵素である。この結果は２９～４５ｋＤａの間に単一なバンドが確認された。これにより酵素は純粋に精製されたことを確認した。
［精製した酵素の性質］
精製した酵素の性質について検討した。
［反応至適ｐＨ］
　図１１で示すようにｐＨ６～１１において活性を示し、最も活性が高いｐＨは７．５であった。
測定にあたり、反応の至適ｐＨについてＤ－プシコースを基質として用い、各種緩衝液ｐＨ　４～１１を用いて３０℃で３０分反応し、生成したＤ－フラクトースを、ＨＰＬＣを用いて測定することで求めた。　反応液組成を表１０に、使用したバッファーを表１１に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［反応至適温度］
　反応温度と総体活性を測定した結果を示す図１２から、本酵素の至適温度はＭｇ２＋イオン添加時で７０℃であることが明らかとなった。Ｍｇ２＋イオンの非存在下では至適温度が６０°であり、Ｍｇ２＋イオン存在下では至適温度が顕著に高くなり、６０℃ないし８０℃で高い活性を示した。図１２では　Ｍｇ２＋イオン存在下で最も高い活性を示した７０℃を１００とした相対活性で示した。　反応条件は表１２に示すように精製酵素をｐＨ７．５において各温度で３０分反応し、生成するＤ－フラクトースの量を測定した。Ｍｇ２＋イオンを添加する場合と添加しない場合（ＭｇＣｌ２のかわりに水を添加）について検討した。反応は２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００℃で３０分間おこなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［ｐＨ安定性］
　精製酵素のｐＨ安定性を検討した結果を図１３に示すようにｐＨ５～１１まで安定であることが明らかとなった。
　測定条件は、各ｐＨで４℃・２４時間保ち、その酵素をｐＨ７．５によって反応した。残存活性の測定はｐＨ　７．５、３０℃で３０分行った。使用した緩衝液は至適ｐＨに用いたと同じものを用いた。
　図１３では、クエン酸緩衝液ｐＨ６の場合の残存活性を１００とし、それぞれのｐＨにおける残存活性を相対活性として表した。
［熱安定性］
　精製酵素の熱安定性について、Ｍｇ２＋イオンの存在下あるいは非存在下で検討した。Ｍｇ２＋イオンが存在する場合と存在しない場合では、熱安定性が大きく変化し、Ｍｇ２＋イオンが酵素の熱安定性を増大させた。Ｍｇ２＋イオン存在下では５０℃・１時間で安定であった。一方、Ｍｇ２＋イオンが存在しない場合は、全体として約１０℃低い熱安定性であった。なお、至適反応温度が７０℃であることと、この結果から本酵素は基質の存在により安定性が増大することを示している。すなわちＥＳ複合体の安定性が高いことを示していると考えられる。図１４では熱処理をしない酵素の活性を１００とした相対活性で表した。
　熱処理条件としては、精製酵素液４０μｌ、緩衝液（１０ｍＭ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）１６０μｌ、４ｍＭ　ＭｇＣｌ２　（Ｍｇ２＋イオン非添加の場合は水）１００μｌの全量３００μｌとし、これを各温度で１時間保持した後氷水中で１０分間冷却後、残存する酵素活性を常法に従って測定した。
［金属イオンの影響］
　酵素の金属イオン要求性について検討した。精製酵素を１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５に２時間透析した。その後ＥＤＴＡを含まない１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に一昼夜透析し、ＥＤＴＡ処理酵素を得た。この酵素を用いて、各種金属イオン１ｍＭを含む条件でＤ－プシコースを基質としてその活性に対する影響を測定した。その結果を、無添加の酵素活性を１００として、各金属イオン添加時の活性を相対活性で表わし、表１３に示した。
　Ｍｇ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｎ２＋の各イオン存在下では、活性が１．３倍以上となり、Ｍｇ２＋イオン存在下で最も高い活性が認められた。この結果より、本酵素はＭｇ２＋イオンにより活性化される。熱安定性におけるＭｇ２＋イオンの大きな影響を考慮すると本酵素反応にはＭｇ２＋イオンが重要であることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013


