WO2017111339A1 - 과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법 - Google Patents

과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법 Download PDF

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WO2017111339A1
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enzyme
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한은진
김정민
김혜정
박종진
이강표
최은수
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    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant strain for producing allose from fructose, a composition for producing allose to produce allose from a fructose-containing raw material comprising the strain, and a method for producing allose using the same.
  • D-allose is an epimer that differs only in the -OH group direction of glucose (D-glucose) and carbon 3, and is a rare sugar monosaccharide known as an isomer of psicose.
  • Allose has the function of inhibiting thrombus formation, autoimmune reactions in patients with organ transplant surgery and proliferation of cancer cells. In addition, the effect of prolonging the death of nerve cells after ischemia of the liver and brain is also being studied as a therapeutic drug for leukemia patients.
  • allose Due to the features mentioned above, allose, it is necessary to develop efficient production processes to industrial applications, but because high utility value, to extremely rare in nature, as the next generation of key material in the medical field.
  • alloose was mainly produced only by chemical synthesis, but there is a problem that chemical wastes are generated in the production of additional sugars and the complicated purification and processing thereof.
  • Still another object of the present invention is to provide a recombinant strain comprising the recombinant vector.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for producing alloose comprising at least one selected from the group consisting of the recombinant strain, the culture of the recombinant strain, and the lysate of the recombinant strain.
  • Still another object of the present invention is to provide a fusion protein for producing allose from fructose comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or 25.
  • Still another object of the present invention is to provide a mixed sugar composition comprising the fructose, psychocos and allose.
  • the present invention relates to a recombinant strain for producing allose from fructose, a composition for producing allose to produce allose from a fructose-containing raw material comprising the strain, and a method for producing allose using the same.
  • one aspect of the present invention provides a recombinant vector comprising a nucleotide sequence encoding a piscose epimerase and a nucleotide sequence encoding an allose isomerase.
  • Said cosmos epimerase is Clostridial synthase (C / (t i3 ⁇ 4w «scidens), Nassifer Adharens (Era ⁇ ra ⁇ flere) or Troponema primisha (7 epo" ewa /) n ' m / t / a).
  • the Clostridium new dance (C7cwt 'i3 ⁇ 4w « « / ife ra) a psicose epimerase (hereinafter, CDPE) is derived from a protein which is active to produce the psicose from fructose.
  • the CDPE may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and have the activity of producing cyclose from fructose.
  • the nucleotide sequence encoding the CDPE may include a nucleotide sequence encoding a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 and / or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the CDPE may have a molecular weight of 30 to 37 kDa, such as 30 to 35 kDa, measured by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • the optimum temperature of the CDPE may be 40 to 65, specifically 50 to 65.
  • the optimal temperature may be, for example, a result of reaction for 5 minutes in the presence of lmM Co 2+ at pH 7.0, but is not limited thereto.
  • the optimal pH of the protein may be pH 6-9, pH 7-9, pH 7-8.5, or pH 7-8.
  • the optimal pH may be, for example, a result of reaction for 5 minutes in the presence of 60, lmM Co 2+ , but is not limited thereto.
  • EDPE a protein having the activity of producing a cycle from fructose.
  • the EDPE may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and have an activity of producing cycos from fructose.
  • the nucleotide sequence encoding the EDPE may comprise a nucleic acid sequence encoding a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • Pseudomonas epimerase derived from the Troponema Primisha is a protein having the activity of producing a cycle from fructose (hereinafter, TDPE) fructose to be.
  • TDPE fructose
  • the TDPE may have an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and have the activity of producing a psychosis from fructose.
  • the nucleotide sequence encoding the TDPE may include a nucleotide sequence encoding a peptide comprising an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 and / or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the psychocos epimerizing enzyme may be substituted, inserted and / or deleted in some of the amino acids of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the cosmos epimerase is an amino acid having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. It may be to include a sequence.
  • Nucleotide sequences encoding the cyclic epimerizing enzyme are Clostridium ⁇ ⁇ Chstridiun scidem, Eciper Adherence (E3 ⁇ 4 «/ er ⁇ / zaerera) or Troponema primisha (7> eo « ema /? N > Nucleotide sequence of the cosmos epimerase obtained from Y / a), or a nucleotide sequence modified to optimize expression in E. coli or Corynebacterium strains.
  • the nucleotide sequence encoding the cyclic epimerase the nucleotide sequence encoding the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the peptide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 It may be a nucleotide sequence encoding a peptide comprising a nucleotide sequence or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence encoding the cyclic epimerase can be a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 9.
  • the nucleotide sequence may have a nucleotide sequence having substantial identity to the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 9.
  • the allose isomerase may be derived from ⁇ ee / 7 / «e // fl Wfl ra EX-Hl, and preferably, allose isomerization comprising a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. It may be an enzyme.
  • the allose isomerization enzyme isomerization activity of the psychos to allose As long as it is maintained, some of the amino acids of SEQ ID NO: 4 may be substituted, inserted and / or deleted.
  • the allose isomerization enzyme may include an amino acid sequence having at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. have.
  • the nucleotide sequence encoding the allose isomerase is a coding nucleotide sequence of the allose isomerase obtained from P ⁇ 1 ⁇ 2 e // a man 3 ⁇ 4z EX-Hl or in E. coli or Corynebacterium strains It may be a nucleotide sequence modified to optimize for expression.
  • the nucleotide sequence encoding the allose isomerase may be a nucleotide sequence encoding a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • it may be a nucleotide comprising a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • nucleotide sequence and any other nucleotide sequence are maximally aligned and analyzed, such that any other nucleotide sequence is at least 70%, at least 90%, with each nucleotide sequence, Or 98% or more sequence homology.
  • nucleotide sequence encoding an enzyme protein having a can be prepared. Such homology comparisons can be performed by calculating homology between two or more sequences as a percentage using a commercially available computer program.
  • amino acid sequences of specific enzymes according to the invention are shown in Table 1 and nucleotide sequences encoding them exemplarily in Tables 2 to 3 below.
  • VV ⁇ f VV9E> ⁇ VVO ⁇ ⁇ 3 ⁇ LV:) V ⁇ V £>
  • the cosmos epimerase and allose isomerase may be one fusion protein linked by a linker template.
  • the cyclic epimerase may be one comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 3.
  • the allose isomerase may be one comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the linker peptide may be composed of 1 to 6 amino acid sequences. When the linker peptide is less than or equal to the amino acid number, the linker peptide may adversely affect the structure of each other when linking the two proteins.
  • the recombinant vector can be constructed as a vector for cloning or as a vector for expression by methods well known in the art (Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:41 1 -421).
  • the recombinant vector may be used as long as it is a vector that has been used for genetic recombination.
  • a plasmid expression vector, a virus expression vector (eg, a replication-defective retrovirus, adenovirus, and adeno-associated virus) and their equivalent functions may be used.
  • Virus vector may be selected from the group consisting of, but is not limited to these.
  • the recombinant vector may be one selected from the group consisting of pACYC, RSF, pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 vector, etc., preferably pACYC or RSF.
  • the recombinant vector refers to a recombinant nucleic acid molecule capable of delivering a target polynucleotide operably linked, wherein the target polynucleotide may be operably linked with one or more transcriptional regulatory elements consisting of a promoter and a transcription terminator. have.
  • the transcription terminator may be rrnB, rrnB ⁇ Tl, rrnB—T2, T7 terminator, and the like, and preferably T7 transcription terminator PCR from the pET2 la vector.
  • Another aspect of the invention relates to a recombinant strain transformed with said recombinant vector.
  • the method of transforming the host cell with the recombinant vector can be selected and used without particular limitation any transformation method known in the art, for example, fusion of bacterial protoplasts, electroporation, projectile bombardment, and It may be selected, for example, infection with a viral vector.
  • the transformed recombinant strain according to the present invention has a high stability, It can overexpress Psychos epimerase and allose isomerization enzyme, and thus can provide a stable long term high allose conversion ability. Therefore, the transformed recombinant strain can be usefully applied to the production of allose, it is possible to further improve the yield of allose production.
  • Cultivation of the recombinant strain may be carried out by various culture methods known in the art in a suitable medium.
  • Examples of the culturing method include batch, continuous and fed-batch cultivation.
  • the fed-batch culture includes, but is not limited to, injection batches and repeated injection batch cultures.
  • Medium that can be used according to the invention generally comprises one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and / or trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars such as monosaccharides, disaccharides or polysaccharides.
  • Nitrogen sources are generally organic or inorganic nitrogen compounds, or materials containing these compounds. Examples of nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate or ammonium nitrate, nitrate, urea, amino acids, or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soybean powder, soy protein , Yeast extract, meat extract and the like.
  • the nitrogen supply 3 ⁇ 4 can be used alone or as a mixture.
  • Inorganic salt compounds that may be present in the medium include chlorides, phosphates or sulfates of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • As the source of phosphorus it is possible to use phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate, or a sodium-containing salt.
  • Chelating agents can be added to the medium to retain metal ions in solution. All components of the medium are sterilized by heating (20 minutes at 1.5 bar and 121) or by sterile filtration. These components can be sterilized together or separately as needed. All components of the medium may be present at the start of the culture, or may be added continuously or batchwise.
