CN108474014A - 由含果糖的底物生产阿洛酮糖的方法 - Google Patents

由含果糖的底物生产阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及：一种通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应在短时间内以工业规模由含果糖的底物以高生产率获得含阿洛酮糖的产物的方法；以及，一种通过分离由该方法获得的含阿洛酮糖的产物来制备液体或粉末状的阿洛酮糖的方法，和一种通过将分离步骤的副产物加入到生产含阿洛酮糖的产物的过程中来连续制备阿洛酮糖的方法。

Description

由含果糖的底物生产阿洛酮糖的方法
技术领域
本发明涉及一种通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应以工业规模在短时间内以高生产率从含果糖的底物获得含阿洛酮糖的产物的方法，以及一种通过分离由该方法获得的含阿洛酮糖的产物来连续制备液体类型或粉末类型的阿洛酮糖的方法。
背景技术
制备糖浆的生物学方法的开发主要集中在通过使用酶或菌体以高转化率制备高浓度的特定糖类。
这种生产糖浆的开发的原因是，由于在生产糖浆之后需要后续工艺(诸如浓缩等)，需要使对这种后续工艺的需求最少，并且通过生产高纯度的特定糖类来减少对特定糖类的分离和纯化所花费的成本和时间。
最近，由于具有特定组成的糖浆具有优异的甜味品质和甜度，因此需要使进行的额外的浓缩、分离和纯化过程最少，以制造所生产的糖浆本身，或者通过最少的后续过程以制造所生产的糖浆本身。
另外，需要以工业规模在短时间内以高生产率生产含特定糖类的糖浆，并且还需要稳定地制备糖浆。
发明内容
技术问题
本发明提供了一种通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应来以工业规模以高生产率由含果糖的底物制备含阿洛酮糖的产物的方法。
此外，本发明提供了一种通过分离由该方法获得的含阿洛酮糖的产物来制备液体类型或粉末类型的阿洛酮糖的方法。
技术方案
本发明的一个实施方式涉及一种通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物制备含阿洛酮糖的产物的方法。
更具体而言，本发明涉及一种通过进行固定化反应来制备含阿洛酮糖的产物的方法，基于产物中阿洛酮糖、葡萄糖和果糖的固体成分含量100重量％，该含阿洛酮糖的产物包括合计固体成分含量小于20重量％的葡萄糖和果糖；并且，将按照含阿洛酮糖的产物中全部糖类的固体成分含量100重量％中阿洛酮糖为25重量％以上的方式进行生产时的反应流速作为1，以8.5至20的反应速度进行固定化反应。
本发明的另一个实施方式涉及一种通过如下步骤生产液体或粉末制品形式的阿洛酮糖的方法：通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物制备含阿洛酮糖的产物；通过使用高纯度分离装置分离出阿洛酮糖含量为80重量％以上或90重量％以上(例如90重量％)的阿洛酮糖级分、以及具有阿洛酮糖含量为5％以下的糖类组分的萃余物级分；并且在阿洛酮糖级分的情况下进行额外的过程。
在下文中，将对本发明进行更详细的描述。
本发明的一个实施方式涉及一种通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物制备合阿洛酮糖的产物的方法。
固定化反应所用的底物是含果糖的底物；并且，基于含果糖的底物的合计固体成分含量100％(w/v)％，用作有效生产阿洛酮糖的底物的果糖含量可以为75至95％(w/v)，例如80至91％(w/v)。果糖可以用于制备含阿洛酮糖的产物的方法，该含阿洛酮糖的产物为溶解于缓冲溶液或水(例如蒸馏水)中的液体形式。含果糖的底物没有特别限制，只要含有用于阿洛酮糖转化反应的果糖即可，并且例如可以是异构化糖浆。当异构化糖浆用作用于生产阿洛酮糖的底物时，异构化糖浆生产过程和阿洛酮糖生产过程可以以一系列过程的方式连续进行。
根据本发明获得的含阿洛酮糖的产物不仅可以含有阿洛酮糖，还可以含有果糖、葡萄糖和各种寡糖。当含阿洛酮糖的产物中所含的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为100重量％时，产物中所含的阿洛酮糖和葡萄糖的合计含量可以小于20重量％，并且例如可以是9重量％以上至小于20重量％。当产物中所含的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为100重量％时，阿洛酮糖和葡萄糖的合计固体成分含量为9重量％以上至小于20重量％，并且果糖含量超过80重量％至91重量％。当果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为100重量％时，产物中所含的阿洛酮糖含量可以为4重量％至29重量％。
