CN116855553A - 一种复合工程菌和生产d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种复合工程菌和生产D‑阿洛酮糖的方法。本发明将特定来源的葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶分别表达枯草芽孢杆菌，经发酵获得包含葡萄糖异构酶和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶的组合酶，利用所述组合酶催化底物葡萄糖发生异构反应，最终制得D‑阿洛酮糖。本发明提供的提供的方法能够明显提高D‑阿洛酮糖的转化速率，大大缩短了葡萄糖转化成D‑阿洛酮糖的时间，同时，本发明以使用廉价的葡萄糖为原料，大大降低D‑阿洛酮糖的生产成本；本发明可同步生产果葡糖浆，节省了一套果葡糖浆的生产线投入，大大提高了经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种复合工程菌和生产D-阿洛酮糖的方法。
背景技术
D-阿洛酮糖是一种稀有糖，具有蔗糖70％的甜度，但热量很低，是蔗糖良好的替代品。而且，D-阿洛酮糖的吸收率低于其他甜味剂，可降低机体对果糖和葡萄糖吸收的作用，降低脂肪的堆积量，从而降低Ⅱ型糖尿病和过度肥胖等病症的患病风险。目前还有研究发现D-阿洛酮糖还具有降低血脂和血糖的功能。美国食品与药物管理局(FDA)已将D-阿洛酮糖认证为GRAS(Generally recognized as safe)，可作为食品添加剂的组成成分。D-阿洛酮糖在食品、保健品中具有广泛的应用前景。然而，目前已有的工艺主要以果糖为原料，原料成本较高。尽管有少数工艺以葡萄糖为原料，但生产周期较长，耗费更多的人力和物力，增加了生产成本，因此不利于工业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种复合工程菌和生产D-阿洛酮糖的方法。本发明利用特定来源的特定来源的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化葡萄糖发生异构反应生成D-阿洛酮糖，该方法能够明显提高D-阿洛酮糖的转化速率，缩短了D-阿洛酮糖的生产时间，降低了生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种生产D-阿洛酮糖的方法，包括：
1)将编码Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcus sp.来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因分别转入枯草芽孢杆菌，获得GI工程菌和DPE工程菌；
2)将所述GI工程菌和DPE工程菌混合接入发酵培养基发酵，破菌后获得含葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的粗酶液；
3)以所述粗酶液为催化剂催化葡萄糖发生异构反应，获得D-阿洛酮糖。
本发明步骤1)中，所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列选自如下任意一项；
a)如SEQ ID NO:1所示；
b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的蛋白活性不发生改变的氨基酸序列；或
c)与SEQ ID NO:1所示序列至少有90％同源性且蛋白活性与SEQ ID NO:1所示序列的蛋白活性相同或相似的氨基酸序列；
所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列选自如下任意一项:
A)如SEQ ID NO:2所示；
B)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的蛋白活性不发生改变的氨基酸序列；或
C)与SEQ ID NO:2所示序列至少有90％同源性且与SEQ ID NO:2所示序列的蛋白活性相同或相似的氨基酸序列。
本发明步骤1)中，所述编码葡萄糖异构酶的基因依照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因依照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明中，所述的葡萄糖异构酶GI来源于Thermus thermophilus，登录号为WP_244348257.1，氨基酸序列为SEQ ID NO:1。所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE来源于Ruminococcus sp.，登录号为MBS6425357.1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明经长期研究，发现不同来源的酶组合催化底物葡萄糖转化为阿洛酮糖的速率不同，最终获得了转化速率明显高于其他组合的最佳组合，即Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcus sp.来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的组合，具体地，所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明步骤2)中，所述混合发酵具体为37℃，200rpm培养48h。
