CN104769109A

CN104769109A - D-阿洛糖的生产方法

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Publication number: CN104769109A
Application number: CN201380057161.8A
Authority: CN
Inventors: P·K·古洛帕利; 新谷知也; 西本幸史; 原园幸一
Original assignee: NAGASE INDUSTRIAL Co Ltd; Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Nagase Chemtex Corp
Current assignee: NAGASE INDUSTRIAL Co Ltd; Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Nagase Chemtex Corp; Nagase and Co Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2015-07-08
Also published as: EP2918677A1; US20150284759A1; EP2918677B1; JPWO2014069537A1; WO2014069537A1; JP6209526B2; KR20150076257A; EP2918677A4

Abstract

本发明提供一种安全性高的微生物所产生的具有由D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的酶蛋白质。下述(a)至(c)中任一记载的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质。(a)由来自属于链霉菌属的微生物710株(保藏号：NITE BP-01423)的序列号1或来自微生物720株(保藏号：NITE BP-01424)的序列号2所记载的氨基酸序列构成的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质；(b)由序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被置换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列构成的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质；(c)由与序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列构成的具有将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的活性的蛋白质。

Description

D-阿洛糖的生产方法

技术领域

本发明涉及由来自属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物的序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列构成的蛋白质的新型用途，即将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的酶的用途。

本发明明确了属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物生产的上述酶所具有的催化糖异构化反应的催化剂功能，涉及利用该新型催化剂功能生产D-阿洛糖的技术。

背景技术

单糖类根据还原基(羰基)的状态可以大致分为醛糖(具有醛基作为羰基的糖)、酮糖(具有酮基作为羰基的糖)、糖醇(别名：多元醇，不具有羰基的糖)。单糖类中具有被称为“稀少糖”的糖。稀少糖根据国际稀少糖学会的定义被定为自然界只稀少地存在的糖，根据其种类，多数有机化学合成方法中的收率也少。因此，现状是寻求包括阿洛糖的己醛糖(醛糖)稀少糖的有效的制造方法的开发和其特异的性质。

已知稀少糖具有生理活性。例如，公开了以D-阿洛糖的衍生物为有效成分的抗肿瘤剂(专利文献1)，利用糖类对活性氧的性质的情况，例如，已知有含有具有抑制活性氧的性质的多糖类的活性氧产生抑制剂(专利文献2)。

阿洛酮糖是具有酮基作为还原基的六碳糖，近年来，由于表异构酶的出现而成为比较容易得到的糖。暗示了D-阿洛酮糖能够有效地利用为甜味料、发酵用碳源、试剂、化妆品·医药品的原料·中间体等。阿洛酮糖的作为试剂·医药品等的中间原料的应用例，例如，报告有以D-阿洛酮糖作为原料的乙内酰脲衍生物的合成例(非专利文献1)。

D-阿洛糖可以由D-阿洛酮糖制造。例如，与利用了作为能够由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的酶的异构酶的D-阿洛糖的制造相关的专利文献中，例如有一种精制稀少糖的大量生产方法，其特征在于，通过对异构化进行催化的酶的作用由基质稀少糖转换为目标稀少糖，通过模拟移动床将得到的原液连续地色谱分离为目标稀少糖组分(专利文献3)。或者，提出了使来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(IPODFERM BP-08593)的具有L-鼠李糖异构酶活性的蛋白质作用异构化为D-阿洛糖的D-阿洛糖的生产方法(专利文献4)。

另外，提出了使D-木糖·异构酶作用于含有D-阿洛酮糖和/或L-阿洛酮糖的溶液，由D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖和D-阿卓糖，由L-阿洛酮糖生成L-阿卓糖，采集选自这些D-阿洛糖、D-阿卓糖以及L-阿卓糖中的1种或2种以上的己醛糖的己醛糖的制造方法(专利文献5)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特公昭59-40400号

专利文献2：日本特开平07-285871号公报

专利文献3：日本特开2006-153591号公报

专利文献4：日本特开2008-109933号公报

专利文献5：日本特开2002-17392号公报

专利文献6：国际公开WO2007-058086号

专利文献7：美国专利5,620,960(1999)

专利文献8：日本特开2009-153516号公报

非专利文献

非专利文献1：Tetrahedron,47,No.12/13,p2113(1991)

非专利文献2：J.Bacteriol.,73:410-414(1956)

非专利文献3：J.Biosci Bioeng.,96:89-91(2003)

非专利文献4：Davis et al.,BASIC METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,1986

非专利文献5：Methods Carbohydr.Chem.,1:102-104(1962)

非专利文献6：Carbohydr.Res.,24:192-197(1972)

非专利文献7：J.Ferment Bioeng.,8:539-541(1998)

非专利文献8：J.Mol.Biol.,300:917-933(2000)

发明内容

发明所要解决的技术问题

一直以来虽然开发了由各种微生物制造D-阿洛糖的技术，但是由于该微生物的安全性方面有问题，所以难以在D-阿洛糖的生产中实用化。因此，一直以来寻求使用来自安全性没有问题的微生物的酶生产稀少糖。