  • compositions for producing allose comprising the culture of the ⁇ and / or recombinant strain of the recombinant strain.
  • the composition may be to prepare allose from fructose-containing raw materials.
  • the culture may include an enzyme produced from the recombinant strain, and may be in a cell-free form including the strain or without the strain.
  • used to prepare alloose Recombinant strains are used to mean the cells of said strain and / or the culture of said strain.
  • the allose may be in the form of a saccharide composition composed of fructose, psychocos and allose, for example, a sugar composition composed of fructose, cycos and allose 100 wt .
  • fructose may be in the form of a mixed sugar composition comprising 60 to 63 weight 0 /., Psychos 24 to 26 weight% and alloose 12 to 15 weight 0 /.
  • the composition may be to produce allose from fructose at a conversion rate of at least 12%, for example 12 to 15%, 12 to 14% or 12 to 13%.
  • alloose is produced at a conversion rate of about 9%, and cannot be produced in one process. The problem is that it takes a long time and increases the production cost.
  • it is possible to produce alloose through a one-step process, thereby reducing the production time and reducing the production cost. It is possible to produce allose with an improved yield of more than%.
  • the composition may not include one or more metal ions selected from the group consisting of copper ions, manganese ions, calcium ions, magnesium ions, zinc ions, nickel ions, cobalt ions, iron ions, aluminum ions, and calcium ions. have.
  • Another aspect of the present invention provides a method for producing alloose by contacting a composition for producing alloose comprising the cells of the recombinant strain and / or a culture of the recombinant strain with a fructose-containing raw material.
  • the allose production method includes the step of reacting the recombinant strain with fructose-containing raw material.
  • the step of reacting the recombinant strain with fructose may be performed by culturing the cells of the recombinant strain in a culture medium containing fructose.
  • the step of reacting the recombinant strain with fructose comprises contacting the recombinant strain (culture of cells and / or strains) with fructose, eg, mixing the recombinant strain with fructose, or
  • the recombinant strain may be performed by contacting fructose with the immobilized carrier. In this way, by converting the recombinant strain into fructose, the fructose is converted into the psychos and the psychos are known. It can be converted to loose to produce allose from fructose.
  • the allose fructose may be one of psicose and allose form of sugar composition consisting of, for example, fructose, psicose and allose saccharide composition 100 parts by weight 0/0 consisting of standards, can be in the form of fructose 60 to 63% of the amount, common worthy comprised between courses 24 to 26 weight 0/0 allose and 12 to 15 parts by weight 0/0 composition.
  • the method may be to produce allose from fructose at a conversion rate of at least 12%, for example 12 to 15%, 12 to 14% or 12 to 13%.
  • the concentration of fructose used as a substrate for the efficient production of psychocos 10 to 80% (w / v), 20 to 30% (w / v) based on the total reaction , 40 to 80% (w / v), 10 to 75% (w / v), 20 to 75% (w / v), 30 to 75% (w / v), for example, 40 to 75% (w / v).
  • the concentration of fructose is lower than the above range, the economical efficiency is lowered.
  • the concentration of fructose is higher than the above range, fructose is not dissolved well, so the concentration of fructose is preferably within the above range.
  • the fructose can be used in the form of a complete solution or a solution dissolved in water (such as distilled water).
  • the reaction may be performed under conditions of pH 6-9, for example, pH 7-9, pH 7-8, or pH 8-9.
  • the reaction may be carried out under temperature conditions of 30 or more, such as 40 or more.
  • the silver is 80 or more, browning of fructose, which is a substrate, may occur, so the reaction reaction is 30 to 80, for example, 35 to 80, 40 to 80, 35 to 75, 40 to 75, 35 to 70 or 40 To 70%.
  • the reaction time is preferably 1 hour or more, such as 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, or 6 hours or more. If the reaction time exceeds 48 hours, the increase rate of allose conversion is insignificant or rather decreases, so the reaction time should not exceed 48 hours. Therefore, the reaction time may be 1 to 48 hours, 2 to 48 hours, 3 to 48 hours, 4 to 48 hours, 5 to 48 hours, or 6 to 48 hours, in consideration of industrial and economic aspects, 1 to 48 hours, 2 to
  • the cell concentration of the recombinant strain used is 5 mg (dcw : dry cell weight) / ml or more, for example, 5 to 100 mg (dcw) / ml, 10 to 90 mg based on the total reaction (dcw) / ml, 20 to 80 mg (dcw) / ml, 30 to 70
  • the method is selected from the group consisting of copper ions, manganese ions, kalmeon ions, magnesium ions, zinc silver, nickel ions, cobalt ions, iron ions, aluminum ions, and calcium ions It may not be added one or more metal ions.
  • Another aspect of the present invention provides an enzyme for allose production—from fructose comprising a fusion protein in which a picos epimemse and an allose isomerase are linked by a linker peptide.
  • the enzyme is characterized by producing allose from fructose at a conversion rate of at least 12%, for example 12-15%, 12-14% or 12-13%.
  • the cosmos epimerase may be an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 3.
  • the allose isomerization enzyme may be one containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the linker peptide may be composed of 1 to 6 amino acids. If the linker peptide is less than or greater than the number of amino acids, the number is appropriate because it may adversely affect the structure of each other when connecting the two proteins.
  • the one fused protein may include an amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 or 25.
  • Yet another aspect of the present invention is produced by biological methods, fructose, psicose and allose saccharide composition 100 parts by weight 0 /. Criteria, fructose 60 to 63 weight 0/0, between the courses 24 to 26% by weight and egg consisting of It provides a reasonably common composition containing trehalose 12 to 15 weight 0/0. [Effects of the Invention ⁇
  • the present invention relates to a recombinant strain for producing alloose from fructose, a composition for producing alloose for producing alloose from a fructose-containing raw material comprising the recombinant strain, and a method for producing alloose using the same.
  • a recombinant strain for producing alloose from fructose a composition for producing alloose for producing alloose from a fructose-containing raw material comprising the recombinant strain, and a method for producing alloose using the same.
  • FIG. 1 shows a cleavage map of a recombinant vector in which a CDPE or TDPE and an RPI gene are introduced into a pACYCDuet-1 vector according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows a cleavage map of the recombinant vector introduced EDPE and RPI gene in the pACYCDuet-1 vector according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows a cleavage map of a recombinant vector incorporating the CDPE or TDPE and RPI gene into the RSFDuet- ⁇ vector according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows a cleavage map of the recombinant vector introduced EDPE and RPI gene in the RSFDuet-1 vector according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing the results of analysis of cell reaction according to the temperature of RSF—CDPE_RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a graph showing the results of analysis of cell reaction according to the temperature of RSF TDPE—RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a graph showing the results of analysis of cell response activity according to the silver of the RSF—EDPE_RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of cell reaction reaction according to the pH of the RSF ⁇ CDPE_RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of cell reaction reaction according to the pH of RSF—TDPE_RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • 10 is a graph showing the results of analysis of cell reaction according to pH of RSF—EDPE_RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a graph showing the result of analyzing the metal ion requirement of the enzyme in the RSF_CDPE_RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of analysis of metal ion requirements of enzymes in the RSF—TDPE® RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 is a graph showing the results of the metal ion requirement analysis of the enzyme in RSF_EDPE—RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 14 is a graph showing the results of cell reaction thermal stability analysis of RSF—CDPE—RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • 15 is a graph showing the results of analysis of cell reaction thermal stability of RSF—TDPE_RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • . 16 is a graph showing the results of analysis of cell reaction thermal stability of RSF_EDPE—RPI strain according to an embodiment of the present invention.
  • 17 is a graph showing the results of allose production from 15% fructose according to an embodiment of the present invention.
  • 18 is a graph showing the results of allose production from 50% fructose according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 19 shows a cleavage map of a recombinant vector in which a gene in which a CDPE or TDPE and an RPI gene are fused to a pACYCDuet-1 vector is introduced according to an embodiment of the present invention.
  • 20 is a photograph confirming the expression of the fusion enzyme according to the present invention and one embodiment through SDS-PAGE.
  • 21 is a graph showing the results of measuring the allose conversion rate of the fusion enzyme according to an embodiment of the present invention.
  • Example 1 Preparation and Transformation of Duet Plasmids Through genetic recombination, a plasmid was expressed to express the CDCDJEDPE, or TDPE, respectively, in one strain together with the RPI enzyme that produces allose in Psychos, and the enzyme that produces Psychos in fructose.
  • pACYC NOVAGEN
  • Ndel and XhoI NEB
  • Recombinant vectors were prepared by inserting into the same restriction enzyme site of RSF (NOVAGEN). Next, to prepare a vector incorporating a psychedelic epimerase coding sequence, a psychedelic epimerase coding sequence was first prepared.
  • polynucleotides encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 derived from crosstridium synthase (C / (w / r / i3 ⁇ 4ww ⁇ / "i / «):
  • EDS0641 1.1 polynucleotides encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 derived from Enshifer adherence (Eraz / er a / zaem), of SEQ ID NO: 3 derived from Troponema pr / a
  • SEQ ID NO: 2 derived from Enshifer adherence
  • SEQ ID NO: 3 derived from Troponema pr / a
  • the nucleotide sequence of the original coding polynucleotide SEQ ID NOs: 5, 7 and 8, respectively
  • variants thereof are optimized to be optimized for E. coli to be used as an expression strain.
