KR20150076257A

KR20150076257A - D-알로오스의 생산 방법

Info

Publication number: KR20150076257A
Application number: KR1020157014443A
Authority: KR
Inventors: 프시파 키란 굴라팔리; 도모야 신타니; 유키후미 니시모토; 고이치 하라조노
Original assignee: 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤; 나가세케무텍쿠스가부시키가이샤; 나가세 상교오 가부시키가이샤
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2015-07-06
Also published as: EP2918677A1; JP6209526B2; US20150284759A1; JPWO2014069537A1; CN104769109A; EP2918677B1; WO2014069537A1; EP2918677A4

Abstract

[과제] 안정성이 높은 미생물이 생산하는, D-프시코오스로부터 D-알로오스로 이성화하는 활성을 가지는 효소 단백질을 제공하는 것.
[해결 수단] 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 D-프시코오스를 D-알로오스로 이성화하는 활성을 가지는 단백질. (a) 스트렙토마이세스속에 속하는 미생물 710주(수탁 번호: NITE BP-01423) 유래의 서열 번호 1 또는 미생물 720주(수탁 번호: NITE BP-01424) 유래의 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 D-프시코오스로부터 D-알로오스로 이성화하는 활성을 가지는 단백질. (b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가, 치환, 부가, 삽입 또는 결실한 아미노산 서열로 이루어지는 D-프시코오스로부터 D-알로오스로 이성화하는 활성을 가지는 단백질. (c) 서열 번호 1 또는서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성(相同性)을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 D-프시코오스로부터 D-알로오스로 이성화하는 활성을 가지는 단백질.

Description

D-알로오스의 생산 방법{METHOD FOR PRODUCING D-ALLOSE}

본 발명은, 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 미생물 유래의 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 신규 용도, 즉 D-프시코오스를 D-알로오스로 이성화(異性化)하는 효소의 용도에 관한 것이다.

본 발명은, 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 미생물이 생산하는 상기 효소가 가지는 당이성화 반응을 촉매하는 촉매 기능을 밝혀낸 것이며, 상기 신규 촉매 기능을 이용하여 D-알로오스를 생산하는 기술에 관한 것이다

단당류는 환원기(카르보닐기)의 상태에 따라 알도오스(카르보닐기로서 알데히드기를 가지는 당), 케토오스(카르보닐기로서 케톤기를 가지는 당), 당 알코올(별명: 폴리올, 카르보닐기를 가지지 않는 당)로 대별된다. 단당류에는 「희소당(稀少糖)」으로 불리는 것이 있다. 희소당이란, 국제 희소당학회의 정의에 의하면 자연계에 드물게 밖에 존재하지 않는 당으로 정의되어 있고, 그 종류에 따라서는, 유기 화학적 합성 방법에서의 수량도 적은 것도 많다. 그러므로, 알로오스를 포함한 알도헥소오스(알도오스) 희소당의 효율적인 제조 방법의 개발과 그 특이한 성질이 탐구되고 있는 것이 현재의 실정이다.

희소당이 생리 활성을 가지는 것은 알려져 있다. 예를 들면, D-알로오스의 유도체를 유효 성분으로 하는 항종양제에 대하여 개시되었고(특허 문헌 1), 당류의 활성 산소에 대한 성질을 이용한 것에서는, 예를 들면, 활성 산소를 억제하는 성질을 가지는 다당류를 함유시킨 활성 산소 생산 억제제는 알려져 있다(특허 문헌 2).

프시코오스는, 환원기로서 케톤기를 가지는 6탄당이며, 최근, 에피머라제의 출현에 의해 비교적 입수가 용이하게 된 당이다. D-프시코오스는, 감미료, 발효용 탄소원, 시약, 화장품·의약품의 원료·중간체 등으로서 유효하게 이용할 수 있는 것이 시사되어 있다. 프시코오스의 시약·의약품 등의 중간 원료로서의 응용예로서는, 예를 들면, D-프시코오스를 원료로 한 히단토인(hydantoin) 유도체의 합성예가 보고되어 있다(비특허 문헌 1).

D-알로오스는 D-프시코오스로부터 제조할 수 있다. 예를 들면, D-프시코오스로부터 D-알로오스를 생산할 수 있는 효소인 이소머라제를 이용한 D-알로오스의 제조에 관한 특허 문헌에는, 예를 들면, 이성화를 촉매하는 효소의 작용으로 기질 희소당으로부터 목적 희소당으로 변환하고, 얻어지는 원액을 유사 이동층에 의해 연속적으로 목적 희소당화분으로서 크로마토그래피로 분리하는 것을 특징으로 하는 정제 희소당의 대량생산 방법(특허 문헌 3)이나, Pseudomonas stutzeri(IPOD FERM BP-08593) 유래의 L-람노스 이소머라제 활성을 가지는 단백질을 작용시켜 D-알로오스로 이성화하는 D-알로오스의 생산 방법(특허 문헌 4)이 제안되어 있다.

또한, D-프시코오스 및/또는 L-프시코오스를 함유하는 용액에 D-크실로오스·이소머라제를 작용시켜, D-프시코오스로부터는 D-알로오스와 D-알트로오스를, L-프시코오스로부터는 L-알트로오스를 생성시키고 이들 D-알로오스, D-알트로오스 및 L-알트로오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 알도헥소스를 채취하는 알도헥소스의 제조 방법이 제안되어 있다(특허 문헌 5).

일본특허공고 소59-40400호 일본공개특허 평07-285871호 공보 일본공개특허 제2006-153591호 공보 일본공개특허 제2008-109933호 공보 일본공개특허 제2002-17392호 공보 국제 공개 WO2007-058086호 미국 특허 5,620,960(1999) 일본공개특허 제2009-153516호 공보

Tetrahedron, 47, No.12/13, p2113 (1991) J. Bacteriol., 73: 410-414 (1956). J. Biosci Bioeng., 96: 89-91 (2003). Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986 Methods Carbohydr. Chem., 1: 102-104 (1962). Carbohydr. Res., 24: 192-197 (1972). J. Ferment Bioeng., 8: 539-541 (1998). J. Mol. Biol., 300: 917-933 (2000).

지금까지 각종 미생물로부터 D-알로오스를 제조하는 기술은 개발되어 왔지만, 그 미생물의 안전성에 문제가 있으므로, 식용 D-알로오스의 생산으로의 실용화가 곤란했다. 따라서, 종래, 안전성에 문제가 없는 미생물 유래의 효소를 사용하여 희소당을 생산하는 것이 요구되고 있었다.

희소당의 제조에 관하여는, 예를 들면, 슈도모나스·치코리이(Pseudomonas cichorii) 유래의 D-케토헥소오스 3-에피머라제를 이용함으로써 D-프룩토오스로부터 D-프시코오스를 제조할 수 있는 것이 알려져 있다. 그러나, 슈도모나스·치코리이는 식물 병원성 미생물이므로, 식품 용도에 이용하기에는 적합하다고 할 수 없다. 리조비움속에 속하는 미생물에 의한 D-프시코오스의 제조도 제안되어 있지만(특허 문헌 6), 리조비움속에 속하는 미생물은, 식물 병원성 미생물인 경우도 있어, 식품 용도에 사용하는 균으로서는 바람직하지 않다. 또한, 이들 기술은, 모두 D-프시코오스를 생산하는 기술로서, D-알로오스를 생산하는 것은 아니다.