［基質特異性］
全ケトヘキソースについて本酵素の反応性について検討した。反応液組成は表１４に示した。その結果、Ｄ－プシコースを１００とした相対活性として表に整理した。本酵素は全ケトヘキソースに活性は示すが、Ｄ－プシコースに最も高い活性を示し、Ｄ－プシコース３－エピメラーゼであることが明確となった。基質特異性については表１５にまとめた。Ｄ－ｓｏｒｂｏｓｅ、Ｌ－ｆｒｕｃｔｏｓｅは７０℃・１２０分、それ以外は７０℃・２０分で反応させて初速度を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
［ＫｍとＶｍａｘ］
　本酵素のＤ－プシコースとＤ－フラクトースのＫｍおよびＶｍａｘを測定した。測定は３０℃でＭｇ２＋イオン存在下の酵素活性測定の条件下で行った。その結果Ｄ－プシコースについては、Ｖｍａｘ＝１６８Ｕ／ｍｇ，Ｋｍ＝３０．１ｍＭであり、Ｄ－フラクトースについては、Ｖｍａｘ＝６８．５Ｕ／ｍｇ，Ｋｍ＝３１．５ｍＭであった。
［酵素の分子量］
［サブユニットの分子量］
　ＳＤＳ-ＰＡＧＥ（ゲル濃度１５％）による精製酵素の移動距離と分子量マーカーの移動距離を測定した。その結果、本酵素のサブユニットの分子量はおよそ３２ｋＤａであることが明らかとなった。
図１５に泳動距離と分子量の関係を示す。図１５はマーカー蛋白質の泳動距離ｃｍと分子量ｋＤａとの関係を示している。精製酵素の移動距離は約４．１ｃｍであることから、本酵素のサブユニットは約３２ｋＤａであると推定された。なお、泳動図は図１０に示した。
［酵素の分子量］
　ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて、本酵素の分子量を測定した。すなわち標準蛋白質と移動距離の関係図１６を求め、本酵素の移動距離から計算した。その結果、酵素の分子量は約１２０ｋＤａであることが明らかになった。
　分子量の測定には、ゲルろ過クロマトグラフィーのカラムは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ　１６／６００を用いた。使用したランニングバッファー組成は１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５，　ＮａＣｌ　２００ｍＭ，ＭｇＣｌ２　　１ｍＭ　である。
使用標準タンパク（マーカー）　は以下の５種類を用いた。
　　（１）Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　　　　　　ＭＷ：４４，０００
　　（２）Ｃｏｎａｌｂｕｍｉｎ　　　　　　　　７５，０００
　　（３）Ａｌｄｏｌａｓｅ　　　　　　　　　　１５８，０００
　　（４）Ｆｅｒｒｉｔｉｎ　　　　　　　　　　　４４０，０００
　　（５）Ｔｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　　　　　　　６６９，０００
　本酵素は７２．５ｍｌに溶出したので、移動距離と分子量との関係より計算し、本酵素の分子量は約１２０ｋＤａであることが明らかとなった。ＳＤＳ-ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量は約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法を用いた本酵素の分子量は約１２０ｋＤａである。このことから、本酵素はサブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造であると考えられる。
［他のＤＰＥ、ＤＴＥとの比較］
　これまで報告されているＤ－タガトース３－エピメラーゼおよびＤ－プシコース３－エピメラーゼの性質を表１６にまとめた。本菌株の生産する酵素は他の微生物起源のケトヘキソース３－エピメラーゼと比較し、至適温度が高いことが大きな特徴である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　本発明のケトース３－エピメラーゼは、他のエピメラーゼやイソメラーゼと同様に、補酵素を必要としない異性化反応である。従って酵素を固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができる。固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能である。工業的に固定化できることで、目的とするケトースの大量生産ができる。
［精製酵素の推定アミノ酸配列］
　上記により得た精製酵素のアミノ酸配列を解析した。精製酵素タンパク（約０．１～０．２μｇ）をトリプシンで処理し、Ｂｒｕｋｅｒ社　Ｕｌｔｒａｆｌｘｔｒｅｍｅ　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで断片のアミノ酸配列を解析した。その結果を次に配列１（配列表配列番号１）として示す。
[配列1]
MKILILGGTR　FLGRAFVEEA　 LQRGHEVTLF　 NRGTNKEIFP　 EVEQLI GDRN　　　　　 ５０
GDVSSLENRK　WDVVIDTCGF　SPHHIRNVGE　 VLKDNIEHYI　 FISSLSVYKD　　　　　 １００
WIPHHIKEDY　ILQPEPTGDQ　IKAVENGEIS　 PYEHYGALKV　 LCEKEAEKYW　　　　　 １５０
PGRVLHVRAG　 LLSGMFDYTD　 RLPYWIGRVA　 KGGKVLVPGR　 KNRPVQIVDI　　　　２００
KDVANWGLNM　 AENNKAGIFN　 VTGPNYELTM　 AGLLNTCKKV　 TNSDAEFVWV　　 ２５０
EESFMNEHKV　 QPWTEMPLWL　 PETISLEGET　 KPWKGGFSIS　 IESAVKEGLT　　　　３００
FRRLEETVTD　 VYAWMKSVDE　 WELKAGISGE　 REKRLLENWY　 Q　　　　　　　　　　３４１
（ただし、G:グリシン、A:アラニン、V:バリン、L:ロイシン、I:イソロイシン、M:メチオニン、F:フェニルアラニン、W:トリプトファン、Y:チロシン、P:プロリン、C:システイン、E:グルタミン酸、D:アスパラガギン酸、Q:グルタミン、N:アスパラギン、K:リシン、R:アルギニン、H:ヒスチジン、S:セリン、T:トレオニン）
　本微生物をＤ－プシコースを炭素源とする最少無機塩培地に生育させ、生育菌体中から得た酵素を用いて、Ｄ－プシコースとＤ－フラクトースの平衡比について検討した。反応液組成は、５０ｍＭトリス緩衝液２００μｌ、０．２Ｍ　Ｄ－プシコースあるいはＤ－フラクトース、酵素液１００μｌ、１０ｍＭ　ＣｏＣｌ２　７５μｌを用いた。反応温度は５０℃、２４時間反応した。反応終了後ＨＰＬＣを用いて反応液中のＤ－フラクトースとＤ－プシコースの量を測定した。
その結果、Ｄ－プシコースを基質とした場合も、Ｄ－フラクトースを基質とした場合も同じ平衡比に達した。
 