适用于本发明的用于生产阿洛酮糖的生物催化剂，例如酶或菌体，可能受诸如转化反应温度、反应时间、底物的果糖含量等因素影响。例如，可以使用在50至60℃的反应温度下在1小时内从底物到阿洛酮糖的转化率为4至29％的生物催化剂。
生物催化剂可以是阿洛酮糖转化酶或生产阿洛酮糖转化酶的菌体，并且酶或菌体可被包含在珠粒中，从而将其填充到固定化反应的柱子中。
在用于生产阿洛酮糖的生物催化剂是菌体的情况下，它可以是重组菌株，该重组菌株被引入了编码生产阿洛酮糖差向异构酶的菌株的基因或编码阿洛酮糖差向异构酶的基因。
在本发明的一个具体实施方式中，生产阿洛酮糖差向异构酶的菌株可以是具有高稳定性并能以高生产率生产阿洛酮糖差向异构酶的菌株，并且重组菌株可以使用各种宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株、沙门氏菌属(Salmonellasp.)菌株和棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株等，但优选它可以是棒状杆菌属菌株(它是GRAS菌株)，并且可以是谷氨酸棒杆状菌(Corynebacterium glutamicum)。
在使用重组菌株的情况下，阿洛酮糖差向异构酶可以使用来自各种菌株的酶的编码基因，例如，该酶可以是韩国专利公开号2014-0021974中公开的来自原始介密螺旋体(Treponema primitia)的酶、韩国专利公开号2014-0080282中公开的来自扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques)的酶以及韩国专利10-1318422中公开的来自闪烁梭菌(Clostridium scindens)的酶，并且还可以是来自粘着剑菌(Ensifer adhaerens)的酶。在一个具体的实施方式中，根据本发明的阿洛酮糖差向异构酶可以是来自闪烁梭菌的酶，并且例如，可以包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且可以由包括核酸SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：9的核酸序列的碱基序列编码。SEQ ID NO：8的核酸序列是大肠杆菌优化的核酸序列，而SEQ ID NO：9是针对棒状杆菌适当修饰的核酸序列。
在根据本发明一个实施方式的重组菌株的制备中，能够使用位于编码阿洛酮糖差向异构酶的核酸序列上游的调控序列来调控酶的表达，该调控序列基本上包含转录启动子，并且可以进一步包含核糖体结合区和/或间隔区序列。构成调控序列的元件可以直接连接，或者通过包含具有1至100个碱基(例如5至80个碱基)的核酸序列的一个或多个接头而连接。
在一个具体的实施方式中，转录启动子可以是在棒状杆菌属菌株中表达编码阿洛酮糖差向异构酶的核酸序列的核酸分子，但可以是tac1、tae2、trc、sod启动子。sod启动子来自谷氨酸棒状杆菌，优选包括SEQ ID NO：1的核酸序列作为核心区。trc启动子是大肠杆菌来源的启动子，并且通过trp启动子和lac UV5启动子的组合进行制备。trc1启动子是大肠杆菌来源的启动子，并且通过trp启动子和lac UV5启动子的组合进行制备。tac2启动子是大肠杆菌来源的启动子，通过trp启动子和lac UV5启动子的组合进行制备，并且是通过修饰Tac1启动子的序列而得的优化形式。
核糖体结合区和间隔区可以直接化学连接或者通过在其间插入接头核酸序列而间接连接。在本发明的一个实施方式中，核糖体结合区和间隔区序列可以包括一个以5′至3′顺序连接的寡核苷酸。根据本发明的一个实施方式的启动子序列、核糖体结合区和间隔区序列的核酸序列示于下面的表1。表1中的粗体下划线部分表示调控序列中的核糖体结合区、间隔区序列、接头序列等。
[表1]
本发明的阿洛酮糖差向异构酶优选在酶活性和热稳定性方面优异，并且在本发明的具体实施方式中，具有编码阿洛酮糖差向异构酶的基因的转录启动子或调控序列与所有的tac1、tac2、trc、trip、sod启动子的组合能够提供相当充足的对本发明中使用的阿洛酮糖差向异构酶的蛋白质表达，并且当使用sod启动子时，是更优选的，因为可以获得蛋白质折叠稳健且热稳定性高的结果。
使用重组菌株等生产阿洛酮糖的方法可以通过韩国专利公开号2014-0021974、韩国专利公开号2014-0080282和韩国专利号10-1318422中公开的方法来进行，但是不特别限于此。
生产阿洛酮糖的方法包括使棒状杆菌属菌株与含果糖的原料反应的步骤。在一个具体的实施方式中，使棒状杆菌属菌株与果糖反应的步骤可以通过使果糖与固定有菌株或酶的载体接触的步骤来进行。阿洛酮糖可以由果糖生产，通过使固定化酶或菌体与含果糖的底物反应，从而将果糖转化为阿洛酮糖。