  • the polynucleotides added (SEQ ID NOs. 6 and 9, respectively) were synthesized by Bioneer (Bioneer.Co, Korea).
  • Ndel and XhoI Ndel and XhoI
  • the respective glycos epimerase encoding polynucleotides were synthesized using the same restriction enzymes as pACYC (NOVAGEN) or RSF (NOVAGEN), which are expression vectors into which the RPI gene was inserted.
  • pACYC NOVAGEN
  • RSF NOVAGEN
  • TDPE, CDPE, and EDPE were inserted into the recombinant vector containing the RPI and inserted into the site, respectively, so that two genes (RPI enzyme gene and psychocos epimerase enzyme gene) were inserted in one vector.
  • the restriction enzymes are shown in Table 6 below.
  • E. coli BL21 (DE3) (invitrogen) was transformed into the respective recombinant vectors prepared by the heat shock method (Sambrook and Russell: Molecular Cloning.) To prepare a recombinant E. coli strain.
  • the recombinant E. coli strain prepared above was inoculated in 5 ml LB-ampicilline medium (Difco), followed by shaking culture at 37 ° C. and 200 rpm until the absorbance (OD) at 600 nm reached 1.5, followed by 500 ml LB- Species were inoculated in ampicilline medium and seeded in a 37 ' C shake incubator. Next, when the absorbance at 600 nm of the culture was 0.5,
  • IPTG isopropyl-l-thio-pD-galactopyranoside
  • Example 2 In order to confirm the optimal temperature for allose production, the cell concentration of the strain isolated in Example 2 was measured in a 10% (v / v) fructose lml, 50 mM PIPES buffer (pH 7.0) solution.
  • the reaction was carried out at 60 ° C. for 2 hours, and the reaction was terminated (heated) by heating for 5 minutes to stop the substrate reaction, and then the temperature showing the maximum activity was measured. Next, measure the conversion of allose from fructose for two hours. Thus, when the allose conversion rate at the optimum temperature was 100%, the relative value of the allose conversion rate at each temperature was expressed (RA (%), which is the Y-axis value in the figure). The results are shown in Table 7 and FIGS. 5 to 7.
  • Amount of substrate added residual fructose + residual amount of psychos + allose production
  • RSF—TDPE_RPI exhibited optimal activity at 55 ° C. (FIG. 5), and RSF_CDPE_RPI (FIG. 6) and RSF_EDPE_RPI (FIG. 7) were optimal at 50 ° C. It was confirmed that the activity.
  • RSF—TDPE_RPI showed optimal activity at pH7.0 (FIG. 8), and RSF_CDPE— RPI (FIG. 9) and RSF_EDPE— RPI (FIG. 10) were pH8. Optimal activity was seen at .0.
  • Example 2 10% (v / v) fructose was used as a substrate, and the cell concentration of the isolate isolated in Example 2 was 5 mg / ml— DCW, and 50 mM PIPES buffer at 50 ° C. Reaction for 2 hours using a solution of ImM metal ions (CuCl 2 , MnCl 2 , FeS0 4 , ZnS0 4 , NiS0 4 , or CoCl 2 ) dissolved in solution (pH7.0 or 8.0, performed at the optimum pH of each enzyme) After the reaction was finished (stopped) by heating for 5 minutes to stop the reaction of the substrate, alloose production was measured by HPLC analysis in the same manner as in Example 3-1. As a control (Non) was used that was not treated with metal ions.
  • ImM metal ions CuCl 2 , MnCl 2 , FeS0 4 , ZnS0 4 , NiS0 4 , or CoCl 2
  • Amount of substrate added residual fructose + residual amount of psychos + allose production [Table 10]
  • the results are shown in Table 12 and FIG.
  • Amount of substrate added residual fructose + residual amount of psychos + alloose production ⁇ Table 12 ⁇ RSF TDPE PI (Histag x) 12.0 25.3
  • ACYC_GDPE_RP1 (Histag x) 1 1.8 25.9
  • Coding genes of the Pseudomonas epimerase derived from Encipher Adherence (Erai / er acZ / werera) were synthesized as polynucleotides (SEQ ID NO: 6) modified by optimizing E. coli and named EDPE. . PRI encoding genes (SEQ ID NO: 10) obtained from Persephone !! a marina EX-lil ⁇ gDNA optimized for E. coli were obtained by PCR, and each template was obtained by overlapping PCR. (SEQ ID NO: 22). '
  • pET21 a prepare a recombinant vector to eu the cleavage map of the resulting recombinant vector 19 It was.
  • E. coli BL21 (DE3) (invitrogen) was transformed with the recombinant vector prepared by a heat shock method (Sambrook and Russell: Molecular Cloning.) To prepare a recombinant strain.
  • Example 5-1 Purification of the fusion enzyme " The cells recovered in Example 4 were suspended in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.0 300 mM NaCl), and then subjected to 4 ° C using an ultrasonic wave vibrator (Ultrasonic processor. ColepParmer). Crushed for 20 minutes at.
  • lysis buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.0 300 mM NaCl
  • Example 6 To confirm allose production from fructose, the enzyme purified in Example 6 in a solution of 1 ml of 50% (v / v) fructose and 50 mM PIPES buffer (pH 7.0 or 8.0, performed at the optimum pH of each enzyme) as substrate. Allose conversion was measured by hourly sampling at a concentration of LOmg / ml, reacting at 50 ° C. for 24 hours. The results are shown in Table 14 and FIG. 21.

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Abstract

본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주, 상기 균주를 포함하는 과당-함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방
【기술분야】
본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주， 상기 균주를 포함하는 과당 -함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성물， 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것이다.
【배경기술】
알로오스 (D-allose)는 포도당 (D-glucose)과 3번 탄소의 -OH 기 방향만 다른 에피머 (epimer)로서, 사이코스 (psicose)의 이성질체로 알려진 희소당 단당류이다. 알 로오스는 혈전 형성, 장기이식수술 환자의 자가 면역 반웅 및 암세포의 증식을 억 제하는 기능을 가지고 있다. 또한, 간과 뇌의 허혈 후 신경세포의 사멸을 연장시 키는 효과도 있으며 백혈병 환자의 치료약으로도 연구가 진행되고 있다.
상기와 같은 특징으로 인해, 알로오스는 의약 분야에서 차세대 핵심 소재 로서 높은 이용가치가 있으나, 자연계에 극히 드물게 존재하기 '때문에 산업적으로 적용하기 위해서는 효율적인 생산 공정을 개발하는 것이 필요하다. 종래에 알로오 스는 주로 화학적 합성 방법에 의해서만 생산되었으나, 부가적인 당류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생한다는 문제가 있다.
이에, 최근에는 미생물이 생산하는 효소를 이용하여 알로오스를 대량 생산 하는 방법이 제안되었다. 일본 카가와 대학의 이즈모리 그룹에서 처음으로 슈도모 나스 슈체리 (Pseudomonas stutzeri) 유래의 람노스 이성화 효소 (L-rhamnose isomemse)를 사용하여 사이코스에서 알로오스를 생산하여 보고하였으나 (Journal of Fermentation and Bioengineering, 85(5); 539-541, 1998), 상기 효소는 알로오스 생성시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose)도 함께 생성시키는 단점이 있었다.
따라서 알트로스와 같은 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온 도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 알로오스를 생산할 수 있는 효소의 개발이 요구되고 있다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 사이코스 에피머화 효소 (psicose epimerase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 백터를 포함하는 재조합 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 상기 재조합 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 균주, 상기 재조합 균주의 배양물, 및 이들의 흔합물을 과당 -함유 원료와 반응시키는 단계를 포함하는 과당 -함유 원료로 부터 알로오스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포함 하는 과당으로부터 알로오스 생산용 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 과당, 사이코스 및 알로오스를 포함하는 흔합당 조성물을 제공하는 것이다.
【과제의 해결 수단】
본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주, 상기 균주를 포함하는 과당 -함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성물, 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것이다.
기존의 알로오스를 화학적 합성 방법에 의해 생산하는 경우, 부가적인 당 류의 생성 및 이로 인한 복잡한 정제 과정과 공정상에서 화학적 폐기물이 발생하 고， 미생물을 이용한 방법은 알로오스 생성시 부산물로 다량의 알트로스 (D-altrose) 도 함께 생성시키는 단점이 있는바, 알트로스와 같은부산물을 생.성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타내며, 높은 수율로 과당으로부터 알로오스를 생산할 수 있는 알로오스의 제조방법을 제공하 고자 한다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다. 이에 본 발명의 하나의 양태는, 사이코스 에피머화 효소 (psicose epimerase) 를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴 클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백터를 제공한다.
상기 사이코스 에피머화 효소는 클로스트리디움 신댄스 (C/( t i¾w« scidens), 엔시퍼 아드해렌스 (Era^r a^flere ) 또는 트로포네마 프리미샤 (7 epo"ewa /)n'm/t/a) 에서 유래된 것일 수 있다.