　　　　平衡比　Ｄ－プシコース：Ｄ－フラクトース＝２７：７３
 
　この結果はＤ－フラクトースを用いて反応すると、その２７％がＤ－プシコースへ変換できることを示しており、Ｄ－プシコースをＤ－フラクトースから生産できることを明確に示す結果である。
　精製した酵素を使用してＤ－プシコースとＤ－フラクトース間のエピ化の平衡について検討した。その結果、平衡状態でのＤ－プシコース：Ｄ－フラクトースは、４０℃では２５：７５、７０℃では３０：７０であった。
 [AgM30菌株の全ゲノム解析によるＤＰＥ遺伝子塩基配列の特定]
　上記の試験の結果から、AgM30菌株のDPEは既知のDPEとは全く異なり、PCR増幅の手法や既存のタンパク質データベースを用いて単離することが出来ないと考えられた。そこで、AgM30菌株の全ゲノム配列を決定しそのタンパク質データベースの構築を行った。AgM30菌株からQiagen社DNeasy Blood & Tissueキットを用いてゲノムＤＮＡを単離、精製し、このうち19.58μｇをタカラバイオ株式会社ドラゴンジェノミクスセンターの高速シーケンス解析に依頼した。その結果、総解析塩基数513569410 bpで22の4 kb以上のコンティグが得られた。この22コンティグで約5.1 MbあることからArthrobacter globiformis M30の全ゲノム配列をカバーできると考えられた。
[AgM30菌株のタンパク質データーベースの構築]
　得られた約5.1 Mbの遺伝子配列を元にGeneMarkSプログラムを用いて4798のORFを推定し、それぞれのORFについてアミノ酸配列を推定した。この4798アミノ酸配列をAgM30菌株のタンパク質データベースとした。
[AgM30菌株のＤＰＥ活性が見られたタンパク質の再同定]
上記のタンパク質データーベースを用いて、タンパク質同定システムであるMASCOT server（マトリックスサイエンス社）に登録し、DPE活性が見られたタンパク質の再同定を行った。その結果、下記の配列２（配列表配列番号２）からなるアミノ酸配列中で下線を引いて示すアミノ酸配列と52%の相似性が見られたことから、本タンパク質がAgM30菌株のDPEであることが強く示唆された。
［配列２］
　　 1 MKIGCHGLVW TGHFDAEGIR YSVQKTREAG FDLVEFPLMD PFSFDVQTAK 
　　51 SALAEHGLAA SASLGLSDAT DVSSEDPAVV KAGEELLNRA VDVLAELGAT 
　 101 DFCGVIYSAM KKYMEPATAA GLANSKAAVG RVADRASDLG INVSLEVVNR 
　 151 YETNVLNTGR QALAYLEELN RPNLGIHLDT YHMNIEESDM FSPILDTAEA 
　 201 LRYVHIGESH RGYLGTGSVD FDTFFKALGR IGYDGPVVFE SFSSSVVAPD 
　 251 LSRMLGIWRN LWADNEELGA HANAFIRDKL TAIKTIELH
 