关于稀少糖的制造，例如，已知有通过利用来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)的D-己酮糖3-表异构酶可以由D-果糖制造D-阿洛酮糖。然而，由于菊苣假单胞菌是植物病原性微生物，因此，不能说其适合利用于食品用途。也提出了通过属于根瘤菌属的微生物来制造D-阿洛酮糖(专利文献6)，但是属于根瘤菌属的微生物也是植物病原性微生物，作为用于食品用途的菌不优选。另外，这些技术都是生产D-阿洛酮糖的技术，不是生产D-阿洛糖的而技术。

为了解决与这样的现有技术的安全性相关的问题，本发明的目的在于从能够推测出确认能用于制造食品时的现有的添加物名单收载品种目录中所收载的菌种且几乎没有毒性的菌种中，取得以高收率对由D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖进行催化的异构酶，并提供使用了该酶的D-阿洛糖的制造方法。

另外，本发明提供一种通过由可以作为现有的添加物对食品的制造没有问题地使用的可能性高的放线菌得到的新型的酶来制造D-阿洛糖的方法。

解决技术问题的技术手段

本发明者们寻求没有作为这样的现有技术的技术问题的安全性相关的担忧的生产D-阿洛糖的微生物、即微生物生产的该酶，进行了重复研究，由此，完成了本发明。即，本发明是基于从土壤中分离放线菌制作库，从其中发现了具有从D-阿洛酮糖转换为D-阿洛糖的作用的酶而成的。由于放线菌可以作为现有的添加物酶的起源微生物食品制造上没有问题地使用的可能性高，因此，由放线菌得到的异构酶能够作为非常有用的D-阿洛糖的大量生产的手段。

即，本发明以以下的(1)～(3)中记载的具有活性的蛋白质为要点。

(1)一种蛋白质，其中，具有如下的活性：识别醛糖C1的CHO基团和C2的OH基团并进行反应，将C1的CHO基团转变为OH基团，将C2的OH基团转变为CO基团；或者识别酮糖C1的OH基团和C2的CO基团并进行反应，将C1的OH基团转变为CHO基团，将C2的CO基团转变为OH基团；

并且，所述蛋白质是下述(a)至(c)中任一记载的蛋白质：

(a)由序列号1或序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由序列号1或序列号2所示的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被置换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列构成的蛋白质；

(c)由与序列号1或序列号2所示的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质。

(2)如上述(1)所述的蛋白质，其中，将酮糖的D-阿洛酮糖异构化为醛糖的D-阿洛糖。

(3)如上述(1)或(2)所述的蛋白质，其中，所述蛋白质是由以下(d)～(f)的物理化学性质特定的，

(d)作用pH和最适pH，

作用pH为6.0～11.0，最适pH为9.0；

(e)作用温度和最适温度，

作用温度为10～80℃，最适温度为60℃；

(f)对于L-鼠李糖、D-木糖、D-核糖、D-阿洛糖、D-葡萄糖以及L-阿拉伯糖有反应性。

另外，本发明的要点还在于(4)所记载的DNA、(5)所记载的重组载体、(6)所记载的宿主细胞、以及(7)所记载的重组蛋白质的制造方法。

(4)一种来自链霉菌(Streptomyces sp.)710(保藏号：NITEBP-01423)或链霉菌(Streptomyces sp.)720(保藏号：NITE BP-01424)的DNA，其中，编码由序列号3或序列号4所示的碱基序列或其互补序列、或者包含这些序列的一部分或全部的序列构成的权利要求1或2所述的蛋白质。

(5)一种重组载体，其中，包含上述(4)所述的DNA。

(6)一种宿主细胞，其中，包含能够表达上述(1)、(2)或(3)所述的蛋白质的表达体系。

(7)一种重组蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述(6)所述的包含表达体系的宿主细胞，从得到的培养物中采取上述(1)、(2)或(3)所述的重组蛋白质。

另外，本发明的要点还在于以下(8)至(12)的D-阿洛糖的生产方法。

(8)一种D-阿洛糖的生产方法，其特征在于，使上述(1)、(2)或(3)所述的蛋白质作用于D-阿洛酮糖，将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖。

(9)如上述(8)所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，D-阿洛酮糖是将D-果糖表异构化来生产的。

(10)如上述(8)所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，D-阿洛酮糖是将D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产的。

(11)如上述(8)所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，D-阿洛酮糖是由未利用资源得到D-葡萄糖，将该D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产的。

(12)如上述(8)～(11)中任一项所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，作为目标的D-阿洛糖为D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合物。

发明的效果

根据本发明，即通过使用来自属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物的酶蛋白质，从而能够识别醛糖C1的CHO基团和C2的OH基团并进行反应，将C1的CHO基团转变为OH基团，将C2的OH基团转变为CO基团；或者识别酮糖的C1的OH基团和C2的CO基团并进行反应，将C1的OH基团转变为CHO基团，将C2的CO基团转变为OH基团，优选能够由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖。本发明可以提供由来自属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物的序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列构成的酶，所述酶识别醛糖C1的CHO基团和C2的OH基团并进行反应，将C1的CHO基团转变为OH基团，将C2的OH基团转变为CO基团；或者识别酮糖的C1的OH基团和C2的CO基团并进行反应，将C1的OH基团转变为CHO基团，将C2的CO基团转变为OH基团，优选将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖，另外，通过使用所述酶可以生产D-阿洛糖。