상기 클로스트리디움 신댄스 (C7cwt 'i¾w« « /ifera)에서 유래한 사이코스 에피 머화 효소 (이하, CDPE)는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백 질이다. 예컨대, 상기 CDPE는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부 터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 CDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호 화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어， 서열번호 5의 염기서열 및 /또는 서열번호 6의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 CDPE는 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 법 (SDS-PAGE)으로 측정된 단량체의 분자량이 30 내지 37 kDa, 예컨대 30 내지 35 kDa인 것일 수 있다. 상기 CDPE의 최적 온도는 40 내지 65, 구체적으로 50 내지 65일 수 있다. 상기 최적 온도는, 예컨대， pH 7.0, lmM Co2+ 존재하에서 5분간 반웅 진행 시의 결과일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 단백질의 최적 pH는 pH 6 내지 9, pH 7 내지 9， pH 7 내지 8.5, 또는 pH 7 내지 8일 수 있다. 상기 최적 pH는 예컨대， 60, lmM Co2+ 존재하에서 5분간 반웅 진행의 결과일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 엔시퍼 아드해렌스 (E ^r ai/ aere/w)에서 유래한 사이코스 에피머화 효소는 (이하 , EDPE) 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질이 다. 예를 들어, 상기 EDPE는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
상기 EDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 핵산서열, 예를 들어, 서열번호 7의 염기 서열을 포함할 수 있다
상기 트로포네마 프리미샤 ( Q emapn'm to)에서 유래한 사이코스 에피머 화 효소는 (이하 , TDPE) 과당으로부터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 단백질 이다. 예를 들어, 상기 TDPE는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지며 과당으로부 터 사이코스를 생산하는 활성을 가지는 것일 수 있다.
상기 TDPE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 서열번 호 8의 염기서열 및 /또는 서열번호 9의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 사이코스 에피머화 효소는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 유지 되는 한, 서열번호 1， 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 중 일부가 치환, 삽 입 및 /또는 결실된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번 호 1 , 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상， 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 클로 스트리디움 ^ ^스 Chstridiun scidem), 엔시퍼 아드해렌스 (E¾«/er ί /zaerera) 또는 트로포네마 프리미샤 (7>e o«ema/?n> Y/a)에서 얻어진 사이코스 에피머화 효소의 암 호화 뉴클레오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
예를 들면, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서 열은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이 드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오 타이드 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
구체적으로, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 서열번호 5 내지 서열번호 9로 이루어지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또는, 상기 서열번호 5 내지 서열번호 9로 이루어 지는 군에서 선택된 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동일성을 갖는 뉴클레 오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 알로오스 이성질화 효소는 尸 e e/7/ «e//fl Wfl ra EX-Hl에서 유래된 것 일 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 포함하는 알로오스 이성질화 효소일 수 있다.
상기 알로오스 이성질화 효소는 사이코스를 알로오스로 이성질화 활성이 유지되는 한, 서열번호 4의 아미노산 중 일부가 치환， 삽입 및 /또는 결실된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열 과 70% 이상, 80% 이상， 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아 미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 P ^^½ e//a man ¾z EX-Hl에서 얻어진 알로오스 이성질화 효소의 암호화 뉴클레 오타이드 서열이거나, 대장균 또는 코리네박테리움속 균주에서 발현에 최적화할 수 있도록 변형된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
예를 들어, 상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서 열은, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이 드 서열일 수 있다. 예를 들어, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이 드일 수 있다. 또는 상기 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적 동 일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기의 실질적인 동일성은 각각의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 뉴 클레오타이드 서열을 최대한 대웅되도록 정렬하고, 그 서열을 분석하여, 상기 임 의의 다른 뉴클레오타이드 서열이 각각의 뉴클레오타이드 서열과 70% 이상, 90% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 것을 의미한다.
당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 당해 분야에 공지된 유전자 재 조합 기술 등을 이용하여 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 그 이상의 염 기를 치환, 부가 또는 결실시킴으로써 상기 실질적 상동성을 갖는 범위에서 동일 한 활성을 갖는 효소 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 제조할 수 있 음을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 이러한 상동성의 비교는 시판되는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율 (%)로 계산하여 수행 될 수 있다.
본 발명에 따른 구체적인 효소의 아미노산 서열을 표 1에， 이를 암호화하 는 뉴클레오타이드 서열을 하기 표 2 내지 3에 예시적으로 기재한다.
【표 11
서열목록 (5·->3') 9
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[Z Έ]
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6S0M0/9T0ZaM/X3d 6εεΐΐΐ/.ΐοζ OAV [e Έ]
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6S0M0/9T0ZaM/X3d 6εεΐΐΐ/.ΐοζ OAV 서열 o ᄋ 서열목록 (5'->3')
번호
8 TDPE ATGCAATAGGTATTTATTTTGCCTATTGGACAAAGGAATGGCA (Original) GGCGGATTACAAAAAGTATATCGATAAAGTATCAAAACTGGGT
TTTGATATACTGGAGATATCCTGTGCAGCCTTGAAGGATCAATA
TGTTTCGGATTCCCAACTTTTTGATTTGCGGGATTATGCGAAAG
AGAAGGGTGTCACCCTGACCGCTGGCTACGGCCCGGCTAAGGG
CGAAAATCTTAGTTCTTCCGATAACCGGGTTGTCAAAAATGCA
AAAGCCTTTTATAAGGATGTGCTGGGAAAGCTCAACAAACTCG
ACATAAGGCTGCTGGGCGGGGGGTTATACTCATACTGGCCGGT
TGACTATTCTCTGCCCATTGATAAGGCGGGGGACTGGAAACGG
TCAGTTGAAAATATCAGGGAAATTGCCGCAATCGCCGCAGACC
GCAACGTGGTATTGGGGATGGAGGTATTAAACCGCTTCGAAGG
GTATTTGCTTAACACCTGTGAGGAAGGAATTAAGTTTGTCGATG
AAGTTAATCACCCGAATGTAAAAGTCATGCTGGATACTTTTCAC
ATGAATATTGAGGAAGATAATATGGCTGAAGCCATCCGCATGG
CGGGGGATAAGCTTGGGCATTTTCATATTGGCGAACAGAACCG
CAAGGTTCCCGGGAAAGGATGCATCCCCTGGAATGCAATTGGT
CATGCCCTGCGGGACATACGGTACAATGGGACGGTGGTGATGG
AGCCCTTTGTCATGCCCGGGGGAACCATAGGGCAGGATATAAA
AGTCTGGAGAAATTTACTTCCCGAGACAAGCGAAACGATACTG
GATCGTGATGCCAAGGGAGCGTTGGAATTTGTGAAGCATGTGT
TTGGTAGTACTTCTGTTTTATAA
9 TDPE ATGCAGTACGGTATCTACTTCGCGTACTGGACCAAAGAATGGC (E.coli) AGGCGGACTACAAAAAATACATCGACAAAGTTTCTAAACTGGG
TTTCGACATCCTGGAAATCTCTTGCGCGGCGCTGAAAGACCAGT
ACGTTTCTGACTCTCAGCTGTTCGACCTGCGTGACTACGCGAAA
GAAAAAGGTGTTACCCTGACCGCGGGTTACGGTCCGGCGAAAG
GTGAAAACCTGTCTTCTTCTGACAACCGTGTTGTTAAAAACGCG
AAAGCGTTCTACAAAGACGTTCTGGGTAAACTGAACAAACTGG
ACATCCGTCTGCTGGGTGGTGGTCTGTACTCTTACTGGCCGGTT
GACTACTCTCTGCCGATCGACAAAGCGGGTGACTGGAAACGTT
CTGTTGAAAACATCCGTGAAATCGCGGCGATCGCGGCGGACCG TAACGTTGTTCTGGGTATGGAAGTTCTGAACCGTTTCGAAGGTT
ACCTGCTGAACACCTGCGAAGAAGGTATCAAATTCGTTGACGA
AGTTAACCACCCGAACGTTAAAGTTATGCTGGACACCTTCCAC
ATGAACATCGAAGAAGACAACATGGCGGAAGCGATCCGTATG
GCGGGTGACAAACTGGGTCACTTCCACATCGGTGAACAGAACC
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TCAACCTGtAA 상기 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소는 링커 템타이 드로 연결된 하나의 융합 단백질인 것일 수 있다.
상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한， 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 링커 펩타이드가 상기 아미노산 개수 마만이거나 초과이면 두 단백질 을 연결할 때 서로의 단백질의 구조에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 상기 TI
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ALGSRVLGIDLALSIVDTFLSTDFEGGRHERRVHLIQNIEKINL 상기 재조합 백터는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 클로닝을 위한 백 터 또는 발현을 위한 백터로서 구축될 수 있다 (Francois Baneyx, current Opinion Biotechnology 1999, 10:41 1 -421). 상기 재조합 백터는 유전자 재조합에 이용되어온 백터라면 모두 사용이 무방하며, 예컨대， 플라스미드 발현백터, 바이러스 발현백터 (예, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스) 및 이 들과 동등한 기능을 수행할 수 있는 바이러스 백터 등으로 이루어진 군에서 선택 된 것일 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어， 상기 재조합 백터는 pACYC, RSF, pET, pKK223-3, pTrc99a, pKD, pXMJ19, pCES208 백터 등으로 이루어진 군에서 선택된 것으로부터 제작된 것일 수 있으며, 바람직하게는 pACYC 또는 RSF 일 수 있다.