在生产阿洛酮糖的方法中，反应可以在pH 6至9.5(例如pH 7至9、pH 7至8或pH 8至9)的条件下进行。
另外，反应可以在30℃以上(例如40℃)的温度条件下进行。当温度为80℃以上时，可能发生作为底物的果糖的褐化现象，因此反应可以在40至80℃(例如50至75℃、60至75℃或68至75℃)的条件下进行。
当反应时间较长时，阿洛酮糖转化率增加；而当反应时间较短时，生产率提高。例如，反应时间优选为0.5小时(30分钟)以上、1小时以上、2小时以上、3小时以上、4小时以上、5小时以上或6小时以上。由于当反应时间超过48小时时阿洛酮糖转化率的增加速率不明显或反而降低，所以反应时间优选为48小时以下。因此，反应时间可以为0.5至48小时、1至48小时、2至48小时、3至48小时、4至48小时、5至48小时或6至48小时；并且在工业和经济方面，可以为约0.5至48小时、0.5至36小时、0.5至24小时、0.5至12小时或0.5至6小时，但不限于此。该条件选择为使从果糖到阿洛酮糖的效率最大化的条件。
将果糖转化成阿洛酮糖的酶(例如差向异构酶)的活化可以通过金属离子进行控制，因此，对于生产阿洛酮糖，当添加金属离子时，可以增加从果糖到阿洛酮糖的转化效率，即，阿洛酮糖的产量。
因此，包含棒状杆菌属菌株的生产阿洛酮糖的组合物还可以包括金属离子。另外，使用棒状杆菌属菌株生产阿洛酮糖的方法还可以包括添加金属离子的步骤。在一个具体的实施方式中，可以将金属离子添加到培养步骤的培养基中，或者培养步骤可以在添加有金属离子的培养基中进行。在其他实施方式中，可以将金属离子添加到果糖中，或者可以(在加入果糖之前)添加到固定有棒状杆菌属菌株的载体中，或者可以(在添加果糖之后)添加到固定有棒状杆菌属菌株的载体与果糖的混合物中，或者可以在添加果糖的同时以混合物的形式添加或分别添加。
金属离子可以是选自由铜离子、锰离子、钙离子、镁离子、锌离子、镍离子、钴离子、铁离子、铝离子等组成的组中的一种或多种。例如，金属离子可以是选自由锰离子、镁离子、镍离子和钴离子等组成的组中一种或多种，并且在一个实施方式中，金属离子可以是锰离子、钴离子或它们的混合物。当金属离子的添加量小于0.5mM时，阿洛酮糖产率提高的效果不明显，因此金属离子的添加量可以为0.5mM以上。另一方面，由于当金属离子的添加量超过5mM时，与超过该量相比效果不显著，所以金属离子的添加量为5mM以下。例如，金属离子的添加量可以在0.5mM至5mM(例如0.5mM至2mM)的范围内。
当根据本发明的用于生产阿洛酮糖的酶或菌体以固定到载体中的形式使用时，载体可以创造环境以长时间维持固定化的菌株或由该菌株生产的酶的活性，并且可以是可用于酶固定化的所有公知载体。例如，可以使用海藻酸钠作为载体。海藻酸钠是丰富存在于海藻细胞壁中的天然胶体多糖，并且由甘露糖醛酸(β-D-甘露糖醛酸)和谷氨酸(α-L-谷氨酸)组成，并且在含量方面，它是通过形成β-1，4键而随机形成，从而稳定地固定菌株或酶，因此可能有利地示出优异的阿洛酮糖产量。
在一个具体的实施方式中，为了更多地提高阿洛酮糖的产量，浓度为1.5至4.0％(w/v)的海藻酸钠溶液(例如海藻酸钠水溶液)，例如2.0％(w/v)的海藻酸钠可用于固定菌株。例如，通过使用注射泵或真空泵将获得的混合物溶液滴入约0.2M钙离子溶液中，可以将菌株的菌体、包含由菌株生产的酶的培养物、或菌株的裂解物固定到海藻酸钠载体中，从而在将菌株的菌体、包含菌株生产的酶的培养物、或菌株的裂解物添加到1至2倍体积的菌株的菌体、包含菌株生产的酶的培养物、或菌株的裂解物的海藻酸钠水溶液之后，生产珠粒。酶可以通过常规方法(诸如透析、沉淀、吸附、电泳、亲和层析、离子交换层析等)进行纯化，形成菌株、菌株培养物或菌株的裂解物。
载有菌体或酶的载体(例如珠粒)可以是用于生产阿洛酮糖的珠粒，它通过压缩处理珠粒而减小珠粒尺寸并减少溶胀，从而增加阿洛酮糖的产量并且能够稳定地使用很长一段时间。
一个实施方式可以是压缩处理的压缩珠粒，它包括用于生产阿洛酮糖的酶或菌体和海藻酸(alginate acid)或其盐作为载体，并且，它可以是这样的用于生产阿洛酮糖的珠粒：相对于压缩过程之前珠粒的平均直径100，压缩珠粒的平均直径为62至100。当与液体底物反应时，压缩珠粒可以减少溶胀现象，并且具体而言，相对于与液体底物接触之前珠粒直径的溶胀率100，珠粒的平均直径的溶胀率可以为100至155，例如100至130或100至125等。
根据本发明的制备压缩珠粒的方法可以包括处理金属离子的方法和处理金属离子和用溶胀抑制剂进行包覆的方法，以及冷冻干燥方法。珠粒压缩处理的金属离子可以是选自由Mn2+、Zn2+、Co2+、Mg2+、Ni2+、Fe2+和Cu2+组成的组中的一种或多种二价金属离子，并且溶胀抑制剂可以是选自由壳聚糖、几丁质、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亚胺(PEI)、壳寡糖和聚赖氨酸组成的组中的一种或多种。冷冻干燥方法可以通过在-90℃至-10℃的温度范围内冷冻并且在小于10毫托的压力下在-40℃至20℃的温度范围内干燥来进行。