根据本发明，能够使用菌体培养物的安全性非常高的菌是很大的技术进步，将D-阿洛酮糖异构化生产D-阿洛糖的酶及其制造方法的确立不仅在制糖产业，在与其相关的食品、化妆品、医药品产业中的工业意义也极大。另外，本发明能够以最廉价可以大量取得的D-葡萄糖、或者果糖为原料经由D-阿洛酮糖制造D-阿洛糖。

附图说明

图1是表示实施例1的重组型异构酶的构成(限制性酶切图)的图。

图2是表示金属离子对本发明的酶活性产生的影响的图。

图3是表示温度对最适酶活性产生的影响(a)与保温1小时后的稳定性(b)的图。

图4是表示pH对最适酶活性产生的影响(a)与保温24小时后的稳定性(b)的图。

图5表示本发明的酶的基质特异性的图。

图6表示反应前(D-阿洛酮糖)和反应后(D-阿洛酮糖、D-阿卓糖、D-阿洛糖混合液)的HPLC分析的图。

具体实施方式

D-阿洛糖是非常有用的稀少糖之一，对癌细胞的增殖抑制产生重要的作用。Arnold和Silady报告了D-阿洛糖不产生其它有害的临床影响，实质上阻碍分叶核嗜中性白细胞的产生，降低血小板数(专利文献7)，还报告了阻碍活性氧的产生(非专利文献3)。对于D-阿洛糖，这几年特别是对抗癌作用进行了多种研究。因此，本发明者们以从能够用于食品制造的安全菌种中得到将D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的酶作为能够大量且安全地制造该有用的D-阿洛糖的方法为目的，进行了专门研究。

作为对由D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的反应进行催化的酶之一，有L-鼠李糖异构酶(L-RhI，E.C：5.3.1.14)，其为对可逆地异构化为作为与L-鼠李糖对应的酮糖的L-鼠李树胶糖(L-rhamnulose)的反应进行催化的酶，在大肠杆菌(Escherichia coli)(非专利文献2)中被人所知，但是不能说是哪个安全地用于食品制造中的菌。

因此，本发明者们为了确立能更容易地生产该产业上有希望的D-阿洛糖的方法，从土壤中分离放线菌制作库，从该库中探索生产由D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的异构酶的菌。

作为本发明中的能够由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的酶，使用上述具有来自属于链霉菌属(Streptomyces)的微生物的序列号1或来自微生物的序列号2所记载的氨基酸序列的具有由D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的活性的蛋白质。

通常可以从得到的培养菌体中提取作为目标的酶直接用于反应，但优选以固定化后的形态使用。作为固定化的对象的具有上述活性的酶本身可以是根据使用目的不一定经过高纯度精制的酶，即使是粗酶也可以使用。作为粗酶的具体例子，可以使用具有生产有上述活性的酶的能力的微生物本身，另外，可以使用其培养物或部分精制后的培养物。

上述固定化酶可以例如对作为本发明的目标的酶通过载体结合法、交联法或者包埋法等规定的方法进行固定化来使用。其不限定于酶，可以通过将菌体本身或粗酶相对于树脂等载体进行固定化等而得到。通过固定化，可以得到到此为止1周左右的稳定性能保持数个月的稳定性的固定化酶。

例如，通过在将作为本发明的目标的酶和/或微生物利用载体结合法中之一的共价结合法固定化后得到的固定化酶和/或固定化微生物中通入含有50％乙醇的D-阿洛酮糖溶液，将稳定控制为反应时为42℃、结晶化时为4℃，由此可以连续地制造D-阿洛糖的结晶。另外，通过不对该结晶化后的滤液进行乙醇除去、浓缩而将其再次通入上述固定化酶和/或固定化微生物中，可以再次连续地制造D-阿洛糖。

这是通过在D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合溶液中添加乙醇从而可以仅仅分离D-阿洛糖的划时代的方法，而且也不需要除去用于酶反应的缓冲液，从而具有如下非常大的优点：大幅度地节省分离过程，可以高效化。在将50％D-阿洛酮糖作为原料以酶反应生产D-阿洛糖的情况下，由于作为35％D-阿洛酮糖和15％D-阿洛糖的混合溶液得到了产物，因此，能够迅速地从酶反应产物中分离D-阿洛酮糖和D-阿洛糖，从而得到高纯度的D-阿洛糖。

在本发明中，例如，由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的情况下的酶反应通常以下述的条件进行。即，作为基质含有D-阿洛酮糖的溶液通常使用水溶液，其基质浓度可以从1～60w/v％、优选为10～50w/v％、更加优选为20～40w/v％的范围适当选择。酶反应温度可以从酶不失活的温度，例如10～85℃、优选为40～80℃、更加优选为最适温度60℃中进行选择。同样地，酶反应pH可以从6.0～11.0、更加优选为最适pH9.0中进行选择。酶活性可以从每克基质为1单位以上、以外50～5,000单位的范围内进行选择。反应时间根据使用的基质量、酶量、温度、pH条件等而变动，如果以不采用固定化酶而采用分批式的情况为例，则考虑到经济性，优选在约2～100小时、优选为约5～50小时的范围内进行。