이러한 종래 기술의 안전성에 관한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은, 식품을 제조할 때 사용이 인정되고 있는 기존 첨가물 명부 수재(收載) 품목 리스트에 수재되어 있는 균종으로서 독성이 거의 없는 것으로 추정할 수 있는 균종으로부터, 높은 수율로 D-프시코오스로부터 D-알로오스로의 이성화를 촉매하는 이소머라제를 취득하는 것과, 그 효소를 사용한 D-알로오스의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은, 기존 첨가물로서 식품의 제조에 문제없이 사용할 수 있는 가능성이 높은 방선균(放線菌)으로부터 얻어지는 신규한 효소에 의해 D-알로오스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 이러한 종래 기술의 문제점인 안전성에 대한 우려가 없는 알로오스를 생산하는 미생물, 즉, 미생물이 생산하는 상기 효소를 찾아서 연구를 거듭하여 본 발명에 도달하였다. 즉, 본 발명은, 토양으로부터 방선균을 단리(單離)하여 라이브러리를 작성하고, 그 중에서, D-프시코오스로부터 D-알로오스로 전환하는 작용을 가지는 효소를 발견한 것에 기초한 것이다. 방선균은 기존 첨가물 효소의 기원 미생물로서 식품 제조에 문제없이 사용할 수 있을 가능성이 높으므로, 방선균으로부터 얻어지는 이소머라제는 매우 유용한 D-알로오스의 대량생산 수단이 될 수 있다.

즉, 본 발명은, 이하의 (1) 내지 (3)에 기재된 활성을 가지는 단백질을 요지로 한다.

(1) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된, 알도오스 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 또는 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 활성을 가지는 단백질.

(a) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가, 치환, 부가, 삽입 또는 결실한 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(c) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 나타내는 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성(相同性)을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(2) 케토오스의 D-프시코오스를 알도오스의 D-알로오스로 이성화하는, 상기 (1)에 기재된 단백질.

(3) 이하의 (d)∼(f)의 물리화학적 성질에 의해 특정되는 것인 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 단백질.

(d) 작용 pH 및 최적 pH

작용 pH는 6.0∼11.0이며, 최적 pH는 9.0이다.

(e) 작용 온도 및 최적 온도

작용 온도는 10∼80 ℃이며, 최적 온도는 60℃이다.

(f) L-람노오스, D-크실로오스, D-리보오스, D-알로오스, D-글루코오스, 및 L-아라비노오스에 대하여 반응성을 가진다.

또한, 본 발명은, 이하의 (4)에 기재된 DNA, (5)에 기재된 재조합 벡터, (6)에 기재된 숙주 세포, 및 (7)에 기재된 재조합 단백질의 제조 방법을 요지로 한다.

(4) 서열 번호 3 또는 서열 번호 4로 나타내는 염기 서열 또는 그 상보적 서열 또는 이들 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 서열로 이루어지는 제1항 또는 2항에 기재된 단백질을 코딩하는 Streptomyces sp.710(수탁 번호: NITE BP-01423) 또는 Streptomyces sp.720(수탁 번호: NITE BP-01424) 유래의 DNA.

(5) 상기 (4)에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.

(6) 상기 (1), (2) 또는 (3)에 기재된 단백질을 발현할 수 있는 발현계를 포함하고 있는 숙주 세포.

(7) 상기 (6)에 기재된 발현계를 포함하고 있는 숙주 세포를 배지에 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 상기 (1), (2), 또는 (3)에 기재된 재조합 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 제조 방법.

또한, 본 발명은, 이하의 (8) 내지 (12)의 D-알로오스의 생산 방법을 요지로 한다.

(8) D-프시코오스에, 상기 (1), (2) 또는 (3) 기재된 단백질을 작용시켜 D-알로오스로 이성화하는 것을 특징으로 하는 D-알로오스의 생산 방법.

(9) D-프시코오스가, D-프룩토오스를 에피머화(epimerization)하여 생산한 것인 상기(8)에 기재된 D-알로오스의 생산 방법.

(10) D-프시코오스가, D-글루코오스를 이성화하여 D-프룩토오스로 유도하고, 그 D-프룩토오스를 에피머화하여 생산한 것인 상기(8)에 기재된 D-알로오스의 생산 방법.

(11) D-프시코오스가, 미이용 자원으로부터 D-글루코오스를 얻고, 그 D-글루코오스를 이성화하여 D-프룩토오스로 유도하고, 그 D-프룩토오스를 에피머화하여 생산한 것인 상기(8)에 기재된 D-알로오스의 생산 방법.

(12) 목적으로 하는 D-알로오스가 D-프시코오스와 D-알로오스의 혼합물인 상기 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 D-알로오스의 생산 방법.

본 발명에 의하여, 즉 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 미생물 유래의 효소 단백질을 사용함으로써, 알도오스 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 또는 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 것과, 바람직하게는 D-프시코오스로부터 D-알로오스를 생산하는 것이 가능하게 되었다. 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 미생물 유래의 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는, 알도오스 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 또는 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는, 바람직하게는 D-프시코오스를 D-알로오스로 이성화하는 효소를 제공할 수 있고, 또한, 이것을 사용함으로써 D-알로오스를 생산하는 것이 가능하게 되었다.

본 발명에 의하여, 균체 배양물의 안전성이 매우 높은 균을 사용할 수 있는 것은 큰 기술적 진보이며, D-프시코오스를 이성화하여 D-알로오스를 생산하는 효소와 그 제조 방법의 확립은, 제당 산업뿐만 아니라, 이와 관련된 식품, 화장품, 의약품 산업에서의 공업적 의의가 극히 크다. 또한, 본 발명은, 가장 염가로 대량으로 입수할 수 있는 D-글루코오스나, 프룩토오스를 원료로 하여 D-프시코오스 경유로 D-알로오스의 제조를 가능하게 하였다.

도 1은 실시예 1의 재조합형 이소머라제의 구성(제한 효소 지도)를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 효소 활성에 미치는 금속 이온의 영향을 나타낸 도면이다.
도 3은 최적 효소 활성에 미치는 온도의 영향(a)과 1시간 보온 후의 안정성(b)을 나타낸 도면이다.
도 4는 최적 효소 활성에 미치는 pH의 영향 (a)과 24시간 보온 후의 효소 안정성(b)를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 효소의 기질 특이성를 나타낸 도면이다.
도 6은 반응 전(D-프시코오스)과 반응 후(D-프시코오스, D-알트로오스, D-알로오스 혼합액)의 HPLC 분석을 나타낸 도면이다.

D-알로오스는 매우 유용한 희소당의 하나이며, 암 세포의 증식 억제에 중요한 역할을 한다. Arnold와 Silady는, D-알로오스가, 다른 유해한 임상적 영향을 미치지 않고, 실질적으로 분절 핵 호중구의 생산을 저해하고, 혈소판 수를 저하시키는 것에 대하여 보고하고 있고(특허 문헌 7), 활성 산소의 생산을 저해하는 보고도 있다(비특허 문헌 3). D-알로오스에 대해서는, 최근 몇년간, 특히 항암 작용에 대하여 많은 연구가 이루어지고 있다. 이에, 본 발명자들은, 이 유용한 D-알로오스를 대량으로 또한 안전하게 제조할 수 있는 방법으로서, 식품 제조에 사용할 수 있는 안전한 균종으로부터, D-프시코오스를 D-알로오스로 변환하는 효소를 얻는 것을 목적으로 하여, 예의 연구를 시도했다.

D-프시코오스로부터 D-알로오스로의 이성화 반응을 촉매하는 효소의 하나로서는, L-람노스이소머라제(L-RhI, E.C: 5.3.1.14)가 있으며, 이것은 본래, L-람노오스를 상응하는 케토오스인 L-람뉴로스(L-rhamnulose)로 가역적으로 이성화하는 반응을 촉매하는 효소로, Escherichia coli(비특허 문헌 2)에 있어서 알려져 있지만, 식품 제조에 안전하게 이용할 수 있는 균이라고는 할 수없다.

따라서, 본 발명자들은, 이 산업적으로 유망한 D-알로오스의 생산를 더욱 용이하게 하는 방법을 확립할 목적으로, 토양으로부터 방선균을 단리하여 라이브러리를 작성하고, 그 라이브러리로부터 D-프시코오스로부터 D-알로오스로 변환하는 이소머라제를 생산하는 균을 탐색했다.