　（配列２　 AgM30菌株のタンパク質データーベースを用いて同定したアミノ酸配列　下線部で示すアミノ酸配列がMALDI-TOF MSで得られたピークと一致した配列。）
[AgM30菌株のＤＰＥ遺伝子の単離]
　アミノ酸配列からゲノム遺伝子情報を取得し、増幅用のＰＣＲプライマー（AglDPE_F: 5'-ATGAAAATTGGTTGCCATG-3', AglDPE_R: 5'-TTAGTGCAGTTCGATGGT-3'）を設計し、AgM30菌株のゲノムよりDPE遺伝子を増幅した。そのPCR産物のシーケンス解析を行ったところ、下記の配列１１（配列表配列番号３）に示す870bpの遺伝子配列、および配列１２（配列表配列番号４）の下線を引いて示した15番目のシトシン（C）がチミン（T）に置換された配列からなる遺伝子配列の2つの塩基配列が得られた。
［配列３（配列表配列番号３）］
ATGAAAATTGGTTGCCATGGCCTGGTTTGGACCGGCCACTTCGACGCTGAAGGCATTCGCTACTCCGTCCAGAAAACCAGGGAAGCCGGTTTCGACCTCGTTGAGTTCCCGCTCATGGATCCGTTCTCCTTCGATGTGCAGACGGCCAAGTCCGCACTGGCCGAACATGGGCTGGCGGCCTCGGCATCTCTGGGACTCTCGGACGCCACTGACGTAAGCAGCGAAGATCCCGCCGTCGTGAAGGCAGGGGAGGAGCTGCTCAACCGCGCCGTGGATGTTCTGGCCGAACTGGGTGCGACGGATTTCTGCGGCGTGATTTATAGCGCCATGAAGAAGTACATGGAGCCGGCAACTGCTGCCGGGCTGGCCAACAGCAAGGCAGCCGTCGGGCGGGTCGCGGACCGGGCATCGGATCTGGGGATCAATGTTTCGCTGGAGGTCGTCAACAGGTACGAAACCAACGTACTGAACACCGGACGTCAGGCCCTTGCCTACTTGGAGGAGCTCAACCGGCCGAACCTGGGCATCCACCTGGACACTTACCACATGAACATTGAGGAATCGGACATGTTCTCCCCGATCCTGGACACCGCGGAGGCCCTGCGGTACGTCCATATCGGCGAAAGCCACCGCGGCTACCTCGGCACGGGAAGCGTTGACTTCGACACTTTCTTCAAGGCCCTCGGCCGCATCGGCTATGACGGACCCGTTGTCTTCGAATCGTTCTCCTCCTCCGTCGTGGCACCGGATCTGAGCCGGATGCTCGGCATCTGGCGCAACCTGTGGGCCGACAACGAGGAACTGGGTGCGCACGCGAATGCCTTCATCCGCGACAAGCTCACCGCGATCAAGACCATCGAACTGCACTAA
 
　（配列３（配列表配列番号３）　AgM30菌株のゲノムDNAより増幅したDPE遺伝子配列。）
 
［配列４（配列表配列番号４）］
ATGAAAATTGGTTGTCATGGCCTGGTTTGGACCGGCCACTTCGACGCTGAAGGCATTCGCTACTCCGTCCAGAAAACCAGGGAAGCCGGTTTCGACCTCGTTGAGTTCCCGCTCATGGATCCGTTCTCCTTCGATGTGCAGACGGCCAAGTCCGCACTGGCCGAACATGGGCTGGCGGCCTCGGCATCTCTGGGACTCTCGGACGCCACTGACGTAAGCAGCGAAGATCCCGCCGTCGTGAAGGCAGGGGAGGAGCTGCTCAACCGCGCCGTGGATGTTCTGGCCGAACTGGGTGCGACGGATTTCTGCGGCGTGATTTATAGCGCCATGAAGAAGTACATGGAGCCGGCAACTGCTGCCGGGCTGGCCAACAGCAAGGCAGCCGTCGGGCGGGTCGCGGACCGGGCATCGGATCTGGGGATCAATGTTTCGCTGGAGGTCGTCAACAGGTACGAAACCAACGTACTGAACACCGGACGTCAGGCCCTTGCCTACTTGGAGGAGCTCAACCGGCCGAACCTGGGCATCCACCTGGACACTTACCACATGAACATTGAGGAATCGGACATGTTCTCCCCGATCCTGGACACCGCGGAGGCCCTGCGGTACGTCCATATCGGCGAAAGCCACCGCGGCTACCTCGGCACGGGAAGCGTTGACTTCGACACTTTCTTCAAGGCCCTCGGCCGCATCGGCTATGACGGACCCGTTGTCTTCGAATCGTTCTCCTCCTCCGTCGTGGCACCGGATCTGAGCCGGATGCTCGGCATCTGGCGCAACCTGTGGGCCGACAACGAGGAACTGGGTGCGCACGCGAATGCCTTCATCCGCGACAAGCTCACCGCGATCAAGACCATCGAACTGCACTAA
 