本发明涉及一种D-阿洛糖的生产方法，其特征在于，使下述(a)至(c)中任一记载的具有活性的蛋白质作用于D-阿洛酮糖将其异构化为D-阿洛糖，即，通过安全性高的放线菌所产生的由D-阿洛酮糖生产D-阿洛糖的酶，从D-阿洛酮糖制造D-阿洛糖。

(a)由序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列构成的具有上述活性的蛋白质；

(b)由序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基被置换、添加、插入或缺失而成的氨基酸序列构成的具有上述活性的蛋白质；

(c)由与序列号1或序列号2所记载的氨基酸序列具有60％以上的同源性的氨基酸序列构成的具有上述活性的蛋白质。

上述蛋白质的L-鼠李糖异构酶活性是由以下(d)～(f)的物理化学性质来特定的。

(d)作用pH和最适pH，

作用pH为6.0～11.0，最适pH为9.0；

(e)作用温度和最适温度，

作用温度为10～80℃，最适温度为60℃；

[D-阿洛酮糖]

本发明中使用的D-阿洛酮糖可以用各种方法进行制造，例如，可以列举将D-果糖表异构化来生产；将D-葡萄糖异构化(Isomerization)转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化(Epimerization)来生产；由未利用资源得到D-葡萄糖，将该D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产D-阿洛酮糖等。

通过实施例来进一步详细地说明本发明，但是本发明并没有被任何实施例限定。

实施例1

[具有由D-阿洛酮糖转变为D-阿洛糖的能力的酶的生产菌株的取得]

将0.1g由环境采取的土壤悬浊于1mL灭菌蒸馏水中。用灭菌蒸馏水将该悬浊液稀释50倍，将其中0.1mL接种于放线菌分离培养基中，在30℃下培养3天。提取出现的菌落(约200株)。放线菌分离培养基使用了表1的组成的放线菌培养基。

[表1]

接着，将得到的约200菌株分别接种于试管中加入了下述所示的生产培养基5mL中，在28℃、振荡速度为220rpm的条件下进行振荡培养。培养第7天将各个培养液回收于各15mL的离心管中，以9000rpm用HITACHI微量高速离心机(CF15RXII型)离心10分钟之后，废弃上清液。用蒸馏水将菌体清洗1次，再次进行离心，废弃上清液。将各个菌体悬浊于2mL的40mM Tris-马来酸缓冲液(pH7.0)中，通过HEAT SYSTEM公司的Astrason超声波细胞破碎机(W385)、占空因数(DUTY CYCLE)50％、输出控制刻度5来进行20秒间2次超声波处理。将破碎溶液以9000rpm离心10分钟，回收各个上清液作为粗酶液。将该粗酶液的蛋白质浓度调节为0.10mg/50μL的样品作为“酶样品”，以下用于酶活性测定。

[生产培养基组成]

分别将糖培养基(1.0％D-阿洛酮糖、0.1％D-塔格糖、0.1％甘油)和矿物质培养基(0.26％硫酸铵、0.24％磷酸二氢钾、0.56％磷酸氢二钾、0.01％硫酸镁7水合物、0.05％酵母提取物：pH7.0)在121℃下灭菌处理20分钟，将各等量无菌混合制备。

[酶活性的确认方法]

使用上述方法中得到的酶样品，各酶样品的异构酶活性通过HPLC法或/和半胱氨酸咔唑法(Cysteine Carbazole法)进行确定。

HPLC法：以表2所示的组成使之酶反应之后，在100℃下处理2分钟由此使酶反应停止，冷却至室温再通过离子交换树脂和过滤器实施精制处理，作为供给HPLC的样品。将该HPLC用样品提供给三菱化学株式会社制造的CK08EC柱(80℃)，以流速0.4mL/min的纯水使之洗脱，用Tosoh Corporation制造的检测器RI-8020测定生成的糖组成。

半胱氨酸咔唑法：以表2所示的组成使之反应之后，在100℃下将反应液处理2分钟由此使酶反应停止，冷却至室温再向500μL的酶反应溶液中加入50μL的10％三氯乙酸，使反应停止。在该样品550μL中加入100μL半胱氨酸溶液和3mL的70％硫酸，在20℃下保温1分钟之后，进一步加入100μL的咔唑溶液，在35℃下加热20分钟，测定540nm的吸光度，由此来测定生成的糖组成。

[表2]

(酶活性确认时的反应条件)