본 발명에서의 D-프시코오스로부터 D-알로오스를 생산할 수 있는 효소로서는, 상기한 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 미생물 유래의 서열 번호 1 또는 미생물 유래의 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 가지는 D-프시코오스로부터 D-알로오스로 변환하는 활성을 가지는 단백질을 사용한다.

통상, 얻어진 배양균체로부터 목적으로 하는 효소를 추출하여, 그대로 반응에 사용할 수 있지만, 바람직하게는 고정화한 형태로 사용한다. 고정화의 대상으로 하는 상기한 활성을 가지는 효소 그 자체는, 사용 목적에 따라, 반드시 고순도로 정제된 것이 아니어도 되고, 조효소(粗酵素)라도 사용할 수 있다. 조효소의 구체적 예로서는, 상기한 활성을 가지는 효소 생산능을 가지는 미생물 자체를, 또한, 그 배양물이나 부분 정제한 배양물을 사용할 수 있다.

상기 고정화 효소는, 예를 들면, 본 발명의 목적으로 하는 효소를 담체 결합법, 가교법, 또는 포괄법 등의 정법에 의해 고정화하여 사용할 수 있다. 이는, 효소로 한정하지 않고, 균체 그 자체나 조효소를 수지 등의 담체에 대하여 고정화 등을 행함으로써 얻어진다. 고정화에 의해, 지금까지 1주일 정도의 안정성인 것이 수개월의 안정성을 가지는 고정화 효소를 얻을 수 있다.

예를 들면, 본 발명이 목적으로 하는 효소 및/또는 미생물을, 담체 결합법 중 하나인 공유 결합법에 의해 고정화한 고정화 효소 및/또는 고정화 미생물에, 50% 에탄올을 포함하는 D-프시코오스 용액을 통액(通液)함으로써, 반응 시에는 42℃, 결정화(結晶化)시에는 4℃와 같이, 온도를 콘트롤함으로써 D-알로오스의 결정을 연속적으로 제조할 수 있다. 또한, 그 결정화 후 액을 에탄올 제거하고, 농축하지 않고 상기한 고정화 효소 및/또는 고정화 미생물에 다시 통액함으로써, 다시 연속적으로 D-알로오스를 제조할 수 있다.

이는, D-프시코오스와 D-알로오스의 혼합 용액에, 에탄올을 첨가함으로써 D-알로오스만을 분리할 수 있는 획기적인 방법이며, 또한 효소 반응에 사용하는 완충액을 제거할 필요도 없으며, 분리 과정을 대폭 저감화하고, 효율화할 수 있는 매우 큰 장점이 있다. 50% D-프시코오스를 원료로 하여 효소 반응으로 D-알로오스를 생산한 경우, 생산물은, 35% D-프시코오스와 15% D-알로오스의 혼합 용액으로서 얻어지므로, 효소 반응 산물로부터 D-프시코오스와 D-알로오스를 신속하게 분리하여 고순도의 D-알로오스를 얻는 것이 가능하게 된다.

본 발명에 있어서, 예를 들면, D-프시코오스로부터 D-알로오스를 생산하는 경우의 효소 반응은, 통상, 하기의 조건 하에서 행해진다. 즉, 기질로서 D-프시코오스를 함유하는 용액으로서, 통상, 수용액을 사용하고, 그 기질 농도는, 1∼60 w/v%, 바람직하게는, 10∼50 w/v%, 더욱 바람직하게는 20∼40 w/v%의 범위로부터 적절하게 선택된다. 효소 반응 온도는, 효소가 실활(失活)하지 않는 온도, 예를 들면, 10∼85 ℃, 바람직하게는 40∼80 ℃, 더욱 바람직하게는 최적 온도 60℃로부터 선택된다. 마찬가지로, 효소 반응 pH는 6.0∼11.0, 더욱 바람직하게는 최적 pH 9.0으로부터 선택된다. 효소 활성은 기질 그램당 1단위 이상, 바람직하게는, 50∼5,000 단위의 범위로부터 선택된다. 반응 시간은, 사용하는 기질량, 효소량, 온도, pH 조건 등에 따라 다르지만, 고정화 효소가 아닌 배치식(batch type)을 채용하는 경우를 예로 들면, 경제성을 고려하여, 약 2∼100 시간, 바람직하게는 약 5∼50 시간의 범위에서 행하는 것이 바람직하다.

본 발명은, D-프시코오스에, 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 활성을 가지는 단백질을 작용시켜 D-알로오스로 이성화하는 것을 특징으로 하는 D-알로오스의 생산 방법에 관한 것이며, 안정성이 높은 방선균으로부터 생산되는 D-프시코오스로부터 D-알로오스를 생산하는 효소에 의해 D-프시코오스로부터 D-알로오스를 제조한다.

(a) 서열 번호 1 혹은 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 상기 활성을 가지는 단백질.

(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기가, 치환, 부가, 삽입 또는 결실한 아미노산 서열로 이루어지는 상기 활성을 가지는 단백질.

(c) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 상기 활성을 가지는 단백질.

상기 단백질의 L-람노스이소머라제 활성은, 이하의 (d)∼(f)의 물리화학적 성질에 의해 특정되는 것이다.

본 발명의 효소 활성은, 이하의 (d)∼(f)의 물리화학적 성질에 의해 특정되는 것이다.

(d) 작용 pH 및 최적 pH

작용 pH는 6.0∼11.0이며, 최적 pH는 9.0이다.

(e) 작용 온도 및 최적 온도

작용 온도는 10∼80 ℃이며, 최적 온도는 60℃이다.

[D-프시코오스]

본 발명에서 사용하는 D-프시코오스는 다양한 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면, D-프룩토오스를 에피머화하여 생산하고, D-글루코오스를 이성화하여 D-프룩토오스로 유도하고, 그 D-프룩토오스를 에피머화하여 생산하고, D-프시코오스가, 미이용 자원으로부터 D-글루코오스를 얻고, 그 D-글루코오스를 이성화하여 D-프룩토오스로 유도하고, 그 D-프룩토오스를 에피머화하여 생산하는 등의 방법이 있다.

본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

[D-프시코오스로부터 D-알로오스로의 변환능를 가지는 효소의 생산 균주의 취득]

환경으로부터 채취한 토양 0.1 g을 멸균 증류수 1 mL에 현탁(懸濁)했다. 이 현탁액을 멸균 증류수로 50배 희석하고, 그 0.1 mL를 방선균 분리 배지에 접종하고, 30℃에서 3일간 배양했다. 나타난 콜로니를 픽업(약 200주)했다. 방선균 분리 배지는 표 1의 조성의 방선균 배지를 사용하였다.

[표 1]

다음으로, 얻어진 약 200 균주를, 시험관에 넣은 하기에 나타낸 생산 배지 5 mL에 각각 식균하고, 28℃, 진탕 속도 220 rpm의 조건 하에서 진탕 배양했다. 배양 7일째에 각각의 배양액을 15 mL씩 원심관에 회수하고, HITACHI 미량 고속 원심기(CF15RXII형) 9000 rpm으로, 10분 원심분리한 후, 상청액을 폐기했다. 균체를 증류수로 1회 세정하고, 다시 원심분리를 행하고, 상청액을 폐기했다. 각각의 균체를 40 mM 트리스-말레산 완충액(pH 7.0) 2 mL에 현탁하고, HEAT SYSTEM사의 아스트라선(Astra Son) 초음파 세포 파쇄기(W385), DUTY CYCLE 50%, 출력 콘트롤 눈금 5로 20초간 2회 초음파 처리를 행하였다. 파쇄 용액을 9000 rpm으로, 10분 원심분리하고, 각각의 상청액을 회수하여 조효소액으로 하였다. 이 조효소액의 단백질 농도를 0.10 mg/50μL가 되도록 조정한 것을 「효소 시료」라고 하고, 이하에서, 효소 활성 측정에 사용하였다.

