CN113621629A

CN113621629A - 一种基于丙二酰辅酶a再生的柚皮素体外酶促合成方法

Info

Publication number: CN113621629A
Application number: CN202110870360.7A
Authority: CN
Inventors: 张新跃; 聂也森; 何妍之; 张智萍; 丁笠; 陈磊; 廖凯; 赵晨宏
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2021-07-30
Filing date: 2021-07-30
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-07-30
Also published as: CN113621629B

Abstract

本发明设计一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，在构建乙酰辅酶A合成酶ACS基因与乙酰辅酶A羧化酶ACC1基因的重组表达质粒的基础上，将重组质粒分别转化大肠杆菌和酵母细胞，表达目的蛋白，并将纯化的ACS与ACC1重组蛋白加入柚皮素体外酶促合成体系中，实现了丙二酰辅酶A的再生，以及以4‑香豆酸为底物在体外低成本酶促合成柚皮素。本发明设计了一个新的反应体系，无需添加昂贵的丙二酰辅酶A便能对其进行再生利用，并最终生成柚皮素。

Description

一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法

技术领域

本发明涉及一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，分类号为C12N9，属于生物医药技术领域。

背景技术

丙二酰辅酶A（malonyl-coenzyme A）是一种辅酶A衍生物。作为一种关键的中间代谢物，丙二酰辅酶A在多种代谢途径中发挥重要作用，是细胞内合成脂肪酸和甘油三酯的重要前体分子（Kastaniotis A J, et al. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids,2017, 1862(1): 39-48.），也是合成聚酮类化合物（Shimizu Y, et al. Chembiochem,2017, 18(1): 50-65.）和许多平台化合物（Kildegaard K R, et al. Microb Cell Fact,2016, 15: 53.）的原材料。

一般而言，细胞内的辅酶A经乙酰辅酶A合成酶（acetyl-CoA synthase, ACS）和乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase, ACC）的先后催化，形成丙二酰辅酶A（Qu Q, etal. Cell Death Dis, 2016, 7(5): e2226.）。丙二酰辅酶A在参与细胞反应并被消耗的同时，脱去羧基重新生成辅酶A（Waki T, et al. Nat Commun, 2020, 11(1): 870.）。因此，丙二酰辅酶A在细胞内处于一种动态平衡。由于丙二酰辅酶A的胞内含量低，分离和纯化难度较大，并且难以通过化学方法合成，导致其市场价格通常远高于其下游产品，因而制约了这一辅助因子在工业化生产中的广泛应用。

近年来，学者们尝试通过多种途径提高微生物细胞内丙二酰辅酶A的量，如通过提高细胞内乙酰辅酶A的含量（Krivoruchko A, et al. Metab Eng, 2015, 28: 28-42.）或乙酰辅酶A羧化酶的表达水平（Wang J C, et al. Biosci Biotechnol Biochem, 2016,80(6): 1214-1222.）等手段促进丙二酰辅酶A的形成，同时限制丙二酰辅酶A流向与目标分子无关的通路（Yang D，et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(40): 9835-9844.），从而提高目标分子的产量。然而，目前在体外合成体系中尚无类似策略降低因丙二酰辅酶A带来的高生产成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术的不足而提供一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素酶促合成方法，该方法首先建立一种丙二酰辅酶A的再生体系，以显著降低了体外酶促合成柚皮素时因昂贵的丙二酰辅酶A所带来的高成本，该体系同样适应于其他需要以丙二酰辅酶A为底物的生化反应；同时构建一种高活性三功能酶，并通过优化体外反应条件显著提高了目标分子的产量和底物的总转化率。

本发明提供了一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，具体包括以下步骤：

步骤1、克隆丙二酰辅酶A再生体系中关键酶基因

从大肠杆菌中克隆ACS基因，构建重组质粒pET-32a-ACS，从毕赤酵母中克隆ACC1基因，构建重组质粒pGAP-Neo-ACC1；

步骤2、重组蛋白ACS和ACC1的诱导表达与纯化

将重组质粒pET-32a-ACS转化感受态大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组蛋白ACS；同时将重组质粒pGAP-Neo-ACC1转化毕赤酵母，经过表达和纯化，得到重组蛋白ACC1；

步骤3、从头合成柚皮素的重组三功能酶的构建、表达与纯化

利用重叠延伸PCR技术，将大豆的4-香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI以及高粱的查尔酮合酶基因CHS2用柔性连接肽(GGGGS)₂相连接，构建原核表达质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI，将原核表达质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI转化大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组三功能酶；

步骤4、建立基于丙二酰辅酶A再生的体外酶促合成体系

基于丙二酰辅酶A再生的体外酶促合成体系至少包含Tris-HCl、磷酸钾缓冲液、甘油、MgCl₂、ATP、CoA、醋酸钠、NaHCO₃、ACS、ACC1，并在该体系中加入用于合成柚皮素的重组三功能酶，然后在一定条件下反应得到反应产物。