通过上述一系列的步骤，得到了作为目标的酶活性高的2株(链霉菌(Streptomyces sp.)710株和链霉菌(Streptomyces sp.)720株。属由16SrRNA碱基序列进行鉴定。)。这些菌株链霉菌(Streptomycessp.)710株和链霉菌(Streptomyces sp.)720株分别在平成24年(2012年)10月10日(原保藏日)以保藏号NITE BP-01423、NITE BP-01424基于布达佩斯条约被国际保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(NITE，千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)中，由其中能够得到。另外，保藏的710株在平成25年(2013年)10月7日由国内保藏(原保藏)基于布达佩斯条约请求移管为国际保藏，720株在平成25年(2013年)10月30日由国内保藏(原保藏)基于布达佩斯条约请求移管为国际保藏，并被接收。而且，对于这2株在平成25年(2013年)10月30日发放了国际保藏的保藏证明。

实施例2

由链霉菌(Streptomyces sp.)710株和链霉菌(Streptomyces sp.)720株进行鸟枪克隆。

[链霉菌(Streptomyces sp.)710株(或720株)的染色体的制备]

将链霉菌(Streptomyces sp.)710株(或720株)用加入有0.5％甘氨酸的胰蛋白酶大豆肉汤培养基(Becton,Dickinson and Company制造)(50mL)在30℃下以160rpm培养2天，通过离心分离(3,000rpm、10分钟、4℃)回收菌体。用TS缓冲液(10.3％蔗糖、50mM Tris缓冲液(pH8.0)、25mM EDTA·2Na)(30mL)清洗菌体，再次通过离心分离(3,000rpm、10分钟、4℃)回收菌体。接着，在菌体中加入0.5％溶菌酶和加0.002％N-乙酰胞壁质酶的TS缓冲液(10mL)，在37℃下静置60分钟。在成为原生质体状的菌体溶液中加入10％SDS水溶液(2.4mL)和加2mg/mL蛋白酶K的TS缓冲液(0.4mL)，缓慢搅拌之后，在37℃下静置60分钟，进一步在50℃下静置30分钟。向其中加入5M氯化钠水溶液(2mL)和加热至65℃的10％鲸蜡基三甲基溴化铵的0.7M氯化钠水溶液(1.6mL)，缓慢搅拌之后，在65℃下静置20分钟。然后，加入氯仿：异戊醇溶液(24:1，20mL)，用移液器进行搅拌。进行离心分离(12,000rpm、10分钟、4℃)之后，在上层中加入上层的0.6倍量的异丙醇，回收生成的沉淀。将沉淀用70％乙醇清洗，进行真空干燥。真空干燥后，使沉淀溶解于加入有Rnase(0.5mg)的TE缓冲液(10mM Tris缓冲液(pH8.0)、1mM EDTA·2Na)中，制备链霉菌(Streptomyces sp.)710株(或720株)的染色体溶液(在4℃下保存)。

实施例3

[染色体的部分分解]

在链霉菌(Streptomyces sp.)710株(或720株)的染色体溶液(40.4μL)中加入10×H缓冲液(TAKARA BIO INC.制造)(4.6μL)和0.25单位的限制酶Sau3AI，在37℃下静置40分钟。加入0.5M EDTA水溶液(50μL)，用0.5％低熔点琼脂糖凝胶进行电泳，切出包含23kb以上的DNA片段的琼脂糖凝胶组分。将切出的凝胶块放入蒸馏水(50mL)，缓慢振荡15分钟，再一次重复相同的操作。相对于凝胶块的重量，以最终浓度成为1×的方式加入10×β-琼胶酶的缓冲液，在68℃下静置直至熔融。使之熔融之后，在40℃下静置10分钟，加入β-琼胶酶(每0.5g凝胶为3单位)，在40℃下静置60分钟。然后，加入5M氯化钠水溶液以使最终浓度成为0.5M，在冰上静置15分钟，进行离心分离(15,000rpm、15分钟、4℃)之后，在上清液中加入上清液的3倍量的乙醇。在-80℃下静置10分钟之后，进行离心分离(15,000rpm、15分钟、4℃)，在生成的沉淀中加入70％乙醇，进行离心分离(15,000rpm、15分钟、4℃)。将沉淀真空干燥之后，溶解于蒸馏水(8μL)中。向其中加入10×碱性磷酸酶缓冲液(1μL)和碱性磷酸酶(1μL)，在37℃下静置60分钟。接着，加入蒸馏水(90μL)和苯酚：氯仿：异戊醇水溶液(25:24:1、100μL)，进行搅拌之后，进行离心分离(15,000rpm、10分钟、25℃)。在上层中加入上层的3倍量的乙醇。在-80℃下静置10分钟之后，进行离心分离(15,000rpm、15分钟、4℃)，在生成的沉淀中加入70％乙醇，进行离心分离(15,000rpm、15分钟、4℃)。将该包含链霉菌(Streptomyces sp.)710株(或720株)的染色体的部分分解DNA片段的沉淀真空干燥之后，溶解于蒸馏水(5μL)中。

实施例4

[链霉菌(Streptomyces sp.)710株(或720株)染色体的粘粒文库的制作]