本发明步骤2)中，将所述发酵的培养基为蛋白胨10g，酵母粉5g，磷酸二氢钾2.5g，磷酸氢二钾15g，四水氯化锰0.1g，七水硫酸镁0.1g，葡萄糖6g，加水定容至1L。
本发明步骤2)中，所述工程菌在接入发酵培养基进行混合发酵前还包括将所述工程菌制成种子液的步骤：将所述工程菌接入LB种子培养基，37℃，200rpm过夜培养，获得种子液。
本发明步骤2)中，所述破菌具体为：将溶菌酶和发酵液按照质量体积比为0.1‰(即溶菌酶的终浓度为0.1g/L)的比例混合，37℃，200rpm反应0.5-4h。一些具体实施例中，所述反应破菌处理的条件为37℃，200rpm反应1h。
本发明步骤3)中，所述异构反应的温度为60℃，时间为2～24h。一些具体实施例中，异构反应的温度为60℃，时间为2h、4h、6h、12h或24h。
本发明所述异构反应之后还包括将反应产物依次进行过滤、纯化、色谱分离、浓缩，分别获得D-阿洛酮糖和果葡糖；所述过滤依次用孔径8-10nm的陶瓷膜、100-300道尔顿的纳滤膜进行过滤，所述纯化包括：先经阳离子树脂，再经阴离子树脂，去除阴阳离子；具体实施例中，阳离子树脂型号为D001-FD，阴离子树脂型号为D354-FD。
本发明还提供一种复合工程菌，包括表达Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌和表达Ruminococcus sp.来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌。一些具体实施例中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB600。
本发明所述复合工程菌构建方法如下：
1)选取Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶蛋白序列(GI，SEQ ID NO:1)和Ruminococccus sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白序列(DPE，SEQ ID NO:2)，其编码基因经密码子优化后由金斯瑞生物科技全基因合成后，优化后的GI基因序列为SEQ ID NO:3，优化后的DPE基因序列为SEQ ID NO:4，通过同源重组连接到载体pWB980上，得到重组质粒pWB980-GI和pWB980-DPE。其中，质粒上SacB信号肽基因片段在重组时被去除，GI和DPE基因由p43启动子控制为组成型胞内表达。
2)分别将重组质粒pWB980-GI和pWB980-DPE转化至枯草芽孢杆菌WB600中，获得重组枯草芽孢杆菌WB600/GI和WB600/DPE。
本发明还提供了复合工程菌在生产D-阿洛酮糖中的应用，或在制备降糖降脂产品中的应用。
本发明的具体实施例中，所述D-阿洛酮糖的制备方法包括：
(1)分别将上述两种工程菌(WB600/GI和WB600/DPE)接入LB种子培养基中，37℃，200rpm过夜培养进行富集，获得OD600值为3-6的种子液；
(2)将步骤(1)获得的两种重组菌菌株的种子液分别按照0.1％(v/v)的比例共同接入同一发酵培养基中进行混合发酵，发酵温度37℃，200rpm培养48h，获得发酵液。
(3)向步骤(2)获得的发酵液中按照0.1‰(w/v)加入溶菌酶，37℃，200rpm反应1h，以破菌释放胞内酶，获得粗酶液。
(4)向步骤(3)获得的粗酶液中，按终浓度600g/L加入葡萄糖，60℃反应24h，获得转化糖浆。
(5)将步骤(4)获得的转化糖浆用孔径8-10nm的陶瓷膜过滤除杂，通量50L/㎡/h，获得透过液。
(6)将步骤(5)获得的透过液用截留分子量100-300道尔顿的纳滤膜过滤除杂脱色，通量10L/㎡/h，获得透过液。
(7)将步骤(6)获得透过液先经过阳离子树脂，再经过阴离子树脂，去除阴阳离子；阳离子树脂型号为D001-FD，阴离子树脂型号为D354-FD；获得脱盐后糖液。
(8)再将步骤(7)脱盐后糖液进行色谱分离，获得AD液为阿洛酮糖糖液，BD液为葡萄糖、果糖混合糖液。色谱分离过程中控制糖液浓：15-25％，温度50-60℃，压力0.2-0.3MPa，水料质量比为1：2，处理量2.2kg/kg/d；
(9)将步骤(8)获得的AD液和BD浓缩至固形物质含量为75％，获得D-阿洛酮糖糖浆和果葡糖浆。
本发明将特定来源的葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶分别表达枯草芽孢杆菌，经发酵获得包含葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的组合酶，利用所述组合酶催化底物葡萄糖发生异构反应，最终制得D-阿洛酮糖。本发明提供的提供的方法能够明显提高D-阿洛酮糖的转化速率，大大缩短了葡萄糖转化成D-阿洛酮糖的时间，同时，本发明以使用廉价的葡萄糖为原料，大大降低D-阿洛酮糖的生产成本；本发明可同步生产果葡糖浆，节省了一套果葡糖浆的生产线投入，大大提高了经济效益。相比于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用特定来源的酶在较短时间内催化葡萄糖转化成D-阿洛酮糖，明显缩短了生产时间，大大提高了经济效益，有利于产业化生产。
(2)本发明使用廉价的原料葡萄糖作为底物，大大降低了D-阿洛酮糖的生产成本。
(3)本发明在生产D-阿洛酮糖的同时，可同步生产果葡糖浆，可节省一套果葡糖浆的生产线投入。
附图说明
图1为重组质粒pWB980-GI和pWB980-DPE图谱；