在通过处理金属离子的方法和处理金属离子并用溶胀抑制剂包覆的方法进行压缩处理的珠粒的情况下，期望的含水百分率可以为50至88％。另外，在通过冷冻干燥制备的压缩珠粒的情况下，理想的含水百分率可以为10至50％。
本发明涉及一种通过如下步骤制备液体或粉末状阿洛酮糖的方法：从通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物得到的含阿洛酮糖的产物进行分离的过程。
一个具体的实施方式涉及一种通过获得含阿洛酮糖的液体制品来制备阿洛酮糖的方法，包括：
通过根据本发明的使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物制备含阿洛酮糖的产物；
对所生产的含阿洛酮糖的产物脱色或脱盐，以及
将经脱色或脱盐的产物浓缩至阿洛酮糖的固体成分含量为75白利度(％)以上。
另一个实施方式涉及一种制备含阿洛酮糖的粉末的方法，包括：
通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物制备含阿洛酮糖的产物；
对所生产的含阿洛酮糖的产物脱色或脱盐，
分离经脱色或脱盐的产物以分离出阿洛酮糖含量为90重量％以上的阿洛酮糖级分和具有阿洛酮糖含量为5％以下的糖类组分的萃余物级分；
浓缩经分离的阿洛酮糖级分；
使浓缩物在阿洛酮糖过饱和状态下结晶；以及
从晶体母液中分离出结晶的阿洛酮糖并干燥。
可以通过常规方法，诸如脱盐、脱色、浓缩、使用SMB色谱法的高纯度分离纯化、结晶、离心、过滤等的一种或多种方法，来实现通过本发明的方法从果糖中收集含阿洛酮糖的产物。结晶步骤可以通过使阿洛酮糖处于过饱和状态来使阿洛酮糖结晶，并且达到过饱和状态的方法的一个实例可以是冷却含阿洛酮糖的溶液的方法，但不限于此。
使用SMB色谱的纯化步骤中使用的SMB的基本原理是通过以一定的时间间隔移动柱之间的位置来复制固定相和流动相的逆流流动，并且实现连续分离。将由于与吸收剂的亲合力弱而快速移动的物质收集到包含通过向液流方向移动而分离的高纯度阿洛酮糖的级分中，并且将由于与吸收剂的亲和力强而缓慢移动的物质收集到通过向固定相流动方向移动而分离的具有阿洛酮糖含量为5％以下的糖类组分的萃余物级分中。色谱柱连续连接，并且入口由混合物和流动相组成，而出口由高纯度阿洛酮糖级分和含低含量阿洛酮糖的级分组成。SMB通常由4个区域组成，并且根据出口和入口的位置划分。与分批分离工艺相比，SMB技术可以实现连续分离，并且获得高浓度和高收率的产品。可以通过根据诸如每种材料的吸附率、扩散和分散等基本因素确定具体条件，来进行SMB实验。
通过将已分级的高纯度阿洛酮糖和已分离的具有阿洛酮糖含量为5％以下的糖类组分的萃余物级分分离，可连续制备阿洛酮糖。
发明效果
本发明是一种通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物制备含阿洛酮糖的产物的方法，以及一种通过分离由该方法获得的含阿洛酮糖的产物来连续制备液体或粉末状阿洛酮糖的方法，并且具有以工业规模在短时间内以高生产率获得阿洛酮糖的优点。
附图说明
图1是示出根据本发明的实施例在通过使用填充有含用于生产阿洛酮糖的细胞的珠粒的固定化反应进行的阿洛酮糖生产中，在液体果糖含量为75％至95％范围内和在葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为5％至小于20％的范围内产物中阿洛酮糖含量根据柱流速的变化的曲线图。
图2是示出根据本发明的实施例在通过使用填充有含用于生产阿洛酮糖的细胞的珠粒的固定化反应进行的阿洛酮糖生产中，在液体果糖含量为75％至95％范围内和在葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为5％至小于20％的范围内产物中阿洛酮糖含量根据柱流速的变化的公式。
图3示出了用于制备本发明的阿洛酮糖糖浆的重组表达载体(pCES_sodCDPE)的实例。
图4是示出根据本发明实施例的阿洛酮糖生产步骤的过程图。
具体实施方式
实施例1：阿洛酮糖生产系统的建立
1-1：生产阿洛酮糖的菌株的制备
将来自闪烁梭菌(Clostridiuim scindens ATCC 35704)的编码阿洛酮糖差向异构酶的基因(DPE基因；基因库：EDS06411.1)合成为针对大肠杆菌优化的修饰多核苷酸形式并且称为CDPE。针对大肠杆菌优化的多核苷酸和由pET21a载体获得的sod启动子和T7终止子通过PCR获得作为每个模板，并且通过重叠PCR方法将它们连接为一个模板并且通过T载体克隆而克隆到pGEM T-easy载体中，以确认包括sod启动子(SEQ ID NO：1)的序列、SEQ IDNO：8的优化CDPE序列和T7-终止子。