[생산 배지 조성]

당 배지(1.0% D-프시코오스, 0.1% D-타가토오스, 0.1% 글리세롤)와 미네랄 배지(0.26% 황산암모늄, 0.24% 인산 이수소칼륨, 0.56% 인산 수소 이칼륨, 0.01% 황산마그네슘 7수화물, 0.05% 효모 엑기스: pH 7.0) 각각을 121℃, 20분간 멸균 처리하여 동일한 양씩을 무균적으로 혼합 조제하였다.

[효소 활성의 확인 방법]

전술한 방법으로 얻은 효소 시료를 사용하여, 각 효소 시료의 이소머라제 활성은, HPLC법 및/또는 시스테인카르바졸법(Cysteine Carbazole법)에 의해 확인하였다.

HPLC법: 표 2에 나타내는 조성으로 효소 반응시킨 후, 100℃·2분간의 처리에 의해 효소 반응을 정지시키고, 실온까지 냉각하고 나서 이온 교환 수지 및 필터에 의한 정제 처리를 행하여, HPLC에 제공하는 시료로 하였다. 이 HPLC용 시료를, 미쓰비시가가쿠 가부시키가이샤에서 제조한 CK08EC 컬럼(80℃)에 제공하여, 유속(流速) 0.4 mL/min의 순수로 용출하고, 도소 가부시키가이샤에서 제조한 검출기 RI-8020에 의해 생성하는 당 조성을 측정하였다.

시스테인카르바졸법: 표 2에 나타내는 조성으로 반응시킨 후, 반응액을 100℃·2분간의 처리에 의해 효소 반응을 정지시키고, 실온까지 냉각하고 나서, 500μL의 효소 반응 용액에 50μL의 10% 트리클로로아세트산을 가하여 반응을 정지시켰다. 이 시료 550μL에, 100μL 시스테인 용액과 3 mL의 70% 황산을 가하고 20℃에서 1분간 보온한 후, 또한 100μL의 카르바졸 용액을 가하고 35℃에서 20분간 가온하고, 540 ㎚에서의 흡광도를 측정함으로써, 생성하는 당 조성을 측정하였다.

[표 2]

전술한 일련의 수순에 따라, 목적으로 하는 효소 활성이 높은 2주(Streptomyces sp.710주 및 Streptomyces sp.720주. 속은, 16SrRNA 염기 서열로부터 확인했다)를 얻었다. 이들 균주 Streptomyces sp.710주 및 Streptomyces sp.720주는, 독립행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(NITE, 지바켄 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)에, 각각 헤이세이 24년(2012년) 10월 10일자(원기탁일)로 수탁 번호 NITE BP-01423, NITE BP-01424 하에서 부다페스트 조약에 기초하여 국제 기탁되어 있고, 이로부터 입수 가능하다. 그리고, 본 기탁의 710주는 헤이세이 25년(2013년) 10월 7일에, 720주는 헤이세이 25년(2013년) 10월 30일에, 국내 기탁(원기탁)으로부터 부다페스트 조약에 기초한 국제 기탁에 이관 청구하고, 수령되었다. 그리고, 이들 2주에 대하여 25년(2013년) 10월 30일에 국제 기탁의 수탁증이 발행되었다.

실시예 2

Streptomyces sp.710주 및 Streptomyces sp.720주로부터 숏건 클로닝을 행하였다.

[Streptomyces sp.710주(또는 720주)의 염색체의 조제]

Streptomyces sp.710주(또는 720주)를 0.5%의 글리신을 가한 트립틱·소이·브로스 배지(벡톤·디킨슨사 제조)(50 mL)에서 30℃, 160 rpm으로 2일간 배양하고, 원심분리(3,000 rpm, 10분, 4℃)하여 균체를 회수하였다. TS 완충액(10.3% 수크로오스, 50 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 25 mM EDTA·2Na)(30 mL))로 균체를 세정하고, 다시 원심분리(3,000 rpm, 10분, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 그 다음에, 0.5% 리소자임과 0.002% N-아세틸뮤라미다제(acetylmuramidase)가 들어간 TS 완충액(10 mL)을 균체에 가하고, 37℃에서, 60분 정치(靜置)했다. 프로토플라스트(protoplast)로 된 균체 용액에, 10% SDS 수용액(2.4 mL)과 2 mg/mL 프로테이나제 K들이 TS 완충액(0.4 mL)을 가하고, 천천히 교반한 후, 37℃에서, 60분 정치하고, 또한 50℃에서, 30분 정치했다. 여기에, 5 M 염화 나트륨 수용액(2 mL)과 65℃로 가온한 10% 세틸트리메틸암모늄브로마이드의 0.7 M 염화 나트륨 수용액(1.6 mL)을 가하고, 천천히 교반한 후, 65℃에서, 20분 정치했다. 그리고, 클로로포름:이소아밀 알코올 용액(24:1, 20 mL)을 가하고, 피펫(pipet)으로 교반하였다. 원심분리(12,000 rpm, 10분, 4℃)한 후, 상층의 0.6 배량의 이소프로필 알코올을 가하여, 생긴 침전을 회수하였다. 침전을 70% 에탄올로 세정하고, 진공 건조하였다. 진공 건조 후, 침전은, Rnase(0.5 mg)를 가한 TE 완충액(10 mM 트리스 완충액(pH 8.0), 1 mM EDTA·2Na)(10 mL)에 용해시켜, Streptomyces sp.710주(또는 720주)의 염색체 용액을 조제하였다(4℃에서 보존).

실시예 3

[염색체의 부분 분해]

Streptomyces sp.710주(또는 720주)의 염색체 용액(40.4μL)에 10×H 완충액(다카라 바이오사 제조)(4.6μL)와 0.25유닛의 제한 효소 Sau3AI을 가하고, 40분간, 37℃에서 정치했다.0.5 M EDTA 수용액(50μL)을 가하고, 0.5% 저융점 아가로스겔로 전기 영동하여, 23 kb 이상의 DNA 단편을 포함하는 아가로스겔 분획(fraction)을 잘라내었다. 잘라낸 겔 블록은, 증류수(50 mL)에 넣고, 15분간 천천히 진탕하고, 한번 더 동일한 조작을 반복하였다. 겔 블록의 중량에 대하여, 최종 농도가 1×로 되도록 10×β-아가라제의 완충액을 가하고, 68℃에서, 융해할 때까지 정치했다. 융해시킨 후, 10분간, 40℃에서 정치하고, β-아가라제(겔 0.5 g당 3유닛)를 가하고, 60분간, 40℃에서 정치했다. 그리고, 5 M 염화 나트륨 수용액을 최종 농도 0.5 M이 되도록 가하고, 얼음 위에서 15분 정치하고, 원심분리(15,000 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상청액에 상청액의 3 배량의 에탄올을 가하였다. -80℃에서 10분간 정치한 후, 원심분리(15,000 rpm, 15분, 4℃)하고, 생긴 침전에 70% 에탄올을 가하고, 원심분리(15,000 rpm, 15분, 4℃)했다. 침전을 진공 건조한 후, 증류수(8μL)에 용해하였다. 여기에 10×알칼리포스파타아제 완충액(1μL)과 알칼리포스파타아제(1μL)를 가하고, 60분간, 37℃에서 정치했다. 그 다음에, 증류수(90μL)와 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 용액(25:24:1, 100μL)을 가하고, 교반한 후, 원심분리(15,000 rpm, 10분, 25℃)했다. 상층에 상층의 3 배량의 에탄올을 가하였다. -80℃에서 10분 정치한 후, 원심분리(15,000 rpm, 15분, 4℃)하였고, 생긴 침전에 70% 에탄올을 가하고, 원심분리(15,000 rpm, 15분, 4℃)했다. 이 Streptomyces sp.710주(또는 720주)의 염색체의 부분 분해 DNA 단편을 포함하는 침전을 진공 건조한 후, 증류수(5μL)에 용해하였다.

