CN113025603B - 一种提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶储存稳定性的方法 - Google Patents

一种提高d-阿洛酮糖3-差向异构酶储存稳定性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶储存稳定性的方法，属于食品工业领域。本发明提供了一种低成本、操作便捷的提高酶液储存稳定性的方法，通过向DPE酶液中加入甘油等小分子醇，Co2+等金属离子，可显著延长酶在低温或常温环境下的半衰期，且不会对后续酶转化反应造成负面影响。本发明通过20％甘油与0.5mM的Co2+的组合可将25℃下粗酶半衰期延长至80d，为DPE的工业化应用提供了技术支撑。

Description

一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶储存稳定性的方法
技术领域
本发明涉及一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶储存稳定性的方法，属于食品工业领域。
背景技术
在全球肥胖症患病率快速增长的大背景下，开发低热量的代糖代替已有的甜味剂成为当下研究热点。其中D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体，具有蔗糖70％的甜度，但其热量仅有蔗糖热量的0.3％，其安全性已经得到了美国食品和药物管理局(FDA)的认可。2019年4月，FDA宣布将D-阿洛酮糖排除在“添加糖”“总糖”标签之外，并将其热量定为0.4kal/g。热量低、甜度高、溶解度高且具有强抗氧化功能的D-阿洛酮糖是当前最有竞争力的代糖之一。
利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimeriase，DPE)的差向异构反应是工业制备D-阿洛酮糖的主要方法。然而易失活、储存稳定性较差的问题限制了DPE的进一步工业化应用。
目前常用的提高蛋白质分子热稳定性、储存稳定性的方法以蛋白质分子改造、化学修饰以及添加稳定剂三种为主。由于基因工程菌株在食品、医药等相关领域的应用限制，添加稳定剂是最受相关工业产品青睐，也是最便捷的改良方法。
发明内容
为解决现有技术存在的DPE酶易失活、储存稳定性较差的问题，本发明提供一种低成本、操作便捷的提高酶液储存稳定性的方法。
本发明提供了一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)储存稳定性的方法，是对酶做(a)、(b)、(c)中至少一种处理：
(a)加入终浓度≥10％的小分子醇；
(b)加入终浓度≥1％的小分子糖；
(c)加入终浓度为0.01～10.0mM的金属离子。
在一种实施方式中，所述金属离子的终浓度为0.1～5.0mmol/L。
在一种实施方式中，所述金属离子的终浓度为0.1～1.0mmol/L。
在一种实施方式中，所述小分子醇的终浓度≥10％。
在一种实施方式中，所述小分子醇包括甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇-6000、尼泊金甲酯中的一种或几种。
在一中实施方式中，所述小分子糖包括甘露糖、乳糖、海藻糖、果糖中的一种或几种。
在一种实施方式中，所述金属离子包括Mg2+，Mn2+，Co2+，Ca2+，Zn2+，Fe2+，Cu2+中的一种或几种。
本发明还提供了所述方法在延长DPE半衰期和/或储存时间方面的应用。
在一种实施方式中，所述方法是对酶做(a)、(b)中至少一种处理：
(a)加入终浓度为0.1～1.0mmol/L的Co2+离子；
(b)加入终浓度≥10％的甘油。
在一种实施方式中，所述应用是将处理后的酶液在0～30℃储存。
在一种实施方式中，所述储存在4℃～25℃下进行。
在一种实施方式中，所述方法是向DPE酶液中加入终浓度为0.2～1.0mmol/L的Co2 +，并将酶在4℃储存。
在一种实施方式中，所述方法是向DPE酶液中加入终浓度为0.5～1.0mmol/L的Co2 +，并将酶在25℃储存。
在一种实施方式中，所述方法是向DPE酶液中加入终浓度≥20％的甘油，并将酶在4℃储存。
在一种实施方式中，所述方法是向DPE酶液中加入终浓度≥30％的甘油，并将酶在25℃储存。
在一种实施方式中，所述方法是向DPE酶液中加入甘油和Co2+，并使酶液中的甘油终浓度≥20％，Co2+浓度≥0.1mmol/L。
有益成果：本发明涉及的稳定剂成分简单，廉价易得，绿色环保，可以用于食品工业。并且经过检验，该稳定剂的添加不影响后续酶转化反应，能极大降低生产成本，推动D-阿洛酮糖工业化应用进程，可使将DPE粗酶液在25℃下以的半衰期由2d延长到80d。
附图说明
图1是不同浓度钴离子在4℃下对DPE的保护作用；
图2是不同浓度钴离子在25℃下对DPE的保护作用；
图3是不同浓度甘油在4℃下对DPE的保护作用；
图4是不同浓度甘油在25℃下对DPE的保护作用；
图5是甘油和钴离子组成的复合稳定剂在4℃下对DPE的保护作用；
图6是甘油和钴离子组成的复合稳定剂在25℃下对DPE的保护作用。
具体实施方式
实施例中涉及的DPE酶来源于Agrobacterium tumefaciens(A9CH28.1)、Clostridium bolteae(A8RG82.1)、Clostridum cellulolyticum(ACL75304)、Desmosporasp.(EGK07060.1)、Ruminococcus sp.(ZP_04858451)、Agrobacterium sp.(AECL01000014.1)。
DPE酶活测定：以20mM HEPES，pH 7.5，0.1mM Co2+为缓冲液配置100g·L-1D-果糖作为底物溶液，取800μL底物溶液置于1.5mL EP管中，于60℃下预热10min。