상기 재조합 백터란 작동 가능하도록 연결된 목적 폴리뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 재조합 핵산 분자를 의미하며, 상기 목적 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및 전사 종결인자 등으로 이루어지는 하나 이상의 전사 조절 요소와 작 동 가능하게 연결되어 있는 것일 수 있다.
상기 전사 종결인자는 rrnB, rrnBᅳ Tl , rrnB—T2, T7 terminator 등 일수 있으며, 바람직하게는 pET2 la vector로부터 PCR된 T7 전사 종결인자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 백터로 형질전환된 재조합 균주에 관한 것이다.
. 본 발명에 따른 구체적인 재조합 백터의 개열지도를 도 1 내지 도 4에 예 시적으로 기재하였다.
상기 재조합 백터로 숙주 세포를 형질 전환시키는 방법은 당업계에 공지 된 모든 형질전환 방법 특별한 제한 없이 선택하여 사용할 수 있으며, 예컨대， 세 균 원형질체의 융합， 전기 천공법, 추진체 포격 (projectile bombardment), 및 바이러 스 백터를 사용한 감염 등 선택된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 형질전환된 재조합 균주는 높은 안정성을 가지며, 도입된 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소를 과발현할 수 있으며 , 따라 서 장기간 안정적으로 높은 알로오스 전환능을 제공할 수 있다. 따라서, 상기 형 질전환된 재조합 균주는 알로오스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며 , 알로오스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.
상기 재조합 균주의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가 식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따라사용될 수 있는 배지는 일반적으로 하나 이상의 탄소 공 급원， 질소 공급원， 무기염, 비타민 및 (또는) 미량 원소를 포함한다. 바람직한 탄소 공급원은 단당류, 이당류 또는 다당류와 같은 당류이다. 질소 공급원은 일반적으 로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공 급원의 예로는 암모니아 기체 또는 암모늄염, 예컨대 황산암모늄， 염화암모늄， 인 산암모늄, 탄산암모늄 또는 질산암모늄, 니트레이트, 우레아, 아미노산, 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액， 대두 분말, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등이 있다. 질소 공급 ¾은 단독으로 또는 흔합물로 사용할 수 있다.
배지에 존재할 수 있는 무기염 화합물은 칼슘, 마그네슴, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염화물, 인산염 또는 황산염을 포함한 다. 인 공급원으로서, 인산， 인산 2수소 칼륨 또는 인산수소 2칼륨， 또는 대웅하는 나트륨 -함유 염을 사용할 수 있다. 용액 중 금속 이온을 유지시키기 위해 배지에 킬레이팅제를 첨가할 수 있다. 배지의 모든 성분은 가열 (1.5 bar 및 121에서 20분) 또는 멸균 여과에 의해 멸균시킨다. 이 성분들은 함께, 또는 필요에 따라.개별적 으로 멸균시킬 수 있다. 배지의 모든 성분은 배양 시작 시에 존재할 수 있거나, 임의로는 연속 또는 회분식으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 균주의 ^체 및 /또는 재조합 균주 의 배양물을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 과당 -함유 원료로부터 알로오스를 제조하는 것일 수 있다. 또한， 상기 배양물은 상기 재조합 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로， 상 기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 무세포 (cell-free) 형태일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 알로오스의 제조에 사용되는 재조합 균주는 상기 균주의 균체 및 /또는 상기 균주의 배양물을 의미하는 것으로 사용된다.
상기 알로오스 생산용 조성물에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물의 형태인 것일 수 있으며, 예를 들어， 과당, 사 이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량0 /0 기준으로， 과당 60 내지 63 중량0 /。, 사이코스 24 내지 26 중량 % 및 알로오스 12 내지 15 중량 0/。를 포함하는 흔합당 조성물의 형태인 것일 수 있다.
상기 조성물은 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어, 12 내지 15%, 12내지 14%또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것일 수 있다. 과당으로 부터 사이코스를 생산한 후, 사이코스로부터 알로오스를 생산하는 2단계의 공정을 통하는 경우에는 약 9% 정도의 전환율로 알로오스가 생산되며, 하나의 공정을 통 해 생산하지 못하기 때문에 시간이 오래 걸리고 생산 비용이 증가하는 문제점이 생긴다. 그러나 상기 조성물을 이용하여 알로오스를 생산하는 경우에는, 1단계의 공정을 통해 알로오스를 생산할 수 있어 시간이 단축되며 생산 비용을 절감할 수 있으며, 특히 2단계의 공정을 통해 생산하는 경우보다 30% 이상 향상된 수율로 알로오스를 생산할 수 있다.
상기 조성물은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이 온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 재조합 균주의 균체 및 /또는 상기 재조합 균주의 배양물을 포함하는 알로오스 생산용 조성물을 과당 -함유 원료와 접촉하여 알로오스를 생산하는 방법을 제공한다ᅳ
상기 알로오스 생산 방법은 상기 재조합 균주를 과당 -함유 원료와 반웅시 키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 재조합 균주를 과당과 반웅시키는 단 계는， 상기 재조합 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 재조합 균주를 과당과 반웅시키는 단계는, 상기 재조합 균주 (균체 및 /또는 균주의 배양물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예를 들어, 상기 재조합 균주를 과당과 흔합하는 단계 또는 상기 재조합균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 재 조합 균주를 과당과 반웅시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하고, 사이코스를 알 로오스로 전환하여 과당으로부터 알로오스를 생산할 수 있다.
상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물의 형태인 것일 수 있으며, 예를 들어, 과당， 사이 코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량0 /0 기준으로, 과당 60 내지 63 중 량 %, 사이코스 24 내지 26 중량0 /0 및 알로오스 12 내지 15 중량0 /0를 포함하는 흔 합당 조성물의 형태인 것일 수 있다.
또한, 상기 방법은 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어， 12 내지 15%, 12 내 지 14%또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것일 수 있다.
또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하 여， 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반웅물 기준으로 10 내지 80%(w/v), 20 내지 30%(w/v), 40 내지 80%(w/v), 10 내지 75%(w/v), 20 내지 75%(w/v), 30 내지 75%(w/v), 예컨대 , 40 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮 으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로， 과 당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완층용액 또는 물 (예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.
상기 알로오스 생산방법에 있어서， 상기 반응은 pH 6 내지 9， 예를 들어, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건하에서 수행될 수 있다. 또한， 상기 반웅은 30 이상, 예컨대 40 이상의 온도 조건하에서 수행될 수 있다. 은도가 80 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반웅은 30 내지 80， 예를 들어, 35 내지 80, 40 내지 80, 35 내지 75, 40 내지 75, 35 내지 70 또 는 40 내지 70의 조건하에서 수행될 수 있다.
또한, 상기 생산방법에 있어서, 상기 반웅 시간이 길수록 알로오스 전환률 이 높아진다. 예를 들어, 상기 반웅 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반웅시간이 48 시간을 넘어가면 알로오스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로， 반 응시간은 48시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반웅 시간은 1 내지 48시 간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시 간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지
36시간, 3 내지 24시간, 3 내지 12시간， 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 알로오스로의 전환 효율이 최 대화되는 조건으로서 선정된 것이다.
또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 사용되는 재조합 균주의 균체 농도는 전체 반웅물 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량 )/ml 이상， 예컨대 , 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70
mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 알로오스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 알로오스 전환 반웅의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 싱 -기 범위로 하는 것이 좋다.
또한, 상기 알로오스 생산 방법에 있어서, 상기 방법은 구리 이온, 망간 이 온, 칼슴 이온, 마그네슘 이온, 아연 이은, 니켈 이온, 코발트 이온， 철 이온， 알루 미늄 이온, 및 칼슘 이온으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 첨 가하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 사이코스 에피머화 효소 (psicose epimemse) 및 알 로오스 이성질화 효소가 링커 펩타이드로 연결된 융합 단백질을 포함하는 과당으 一로부터—알로오스ᅳ생산용 효소를 제공한다.
상기 효소는 과당으로부터 12% 이상, 예를 들어， 12 내지 15%, 12 내지 14% 또는 12 내지 13%의 전환율로 알로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것이다. 또한, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군 에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 알로오스 이성 질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열올 포함하는 것일 수 있다.
상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다. 상기 링커 펩타이드가 상기 아미노산 개수 미만이거나 초과이면 두 단백질을 연 결할 때 서로의 단백질의 구조에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 상기 개수 가 적당하다.