실시예 4

[Streptomyces sp.710주(또는 720주) 염색체의 코스미드 라이브러리의 제작]

방선균-대장균 셔틀코스미드벡터 pTOYAMAcos(오나카 히로야스(Hiroyasu Onaka) 등, 「더·저널·오브·안티 바이오 디크스(J. Antibiotics」, 2003년, 56권, 950-956 페이지에 기재)의 10μg을 제한 효소 BamHI로 분해하고, 아가로스겔로 전기 영동하여, 8.3 kb의 DNA 단편을 포함하는 아가로스겔 분획을 잘라내었다. 잘라낸 겔 블록으로부터, 진 클린 키트(Q바이오진사 제조)로 DNA 단편을 정제하고, 증류수(2.5μL)에 용해하였다. 여기에 실시예에서 얻은 Streptomyces sp. XP-710주 및 XP-720주의 염색체의 부분 소화 DNA 단편 수용액(5μL)을 가하고, 라이게이션 키트(다카라 바이오사 제조)(7.5μL)를 가하고, 17시간, 16℃에서 정치했다. 그 다음에, 이 라이게이션 용액 중의 플라스미드를 기가 팩 III 패키징엑스트랙트 키트(Stratagene사 제조)로, 접합성 대장균에 도입하였다. 카베니실린(50μg/L)이 들어간 LB 한천 배지에서 30℃에서, 2일간, 플라스미드가 들어간 대장균을 배양하고, 생육한 형질 전환체(대장균)로부터 1,000 콜로니를 집균하여 별도의 카베니실린(50μg/L)이 들어간 LB 한천 배지에서 30℃에서, 1일간, 배양했다.

실시예 5

[대장균 코스미드 라이브러리로부터 방선균으로의 플라스미드의 도입]

실시예 4에서 취득한 코스미드 플라스미드가 들어간 대장균 1,000 콜로니를, 각각 1 콜로니씩 카나마이신(50μg/mL)이 들어간 LB 배지(5 mL)에서, 흡광도 660 ㎚가 0.6이 될 때까지, 30℃에서 배양했다. 이 배양액(2 mL)을 멸균된 에펜도프 튜브(eppendorf tube)로 옮겨, 원심분리(3,000 rpm, 5분, 4℃)했다. 상청액을 디캔테이션(decantation)한 후, LB 배지(1 mL)를 가하고 격렬하게 교반하고, 균체를 세정하였다. 원심분리(3,000 rpm, 5분, 4℃)하고, 상청액을 디캔테이션한 후, 2회 더 동일한 조작을 반복하였다. LB 배지(0.5 mL)를 가하여 균체를 현탁했다. 별도로 준비한 멸균된 에펜도프 튜브에 스트렙토마이세스·리비단스(Streptomyces lividans 1326주(NBRC 번호: 15675))의 포자 현탁액(1μL)과 플라스미드가 들어간 접합성 대장균의 현탁액(0.1 mL)을 잘 혼합하고, 방선균 배지 「다이고」No.4(일본제약사 제조)에서 넓혔다. 30℃에서 18시간 배양 후, 티오스트렙톤(167μg/mL)과 날리딕스산 Na(67μg/mL)가 들어간 뉴트리엔트·브로스(벡톤·디킨슨사 제조) 한천 배지(한천 0.5%, 3 mL)를 중층(重層)하고, 3일간 더 배양을 계속했다. 생육된 콜로니를 취득하였다(1개의 대장균에 대하여 1 콜로니 취득함).

실시예 6

[이소머라제 생산능을 가지는 재조합 방선균의 취득]

실시예 5에서 제작한 1,000 콜로니를 500 mL 배플(baffle) 플라스크에 넣은, 상기에서 나타낸 배지 50 mL에 각각 식균하고, 온도 28℃, 회전수 160 rpm의 조건 하에서 회전 배양했다. 배양 3일째에 각각의 배양액을 50 mL의 원심관에 회수하였다. HITACHI 미량 고속 원심기(CF15RXII형)로 9000 rpm으로, 10분간 원심분리한 후, 상청액을 폐기했다. 균체를 증류수로 1회 세정하고, 다시 원심분리를 행하고, 상청액을 폐기했다. 각각의 균체를 40 mM 트리스-말레산 완충액(pH 7.0) 30 ml에 현탁했다. HEAT SYSTEM사의 아스트라선 초음파 세포 파쇄기(W385) DUTY CYCLE 50%, 출력 콘트롤 눈금 5로 20초간 2회 초음파 처리를 행하였다. 파쇄 용액을 9,000 rpm으로, 10분 원심분리하고, 각각의 상청액을 회수하였다. 사토리우스사의 Minisart 1.2㎛로 막 여과하여, 각각의 조효소액(1,000 콜로니분)을 얻었다.

이들 조효소액의 활성의 확인을, 상기 기재된 방법으로 행한 바, 1 콜로니의 조효소액에서 본 활성이 확인되었다.

본 콜로니의 코스미드 라이브러리의 DNA 배열을 해석한 결과, 기능을 추정할 수 없는 구조 유전자 서열이 확인되었으므로, 본 구조 유전자의 발현을 시도하기로 했다.

실시예 7

본 예에서는, 접합형 방선균 플라스미드 pTONA4(특허 문헌 8)를 사용하여, PCR 단편을 플라스미드 pTONA4에 도입하고, 스트렙토마이세스·리비단스(Streptomyces lividans 1326주(NBRC 번호: 15675))에 발현시켜, 도 1에 나타낸 재조합형 이소머라제의 구성(제한 효소 지도)을 얻었다.

상품명 「InstaGene(상표) Matrix」(BIO-RAD사 제조)를 사용하여, Streptomyces sp.710주 및 720주로부터 각각의 게놈 DNA를 단리하였다. 포워드 프라이머(primer)(서열 번호 5) 및 리버스 프라이머(서열 번호 6)를 합성하였다. 상기 2개의 프라이머를 사용하여, Streptomyces sp.710주 게놈 DNA를 주형(鑄型)으로 한 PCR 반응을 행하였다. 그리고, 상기 PCR 반응은, 상품명 「Phusion DNA Polymerase」(FINNZYMES사 제조)를 사용하여, 1 사이클(98℃에서 10초간, 58℃에서 10초간, 72℃에서 2분간을 순차적으로 행함)을 35 사이클 행하였다. 상기 PCR 반응에 의해 얻어진 PCR 단편을, 제한 효소 NdeI 및 HindIII로 처리하였다. 또한, 상기 접합형 방선균 플라스미드 pTONA4도 제한 효소 NdeI 및 HindIII로 처리하였다. 얻어진 2개의 단편을 서로 라이게이션한 후, 스트렙토마이세스·리비단스(Streptomyces lividans 1326주(NBRC 번호: 15675))에 도입하고, XGP-710주를 얻었다. 얻어진 PCR 단편은, DNA 시퀀서로 분석하여, 염기 서열을 결정하였고, 서열 번호 3과 동일한 것을 확인하였다.

또한, 포워드 프라이머(서열 번호 7) 및 리버스 프라이머(서열 번호 8)를 합성하였다. 상기 2개의 프라이머를 사용하여, Streptomyces sp.720주 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR 반응을 행하였고, 이하에서, 상기와 동일한 조작을 행하여, XGP-720주를 얻었다. 얻어진 PCR 단편은, DNA 시퀀서로 분석하여, 염기 서열을 결정하였고, 서열 번호 4과 동일한 것을 확인하였다. 서열 번호 5∼8의 프라이머를 표 3에 나타내었다.