用限制性酶NotI和XbaI(NEB)将整个多核苷酸插入到表达载体pCES208(J.Microbiol.Biotechnol.，18：639-647，2008)的相同限制酶位点中，以生产重组载体pCES208/阿洛酮糖差向异构酶(pCES_sodCDPE)。所生产的重组载体(pCES_sodCDPE)的分解图(cleavage map)示于图1。
通过使用电穿孔，用所制备的重组载体(pCES_sodCDPE)转化谷氨酸棒杆状菌。挑取菌落并接种到补充有最终浓度为15ug/ml的卡那霉素的4ml的LB培养基(胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母提取物5g/L)中，然后在30℃和250rpm的培养条件下培养约16小时。然后，收集1ml培养液并将其接种到含15ug/ml卡那霉素的100ml的LB培养基中，继续培养超过16小时。在用珠磨式研磨器(beadbeater)裂解培养的细胞后，仅获得上清液并将其与样品缓冲液以1∶1的混合比混合，然后在100℃加热5分钟。将制备的样品在12％SDS-PAGE凝胶(组成：电泳胶(3.3ml的H2O，4.0ml的30％丙烯酰胺，2.5ml的1.5M Tris缓冲液(pH8.8)，100μl的10％SDS，100μl的10％APS，4μl的TEMED)/积层胶(1.4ml的H2O，0.33ml的30％丙烯酰胺，0.25ml的1.0M Tris缓冲液(pH 6.8)，20μl的10％SDS，20μl的10％APS，2μl的TEMED))上在180V电泳约50分钟，以确认蛋白质表达。在SDS-PAGE凝胶上确认CDPE的表达后，使用Ni-NTA树脂进行His标签纯化，并使用计算公式(表达率(％)＝(纯化蛋白质(mg)/总计可溶性蛋白(mg))×100)计算表达率，以精确测量表达水平。制备的谷氨酸棒状杆菌转化体生产了16.62mg的总水溶性蛋白质和1.74mg的纯化酶蛋白质。
1-2：固定珠粒的制备
为了使用实施例1-1中的生产阿洛酮糖差向异构酶的重组菌株由果糖制备阿洛酮糖，在细胞培养物中通过离心收集细胞。
然后，在35℃(±5℃)，用终体积为0.05％(v/v)的乳化剂(Ryoto(tkSugar Ester，M-1695))处理细胞悬液60分钟。当反应完成后，在通过离心再次除去含乳化剂的上清液后收集菌体。
为了制备固定珠粒，将收集的菌体与蒸馏水混合至菌体终浓度为5％(v/v)，并且将5％(v/v)的收集的菌体与4％(v/v)的溶解于水中的海藻酸以1∶1的混合比混合，并且在4℃冷藏以除去混合过程中产生的气泡。将冷藏的混合物溶液通过针(Neddle)(内径0.20至0.30mm)挤出并且由于重量而形成液滴形状，并且滴下的混合物溶液通过滴入所制备的100mM氯化钙(CaCl2)溶液中而固化，以形成球形或椭圆形珠粒(直径2.0至2.2mm)。将形成的珠粒浸泡在100mM的氯化钙溶液中，并且用搅拌器均匀混合，以使其进一步固化。
在全部混合物溶液被挤出后，将珠粒在冰箱中保持4至6小时从而进一步固化，然后用新的100mM氯化钙溶液进行替换，在冷藏状态下固化约6小时。在珠粒完全固化后，将珠粒撇去并完全除去水分。在加入3倍于珠粒体积的水后，将珠粒搅拌10分钟。重复该过程三次以除去氯化钙溶液。在完全除去洗过的珠粒的水分后，以3倍于珠粒的体积输入含果糖的底物(50白利度的果糖和1mM的MnCl2.4H2O)，然后搅拌10分钟。这种处理进行2次以上，以用作为反应底物的含果糖的底物代替。用3N的NaOH将反应底物调节至pH为6.8至7.2。根据制品种类，能够使用液体果糖或结晶果糖作为底物。
将经反应底物替代的珠粒填充到固定化反应柱中，然后用于生产阿洛酮糖浆。
1-3：阿洛酮糖糖浆的制备
在将实施例1-2中制备的珠粒填充到固定化反应柱中后，在以下反应条件下生产阿洛酮糖浆。将原料提供至下面的固定化反应柱，该原料中的固体成分含量为50重量％，并且在固体成分含量为50％(w/w)以上的含果糖的底物(pH6.8至7.1)的全部糖类固体成分含量100重量％中，含88.8重量％的果糖和4.8重量％的葡萄糖，从而制备混合糖类的阿洛酮糖浆。
<固定化柱反应条件>
(1)反应温度：柱套内部温度为50℃，
(2)反应底物：底物在固体成分含量为50％(w/w)以上的含果糖的底物的合计固体成分含量中含有88.8重量％的果糖和4.8重量％的葡萄糖，并且底物包括小于6.4重量％的除果糖和葡萄糖之外的DP(聚合度)为1以上的其他糖类。
(3)生产标准：生产在产物中的全部糖类的固体成分含量100重量％中，含阿洛酮糖24重量％的糖浆。
作为该反应的结果，从反应溶液中收集了葡萄糖∶果糖∶阿洛酮糖∶寡糖的重量比为5∶65∶24∶6的24重量％的阿洛酮糖浆。
实施例2：根据增加的反应流速的阿洛酮糖产量