加入200μL用缓冲液适当稀释的酶液，混合均匀后准确反应10min，沸水浴10min终止反应。将样品离心后用0.22μm水系滤膜过滤，经高效液相色谱(HPLC)检测D-阿洛酮糖的含量。
酶活力单位定义：在pH 7.5，60℃下，每分钟产生1μmol的D-阿洛酮糖即为一个酶活力单位(U)。
实施例1
分别向4℃，1000bar高压匀浆破壁(循环破壁三次)获得的来源于Clostridumcellulolyticum的DPE(CcDPE，具体构建过程公布于Microb Cell Fact 17,188(2018))粗酶液中添加终浓度为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7与1.0mM的CoCl2，将其放置在4℃的环境中，每隔一段时间取样测定残余酶活。
结果显示，添加了终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7与1.0mM的酶液的半衰期分别为62.5d、104d、104d、104d、110.5d与104d(图1)。
实施例2
分别向4℃，1000bar高压匀浆破壁(循环破壁三次)获得的CcDPE粗酶液中添加终浓度为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7与1.0mM的Co2+，将其放置在25℃的环境中，每隔一段时间取样测定残余酶活。
结果显示，添加了终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.5、0.7与1.0mM的酶液的半衰期分别为4.8d、6d、7d、25d、38d与46d(图2)。
实施例3
分别向4℃，1000bar高压匀浆破壁(循环破壁三次)获得的CcDPE粗酶液中添加甘油，使最终酶液中甘油浓度分别为10％、20％与30％，以不添加甘油的酶液为对照，将各组酶液放置在4℃的环境中，每隔一段时间取样测定残余酶活。结果显示，甘油浓度分别为0、10％、20％与30％的酶液的半衰期分别为42d、42d、167d与167d(图3)。
实施例4
分别向4℃，1000bar高压匀浆破壁(循环破壁三次)获得的CcDPE粗酶液中添加甘油，使得最终酶液中甘油浓度分别为10％、20％与30％，以不添加甘油的酶液为对照，将各组酶液其放置在25℃的环境中，每隔一段时间取样测定残余酶活。结果显示，甘油浓度分别为0、10％、20％与30％的酶液的半衰期分别为4.5d、5d、8d与33d(图4)。
实施例5
分别向4℃，1000bar高压匀浆破壁(循环破壁三次)获得的CcDPE粗酶液中添加甘油与Co2+，使酶液中甘油的终浓度为20％，Co2+的终浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM与0.7mM。将以上5组放置在4℃的环境中，每隔一段时间取样测定残余酶活。4000h后所有组别的残余酶活都在70％以上(图5)。
实施例6
分别向4℃，1000bar高压匀浆破壁(循环破壁三次)获得的CcDPE粗酶液中同时添加甘油与Co2+，使酶液中甘油的终浓度为20％，Co2+的终浓度分别为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.5mM与0.7mM。将以上5组放置在25℃的环境中，每隔一段时间取样测定残余酶活。以上组别酶液的半衰期分别为14d、31d、60d、80d与81d(图6)。
实施例7
将20％甘油和0.5mM Co2+于25℃处理80d后的CcDPE酶用于D-阿洛酮糖的酶法制备反应，具体步骤为：将经储存后的酶液加入至300g/L的D-果糖溶液中，于55-65℃温度反应4h，以匀浆破壁获得的CcDPE粗酶液作为对照，结果显示，处理后储藏80d的CcDPE催化效果与对照组均可使D-阿洛酮糖的反应得率达28％。
实施例8
具体实施方式同实施例5，区别在于，将Co2+替换为Mn2+金属离子，将加入金属离子和甘油后的CcDPE粗酶液放置在4℃的环境中，储存4000h后的残余酶活可保持在60％以上。
实施例9
具体实施方式同实施例5，区别在于，将高压匀浆破壁获得的DPE粗酶液替换为Clostridium bolteae(A8RG82.1)、Desmospora sp.(EGK07060.1)、Ruminococcus sp.(ZP_04858451)、Agrobacterium sp.(AECL01000014.1)等不同来源的DPE，将加入金属离子和甘油后的粗酶液放置在25℃的环境中，储存80天后的残余酶活均保持在50％以上。
实施例10
具体实施方式同实施例5，区别在于，将甘油替换为尼泊金甲酯，将加入金属离子和尼泊金甲酯后的粗酶液放置在4℃的环境中，储存3000h后的残余酶活均保持在50％以上。
实施例11
具体实施方式同实施例5，区别在于，将甘油替换为聚乙二醇-6000，将加入金属离子和聚乙二醇-6000后的粗酶液放置在4℃的环境中，储存4400h后的残余酶活均保持在50％以上。
实施例12
具体实施方式同实施例5，区别在于，将甘油替换为果糖，将加入金属离子和果糖后的粗酶液放置在4℃的环境中，储存3000h后的残余酶活均保持在50％以上。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (2)

1.一种延长d-阿洛酮糖3-差向异构酶半衰期和/或储存时间的方法，其特征在于，向d-阿洛酮糖3-差向异构酶液中加入终浓度为20%的甘油与终浓度为0.5~0.7mmol/L的Co2+，并将酶在4~25℃储存，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶来源于Clostridum cellulolyticum。
2.权利要求1所述方法在食品、饲料、添加剂或制药领域中生产d-阿洛酮糖的应用。
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