상기 하나의 융합된 단백질은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서열을 포 함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 생물학적 방법으로 생산되며, 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량0 /。 기준으로, 과당 60 내지 63 중량0 /0， 사이코스 24 내지 26 중량 % 및 알로오스 12 내지 15 중량0 /0를 포함하는 흔합당 조성물을 제공한다. [발명의 효과】
본 발명은 과당으로부터 알로오스를 생산하는 재조합 균주， 상기 재조합 균주를 포함하는 과당 -함유 원료부터 알로오스를 생산하는 알로오스 생산용 조성 물， 및 이를 이용한 알로오스의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 재조합 균주 및 /또는 이를 이용한 알로오스의 제조방법을 이용하여, 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건을 나타내며 높은 열 안정성을 나타 내며, 높은 수율로 알로오스를 생산할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 백터에 CDPE 또는 TDPE와 RPI 유전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 백터에 EDPE와 RPI 유 전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 RSFDuet-Ι 백터에 CDPE 또는 TDPE 와 RPI 유전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 RSFDuet-1 백터에 EDPE와 RPI 유전 자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— CDPE_RPI 균주의 온도에 따른 세포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF TDPE— RPI 균주의 온도에 따른 세포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— EDPE_RPI 균주의 은도에 따른 세포 반응 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSFᅳ CDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세 포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— TDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세 포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다ᅳ
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— EDPE_RPI 균주의 pH에 따른 세포 반웅 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 1 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_CDPE_RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— TDPEᅳ RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE— RPI 균주에서의 효소의 금속 이온 요구성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— CDPE— RPI 균주의 세포 반웅 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF— TDPE_RPI 균주의 세포 반웅 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
. 도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 RSF_EDPE— RPI 균주의 세포 반웅 열 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 15% 과당으로부터 알로오스 생산 결 과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 50% 과당으로부터 알로오스 생산 결 과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 pACYCDuet-1 백터에 CDPE 또는 TDPE와 RPI 유전자가 융합된 유전자를 도입한 재조합 백터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명와 일 실시예에 따른 융합 효소의 발현을 SDS-PAGE를 통 해서 확인한 사진이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 효소의 알로오스 전환율을 측 정한 결과를 나타낸 그래프이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실 시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 실시예 1. 듀엣 플라스미드의 제조 및 형질전환 유전자 재조합을 통해， 사이코스에서 알로오스를 생산하는 RPI 효소와 함 께 하나의 균주에서, 과당에서 사이코스를 생산하는 효소 CDPEJEDPE, 또는 TDPE 각각을 발현시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로, RPr암호화 서열을 도입한 백터를 제조하고자, RPI 단백질인 서열번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (서열번호 1 1)를 Ndel과 XhoI(NEB)올 사용하여 발현백터인 pACYC(NOVAGEN) 또는
RSF(NOVAGEN)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 백터를 제조하였다. 그 다음, 사이코스 에피머라제 암호화 서열을 도입한 백터를 제조하고자, 먼저 사이코스 에피머라제 암호화 서열를 제조하였다.
구체적으로, 크로스트리디움 신댄스 (C/(w/r/i¾ww ^/"i /«)로부터 유래된 서 열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (Gene bank:
EDS0641 1.1), 엔시퍼 아드해렌스 (Eraz/er a /zaem )로부터 유래된 서열번호 2의 아 미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 트로포네마 프리미샤 (Jreponema pr/ a)에서 유래한 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이 드로서 (Gene bank: WP_010256447)， 발현 균주로 사용될 대장균에 최적화되도록 원 래의 암호화 폴리뉴클레오타이드의 염기서열 (각각 서열번호 5, 7 및 8) 및 이에 변 형이 가해진 폴리뉴클레오타이드 (각각 서열번호 6 및 9)를 바이오니아 (Bioneer.Co, Korea)에 의뢰하여 합성하였다.
그 다음， 제한효소 Ndel과 XhoI(NEB)을 사용하여， 상기 합성된 각각의 사 이코스 에피머라제 암호화 폴리뉴클레오타이드를 RPI 유전자가 삽입된 발현백터 인 pACYC(NOVAGEN) 또는 RSF(NOVAGEN)의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 RPI가 포함된 제조된 재조합 백터에 TDPE, CDPE, EDPE를 각각 삽입하여 한 백터 에 두 개의 유전자 (RPI 효소 유전자 및 사이코스 에피머라제 효소 유전자)가 삽 입 되도록 하였다. 상기 제한 효소는 하기 표 6에 나타내었다.
【표 6】
서열번 Primer Name Sequence (5'→ 3') 제한 효소 호
1 1 CDPE_F_BamHI(Duet) CGATCGGATCCGATGAAACACGGTAT BamHI
CTACTAC
12 CDPE_R_HindIII(Duet) GCGACCAAGCTTTTATTTCCATTCCA Hindlll
GCATG
13 EDPE— F BamHI(Duet) CGATCGGATCCGATGCAGGGTTTTGG BamHI CGTC
14 EDPE_R_NotI(Duet) GCGACCGCGGCCGCTTAGATCAATCC Notl
GTATTGCCG
15 TDPE F— BamHI(Duet) CGATCGGATCCGATGCAGTACGGTAT BamHI
CTAC
16 TDPE_R_HindIII(Duet) GCGACCAAGCTTTTACAGAACAGAG Hindlll
GTAGAACC
17 RPI_F_NdeI(Duet) GCGTTGCATATGAAAATCTCTATCGG Ndel
TTCTG
18 RPI_R_XhoI(Duet) GGCAGGCTCGAGTTACAGGTTGATTT Xhol
TTTCGATG
19 CDPE_F_NcoI(Duet) CGCAAGCCATGGGCATGAAACACGG Ncol
TATCTACTAC
20 EDPE_F_NcoI(Duet) CGCAAGCCATGGGCATGCAGGGTTTT Ncol
GGCGTC
21 TDPE_F_NcoI(Duet) CGCAAGCCATGGGCATGCAGTACGGT Ncol
ATCTAC 그 다음, heat shock방법 (Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대장균 BL21(DE3)(invitrogen)를 상기 제작한 각각의 재조합 백터로 형질 전환하여 재조합 대장균 균주를 제조하였다.
상기 제조된 재조합 대장균 균주를 5ml LB-ampicilline 배지 (Difco)에 접종한 ,후 600nm에서의 흡광도 (OD)가 1.5에 도달할 때까지 37 °C , 200rpm에서 진탕 배양하 고， 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37 'C의 진탕 배양기에서 종 배양하였다. 그 다음, 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 ImM의
IPTG(isopropyl-l-thio-p-D-galactopyranoside)를 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도 하였다. 상기 과발현 유도 시점부터 배양조건을 16°C 및 150rpm으로 전환하여 16 시간 동안 유지하였다. 실시예 2. 알로오스 생산 균주의 반응조건 확립
2-1. 온도에 따른 세포 반웅 활성 분석
알로오스 생산 최적 온도를 확인하기 위하여 , 10%(v/v) 과당 lml, 50mM PIPES buffer (pH 7.0) 용액에, 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를
5mg/ml_DCW 범위에서, 60 °C 하에서 2시간 동안 반웅시키고, 기질 반웅 정지를 위 해 5분간 가열하여 반웅을 종료 (정지)시키고 난 후에， 최대 활성을 나타내는 온도 를 측정하였다. 그 다음， 두 시간 동안의 과당으로부터의 알로오스 전환율을 측정 하여, 최적 온도에서의 알로오스 전환율올 100%로 했을 때 각각의 온도에서의 알 로오스 전환율의 상대적인 값으로 나타내었다 (도면의 Y축 값인 RA(%)). 그 결과 를 하기 표 7 및 도 5 내지 7에 나타내었다.
[계산식]
전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100
넣어준 기질양 = 잔여 과당 + 사이코스 잔여량 + 알로오스 생산량
【표 7】
Figure imgf000023_0001
상기 표 7 및 도 5 내지 7에 나타난 바와 같이, RSF— TDPE_RPI는 55 °C에서 (도 5)최적의 활성을 나타냄을， RSF_CDPE_RPI (도 6)와 RSF_EDPE_RPI (도 7)는 50°C 에서 최적의 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
2-2. pH에 따른 세포 반웅 활성 분석
pH에 따른 세포 반웅 활성을 분석하기 위하여 , 실시예 1에서 분리된 균주 의 균체농도 5mg/ml_DCW 및 과당농도 10%(v/v)의 완충용액 50 mM sodium citrate(pH 4 내지 5), 50 mM sodium phosphate(pH 6 내지 8)， 50 mM glycine NaOH (pH 9 내지 10)을 각각 사용하여 각 pH 조건에서 50°C에서 2시간 반웅시키고 기질 반웅 정지를 위해 5분간 가열하여 반웅을 종료 (정지)시켜, 최대 활성을 나타내는 pH를 측정하였다. 그 다음, 두 시간 동안의 과당으로부터의 알로오스 전환율을 측정하 여, 최적 pH에서의 알로오스 전환율을 100%로 했을 때 각각의 pH에서의 알로오 스 전환율의 상대적인 값으로 나타내었다 (도면의 Y축 값인 RA(%)). 그 결과를 하기 표 8 및 도 8 내지 10에 나타내었다.
[계산식]
전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100 넣어준 기질양 잔여량 + 알로오스 생산량
【표 8】
Figure imgf000024_0001
상기 표 8 및 도 8 내지 10에 나타난 바와 같이, RSF— TDPE_RPI는 pH7.0에 서최적의 활성을 나타내었으며 (도 8), RSF_CDPE— RPI (도 9)와 RSF_EDPE— RPI (도 10)는 pH8.0에서 최적의 활성을 나타내었다.