在将实施例1-2中制备的珠粒填充到固定化反应柱中后，在柱中的阿洛酮糖含量(％)稳定的时刻，通过根据流速的增加比率、用1小时供给5倍于柱体积的反应底物，来比较下列反应条件下的根据柱流速的生产阿洛酮糖浆的量。在柱中供给固体成分含量为50重量％(w/w)的反应底物溶液的原料，该反应底物溶液中，基于全部糖类的固体成分含量100重量％，包括果糖含量88.8重量％以上和葡萄糖含量4.8重量％。
通过使用Biorad公司的Aminex HPX-87C柱(80℃)并且在30分钟的分析时间内，通过以0.6ml/min的流速注入10μL的经水溶剂适当稀释的样品，用RI检测糖类含量的分析，对果糖、阿洛酮糖和其他DP为1以上的糖类进行积分，从而分析各面积。另外，为了分析各糖类组分的含量，当在30分钟的分析时间内示出的果糖、阿洛酮糖和其他DP为1以上的糖类的总面积之和的值设为100时，将与各糖类组分的面积对应的值作为各糖类的含量进行分析。
<固定化柱反应条件>
(1)反应温度：柱套内部温度为50℃，
(2)反应底物：底物在以固体成分含量为50％(w/w)的含果糖的底物(pH 6.8至7.2)的全部糖类的固体100重量％中，包括88.8重量％的果糖和4.8重量％的葡萄糖，并且含有含量小于6.4％的除果糖和葡萄糖之外的DP为1以上的其他糖类，作为该底物，是以果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量100重量％进行换算时，在原料底物中包括含量为94.9重量％的果糖和含量为5.1重量％的葡萄糖的原料。
(3)柱流速：将按照含阿洛酮糖的产物中的全部糖类的固体成分含量100重量％中阿洛酮糖为25重量％以上进行生产时的反应流速作为1，随着以反应流速增加1至20倍进行反应，根据流速的增加比率来评估产物中的阿洛酮糖含量。
(4)生产标准：以产物中果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为100重量％，葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为9重量％以上至小于20重量％的范围。
实验结果示于下面的表2和图1。在表2中，基于产物中全部糖类的固体成分含量中果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量100重量％，示出了每种糖的含量。
[表2]
如表2所示，当反应底物中包含的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计固体成分含量100重量％时，使用果糖含量为94.9％且葡萄糖含量为5.1％的原料。由于果糖转化成阿洛酮糖，随着转化反应的进行，作为底物的果糖的94.9％含量逐渐减少，并且阿洛酮糖含量增加，而保持5.1％葡萄糖的相同含量。
根据柱流速的增加，阿洛酮糖的转化率逐渐降低。当以比表2中的生产27.1％阿洛酮糖含量的流速高20倍的流速进行反应时，阿洛酮糖含量为4.6％。当以比实施例1的生产25％阿洛酮糖含量的流速高10倍的流速进行反应时，产生了葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量小于20重量％的糖浆组合物。
图1示出了表2中柱流速变化引起的阿洛酮糖含量变化，从而示出了根据柱流速增加的比率引起的产物中阿洛酮糖含量的变化。
如图2所示，当将柱流速的数值输入到公式中时，可以看出：基于产物中的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖合计含量100重量％，包含葡萄糖和阿洛酮糖的合计固体成分含量为9.7重量％以上至小于20重量％的糖浆组合物的生产条件可以控制为实施例1中生产阿洛酮糖含量为25重量％的浆料组合物的流速的8.5倍至20倍。该结果示出了：比生产实施例1中包含含量为25重量％的阿洛酮糖的浆料组合物的流速提高约10倍，柱流速可用于生产具有小于20重量％的葡萄糖和阿洛酮糖合计固体成分含量的糖浆组合物，该流速比生产实施例1中包含含量为25重量％的阿洛酮糖的糖浆组合物的流速提高约8.5倍。
另外，作为通过使用图2的公式分析在固定化反应条件下以提高了10倍的柱流速的反应中完成生产的生产材料的含量的结果，如图2所示，基于全部糖类固体成分含量100重量％，获得了含有76.5重量％的果糖、12.3重量％的阿洛酮糖、4.8重量％的葡萄糖和6.4％的DP为1以上的其他糖类的组合物，当换算为果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量100重量％时，生产的阿洛酮糖和葡萄糖含量的合计可以为18.2重量％。
实施例3：反应稳定性的评价
在将实施例1-2中制备的珠粒填充到固定化反应柱中后，含果糖的底物和反应条件与实施例2中的相同。