图2为SDS-PAGE电泳图片，其中，泳道1～4分别代表：1:WB600/pWB980，2:WB600/pWB980-GI，3:WB600/pWB980-DPE，4:WB600/pWB980-GI+WB600/pWB980-DPE；
图3～5为液相检测图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种复合工程菌和生产D-阿洛酮糖的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明葡萄糖异构酶(GI)工程菌的构建和功能验证
1)选取Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶蛋白序列(GI，SEQ ID NO:1)，其编码基因根据枯草芽孢杆菌密码子进行优化，优化后的GI基因序列为SEQ ID NO:3，由金斯瑞生物科技全基因合成，合成好的基因连接到pUC57载体上，命名为pUC57-GI。
2)以合成的重组质粒pUC57-GI为模板，以GI-F和GI-R为引物进行PCR扩增，胶回收纯化获得GI片段。
3)以质粒载体pWB980为模板，以pWB980-F1和pWB980-R1为引物进行PCR扩增，胶回收纯化获得去除SacB信号肽的线性化基因片段P1。
4)将GI片段和pWB980线性化基因片段P1按同源重组试剂盒说明书进行连接，连接产物电转至枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，得到重组枯草芽孢杆菌命名为WB600/GI，重组质粒命名为pWB980-GI(质粒图谱如图1所示)。通过转化子菌落PCR和测序分析验证是否正确(引物序列如表1所示)。
表1本发明引物序列
5)挑取上述含卡那霉素的LB培养基平板上出现的阳性转化子，接种于5ml含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养；以0.1％接种量接入1L以上含有50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，37℃，200rpm培养48h。按0.1‰加入溶菌酶粉末，37℃，200rpm继续反应1h，即获得GI粗酶液(SDS-PAGE电泳结果如图2所示)。
6)向上述获得的粗酶液中，按终浓度600g/L加入葡萄糖，60℃反应24h。取0.02ml反应液用纯水稀释50倍后，100℃水浴处理10min灭酶，再10000rpm离心10min后，0.22μm微孔滤膜过滤处理，滤液做高效液相色谱分析。
使用带有空质粒pWB980的枯草芽孢杆菌WB600作为空白对照，其他操作条件相同。
高效液相色谱按如下条件进行：安捷伦高效液相色谱仪1200；分析柱：waterssugarpak I色谱柱；流动相：纯水；流速：0.3ml/min，柱温：80度；检测器：示差折光检测器。以sigma公司生产的葡萄糖、果糖、D-阿洛酮糖纯品为标准品，将上述样品进行分析，进样量为10μl。
液相色谱分析结果表明，葡萄糖、果糖和D-阿洛酮糖的出峰时间分别为14.1min、17.9min和26.9min。
空白对照(枯草芽孢杆菌WB600/pWB980)的液相图谱中只有葡萄糖；实验组(枯草芽孢杆菌WB600/pWB980-GI)的液相图谱中既有葡萄糖，也有果糖(液相图谱如图3所示)。该结果表明，上述方法制作的GI粗酶液能将葡萄糖转化为果糖，通过峰面积计算，转化后糖液中含有330g/L的葡萄糖和270g/L的果糖，所占比例为55:45。
实施例2D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)表达工程菌的构建和功能验证
1)选取Ruminococcus sp.来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE，SEQ ID NO:2)，其编码基因根据枯草芽孢杆菌密码子进行优化，优化后的DPE基因序列为SEQ ID NO:4，由金斯瑞生物科技全基因合成，合成好的基因连接到pUC57载体上，命名为pUC57-DPE。
2)编码基因经密码子优化后由金斯瑞生物科技全基因合成，合成好的基因连接到pUC57载体上，命名为pUC57-DPE。
3)以合成的重组质粒pUC57-DPE为模板，以DPE-F和DPE-R为引物进行PCR扩增，胶回收纯化获得DPE片段。
4)以质粒载体pWB980为模板，以pWB980-F2和pWB980-R2为引物进行PCR扩增，胶回收纯化获得去除SacB信号肽的线性化基因片段P2。
5)将DPE片段和pWB980线性化基因片段P2按同源重组试剂盒说明书进行连接，连接产物电转至枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞，得到重组枯草芽孢杆菌命名为WB600/DPE，重组质粒命名为pWB980-DPE(质粒图谱如图1所示)。通过转化子菌落PCR和测序分析验证是否正确(引物序列如表1所示)。
6)挑取上述菌落PCR和测序正确的阳性转化子，接种于5ml含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养；以0.1％接种量接入1L以上含有50mg/L卡那霉素的发酵培养基中，37℃，200rpm培养48h。按0.1‰加入溶菌酶，37℃，200rpm继续反应1h，即获得DPE粗酶液(SDS-PAGE电泳结果如图2所示)。
7)向上述获得的粗酶液中，按终浓度600g/L加入果糖，60℃反应24h。取0.02ml反应液用纯水稀释50倍后，100℃水浴处理10min灭酶，再10000rpm离心10min后，0.22μm微孔滤膜过滤处理，滤液做高效液相色谱分析。