用限制性酶BamHI分解放线菌-大肠杆菌穿梭粘粒载体pTOYAMAcos(尾仲宏康(Hiroyasu Onaka)等人，《The Journal ofAntibiotics(J.Antibiotics)》，2003年，56卷，950-956页中记载)10μg，用琼脂糖进行电泳，切出包含8.3kb的DNA片段的琼脂糖凝胶组分。由切出的凝胶块用GENECLEAN试剂盒(Q-Biogene公司制造)对DNA进行精制，溶解于蒸馏水(2.5μL)中。向其中加入实施例中得到的链霉菌(Streptomyces sp.)XP-710株和XP-720株的染色体的部分消化DNA片段水溶液(5μL)，并加入Ligation试剂盒(TAKARA BIO INC.制造)(7.5μL)，在16℃下静置17小时。接着，将该Ligation溶液中的质粒通过Gigapack III包装提取物试剂盒(Stratagene公司制造)导入接合性大肠杆菌中。用加有羧苄青霉素(50μg/L)的LB琼脂培养基在30℃下培养加入有质粒的大肠杆菌2天，从繁殖的转化体(大肠杆菌)中提取1,000菌落，用其它的加入有羧苄青霉素(50μg/L)的LB琼脂培养基在30℃下培养1天。

实施例5

[从大肠杆菌粘粒文库向放线菌中导入质粒]

将实施例4中取得的加入有粘粒质粒的大肠杆菌1,000菌落分别每1菌落用加有卡那霉素(50μg/L)的LB培养基(5mL)在30℃下进行培养直至吸光度660nm成为0.6。将该培养液(2mL)移至灭菌后的Eppendorf管中，进行离心分离(3,000rpm、5分钟、4℃)。将上清液倾析之后，加入LB培养基(1mL)剧烈搅拌，清洗菌体。进行离心分离(3,000rpm、5分钟、4℃)，将上清液倾析之后，进一步再重复2次相同的操作。加入LB培养基(0.5mL)将菌体悬浊。另外在容易完成灭菌的Eppendorf管中将变青链霉菌(Streptomyces lividans 1326株(NBRC号：15675))的孢子悬浊液(1μL)和加入有质粒的接合性大肠杆菌的悬浊液(0.1mL)充分混合，扩展为放线菌培养基“DAIGO”No.4(日本制药公司制造)。在30℃下培养18小时之后，重叠加入有硫链丝菌素(167μg/mL)和萘啶酸钠(67μg/mL)的营养肉汤(Becton,Dickinson and Company制造)琼脂培养基(琼脂0.5％、3mL)，进一步持续培养3天。取得繁殖的菌落(对于1个大肠杆菌取得1个菌落)。

实施例6

[具有异构酶生产能力的重组放线菌的取得]

将实施例5中制作的1,000菌落分别接种于500mL三角烧瓶中所加入的上述所示的培养基50mL，在28℃、转速160rpm的条件下进行旋转培养。在培养第3天将各个培养液回收于50mL离心管中。用HITACHI微量高速离心机(CF15RXII型)以9000rpm离心10分钟之后，废弃上清液。用蒸馏水将菌体清洗1次，再次进行离心，废弃上清液。将各个菌体悬浊于40mM Tris-马来酸缓冲液(pH7.0)30ml中。通过HEAT SYSTEM公司的Astrason超声波细胞破碎机(W385)、占空因数(DUTY CYCLE)50％、输出控制刻度5来进行20秒间2次超声波处理。将破碎溶液以9,000rpm离心10分钟，回收各个上清液。用Sartorius K.K.的Minisart 1.2μm进行膜过滤，得到各个粗酶液(1,000菌落分)。

用上述记载的方法确定了这些粗酶液的活性，结果在1个菌落的粗酶液中确认有活性。

对该菌落的粘粒文库的DNA序列进行分析，结果由于确认有不能推测机能的结构基因序列，因此，尝试进行该结构基因的表达。

实施例7

在本例中，使用接合型放线菌质粒pTONA4(专利文献8)，将PCR片段导入质粒pTONA4中，在变青链霉菌(Streptomyces lividans 1326株(NBRC号：15675))中使之表达，得到图1所示的重组型异构酶的构成(限制性酶切图)。

使用商品名“InstaGene(商标)Matrix”(BIO-RAD公司制造)，从链霉菌(Streptomyces sp.)710株和720株中分别分离出基因组DNA。合成正向引物(序列号5)和反向引物(序列号6)。使用上述2种引物，进行将链霉菌(Streptomyces sp.)710株基因组DNA作为模板的PCR反应。另外，所述PCR反应使用商品名“Phusion DNAPolymerase”(FINNZYMES公司制造)，1循环(依次在98℃下进行10秒、在58℃下进行10秒、在72℃下进行2分钟)并进行35次循环。对通过所述PCR反应所得到的PCR片段用限制性酶Ndel和HindIII进行处理。另外，还用限制性酶Ndel和HindIII对所述接合型放线菌质粒pTONA4进行处理。将得到的2种片段相互连接之后，导入变青链霉菌(Streptomyces lividans 1326株(NBRC号：15675))中，得到XGP-710株。得到的PCR片段用DNA测序仪进行分析，确定碱基序列，确认为与序列号3完全相同。

另外，合成正向引物(序列号7)和反向引物(序列号8)。使用所述2种引物，进行将链霉菌(Streptomyces sp.)720株基因组DNA作为模板的PCR反应，以下进行与上述相同的操作，得到XGP-720株。得到的PCR片段用DNA测序仪进行分析，确定碱基序列，确认与序列号4完全相同。将序列号5～8的引物示于表3中。