[표 3]

다음으로, 상기 발현계를 포함하여 이루어지는 숙주 세포를 배양하여 조효소액을 얻었다.

500 mL 배플baffle 플라스크에 넣은 TSB 배지 50 mL2 본에 XGP-710주 및 XGP-720주를 각각 식균하고, 28℃, 회전수 160 rpm의 조건 하에서 회전 배양했다. 배양 3일째에 각각의 배양액을 50 mL원심관에 회수하였다. HITACHI 미량 고속 원심기(CF15RXII형) 9000 rpm, 10분 원심 후, 상청을 폐기했다. 균체를 증류수로 1회세정하고, 다시 원심을 행하고, 상청을 폐기했다. 각각의 균체를 40 mM트리스-말레산완충액(pH7.0) 30 ml에 현탁 했다. HEAT SYSTEM사 아스트라선 초음파 세포 파쇄기(W385) DUTY CYCLE 50%, 출력 콘트롤 눈금 5로 20초간 2회 초음파 처리를 행하였다. 파쇄 용액을 9000 rpm, 10분 원심하고, 각각의 상청을 회수하였다. 사토리우스사의 Minisart 1.2㎛로 막 여과하고, 각각의 조효소액(XGP-710 조효소액 및 XGP-720 조효소액)을 얻었다.

실시예 8

D-알로오스는, 화학적 또는 생물학적인 방법에 의해 생산할 수 있고, 화학적으로는, D-리보오스로부터 생산하거나(비특허 문헌 5), 1,2:5,6-디-O-이소프로필리덴-α-D-리보헥소푸라노오스-3-울로오스를 환원함으로써 얻어지고(비특허 문헌 6), 효소적으로는, Pseudomonas stutzerii LL172로부터의 L-리보오스이소머라제(L-RhI)를 이용함으로써, D-프시코오스로부터 생산할 수 있다(비특허 문헌 7).

본 발명에서는, Streptomyces속으로부터 얻어진 이소머라제의 특성을 조사하기로 하였다.

(1) 본 효소의 반응성

먼저, 본 효소의 각 기질에 대한 반응성을 조사하는 것으로 하였다.

기질로서, 알도오스인 L-람노오스, D-리보오스, D-아라비노오스, L-아라비노오스, D-크실로오스, D-글루코오스, D-알로오스를 각각 사용하고, 전술한 효소 활성 반응 조건 하에서 반응시킨 후, 얻어진 각각의 반응액을 Cysteine Carbazole법에 따라 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, L-람노오스에 대한 기질 활성이 높고, 이어서, D-크실로오스, D-리보오스, D-알로오스, D-글루코오스, 및 L-아라비노오스에 대한 기질 반응 활성이 높았다(도 5).

(2) 본 효소 활성에 미치는 금속의 영향

다음으로, 이소머라제 활성에 대한 금속 이온의 영향을 조사할 목적으로, 효소를 일부 투석하여 효소 활성을 측정하였다. 투석은, 조효소액을 셀룰로오스 막에 넣고, 20 mM EDTA를 포함하는 글리신-NaOH 완충액(pH 9.0)에 침지하고, 이 완충액을 16시간 걸쳐처 천천히 교반함으로써 행하여, 다른 금속 이온의 영향을 제거하였다. 이와 같이 하여 얻어진 아포 효소의 효소 활성을, 각종 2가 이온 존재 하(표 4의 반응 조건 하)에서 반응 후, 시스테인카르바졸법에 의해 측정하였다.

그 결과, MnCl₂는 본 효소 활성을 현저하게 상승시켜, 본 효소는 금속 의존성을 나타낸 한편, MgSO₄, MgCl₂, CoCl₂는, 그 활성을 약간 상승시켰다. CaCl₂, BaCl₂, ZnCl₂, CuSO₄는 그 활성을 저해하는 것을 알 수 있었다(도 2).

E. coli에서 발현하는 L-RhI는, 그 효소 활성을 나타내는 데 Mn² ^＋ 또는 Zn² ^＋를 요구하는 것으로 보고되어 있다(비특허 문헌 8).

[표 4]

(3) 본 효소 활성에 미치는 온도의 영향(최적 온도)

다음으로, 본 효소 활성에 미치는 온도의 영향을 조사하였다.

효소 활성은, 표 5의 조건에 있어서 반응 온도를 수시로 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ℃로 변경하여 효소 반응을 시킨 후에, 시스테인카르바졸법에 의해 측정함으로써 확인하였다.

그 결과, 본 효소 활성의 최적 온도는 60℃였다(도 3의 (a)).

[표 5]

(4) 본 효소 활성의 열내성

다음으로, 본 효소 활성의 열내성을 조사하였다.

각 효소액을, 글리신-NaOH 완충액(pH 9.0) 중에서 각각의 온도 조건(10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 ℃) 하에서 1시간 보온하고, 그 잔존하는 효소 활성을, 상기 조건 하에서 효소 반응시킨 후에, 시스테인카르바졸법에 의해 측정하였다.

그 결과, 60℃에서의 1시간의 보온 후에도, 약 80∼90 %의 효소 활성이 잔존하고 있었다(도 3의 (b)).

(5) 본 효소 활성에 미치는 pH의 영향(최적 pH)

다음으로, 본 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하였다.

구체적으로는, 각 pH 완충 용액(50 mM 시트르산 완충액 (pH 3.0-6.0), 50 mM인산 나트륨 완충액(pH 6.0-8.0), 50 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.0-9.0), 50 mM 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.0-11.0) 중에, 효소액을 4℃에서 24시간 방치한 후, 표 6의 반응 조건 하에서 효소 반응시켜, 잔존하는 효소 활성을 시트레인카르바졸(Cysteine Carbazole)법에 의해 측정하였다. 이 때의 D-알로오스로부터 D-프시코오스로의 이성화 반응 조건은 하기 표에 나타내었다.

그 결과, 본 효소의 최적 pH는 pH 9.0인 것을 알 수 있고(도 4의 (a)), pH 9.0의 글리신-수산화나트륨 완충액 중에서의 효소 활성이 보다 안정적이었다(도 4의 (b)).

[표 6]

(6) 본 효소가 촉매하는 반응의 평형점에서의 각각의 희소당의 생성율

다음으로, 본 효소가, 알도오스인 L-람노오스, D-리보오스, D-아라비노오스, L-아라비노오스, D-크실로오스, D-글루코오스, D-알로오스의 각각을 기질로 하고, 표 7의 반응 조건 하에서 반응시키고(단, 반응 시간은 6∼48시간), 평형점에 도달했을 때 얻어지는 반응액의 당 조성을 HPLC법에 의해 조사하였다.

[표 7]

표 8에, 각각의 알도오스에 본 효소(XGP-720 효소액)를 작용시켰을 때의 케토오스와 알도오스의 생성율을 나타내었다.

[표 8]

^a모든 경우에 있어서, 처음으로 케토오스의 생성이 관찰되엇다.

^b생성율은, 평형점에 도달했을 때의 알도오스(잔존한 기질):케토오스(생성물):알도오스(생성물)를 나타낸다.

(7) D-프시코오스와 D-알로오스의 사이의 이소머라제 반응

다음으로, D-프시코오스로부터 D-알로오스로의 이소머라제 반응에 대하여 조사하였다.

표 9의 반응 조건 하에서 효소 반응시키고, HPLC법에 의해 당 조성을 측정하였다. 반응 전(0시간, D-프시코오스)과 반응 후 (24시간 반응 후의 D-프시코오스, D-알트로오스, D-알로오스 혼합액)의 HPLC 분석 결과를 도 6에 나타내었다.