使用带有空质粒pWB980的枯草芽孢杆菌WB600作为空白对照，其他操作条件相同。
高效液相色谱按如下条件进行：安捷伦高效液相色谱仪1200；分析柱：waterssugarpak I色谱柱；流动相：纯水；流速：0.3ml/min，柱温：80℃；检测器：示差折光检测器。以sigma公司生产的葡萄糖、果糖、D-阿洛酮糖纯品为标准品，将上述样品进行分析，进样量为10μl。
液相色谱分析(见图4)结果表明，葡萄糖、果糖和D-阿洛酮糖的出峰时间分别为14.1min、17.9min和26.9min。
空白对照(枯草芽孢杆菌WB600/pWB980)的液相图谱中只有果糖；实验组(枯草芽孢杆菌WB600/pWB980-DPE)的液相图谱中既有果糖，也有D-阿洛酮糖(液相图谱如图5所示)。该结果表明，上述方法制作的DPE粗酶液能将果糖转化为D-阿洛酮糖，通过峰面积计算，转化后糖液中含有426g/L的果糖和174g/L的D-阿洛酮糖，所占比例为71:29。
实施例3GI工程菌和DPE工程菌混合发酵生产果葡糖浆和D-阿洛酮糖
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1和2所述的两种工程菌接入LB种子培养基中，37℃，200rpm过夜培养进行富集，获得OD600值为3-6的种子液；
(2)将步骤(1)获得的两种重组菌菌株的种子液分别按照0.1％
(v/v)的比例共同接入同一发酵培养基中进行混合发酵，发酵温度37℃，200rpm培养48h，获得发酵液。
(3)向步骤(2)获得的发酵液中按照0.1‰(w/v)加入溶菌酶，37℃，200rpm反应1h，以破菌释放胞内酶，获得粗酶液。
(4)向步骤(3)获得的粗酶液中，按终浓度600g/L加入葡萄糖，60℃反24h，获得转化糖浆。
(5)将步骤(4)获得的转化糖浆用孔径8-10nm的陶瓷膜过滤除杂，通量50L/㎡/h，获得透过液。
(6)将步骤(5)获得的透过液用截留分子量100-300道尔顿的纳滤膜过滤除杂脱色，通量10L/㎡/h，获得透过液。
(7)将步骤(6)获得透过液先经过阳离子树脂，再经过阴离子树脂，去除阴阳离子；阳离子树脂型号为D001-FD，阴离子树脂型号为D354-FD；获得脱盐后糖液。
(8)再将步骤(7)脱盐后糖液进行色谱分离，获得AD液为阿洛酮糖糖液，BD液为葡萄糖、果糖混合糖液。色谱分离过程中控制糖液浓：15-25％，温度50-60℃，压力0.2-0.3MPa，水料质量比为1：2，处理量2.2kg/kg/d；
(9)将步骤(8)获得的AD液和BD浓缩至固形物质含量为75％，获得D-阿洛酮糖糖浆和果葡糖浆。
对比例1
选取CN113980880专利中葡萄糖异构酶(GI，核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:1)和D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE，核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:3)，按照本发明实施例1，2的方法分别构建表达葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌和表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌工程菌，然后按照本发明实施例3的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
对比例2(GI不同属(与本发明GI同源性56％)，DPE相同)
选取CN113980880专利中葡萄糖异构酶(GI，核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:1)，按照本发明实施例1的方法构建表达GI的枯草芽孢杆菌工程菌。使用构建好的GI表达菌种与本发明构建的DPE表达菌种按照本发明实施例3的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
对比例3(GI不同属(与本发明GI同源性97％)，DPE相同)
选取水管致黑栖热菌(ThermusScotoductus)来源的葡萄糖异构酶(GI，登录号WP_126200404.1)，经密码子优化后(GI核酸序列为SEQ ID NO:5)，按照本发明实施例1的方法构建表达GI的枯草芽孢杆菌工程菌。使用构建好的GI表达菌种与本发明构建的DPE表达菌种按照本发明实施例3的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
对比例4(GI相同，DPE不同(与本发明DPE同源性40％))
选取CN113980880专利中D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE，核酸序列参见CN113980880的记载中的SEQ ID NO:3)，按照本发明实施例2的方法构建表达DPE的枯草芽孢杆菌工程菌。使用构建好的DPE表达菌种与本发明构建的GI表达菌种按照本发明实施例3的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
对比例5(GI相同，DPE不同(与本发明DPE同源性69％))