通过使用图2的公式，基于产物的糖类中的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量100重量％，在阿洛酮糖和葡萄糖的合计含量小于20重量％的柱流速中选择并固定流速，并且在不同的反应天数时测量产物中阿洛酮糖含量的变化。具体而言，通过将流速设定为比生产阿洛酮糖含量为25重量％(以实施例1中全部糖类的固体成分含量为100重量％)的流速高8.5倍并反应15天，测量产物中所含的阿洛酮糖含量的变化的结果示于下面的表3。
<固定化反应条件>
(1)反应温度：50℃，
(2)反应底物：与实施例2相同的反应底物，
(3)色谱柱条件：流速提高至比生产阿洛酮糖含量为25重量％(以实施例1中的全部糖类的固体成分含量为100重量％)的流速高8.5倍，以及
(4)生产标准：当产物中果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为100重量％时，葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为15重量％以上至小于20重量％的范围。
[表3]
如表3所示，在以高反应流速反应15天期间测量产物中的阿洛酮糖含量，基于果糖、阿洛酮糖和葡萄糖的合计含量100重量％，包含含量为10重量％以上至小于15重量％的阿洛酮糖和合计含量为15重量％以上至小于20重量％的阿洛酮糖和葡萄糖的组合物可以稳定地生产持续15天。
实施例5：阿洛酮糖的连续循环生产
当产物中所含的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量为100重量％时，连续生产包含葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量小于20重量％的阿洛酮糖糖浆，并且从产物中分离阿洛酮糖级分和果糖萃余物级分，从而，阿洛酮糖生产系统被建立作为连续生产过程。
具体而言，通过基于产物中所含的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量100重量％，在生产小于20重量％的葡萄糖和阿洛酮糖的条件下控制阿洛酮糖转化反应柱的流速来进行阿洛酮糖转化反应，并且通过使用高纯度分离方法从含阿洛酮糖的产物中分离出具有90％以上阿洛酮糖纯度的阿洛酮糖级分和含有过量果糖的果糖萃余物级分。
阿洛酮糖生产的整个反应过程的示意图示于图4，并且可以根据生产质量或生产过程插入或排除其中的过程。详细的生产过程如下。
在将具有75白利度(％)的固体成分含量的液态果糖(当合计固体成分含量为100重量％时，果糖含量为88.8重量％)添加至水中而调节至50白利度(％)的固体成分含量之后，通过添加5N的NaOH而调节至pH 7.0，以制备反应原料。将该原料装入填充有实施例1-2的菌体固定珠粒(50℃恒温)的反应柱中，并且，当将原料中的果糖转化成阿洛酮糖时，基于反应原料的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量100重量％，根据与实施例3的基本相同的方法生产小于20重量％的葡萄糖和阿洛酮糖的糖浆。
作为分离生产的阿洛酮糖浆的方法，通过向糖浆中的固体成分含量中添加0.05％(w/w)的活性炭，对生产的含阿洛酮糖浆在50℃脱色30分钟，并且使完全脱色的含阿洛酮糖的糖浆通过微过滤器，从而除去活性炭。
除去活性炭的含阿洛酮糖的糖浆通过流过填充有阳离子交换树脂、阴离子交换树脂及其混合树脂的柱从而在室温下进行脱盐，以便以每小时离子交换树脂的2倍(1至2倍)的体积比除去诸如离子组分等杂质。在阿洛酮糖∶果糖的分离比为0.7∶1的条件下，在以0.06SV流速的填充有钙(Ca2+)型离子交换树脂的SMB(模拟移动床)中，基于阿洛酮糖转化反应的原料中合计固体重量为1，以0.15的比率分离阿洛酮糖，以获得固体成分含量为4白利度(％)的96％阿洛酮糖纯度的高纯度阿洛酮糖级分。由于食品应用，在柱的流动相中使用三重蒸馏水。
同时，当用于阿洛酮糖转化反应的原料的合计固体重量为1时，以0.85的比例收集萃余物级分，该萃余物级分包含除了高纯度阿洛酮糖级分之外的组分含量为5.5％的葡萄糖、83.9％的果糖、3.4％的阿洛酮糖和4.2％的其他糖类。在将经分级的萃余物转移并固定为50白利度(％)的固体成分含量以作为阿洛酮糖转化的含果糖底物之后，用5N的NaOH调节至pH 7.0，装入反应柱中，并再循环以进行阿洛酮糖转化反应。
将SMB中分离出的高纯度阿洛酮糖转移至储罐中并且在60℃浓缩至固体成分含量为80白利度(％)以上，并且根据冷却结晶法冷却至过饱和状态，以生产阿洛酮糖晶体。然后，通过离心脱水和干燥，最终以81％的产率获得具有99％阿洛酮糖纯度的阿洛酮糖粉末。

Claims (17)

1.一种通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂的固定化反应由含果糖的底物制备含阿洛酮糖的产物的方法，