　（配列４（配列表配列番号４）　AgM30菌株のゲノムDNAより増幅したDPE遺伝子配列　下線部で示した１５番目のシトシン（C）がチミン（T）に置換された配列からなる。）
[大腸菌発現系を用いたＤＰＥ遺伝子産物の解析]
　配列１１（配列表配列番号３）の配列を元に大腸菌発現系の構築を行った。pETベクター（clontech社）にAgM30菌株由来のDPE遺伝子を組込み、発現用大腸菌を形質転換した。その結果、図１７に示すように可溶性画分に誘導タンパク質が確認できた。またDPE活性も確認できたが、その活性は培養液1mL当たりでは野生型と同程度であった。
　さらに大腸菌発現系での活性向上を目指しAgM30菌株由来のDPE遺伝子をpRSETベクター（invitrogen社）およびpColdベクター（タカラバイオ社）に組込み、大腸菌形質転換体を作出した。これらの系で生産したDPEの活性を測定したところ、培養液1mL当たりでpRSETベクターの系では野生型と同程度、pColdベクターの系では野生型の10倍程度の活性を示した。
[枯草菌発現系を用いたＤＰＥ遺伝子産物の解析]
　大腸菌の系より遺伝子組換えタンパク質の生産量が多いと報告がある枯草菌の系を構築した。AgM30菌株由来のDPE遺伝子を宿主である枯草菌Bacillus subtilis形質転換用pHT01ベクター（MoBiTec社）に組込み、シーケンス解析後、形質転換を行った。その結果、抗生物質耐性を獲得した形質転換体を数多く得ることが出来たのでDPE遺伝子誘導実験を行ったが、DPE遺伝子産物の生産は見られずその活性も測定不可能であった。
[大腸菌発現系を用いたＤＰＥ遺伝子産物の大量生産]
　枯草菌の系ではDPE遺伝子産物の大量生産が不可能であったことから、再度大腸菌の系を用いてAgM30菌株由来のDPE遺伝子産物の大量生産を試みることとした。これまでに使用していたベクターの系では組換えタンパク質の精製が簡便に行えるようにN末端側にHis-tagが付加されたり、可溶化させるための可溶化tag等が付加されることから、組換えタンパク質の生産量、酵素活性に影響があると考えられた。そこで組換えタンパク質にtag等が付加しないpQEベクター（qiagen社）の系を用いることとした。AgM30菌株由来のDPE遺伝子をpQE60ベクター（qiagen社）に組込み、その宿主である大腸菌M15[pREP4] （qiagen社）を形質転換し、その発現産物に関して解析を行った。SDS-PAGE（ゲル濃度12%）による電気泳動を行うと図１８に示すように野生型のタンパク質とほぼ同じ分子量を示す約３０ｋＤ付近の可溶性画分に発現産物であるタンパク質が確認された。また、1mLの培養液のDPE酵素活性を測定したところ、55.2Ｕ(μmol/min)であった。現在のところArthrobacter globiformis M30菌株から粗精製したDPEの酵素活性は1mL培養液当たり1.5-1.8Ｕ(μmol/min)であることから30-37倍程度の酵素活性の上昇がみられた。
　本発明のケトース３－エピメラーゼは、遊離のＤ－又はＬ－ケトース、Ｄ－又はＬ－ケトペントースに作用させて、これらケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－又はＬ－ケトース、Ｄ－又はＬ－ケトースを容易に生成する。この反応は、各種ケトース、とりわけＤ－フラクトースを原料としたＤ－プシコースの大量生産の道を拓くものである。さらに、本発明のケトース３－エピメラーゼは、種々の固定化方法によって活性の高い固定化酵素を得ることができ、固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能である。工業的に固定化できることで、目的とするケトースの大量生産ができる。
　従って、本発明のケトース３－エピメラーゼとその製造方法の確立は、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における工業的意義が極めて大きい。
　本酵素を生産する、アルスロバクター グロビフォルミスを食品産業で用いる最も大きな特徴としては、菌の安全性にある。この菌種はアメリカにおいて、FDAによるEAFUSに収載されていることは、菌体自体の安全性が非常に高いことを証明するものである。これまで知られているD-プシコースの生産酵素としては、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、リゾビウム属などによるものがあるが、これらは米欧のリストには収載されていないばかりか、日和見菌としてや、植物細胞感染などの報告もあり、安全性を確認するには多くの労力を要する微生物であった。本発明で菌体自体の安全性が非常に高い菌を使用できることは大きな技術の進歩である。

Claims (7)