그 결과, D-프시코오스를 기질로 하여 효소 반응을 개시했을 때도, 앞서의 각각의 알도오스를 기질으로 했을 때의 변환율에 나타낸 바와 같이, 본 효소는, D-프시코오스:D-알로오스:D-알트로오스=66:33:1의 비율로, D-프시코오스로부터 D-알로오스를 생성하는 것을 확인할 수 있었다.

[표 9]

[결론]

양 효소 모두 L-람노오스에 대하여 높은 친화성을 나타내고, XGP-710 효소와 비교하여 XGP-720 효소 쪽이 약간 높은 활성을 나타낸다. 이들 효소의 최적 온도 및 안정성은 60℃ 부근에 있으며, 미생물 오염을 방지하는 효과를 전망할 수 있다. 또한, 금속 이온으로서의 MnCl₂ 존재 하에서, pH 9.0의 글리신-수산화나트륨 완충액 중에서 가장 높은 활성을 나타낸다. 이들 결과로부터, 동정(同定)된 본 스트렙토마이세스속(Streptomyces)에 속하는 균주의 효소는 D-프시코오스로부터 D-알로오스를 생산하는 데 효과적인 효소인 것을 분명하게 시사하고 있다.

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 효소는, D-프시코오스를 이성화하여 D-알로오스를 생산하는 능력을 가지는 동시에, 이 효소를 생산하는 미생물은, 스트렙토마이세스속에 속하는 주인 것을 특징으로 한다. 스트렙토마이세스속의 미생물은, 종래 식품의 제조와 관련된 것이며, 안정성이 높은 미생물이다. 본 효소를 생산하는 스트렙토마이세스 주를 식품 산업에서 사용하는 가장 큰 특징으로서는, 균의 안전성에 있다. 지금까지 알려진 D-알로오스 등의 희소당의 생산 효소로서는, 슈도모나스속, 아그로박테륨속, 리조비움속, 슈도모나스속 등에 의한 것이 있지만, 이들은 기회주의적 균(opportunistic fungus)으로서, 식물세포 감염 등의 보고도 있어, 안전성을 확인하기 위해서는 많은 노력을 요하는 미생물이었다. 본 발명에서 균체 또는 균체 배양물의 안전성이 매우 높은 균을 사용할 수 있는 것은 큰 기술적 진보이다. 따라서, 본 발명의, D-프시코오스를 이성화하여 D-알로오스를 생산하는 효소와 그 제조 방법의 확립은, 제당 산업뿐만 아니라, 이와 관련된 식품, 화장품, 의약품 산업에서의 공업적 의의가 극히 큰 것으로 여겨진다.

독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허 미생물 기탁 센터

NITEBP-1423

20121010

NITEBP-1424

20121010

SEQUENCE LISTING <110> MATSUTANI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. NAGASE CO.,LDT. NAGASE CHEMTEX CORPORATION? <120> A PROCESS FOR THE PRODUCTION OF D-ALLOSE? <130> PCT13053MC-KR <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 386 <212> PRT <213> Streptomyces 710 <400> 1 Met Thr Glu Leu Ala Ala Val Lys Ala Ala Leu Lys Thr Gln Ala Val 1 5 10 15 Glu Thr Pro Ser Trp Ala Tyr Gly Asn Ser Gly Thr Arg Phe Lys Val 20 25 30 Phe Ala Gln Pro Gly Val Pro Arg Asp Pro Phe Glu Lys Leu Asp Asp 35 40 45 Ala Ala Lys Val His Glu Phe Thr Gly Ala Ala Pro Thr Val Ala Leu 50 55 60 His Ile Pro Trp Asp Arg Val Glu Asp Tyr Ala Ala Leu Ala Ala His 65 70 75 80 Ala Glu Lys Arg Gly Val Arg Ile Gly Ala Ile Asn Ser Asn Thr Phe 85 90 95 Gln Asp Asp Asp Tyr Arg Leu Gly Ser Ile Cys His Pro Asp Ala Ala 100 105 110 Val Arg Arg Lys Ala Val Asp His Leu Leu Glu Cys Val Asp Ile Met 115 120 125 Asp Ala Thr Gly Ser Arg Asp Leu Lys Leu Trp Phe Ala Asp Gly Thr 130 135 140 Asn Tyr Pro Gly Gln Asp Asp Ile Arg Ser Arg Gln Asp Arg Leu Ala 145 150 155 160 Glu Gly Leu Ala Glu Val Tyr Glu Arg Leu Gly Glu Gly Gln Arg Met 165 170 175 Leu Leu Glu Tyr Lys Leu Phe Glu Pro Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Val 180 185 190 Pro Asp Trp Gly Thr Ala Tyr Ala His Cys Leu Lys Leu Gly Glu Lys 195 200 205 Ala Gln Val Val Val Asp Thr Gly His His Ala Pro Gly Thr Asn Ile 210 215 220 Glu Phe Ile Val Ala Thr Leu Leu Arg Glu Gly Lys Leu Gly Gly Phe 225 230 235 240 Asp Phe Asn Ser Arg Phe Tyr Ala Asp Asp Asp Leu Met Val Gly Ala 245 250 255 Ala Asp Pro Phe Gln Leu Phe Arg Ile Met Tyr Glu Val Val Arg Gly 260 265 270 Gly Gly Phe Thr Ser Asp Val Ala Phe Met Leu Asp Gln Cys His Asn 275 280 285 Ile Glu Ala Lys Ile Pro Ala Ile Ile Arg Ser Val Met Asn Val Gln 290 295 300 Glu Ala Thr Ala Lys Ala Leu Leu Val Asp Gly Thr Ala Leu Ala Glu 305 310 315 320 Ala Gln Ala Ala Gly Asp Val Leu Glu Ala Asn Ala Val Leu Met Asp 325 330 335 Ala Tyr Asn Thr Asp Val Arg Pro Leu Leu Arg Glu Val Arg Glu Glu 340 345 350 Ser Gly Leu Asp Pro Glu Pro Met Lys Ala Tyr Arg Ser Cys Gly Trp 355 360 365 Ala Glu Lys Val Val Ala Glu Arg Ile Gly Gly Gln Gln Ala Gly Trp 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Thr Ala Tyr Ala His Cys Leu Lys Leu Gly Asp Arg 195 200 205 Ala Gln Val Val Val Asp Thr Gly His His Ala Pro Gly Thr Asn Ile 210 215 220 Glu Phe Ile Val Ala Thr Leu Leu Arg Glu Gly Lys Leu Gly Gly Phe 225 230 235 240 Asp Phe Asn Ser Arg Phe Tyr Ala Asp Asp Asp Leu Met Val Gly Ala 245 250 255 Ala Asp Pro Phe Gln Leu Phe Arg Ile Met Tyr Glu Val Ile Arg Gly 260 265 270 Gly Gly Leu Thr Ser Asp Val Ala Phe Met Leu Asp Gln Cys His Asn 275 280 285 Ile Glu Ala Lys Ile Pro Ala Ile Ile Arg Ser Val Met Asn Val Gln 290 295 300 Glu Ala Thr Ala Lys Ala Leu Leu Val Asp Arg Glu Ala Leu Arg Ser 305 310 315 320 Ala Gln Arg Ser Gly Asp Val Leu Glu Ala Asn Ala Val Leu Met Asp 325 330 335 Ala Tyr Asn Thr Asp Val Arg Pro Leu Leu Ala Glu Leu Arg Glu Glu 340 345 350 Thr Gly Leu Asp Pro Asp Pro Val Ala Ala Tyr Arg Arg Ser Gly Trp 355 360 365 Ala Ser Lys Ile Ala Glu Glu Arg Val Gly Gly Gln Gln Ala Gly Trp 370 375 380 Gly Ala 385 <210> 3 <211> 1161 <212> DNA <213> Streptomyces 710 <400> 3 gtgaccgagc tcgccgcggt gaaagccgcg ctcaagaccc aggccgtcga gacgccgtcg 60 tgggcgtacg gcaactcggg cacccgcttc aaggtgttcg cccagcccgg tgtcccgcgc 120 gaccccttcg agaaactgga cgacgcggcg aaggtgcacg agttcaccgg cgcggccccg 180 accgtcgccc tgcacatccc gtgggaccgg gtcgaggact acgccgcgct ggcggcgcac 240 gccgagaagc ggggcgtgcg gatcggcgcg atcaactcca acaccttcca ggacgacgac 300 tacaggctgg gcagcatctg ccaccccgac gcggcggtgc gccggaaggc cgtcgaccac 360 ctgctggagt gcgtcgacat catggacgcc accggctcgc gcgacctgaa gctgtggttc 420 gccgacggca cgaactaccc gggacaggac gacatccggt cccggcagga ccggctggcc 480 gagggcctgg ccgaggtgta cgagcggctc ggcgaggggc agcggatgct cctggagtac 540 aagctcttcg agccggcgtt ctacacgacg gacgtgccgg actggggcac ggcgtacgcg 600 cactgtctca agctgggcga gaaggcccag gtcgtggtcg acacgggaca ccacgcgccg 660 ggcacgaaca tcgagttcat cgtggcgacg ctgctgcggg aggggaagct cggcgggttc 720 gacttcaact cgcggttcta cgccgacgac gacctgatgg tgggtgccgc cgacccgttc 780 cagctgttcc ggatcatgta cgaggtggtg cgcgggggcg ggttcacctc cgacgtggcg 840 ttcatgctcg accagtgcca caacatcgag gcgaagatcc cggcgatcat ccggtcggtg 900 atgaacgtgc aggaggcgac ggcgaaggcg ctgctggtcg acggcaccgc cctggccgag 960 gcgcaggccg cgggggatgt gctggaggcg aacgcggtgc tgatggacgc gtacaacacg 1020 gacgtgcggc cgctgctccg ggaagtgcgg gaggagtcgg ggctggaccc cgaacccatg 1080 aaggcgtacc gctcctgcgg gtgggcggag aaggtcgttg ccgagcggat cggtgggcag 1140 caggccgggt ggggggcgta g 1161 <210> 4 <211> 1161 <212> DNA <213> Streptomyces 720 <400> 4 gtgaccgagc tcgccgcggt gaaggccgcc ctcaagaccc aggccgtaga gacgccgtca 60 tgggcgtacg ggaactcggg gacccgcttc aaggtgttcg cgcagccggg agtcccccgc 120 acgccccagg agaagctcga cgacgccgcg caggtgcacg cgtacacggg tgccgcgccg 180 accgtggcac tgcacatccc ctgggaccgg gtcgaggact acgcgaagct cgccgagtac 240 gccgaggagc gcgggctgaa gctggggacg atcaactcca acaccttcca ggacgacgcg 300 tacaagctcg gcagcatctg ccaccccgag gcggccgtgc gccgcaaagc ccttgatcac 360 ttgctcgagt gcgtcgacat catggacgcg accggttcga aggacctgaa gctgtggttc 420 gcggacggca ccaactatcc cggccaggac gatgtccgtg agcgccagga ccgcctcacc 480 gaagggctgg ccacggtgta cgagcggctc ggtgacgacc agcggatgct gctcgagtac 540 aagttcttcg agcccgcctt ctacacgacg gacgtgccgg actggggcac ggcgtacgcg 600 cactgcctca agctcggtga cagggcgcag gtcgtggtcg acaccgggca tcacgcaccc 660 ggcaccaaca tcgagttcat cgtggccaca ctgctgcgcg aggggaagct cggcggcttc 720 gacttcaact cccgcttcta cgccgacgac gacctgatgg tgggcgccgc cgaccccttc 780 cagctgttcc ggatcatgta cgaggtgatc cgcggcggcg gcctcacgtc cgacgtggcc 840 ttcatgctcg accagtgcca caacatcgag gcgaagatcc cggcgatcat ccgctcggtg 900 atgaacgtcc aggaggcgac ggcgaaggcg ctgctcgtgg atcgtgaggc gctgcggtcg 960 gcgcagcggt ccggggacgt gctggaggcg aacgcggtcc tcatggacgc gtacaacacc 1020 gatgtacggc cgctgctcgc cgagctgcgc gaggagacgg ggctcgaccc ggacccggtc 1080 gccgcgtacc ggcggtccgg gtgggcgtcg aagatcgccg aggagcgggt gggtggtcag 1140 caggcgggct ggggagcgtg a 1161 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> primer <400> 5 ggaattccat atgaccgagc tcgccgcggt 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> primer <400> 6 cccaagcttc tacgcccccc acccggcctg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> primer <400> 7 ggaattccat atgaccgagc tcgccgcggt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> primer <400> 8 cccaagcttt cacgctcccc agcccgcctg 30