2-3. 효소의 금속 이온 요구성 분석
금속이온 요구성을 확인하기 위하여 , 10%(v/v) 과당을 기질로 사용하고, 상 기 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도 5mg/ml— DCW, 및 50°C에서, 50mM PIPES 완충용액 (pH7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행)에 녹인 ImM 금속 이온 (CuCl2, MnCl2, FeS04, ZnS04, NiS04, 또는 CoCl2) 용액을 각각 사용하여 2시간 동안 반웅시키고， 기질 반웅 정지를 위해 5분간 가열하여 반웅을 종료 (정지)시키 고 난 후에， 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 알로오스 생산량을 측정하였다. 대조군 (Non)으로는 금속이온을 처리하지 않은 것을 사용하 였다. 1
그 결과를 하기 표 9 및 도 1 1 내지 13에 나타내었다.
【표 9】
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000025_0001
상기 표 9 및 도 11 내지 13에 나타난 바와 같이, CDPE_RPI의 경우, Fe 이 온에 의해 약간 활성이 증가하였지만 (도 11), 세 효소 모두 크게 금속 이온에 의 존하는 결과를 나타내지 않음을 확인하였다 (도 11 내지 13).
즉, 기존의 CDPE, TDPE, EDPE를 단독으로 발현했을 경우에는 금속이 없으 면 활성, 전환율， 열 안전성 등이 현저히 저하되나， 두 효소를 동시에 하나의 백터 에서 발현했을 때는, 기존의 각각의 효소와 달리 금속 이온이 없이도 전환반응이 일어남을 확인하였다.
2-4. 세포 반웅의 열 안정성 분석
세포 반웅의 열 안정성을 확인하기 위해, 40 내지 50°C에서 24시간 동안 효소에 열을 가한 후, 열 층격이 가해진 균주를 반웅에 사용하였다.
구체적으로, 10%(v/v) 과당을 기질로 사용하고, 상기 열 층격이 가해진 균 주의 균체 농도 5mg/ml_DCW, 및 50에서, 50mM PIPES 완층용액 (pH7.0 또는 8.0， 각 효소의 최적 pH에서 수행)을 각각 사용하여 2시간 동안 반웅시키고, 기질 반 웅 정지를 위해 5분간 가열하여 반응을 종료 (정지)시켰다. 하기의 계산식을 통해 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10(40°C) 및 표 11 (50°C)에 나 타내었으며, 도 14 내지 16에 전환율을 로그 값으로 변환시켜 나타내었다.
[계산식]
전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100
넣어준 기질양 = 잔여 과당 + 사이코스 잔여량 + 알로오스 생산량 【표 10】
40 °C 전환율 (%)
시간 (h) RSF CDPE RPI RSF TDPE— RPI RSF EDPE RPI
(his tag X) (his tag X) (his tag X)
0 5.4 5.4 5.7
2 5.8 6.4 6.0
Figure imgf000026_0001
[표 1 1】
Figure imgf000026_0002
상기 표 10 내지 1 1 및 도 14 내지 16에 나타난 바와 같이, 40°C에서는 20 시간 이상 어느 정도 열에 효소가 견디는 양상을보였지만,'각 은도에서의 반감기 (Half-life)를 비교해 볼 때， 50°C에서는 3시간 정도 ¾ 층격이 가해졌올 때 활성이 반으로 줄어 들었음을 확인하였다.
실시예 3. 알로오스 생산
3-1. 15% (v/v) 과당으로부터 알로오스 생산 반웅
과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여, 기질로 15%(v/v) 과당 1 ml 와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에， 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg/ml_DCW 범위에서 , 50 °C온도에서 0 내지 20시간 동안 반웅시키면서, 시간별 샘플링을 하여 하기의 계산식을 통해 알 로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 표 12 및 도 17에 나타내었다.
[계산식]
전환율 (%) = (생산량 I 넣어준 기질 양) * 100
넣어준 기질양 = 잔여 과당 +사이코스 잔여량 + 알로오스 생산량 【표 12】
Figure imgf000026_0003
RSF TDPE PI (Histag x) 12.0 25.3
RSF_EDPE_RPI (Histag x) 12.6 25.3
RSF_CDPE_RPI (Histag 0) 13.0 24.8
RSF_TDPE_RPI (Histag 0) 1 1.5 25.3
RSF— EDPE RPI (Histag 0) 12.9 24.9
ACYC_GDPE_RP1 (Histag x) 1 1.8 25.9
ACYC— TDPE_RPI (Histag x) 12.8 25.7
ACYC— TDPE RPI (Histag x) 13.6 25.9
ACYC_CDPE_RPI (Histag O) 13.4 24.7
ACYC_TDPE_RPI (Histag 0) 13.1 25.9
ACYC_EDPE_RPI (Histag 0) 12.8 26.0 상기 표 12에서 확인할 수 있듯이 , 12개의 효소 반웅 전환 분석 결과, 효소 마다 약간의 차이는 있지만 평균적으로 과당으로부터 약 13% 정도의 전환율로 알로오스를 생산함을 확인할 수 있었다.
3-2. 50% (v/v) 과당으로부터 알로오스 생산 반응
과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여, 기질로 50%(v/v) 과당 lml 와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0, 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에, 실시예 2에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg/ml一 DCW 범위에서, 50 하에서 0 내 지 20시간 동안 반웅시키면서, 시간별 샘플링을 하여 알로오스 전환율을 측정하였 다. 그 결과를 표 13 및 도 18에 나타내었다.
【표 13】
Figure imgf000027_0001
상기 표 13에서 확인할 수 있듯이， 12개의 효소 반웅 전환 분석 결과, 효소 마다 약간의 차이는 있지만 평균적으로 과당으로부터 약 13% 정도의 전환율로 알로오스를 생산함을 확인할 수 있었다. 실시예 4. 융합 효소 플라스미드의 제조 및 형질전환
엔시퍼 아드해렌스 (Erai/er acZ/werera)로부터 유래된 사이코스 에피머화 효소 의 암호화 유전자를, 대장균에 최적화하여 변형한 형태의 폴리뉴클리오티드 (서열 번호 6)로 합성하고 EDPE라 명명하였다. 대장균에 최적화된 폴리뉴클리오티드， Persephone!!a marina EX-lil ^ gDNA에서 확보한 PRI의 암호화 유전자 (서열번호 10)을 PCR을 통해 각각의 주형으로 확보하였고, 이를 오버랩 PCR 법으로 하나의 주형으로 연결하였다 (서열번호 22). '
상기 하나의 주형으로 연결된 폴리뉴클레오타이드를 제한효소 Ndel과 Xh 을 사용하여 발현백터인 pET21 a의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 재조합 백터를 제조하였다ᅳ 상기 제조된 재조합 백터의 개열지도를 도 19에 '개시하였다. 그 다음, heat shock방법 (Sambrook and Russell: Molecular Cloning.)에 의하여 대 장균 BL21 (DE3)(invitrogen)를 상기 제작한 재조합 백터로 형질전환 하여 재조합 균주를 제조하였다.
상기 제조된 재조합 균주를 5ml LB-ampicilline 배지 (Difco)에 접종한 후 600nm에서의 흡광도 (OD)가 1.5에 도달할 때까지 37 °C , 200rpm에서 진탕 배양하고， 이를 다시 500ml LB-ampicilline 배지에 접종한 후 37 °C의 진탕 배양기에서 종 배 양하였다. 이 배양액의 600nm에서 흡광도가 0.5일 때 ImM의 IPTG(isopropyl-l - thio-p-D-galactopyranoside) - 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 상기 과 발현 유도 시점부터 배양조건을 16 °C 및 150rpm으로 전환하여 16시간 동안 유지 하였다. 이후 8000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체만올 회수하고, 0.85% (w/v) NaCl로 2회 세척한 다음 알로오스 생산 및 효소 정제에 사용하였다. 실시예 5. 융합 효소를 이용한 알로오스 생산 반웅 (효소 반웅)
5-1: 융합 효소의 정제 " 상기 실시예 4에서 회수된 균체를 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.0 300mM NaCl)에 흔탁시킨 후 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 4 °C 에서 20분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 13,000rpm으로 4°C에서 20분 동안 원 심분리하여 상등액을 회수하여 미리 lysis buffer로 평형 시킨 Ni-NTA컬럼 (Ni-NTA Superflow, Qiagen)에 적용시킨 다음 50mM Tris-HCl 300mM NaCl, pH 7.0에 20mM imidazd과 250mM imidaz 이 함유된 완층용액을 순차적으로 홀려주었다. 용출된 목적 단백질은 효소 활성 측정용 완충용액 (50mM Tris-HCl, pH7.0)으로 전환하여 다음 실험에 사용하였다. 상기 방법으로 부분 정제된 효소를 얻을 수 있었고, SDS-PAGE를 통하여 단량체의 크기가 약 47 kDa임을 확인하였다 (도 20).
5-2: 과당으로 부터 알로오스 생산
과당으로부터 알로오스 생산을 확인하기 위하여， 기질로 50%(v/v) 과당 1 ml와 50mM PIPES buffer (pH 7.0 또는 8.0， 각 효소의 최적 pH에서 수행) 용액에, 실시예 6에서 정제된 효소의 농도를 LOmg/ml 범위에서, 50°C에서 24시간동안 반 응시키면서, 시간별 샘플링을 하여 알로오스 전환율을 측정하였다. 그 결과를 표 14 및 도 21에 나타내었다.