选取窦口杆菌(Oribacterium sinus)来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE，WP_183684385.1)，经密码子优化后(核酸序列为SEQ ID NO:6)，按照本发明实施例2的方法构建表达DPE的枯草芽孢杆菌工程菌。使用构建好的DPE表达菌种与本发明构建的GI表达菌种按照本发明实施例3的方法制备含葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的转化糖浆。
试验例
按照实施例3、对比例1～5的方法制备转化糖浆，分别取反应2h、4h、6h、12h、24h的样品，HPLC检测葡萄糖、果糖和阿洛酮糖的含量，计算阿洛酮糖的生产速率。结果见表2。
表2
由以上结果可知，虽然对比例1～5和本发明工程菌株生产的酶催化葡萄糖生产阿洛酮糖的效率相当，均在15～18％之间，但达到平衡转化率所用的时间有明显差异，分别为6h、6h、12h、4h、12h和2h。其中，本发明特定来源的酶组合所用时间最短，明显低于其他对比例；且阿洛酮糖的生产速率最大，明显高于其他对比例。因此，可以确定本发明提供的Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcus sp.来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的组合对葡萄糖的催化活性最高，为最佳组合。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括：
1)将编码Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶和Ruminococcussp.来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因分别转入枯草芽孢杆菌，获得GI工程菌和DPE工程菌；
2)将所述GI工程菌和DPE工程菌混合接入发酵培养基发酵，破菌后获得含葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶的粗酶液；
3)以所述粗酶液为催化剂催化葡萄糖发生异构反应，获得D-阿洛酮糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述葡萄糖异构酶的氨基酸序列选自如下任意一项；
a)如SEQ ID NO:1所示；
b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的蛋白活性不发生改变的氨基酸序列；或
c)与SEQ ID NO:1所示序列至少有90％同源性且蛋白活性与SEQ ID NO:1所示序列的蛋白活性相同或相似的氨基酸序列；
所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列选自如下任意一项:
A)如SEQ ID NO:2所示；
B)SEQ ID NO:2所示序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的蛋白活性不发生改变的氨基酸序列；或
C)与SEQ ID NO:2所示序列至少有90％同源性且与SEQ ID NO:2所示序列的蛋白活性相同或相似的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述编码葡萄糖异构酶的基因依照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述编码D-阿洛酮糖3-差向异构酶的基因依照枯草芽孢杆菌密码子偏好性进行优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述发酵具体为37℃，200rpm培养48h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中将所述发酵的培养基包括水和如下组分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，磷酸氢二钾15g/L，四水氯化锰0.1g/L，七水硫酸镁0.1g/L，葡萄糖6g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述工程菌在接入发酵培养基进行混合发酵前还包括将所述工程菌制成种子液的步骤：将所述工程菌接入LB种子培养基，37℃，200rpm过夜培养，获得种子液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述破菌具体为：将溶菌酶和发酵液按照质量体积比为0.1‰的比例混合，37℃，200rpm反应1h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述异构反应的温度为60℃，时间为2～24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述异构反应之后还包括将反应产物依次进行过滤、纯化、色谱分离、浓缩，分别获得D-阿洛酮糖和果葡糖。
10.复合工程菌，其特征在于，包括表达Thermus thermophilus来源的葡萄糖异构酶的枯草芽孢杆菌和表达Ruminococcus sp.来源的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的枯草芽孢杆菌。
11.权利要求10所述的复合工程菌在生产D-阿洛酮糖中的应用，或在制备降糖降脂产品中的应用。
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