  1. アルスロバクター　グロビホルミス　Ｍ３０（受託番号 ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１１）である微生物由来である、部分アミノ酸配列として、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、下記（Ａ）、（Ｂ）の基質特異性を有し、且つ、下記（Ａ）～（Ｂ）の理化学的性質を有するケトース３－エピメラーゼ。
    （Ａ）Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化し、対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成する。
    （Ｂ）Ｄ－またはＬ－ケトースの中ではＤ－フラクトースおよびＤ－プシコースに対する基質特異性が最も高い。
  2. 下記（ａ）～（ｆ）の理化学的性質を有する請求項１に記載のケトース３－エピメラーゼ。
    （ａ） 分子量
    ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによるサブユニットの分子量が約３２ｋＤａであり、ゲル濾過法による分子量が１２０ｋＤａである、サブユニットの分子量が３２ｋＤａのホモテトラマー構造である。
    （ｂ）至適ｐＨ
    　３０℃、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６ないし１１。
    （ｃ）至適温度
    　ｐＨ７．５、３０分間反応、２０ｍＭのマグネシウム（Ｍｇ２＋）存在下の条件で、６０ないし８０℃。
    （ｄ）ｐＨ安定性
    　４℃、２４時間保持の条件下で、少なくともｐＨ５ないし１１の範囲で安定。
    （ｅ）熱安定性
    　ｐＨ７．５、１時間保持、４ｍＭのマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下の条件で、約５０℃以下で安定。マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の非存在下の条件で、約４０℃以下で安定。
    （ｆ）金属イオンによる活性化
    　二価マンガンイオン（Ｍｎ２＋）、二価コバルトイオン（Ｃｏ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）により活性化される。
  3. 　下記の基質特異性１．～８．を有する請求項１または２に記載のケトース３－エピメラーゼ。
    　　　　　　　　　　　　　　　　　　　記
     
    　　　１．D-フルクトースを基質としたときの相対活性が４３．８％、
    　　　２．D-プシコースを基質としたときの活性が１００％、
    　　　３．D-ソルボースを基質としたときの相対活性が１．１３％、
    　　　４．D-タガトースを基質としたときの相対活性が１８．３％、
    　　　５．L-フルクトースを基質としたときの相対活性が０．９７％、
    　　　６．L-プシコースを基質としたときの相対活性が２１．２％、
    　　　７．L-ソルボースを基質としたときの相対活性が１６．６％、
    　　　８. L-タガトースを基質としたときの相対活性が４４．０％。
    　ただし、Ｄ－プシコースのエピ化活性を１００としてそれぞれのケトースに対する活性を相対活性として示している。
  4. 　配列表における配列番号３または配列番号４に示す塩基配列か、または配列表における配列番号３または配列番号４に示す塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で１個または２個以上の塩基配列が欠失、置換もしくは付加した塩基配列、またはそれに相補的な塩基配列でコードされる、Ｄ－またはＬ－ケトースの３位をエピマー化して対応するＤ－またはＬ－ケトースを生成するケトース３－エピメラーゼ。
  5. 　ケトース３－エピメラーゼが、Ｄ－プシコースイソメラーゼである請求項7に記載のケトース３－エピメラーゼ。
  6. 　Ｄ－またはＬ－ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、請求項１ないし５のいずれかに記載のケトース３－エピメラーゼを作用させて、該ケトースの３位をエピマー化することを特徴とするケトースの変換方法。
  7. 　Ｄ－またはＬ－ケトースから選ばれる１種以上を含有する溶液に、請求項１ないし５のいずれかに記載のケトース３－エピメラーゼを作用させて該ケトースの３位をエピマー化し、対応するケトースを生成せしめ、これを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
     
     


     
PCT/JP2013/084978 2013-01-08 2013-12-26 アルスロバクター グロビホルミスの生産するケトース３－エピメラーゼ WO2014109254A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201380069857.2A CN104919045A (zh) 2013-01-08 2013-12-26 球形节杆菌生产的酮糖3-差向异构酶
JP2014556386A JP5848834B2 (ja) 2013-01-08 2013-12-26 アルスロバクターグロビホルミスの生産するケトース３−エピメラーゼ
EP13870446.5A EP2944691A4 (en) 2013-01-08 2013-12-26 3-EPIMEASE Ketone produced by ARTHROBACTER GLOBIFORMIS
US14/759,620 US9932617B2 (en) 2013-01-08 2013-12-26 Ketose 3-epimerase produced by arthrobacter globiformis
KR1020157021500A KR102132381B1 (ko) 2013-01-08 2013-12-26 아스로박터 글로비포미스에 의해 생산되는 케토오스 3-에피머라제

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013001035 2013-01-08
JP2013-001035 2013-01-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014109254A1 true WO2014109254A1 (ja) 2014-07-17

Family

ID=51166910

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/084978 WO2014109254A1 (ja) 2013-01-08 2013-12-26 アルスロバクター グロビホルミスの生産するケトース３－エピメラーゼ