【표 14】
Figure imgf000029_0001
상기 표 14 및 도 20에서 확인할 수 있듯이, 두 효소 반옹 분석 결과, 24시 간 동안 EDPE_RPI— FUSION은 약 13.4%, CDPE_RPI_FUSION은 약 13.1%의 전환율 로 알로오스를 생산하는 것을 확인하였다. 즉, 융합 효소의 경우 발현율은 감소하 였지만, 두 효소를 각각 발현시켜 반웅할 때와 전환율에 있어서는 유사한 평형 값 인 13%에 도달함을 확인하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1 ]
사이코스 에피머화 효소 (psicose epimerase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서 열 및 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재 조합 백터.
【청구항 2】
제 1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 백터.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 백터.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소를 암호화하는 뉴클레오타이 드 서열은 서열번호 5 내지 9로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하^ 것 인， 재조합 백터.
【청구항 5】
제 1항에 있어서, 상기 알로오스 이성질화 효소를 암호화하는.뉴클레오타이 드 서열은 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 것인， 재조합 백터.
【청구항 6】
거 U항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소 및 알로오스 이성질화 효소 는 링커 펩타이드로 연결된 하나의 융합 단백질인 것인, 재조합 백터.
【청구항 7】
거 16항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 상기 알로오스 이성질 화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 재조합 벡터.
【청구항 8]
제 6항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산으로 이루어 진 것인, 재조합 백터.
[청구항 9】
게 6항에 있어서， 상기 융합 단백질은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서 열을 포함하는 것인, 재조합 백터.
【청구항 10]
게 6항에 있어서, 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 22 또는 24의 염기서열을 포함하는 것인, 재조합 백터.
【청구항 1 1】
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 재조합 백터로 형질전환된 재조합 균 주, 상기 재조합 균주의 배양물 또는 이들의 흔합물을 포함하는, 과당 -함유 원료 로부터 알로오스 생산용 조성물.
【청구항 12】
제 1 1항에 있어서, 상기 조성물은 12 내지 15%의 전환율로 과당으로부터 알로오스를 생산하는 것올 특징으로 하는 것인, 조성물.
【청구항 13】
제 1 1항에 있어서, 상기 알로오스는 과당， 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량0 Λ 기준으로, 과당 60 내지 63 중량0 /0, 사이코스 24 내지 26 중량% 및 알로오스 12 내지 15 중량0 /0를 포함하는 흔합당 조성물의 형태인 것인, 조성물.
【청구항 14】
제 1 1항에 있어서, 상기 조성물은 구리 이온, 망간 이은, 칼슴 이온, 마그네 슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온， 코발트 이온, 철 이온， 알루미늄 이온, 및 칼슴 이 은으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 포함하지 않는 것인， 조 성물ᅳ
【청구항 15】
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 재조합 백터로 형질전환된 재조합 균 주, 상기 재조합 균주의 배양물, 또는 이들의 흔합물올 과당 -함유 원료와 반웅시 키는 단계를 포함하는 과당 -함유 원료로부터 알로오스 (allose)를 생산하는 방법.
【청구항 16】
제 15항에 있어서, 상기 방법은 과당으로부터 12 내지 15%의 전환율로 알 로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
【청구항 17]
제 15항에 있어서, 상기 알로오스는 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량0 /0 기준으로, 과당 60 내지 63 중량0 /0, 사이코스 24 내지 26 중량0 /0 및 알로오스 12 내지 15 중량%를 포함하는 흔합당 조성물의 형태인 것인, 방법.
【청구항 18]
제 15항에 있어서, 상기 반웅에 사용되는 과당의 농도는 10 내지 80%(w/v) 인 것인, 방법.
【청구항 19]
제 15항에 있어서, 상기 반웅은 pH 6 내지 9의 조건하에서 수행되는 것인， 방법.
【청구항 20】
제 15항에 있어서, 상기 반웅은 30 내지 80의 조건하에서 수행되는 것인, 방법.
【청구항 21】
제 15항에 있어서, 상기 방법은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이은, 마그네슴 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이은, 철 이온, 알루미늄 이온, 및 칼슘 이온 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이은을 첨가하는 단계를 포함하지 않는 것인, 방법.
【청구항 22]
사이코스 에피머화 효소 (psicose epimerase) 및 알로오스 이성질화 효소가 링 커 펩타이드로 연결된 융합 단백질을 포함하는 과당으로부터 알로오스 생산용 효 소.
【청구항 23】
제 22항에 있어서, 상기 사이코스 에피머화 효소는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 상기 알로오스 이성질화 효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 효소.
【청구항 24]
제 22항에 있어서, 상기 링커 펩타이드는 1 내지 6개의 아미노산 서열로 이 루어진 것인, 과당으로부터 알로오스 생산용 효소.
【청구항 25 ]
제 22항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 23 또는 25의 아미노산 서 열을 포함하는 것인, 과당으로부터 알로오스 생산용 효소.
[청구항 26】
제 22항에 있어서, 상기 효소는 과당으로부터 12 내지 15%의 전환율로 알 로오스를 생산하는 것을 특징으로 하는 것인, 효소.
【청구항 27】
생물학적 방법으로 생산되며, 과당, 사이코스 및 알로오스로 구성된 당류 조성물 100중량0 /。 기준으로, 과당 60 내지 63 중량0 /0, 사이코스 24 내지 26 중량0 /0 및 알로오스 12 내지 15 중량0 /0를 포함하는 흔합당 조성물.
PCT/KR2016/014059 2015-12-21 2016-12-01 과당으로부터 알로오스를 생산하는 균주 및 이를 이용한 알로오스 생산방법 WO2017111339A1 (ko)

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EP16879206.7A EP3401403A4 (en) 2015-12-21 2016-12-01 STRAIN PRODUCING ALLOSE FROM FRUCTOSE AND PROCESS FOR PRODUCING ALLOSE USING THE SAME
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190100386A (ko) 2017-01-06 2019-08-28 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. 당의 무세포 생산
KR102063908B1 (ko) * 2017-12-27 2020-01-08 씨제이제일제당 주식회사 신규 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법
KR102055875B1 (ko) * 2017-12-27 2019-12-13 씨제이제일제당 주식회사 신규 내열성 과당-6-인산 3-에피머화 효소 및 이를 이용한 알룰로스 제조방법
CN112501224B (zh) * 2020-11-26 2022-04-19 北京化工大学 一种利用d-葡萄糖生物合成d-阿洛糖的方法
CN114591939B (zh) * 2022-03-15 2023-11-28 天津科技大学 一种高耐热d-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090068710A1 (en) * 2005-03-04 2009-03-12 National University Corporation Kagawa University Complex crystalline sugar comprising d-psicose and d-allose and process for production of the same
KR20120004492A (ko) * 2009-03-30 2012-01-12 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤 목적으로 하는 헥소오스를 소정량 포함하는, 원료당과는 상이한 당 조성의 당 조성물의 제조 방법 및 제조된 당 조성물의 용도
KR20150076257A (ko) * 2012-10-30 2015-07-06 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤 D-알로오스의 생산 방법
KR20150076051A (ko) * 2013-12-26 2015-07-06 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법
US20150230509A1 (en) * 2010-09-29 2015-08-20 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. Composition for improving taste of high-intensity sweetener and application thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7244601B2 (en) * 1997-12-15 2007-07-17 National Research Council Of Canada Fusion proteins for use in enzymatic synthesis of oligosaccharides
KR20110035805A (ko) * 2009-09-30 2011-04-06 씨제이제일제당 (주) 사이코스-에피머화 효소의 고정화 및 이를 이용한 사이코스의 제조방법
US8679822B2 (en) * 2010-06-29 2014-03-25 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilization in recombinant zymomonas
KR101539096B1 (ko) * 2012-08-10 2015-07-24 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소 및 이를 이용한 사이코스로 전환용 조성물
CN102839184A (zh) * 2012-09-27 2012-12-26 江南大学 一种重组核糖-5-磷酸异构酶及其应用
KR101318422B1 (ko) * 2013-04-09 2013-10-15 주식회사 삼양제넥스 D-사이코스 에피머화 효소, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법
JP6774875B2 (ja) * 2013-09-03 2020-10-28 ロケット フレールＲｏｑｕｅｔｔｅ Ｆｒｅｒｅｓ Ｄ−プシコース ３−エピメラーゼの改良された変異体およびその使用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090068710A1 (en) * 2005-03-04 2009-03-12 National University Corporation Kagawa University Complex crystalline sugar comprising d-psicose and d-allose and process for production of the same
KR20120004492A (ko) * 2009-03-30 2012-01-12 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤 목적으로 하는 헥소오스를 소정량 포함하는, 원료당과는 상이한 당 조성의 당 조성물의 제조 방법 및 제조된 당 조성물의 용도
US20150230509A1 (en) * 2010-09-29 2015-08-20 Matsutani Chemical Industry Co., Ltd. Composition for improving taste of high-intensity sweetener and application thereof
KR20150076257A (ko) * 2012-10-30 2015-07-06 마쓰다니가가꾸고오교가부시끼가이샤 D-알로오스의 생산 방법
KR20150076051A (ko) * 2013-12-26 2015-07-06 주식회사 삼양제넥스 사이코스 에피머화 효소를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 이용하는 사이코스 생산방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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