Claims

하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된, 알도오스 C1의 CHO기와 C2의 OH기를 인식하여 반응하고, C1의 CHO기를 OH기로, C2의 OH기를 CO기로 변환하거나, 또는 케토오스의 C1의 OH기와 C2의 CO기를 인식하여 반응하고, C1의 OH기를 CHO기로, C2의 CO기를 OH기로 변환하는 활성을 가지는 단백질:
(a) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질,
(b) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산 잔기가, 치환, 부가, 삽입 또는 결실한 아미노산 서열로 이루어지는 단백질,
(c) 서열 번호 1 또는 서열 번호 2로 나타내는 아미노산 서열과 60% 이상의 상동성(相同性)을 가지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
제1항에 있어서,
케토오스의 D-프시코오스를 알도오스의 D-알로오스로 이성화하는, 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
하기 (d)∼(f)의 물리화학적 성질에 의해 특정되는, 단백질:
(d) 작용 pH 및 최적 pH,
작용 pH는 6.0∼11.0이며, 최적 pH는 9.0이고,
(e) 작용 온도 및 최적 온도,
작용 온도는 10∼80 ℃이며, 최적 온도는 60℃이고,
(f) L-람노오스, D-크실로오스, D-리보오스, D-알로오스, D-글루코오스, 및 L-아라비노오스에 대하여 반응성을 가짐.
서열 번호 3 또는 서열 번호 4로 나타내는 염기 서열 또는 그 상보적(相補的) 서열 또는 이들 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 서열로 이루어지는 제1항 또는 제2항에 기재된 단백질을 코딩하는 Streptomyces sp.710(수탁 번호: NITE BP-01423) 또는 Streptomyces sp.720(수탁 번호: NITE BP-01424) 유래의 DNA.
제4항에 기재된 DNA를 포함하는 재조합 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 발현할 수 있는 발현계를 포함하고 있는 숙주 세포.
제6항에 기재된 발현계를 포함하고 있는 숙주 세포를 배지에 배양하여, 얻어지는 배양물로부터 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 단백질을 채취하는, 재조합 단백질의 제조 방법.
D-프시코오스에, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 작용시켜 D-알로오스로 이성화하는, D-알로오스의 생산 방법.
제8항에 있어서,
D-프시코오스가, D-프룩토오스를 에피머화(epimerization)하여 생산한 것인, D-알로오스의 생산 방법.
제8항에 있어서,
D-프시코오스가, D-글루코오스를 이성화하여 D-프룩토오스로 유도하고, 상기 D-프룩토오스를 에피머화하여 생산한 것인, D-알로오스의 생산 방법.
제8항에 있어서,
D-프시코오스가, 미이용 자원으로부터 D-글루코오스를 얻고, 상기 D-글루코오스를 이성화하여 D-프룩토오스로 유도하고, 상기 D-프룩토오스를 에피머화하여 생산한 것인, D-알로오스의 생산 방법.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
목적으로 하는 D-알로오스가 D-프시코오스와 D-알로오스의 혼합물인, D-알로오스의 생산 방법.