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9932617B2 (ja)
EP (1) EP2944691A4 (ja)
JP (1) JP5848834B2 (ja)
KR (1) KR102132381B1 (ja)
CN (2) CN108315316B (ja)
WO (1) WO2014109254A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019500037A (ja) * 2015-12-23 2019-01-10 テサン・コーポレイションＤａｅｓａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 微生物菌体固定化装置およびそれを用いた微生物菌体固定化方法
TWI666323B (zh) * 2016-11-16 2019-07-21 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司 D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備d-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物
WO2019146717A1 (ja) 2018-01-24 2019-08-01 松谷化学工業株式会社 熱安定性が向上したケトース ３－エピメラーゼ
WO2020033472A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Archer Daniels Midland Company Epimerase enzymes and their use
WO2020105709A1 (ja) * 2018-11-21 2020-05-28 国立大学法人香川大学 新規ケトース３－エピメラーゼ
WO2022075435A1 (ja) 2020-10-09 2022-04-14 天野エンザイム株式会社 新規ケトース－３－エピメラーゼを用いたケトースの製造方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101944103B1 (ko) * 2015-12-07 2019-01-30 주식회사 삼양사 마이크로박테리움 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법
CN105567606B (zh) * 2016-03-02 2019-03-19 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司 一种球形节杆菌及其产生的透明质酸酶
CN105821027B (zh) * 2016-04-01 2023-11-21 南京朗奈生物技术有限公司 一种3-差向异构酶的用途
CN113015810A (zh) * 2018-11-08 2021-06-22 国立大学法人香川大学 含有稀少糖的组合物的制造方法和含有稀少糖的组合物
CN110396513B (zh) * 2019-07-19 2022-01-11 天津科技大学 一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用
CN111019928B (zh) * 2019-12-11 2022-08-16 吉林中粮生化有限公司 D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因、载体、重组细胞以及它们的应用
CN111172145A (zh) * 2020-01-10 2020-05-19 量子高科(中国)生物股份有限公司 固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法
CN111733175A (zh) * 2020-05-08 2020-10-02 西安交通大学 一种重组质粒和重组工程菌及其构建方法和提高d-阿洛酮糖的产量的应用
CN112080453B (zh) * 2020-08-28 2022-12-23 天津科技大学 一种合成d-阿洛酮糖的基因工程菌及其构建方法与应用
CN113025603B (zh) * 2021-03-04 2023-07-18 江南大学 一种提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶储存稳定性的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06125776A (ja) * 1992-10-08 1994-05-10 Hayashibara Biochem Lab Inc Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JP2001011090A (ja) 1999-06-24 2001-01-16 Hayashibara Biochem Lab Inc 複合体結晶性糖質とその製造方法並びに用途
JP2005213227A (ja) 2004-01-30 2005-08-11 Teikoku Seiyaku Co Ltd Ｄ−プシコースの血糖上昇抑制効果の利用
EP1586652A1 (en) * 2004-03-25 2005-10-19 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant improvement
WO2007058086A1 (ja) 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JP2008541753A (ja) 2005-06-01 2008-11-27 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション Ｄ−プシコースエピメラーゼによるｄ−プシコースの生成方法
WO2013005800A1 (ja) * 2011-07-06 2013-01-10 松谷化学工業株式会社 アルスロバクター グロビホルミスの生産する酵素

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014140361A (ja) * 2012-12-26 2014-08-07 Matsutani Chem Ind Ltd ケトース３−エピメラーゼ酵素

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06125776A (ja) * 1992-10-08 1994-05-10 Hayashibara Biochem Lab Inc Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
JP2001011090A (ja) 1999-06-24 2001-01-16 Hayashibara Biochem Lab Inc 複合体結晶性糖質とその製造方法並びに用途
JP2005213227A (ja) 2004-01-30 2005-08-11 Teikoku Seiyaku Co Ltd Ｄ−プシコースの血糖上昇抑制効果の利用
EP1586652A1 (en) * 2004-03-25 2005-10-19 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant improvement
JP2008541753A (ja) 2005-06-01 2008-11-27 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション Ｄ−プシコースエピメラーゼによるｄ−プシコースの生成方法
WO2007058086A1 (ja) 2005-11-15 2007-05-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo ケトース３－エピメラーゼとその製造方法並びに用途
WO2013005800A1 (ja) * 2011-07-06 2013-01-10 松谷化学工業株式会社 アルスロバクター グロビホルミスの生産する酵素