其中，所述生物催化剂在50至60℃的反应温度下在1小时内具有4％至29％的从含果糖的底物的阿洛酮糖转化率，
其中，将按照含阿洛酮糖的产物中的全部糖类的固体成分含量100重量％中阿洛酮糖的含量为25重量％以上的方式进行生产时的反应流速作为1，以8.5至20的反应流速进行所述固定化反应，并且
其中，相对于含阿洛酮糖的产物中所含的阿洛酮糖、葡萄糖和果糖的固体成分含量100重量％，阿洛酮糖和葡萄糖的固体成分含量低于20重量％。
2.一种按照如下方式实施的方法，基于糖类和阿洛酮糖的合计固体成分含量100重量％，阿洛酮糖和葡萄糖的固体成分含量为9重量％以上至小于20重量％。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，将按照含阿洛酮糖的产物中的全部糖类的固体成分含量100重量％中阿洛酮糖为25重量％以上的方式进行生产时的反应流速作为1，以10至18的反应流速进行所述固定化反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，进行所述固定化反应以实现：基于所述含阿洛酮糖的产物中的果糖、葡萄糖和阿洛酮糖的合计含量100重量％，阿洛酮糖和葡萄糖的合计固体成分含量为9重量％以上且低于20重量％，并且果糖的固体成分含量为80至91重量％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述底物中的全部糖类的固体成分含量100重量％中，所述含果糖的底物包括75重量％至95重量％的果糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用用于生产阿洛酮糖的生物催化剂和底物进行所述固定化反应，所述生物催化剂的从含果糖的底物的阿洛酮糖转化率为20％至29％，并且，含果糖的底物中的全部糖类的固体成分含量100重量％中，所述底物包括80重量％至95重量％的果糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含果糖的底物是异构化的糖浆。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物催化剂是用于生产阿洛酮糖的酶或生产阿洛酮糖的菌体。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用填充有珠粒的固定化柱进行所述固定化反应，所述珠粒包含用于生产阿洛酮糖的酶或生产阿洛酮糖的菌体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，通过使用含菌体或酶的珠粒进行所述固定化反应，该珠粒经二价金属离子处理并且经选自由壳聚糖、几丁质、聚乙烯乙二醇(PEG)、聚乙烯胺(PEI)、壳寡糖和聚赖氨酸组成的组中的一种或多种溶胀抑制剂包覆。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，通过使用生产含阿洛酮糖的酶或生产阿洛酮糖的菌体的珠粒进行所述固定化反应，该珠粒经冷冻干燥处理和压缩处理。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，生产阿洛酮糖的菌体是用阿洛酮糖差向异构酶的基因转化的棒状杆菌菌株。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述棒状杆菌菌株是选自由谷氨酸棒状杆菌、醋谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒状杆菌、热产氨棒状杆菌、栖糖蜜棒杆状菌和有效棒杆状菌组成的组中的一种或多种棒状杆菌属菌株。
14.根据权利要求8所述的方法，其中，生产阿洛酮糖的菌体是生产阿洛酮糖差向异构酶的菌株。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述固定化反应在40至80℃进行0.5至48小时。
16.一种通过获得含阿洛酮糖的液体制品来制备阿洛酮糖的方法，包括：
根据权利要求1至15中任一项所述的方法获得含阿洛酮糖的产物，
对所生产的含阿洛酮糖的产物脱色或脱盐，以及
将经脱色或脱盐的产物浓缩至阿洛酮糖的固体成分含量为75白利度(％)以上。
17.一种制备阿洛酮糖的方法，包括制备含阿洛酮糖的粉末，所述制备含阿洛酮糖的粉末包括：
根据权利要求1至15中任一项所述的方法获得含阿洛酮糖的产物，
对所生产的含阿洛酮糖的产物脱色或脱盐，
分离经脱色或脱盐的产物以分离出阿洛酮糖含量为90重量％以上的阿洛酮糖级分和萃余物级分，
浓缩经分离的阿洛酮糖级分，
制备处于阿洛酮糖过饱和状态的浓缩物，以使阿洛酮糖结晶，并且
从晶体母液中分离出结晶的阿洛酮糖并干燥。
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