[表3]

接着，对含有上述表达体系而成的宿主细胞进行培养，得到粗酶液。

在2个加入于500mL三角烧瓶中的TSB培养基50mL中分别接种XGP-710株和XGP-720株，在28℃、转速160rpm的条件下进行旋转培养。在培养第3天将各个培养液回收于50mL离心管中。用HITACHI微量高速离心机(CF15RXII型)以9000rpm离心10分钟之后，废弃上清液。用蒸馏水将菌体清洗1次，再次进行离心，废弃上清液。将各个菌体悬浊于30ml的40mM Tris-马来酸缓冲液(pH7.0)中。通过HEAT SYSTEM公司的Astrason超声波细胞破碎机(W385)、占空因数(DUTY CYCLE)50％、输出控制刻度(OUTPUT CONTROL)5来进行20秒间2次超声波处理。将破碎溶液以9000rpm离心10分钟，回收各个上清液。用Sartorius K.K.公司的Minisart 1.2μm进行膜过滤，得到各个粗酶液(XGP-710粗酶液和XGP-720粗酶液)。

实施例8

D-阿洛糖可以通过化学或生物学的方法进行生产，作为化学方法，由D-核糖进行生产(非专利文献5)，或通过将1,2:5,6-二-O-异亚丙基-α-D-己酮呋喃核糖-3-酮还原而得到(非专利文献6)；作为酶的方法，通过利用来自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)LL172的L-核糖异构酶(L-RhI)可以由D-阿洛酮糖进行生产(非专利文献7)。

在本发明中，研究由链霉菌(Streptomyces)属得到的异构酶的特性。

(1)本发明的酶的反应性

首先，研究本发明的酶对于各基质的反应性。

作为基质，分别使用作为醛糖的L-鼠李糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-阿洛糖，在上述酶活性反应条件下使之反应之后，将得到的各个反应液按照半胱氨酸咔唑法(CysteineCarbazole法)测定酶活性。其结果，对于L-鼠李糖的基质活性高，其次，对于D-木糖、D-核糖、D-阿洛糖、D-葡萄糖以及L-阿拉伯糖的基质反应活性高(图5)。

(2)金属对本发明的酶活性产生的影响

接着，为了研究金属离子对异构酶活性的影响，将酶部分透析进行酶活性的测定。透析通过将粗酶液加入纤维素膜中，浸入含有20mMEDTA的甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0)中，用16小时缓慢搅拌该缓冲液来进行，除去其它金属离子的影响。在各种二价离子存在下(表4的反应条件下)进行反应之后，通过半胱氨酸咔唑法测定由此得到的酶蛋白的酶活性。

其结果，MnCl₂使本发明的酶活性显著上升，本发明的酶显示金属依赖性，另一方面，MgSO₄、MgCl₂、CoCl₂使其活性稍稍上升。可知CaCl₂、BaCl₂、ZnCl₂、CuSO₄阻碍其活性(图2)。

报道了大肠杆菌(E.coli)中表达的L-RhI为了显示其酶活性需要Mn²⁺或Zn²⁺(非专利文献8)。

[表4]

(确认金属离子的影响时的反应条件)

(3)温度对本发明的酶活性产生的硬性(最适温度)

接着，研究温度对本发明的酶活性产生的影响。

通过将表5的条件中的反应温度随时改变为10、20、30、40、50、60、70、80、90℃进行酶反应之后，用半胱氨酸咔唑法进行测定来确定酶活性。

其结果，本发明的酶活性的最适温度为60℃(图3a)。

[表5]

(确认温度的影响时的反应条件)

(4)本发明的酶活性的耐热性

接着，研究本发明的酶活性的耐热性。

将各酶液在甘氨酸-NaOH缓冲液(pH9.0)中的各温度条件(10、20、30、40、50、60、70、80℃)下保温1小时，在上述条件下进行酶反应之后，通过半胱氨酸咔唑法来测定其残留的酶活性。

其结果，60℃下保温1小时后还残留约80～90％的酶活性(图3b)。

(5)pH对本发明的酶活性产生的影响(最适pH)

接着，研究pH对本发明的酶活性产生的影响。

具体来说，在各pH缓冲溶液(50mM柠檬酸缓冲液(pH3.0～6.0)、50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0～8.0)、50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0～9.0)、50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0～11.0))中将酶液在4℃下静置24小时后，在表6的反应条件下进行酶反应，通过半胱氨酸咔唑法(Cysteine Carbazole法)测定残留的酶活性。此时由D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖的反应条件示于下表中。

其结果，可知本发明的酶的最适pH为pH9.0(图4a)，在pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的酶活性更稳定(图4b)。

[表6]

(确认pH的影响时的反应条件)

(6)本发明的酶催化的反应的平衡点处各稀少糖的生成率

接着，本发明的酶分别将作为醛糖的L-鼠李糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-阿洛糖作为基质，在表7的反应条件下使之反应(但是，反应时间为6～48小时)，通过HPLC法测得达到平衡点时所得到的反应液的糖组成。