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK [online] 30 April 2009 (2009-04-30), "Definition: NAD-dependent epimerase/dehydratase [Bacillus cereus MM3", XP055265544, retrieved from NCBI Database accession no. EEK67073 *
KEN IZUMORI ET AL., BIOSCI. BIOTECH. BIOCHEM., vol. 57, 1993, pages 1037 - 1039
MATSUO, T.; K. IZUMORI, ASIAPAC. J. CLIN. NUTR., vol. 13, 2004, pages S127
MATSUO, T.; Y. BABA; M. HASHIGUCHI; K. TAKESHITA; K. IZUMORI A; H. SUZUKI, ASIA PAC. J. CLIN. NUTR., vol. 10, 2001, pages 233 - 237
See also references of EP2944691A4 *
UECHI K. ET AL.: "Gene cloning and characterization of L-ribulose 3-epimerase from Mesorhizobium loti and its application to rare sugar production", BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 77, no. 3, 1 January 2013 (2013-01-01), pages 511 - 515, XP055264020, DOI: 10.1271/BBB.120745 *
ZWICK ME. ET AL.: "Genomic characterization of the Bacillus cereus sensu lato species: backdrop to the evolution of Bacillus anthracis", GENOME RES., vol. 22, no. 8, 1 August 2012 (2012-08-01), pages 1512 - 1524, XP055179503, DOI: 10.1101/GR.134437.111 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019500037A (ja) * 2015-12-23 2019-01-10 テサン・コーポレイションＤａｅｓａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 微生物菌体固定化装置およびそれを用いた微生物菌体固定化方法
TWI666323B (zh) * 2016-11-16 2019-07-21 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司 D-阿洛酮糖表異構酶、使用其製備d-阿洛酮糖的方法、編碼其的聚核苷酸、重組載體、微生物以及組成物
WO2019146717A1 (ja) 2018-01-24 2019-08-01 松谷化学工業株式会社 熱安定性が向上したケトース ３－エピメラーゼ
JPWO2019146717A1 (ja) * 2018-01-24 2020-02-06 松谷化学工業株式会社 熱安定性が向上したケトース ３−エピメラーゼ
US11104893B2 (en) 2018-01-24 2021-08-31 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. Ketose 3-epimerase with improved thermal stability
WO2020033472A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Archer Daniels Midland Company Epimerase enzymes and their use
WO2020105709A1 (ja) * 2018-11-21 2020-05-28 国立大学法人香川大学 新規ケトース３－エピメラーゼ
CN113166788A (zh) * 2018-11-21 2021-07-23 国立大学法人香川大学 新型酮糖3－差向异构酶
JPWO2020105709A1 (ja) * 2018-11-21 2021-10-07 国立大学法人 香川大学 新規ケトース３−エピメラーゼ
JP6995410B2 (ja) 2018-11-21 2022-02-04 国立大学法人 香川大学 新規ケトース３－エピメラーゼ
WO2022075435A1 (ja) 2020-10-09 2022-04-14 天野エンザイム株式会社 新規ケトース－３－エピメラーゼを用いたケトースの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP5848834B2 (ja) 2016-01-27
US9932617B2 (en) 2018-04-03
EP2944691A4 (en) 2016-08-24
CN108315316A (zh) 2018-07-24
EP2944691A1 (en) 2015-11-18
KR102132381B1 (ko) 2020-07-09
US20150344925A1 (en) 2015-12-03
JPWO2014109254A1 (ja) 2017-01-19
CN104919045A (zh) 2015-09-16
KR20150103289A (ko) 2015-09-09
CN108315316B (zh) 2021-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5848834B2 (ja) アルスロバクターグロビホルミスの生産するケトース３−エピメラーゼ
JP5997693B2 (ja) アルスロバクターグロビホルミスの生産する酵素
JP5098086B2 (ja) ケトース３−エピメラーゼとその製造方法並びに用途
US8802393B2 (en) Arabinose isomerase expressed from Corynebacterium genus and tagatose manufacturing method by using it
JP6995410B2 (ja) 新規ケトース３－エピメラーゼ
KR101919713B1 (ko) 신규한 d-사이코스 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 d-사이코스의 제조 방법
JP4663631B2 (ja) 放線菌由来のａｍｐデアミナーゼ及びその利用
Poonperm et al. Cloning, sequencing, overexpression and characterization of L-rhamnose isomerase from Bacillus pallidus Y25 for rare sugar production
JP2014140361A (ja) ケトース３−エピメラーゼ酵素
JP2003523203A (ja) Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌単離体およびそれから単離されたイソマルツロース・シンターゼ遺伝子
KR102187354B1 (ko) 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스의 제조 방법
WO2022114207A1 (ja) 新規ｌ－ラムノースイソメラーゼ
KR20050051055A (ko) 더머스 칼도필러스 ｇｋ24 균주 유래의 알파-글루칸포스포릴라제, 재조합 균주를 이용한 상기 효소의제조방법 및 상기 효소를 이용한알파--디-포도당-1-인산염의 합성방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13870446

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014556386

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14759620

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013870446

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20157021500

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A