[表7]

(将各醛糖作为基质达到平衡点的反应条件)

在表8中表示使本发明的酶(XGP-720酶液)作用于各醛糖时的酮糖和醛糖的生成率。

[表8]

a在全部情况下首先发现酮糖的生成。

b生成率表示达到平衡点时的醛糖(残留的基质)：酮糖(生成物)：醛糖(生成物)。

(7)D-阿洛酮糖与D-阿洛糖间的异构酶反应

接着，研究由D-阿洛酮糖到D-阿洛糖的异构酶反应。

在表9的反应条件下进行酶反应，通过HPLC法测定糖组成。将反应前(0小时，D-阿洛酮糖)和反应后(24小时反应后的D-阿洛酮糖、D-阿卓糖、D-阿洛糖混合液)的HPLC分析结果示于图6中。

其结果，将D-阿洛酮糖作为基质开始酶反应时，如之前将各醛糖作为基质时的转换率所示，可以确认本发明的酶以D-阿洛酮糖：D-阿洛糖：D-阿卓糖＝66:33:1的比率由D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖。

[表9]

[结论]

两种酶都对L-鼠李糖显示高的亲和性，与XGP-710酶相比XGP-720酶显示稍高的活性。这些酶的最适温度和稳定性在60℃附近，估计有防止微生物污染的效果。进一步，在作为金属离子的MnCl₂存在下，在pH9.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中显示最高的活性。由这些结果表明，被鉴定的属于本链霉菌属(Streptomyces)的菌株的酶是对由D-阿洛酮糖生成D-阿洛糖有效的酶。

产业上的可利用性

本发明的酶的特征在于，具有对D-阿洛酮糖进行异构化产生D-阿洛糖的能力，并且产生该酶的微生物是属于链霉菌属的菌株。链霉菌属的微生物一直以来与食品的制造有关，被认为是安全性高的微生物。作为生产本发明的酶的链霉菌株在食品产业中使用的最大特征在于菌的安全性。作为至今已知的D-阿洛糖等稀少糖的生产酶，有由假单胞菌属、农杆菌属、根瘤菌属、假单胞菌属等产生的酶，但是这些作为兼性菌还有植物细胞感染等的报告，是为了确认安全性需要大量劳力的微生物。本发明中可以使用菌体或菌体培养物的安全性非常高的菌是非常大的技术进步。因此，可以认为本发明的将D-阿洛酮糖异构化产生D-阿洛糖的酶及其制造方法的确立不仅在制糖产业，而且在与其相关的食品、化妆品、医药品产业中的工业意义极大。

Claims

1.一种蛋白质，其中，

具有如下活性：识别醛糖C1的CHO基团和C2的OH基团并进行反应，将C1的CHO基团转变为OH基团，将C2的OH基团转变为CO基团；或者识别酮糖C1的OH基团和C2的CO基团并进行反应，将C1的OH基团转变为CHO基团，将C2的CO基团转变为OH基团；

并且，所述蛋白质是下述(a)至(c)中任一记载的蛋白质：

(a)由序列号1或序列号2所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

2.如权利要求1所述的蛋白质，其中，

将酮糖的D-阿洛酮糖异构化为醛糖的D-阿洛糖。

3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中，

所述蛋白质是由以下(d)～(f)的物理化学性质特定的，

(d)作用pH和最适pH，

作用pH为6.0～11.0，最适pH为9.0；

(e)作用温度和最适温度，

作用温度为10～80℃，最适温度为60℃；

4.一种来自链霉菌(Streptomyces sp.)710或链霉菌(Streptomycessp.)720的DNA，其中，

编码由序列号3或序列号4所示的碱基序列或其互补序列、或者包含这些序列的一部分或全部的序列构成的权利要求1或2所述的蛋白质，所述链霉菌710的保藏号为NITE BP-01423，所述链霉菌720的保藏号为NITE BP-01424。

5.一种重组载体，其中，

包含权利要求4所述的DNA。

6.一种宿主细胞，其中，

包含能够表达权利要求1、2或3所述的蛋白质的表达体系。

7.一种重组蛋白质的制造方法，其特征在于，

在培养基中培养权利要求6所述的包含表达体系的宿主细胞，从得到的培养物中采取权利要求1、2或3所述的重组蛋白质。

8.一种D-阿洛糖的生产方法，其特征在于，

使权利要求1、2或3所述的蛋白质作用于D-阿洛酮糖，将D-阿洛酮糖异构化为D-阿洛糖。

9.如权利要求8所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，

D-阿洛酮糖是将D-果糖表异构化来生产的。

10.如权利要求8所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，

D-阿洛酮糖是将D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产的。

11.如权利要求8所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，

D-阿洛酮糖是由未利用资源得到D-葡萄糖，将该D-葡萄糖异构化转变为D-果糖，将该D-果糖表异构化来生产的。

12.如权利要求8～11中任一项所述的D-阿洛糖的生产方法，其中，

作为目标的D-阿洛糖为D-阿洛酮糖和D-阿洛糖的混合物。