本发明设计一种丙二酰辅酶A再生的反应体系，在构建乙酰辅酶A合成酶ACS基因与乙酰辅酶A羧化酶ACC1基因的重组表达质粒的基础上，将重组质粒分别转化大肠杆菌和酵母细胞，表达目的蛋白，并将纯化的ACS与ACC1重组蛋白加入柚皮素体外酶促合成体系中，实现了丙二酰辅酶A的再生，以及以4-香豆酸为底物在体外低成本酶促合成柚皮素。本发明设计了一个新的反应体系，无需添加昂贵的丙二酰辅酶A便能对其进行再生利用，并最终生成柚皮素。该体系仅需添加低成本的无机盐、ATP和能够维持丙二酰辅酶A循环生成的辅酶A，反应产物单一，易于分离纯化，成本可控，使柚皮素体外合成在生产层面成为可能，同时为其他利用丙二酰辅酶A进行生产的方案提供新思路。

所述步骤1中，克隆ACS基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5’-GCTGATATCGGATCC GAATTC atgagccaaattcacaaacac-3’，斜体碱基示酶切位点EcoRI；反向引物为5’-GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAG ttacgatggcatcgcgatag-3’，斜体碱基示酶切位点XhoI；

克隆ACC1基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5’-CTATTTCGAAACGAG GAATTC ATGAGCGAAGAAAGCTTATTC-3’，斜体碱基示酶切位点EcoRI；反向引物为5’-TCGGGCCCAAGCTG GCG GCCGC CTTTCAAAGTCTTCAACAATTTTTC-3’，斜体碱基示酶切位点NotI。

采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）将PCR片段分别克隆至原核表达质粒pET-32a(+)和酵母表达质粒pGAP-Neo。

所述步骤2中，取重组质粒pET-32a-ACS，常规转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，37℃、220 rpm培养过夜；挑取3～5个菌落，接种至含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃、250 rpm培养过夜；按照1:100转接至300 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃ 250 rpm培养约2 h，至菌液OD_600nm达0.4～0.6；向菌液中加入IPTG至终浓度0.1 mM，20 ℃诱导表达4 h，4 ℃离心收集菌体；参照碧云天BeyoGold™ His-tag PurificationResin试剂说明书纯化重组蛋白；用Tris-Cl缓冲液（pH 7.5）常规透析纯化的重组蛋白，再用PEG 20000进行浓缩，收集蛋白溶液，加入甘油至终浓度10%，分装，-80 ℃保存备用。

取重组质粒pGAP-Neo-ACC1，LiCl法转化毕赤酵母GS115，涂板含有500 µg/mL G-418的YPD平板，30 ℃恒温培养箱中倒置培养；3 d后，挑取单菌落，接种至2 mL含有500 µg/mL G-418的YPD液体培养基中，30 ℃、250 rpm培养24 h；按1：100转接300 mL含有500 µg/mL G-418的YPD液体培养基，30 ℃、250 rpm继续培养12 h；4 ℃、5000 g离心10 min，收集菌体；加入16.5 g 0.4 mm玻璃珠和21 mL非变性裂解液，在涡旋振荡仪中破碎酵母菌体；离心，收集裂解上清，进行硫酸铵沉淀，硫酸铵终浓度为40%饱和度；4 ℃、7000 g离心20 min，弃上清，沉淀用非变性裂解液溶解；参照碧云天BeyoGold™ His-tag Purification Resin试剂说明书纯化重组蛋白；配制pH 7.5透析缓冲液（含100 mM Tris-HCl和100 mM磷酸钾），对纯化后的蛋白透析3次，3 h/次；PEG 20000浓缩透析后的蛋白溶液，加入甘油至终浓度10%，分装，-80 ℃保存备用。

所述步骤3中，利用重叠延伸PCR技术拼接基因片段，将大豆的4-香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI，高梁的查尔酮合酶基因CHS2重组为单一序列，克隆至原核表达载体pET-32a-SUMO，构建重组质粒

pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI，各个关键酶之间通过连接肽(GGGGS)₂相连接。将上述重组质粒按常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3),经0.05 mM IPTG于16 ℃诱导表达12 h，利用镍柱亲和纯化重组三功能酶蛋白，透析，PEG20000浓缩，加入甘油至终浓度10%，分装，-80 ℃保存备用。

构建重组质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI过程中，克隆4CL1基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GAACAGATTGGTGGT GGATCC ATGGCACCTTCTCCACAA-3’，斜体碱基示酶切位点BamHI；反向引物为5’-CGACCCACCTCCGCCCGACCCACCTCCGCCACTAGTATTGGCCACCACCAAACC-3’。

克隆CHS2基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GGCGGAGGTGGGTCGGCTAGCATGGCCGGCGCGACTGTG-3’；反向引物为5’-ACTGCCCCCGCCACCCGATCCCCCGCCACCGGATCCGGCGGTGATGGCCGCTCCG-3’；

克隆CHI基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GGTGGCGGGGGCAGTGAATTCATGGCAACGATCAGCGCG-3’；

反向引物为5’-GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAG TCAGACTATAATGCCGTGGC-3’，斜体碱基示酶切位点XhoI。

利用重叠延伸PCR技术拼接各个基因片段，用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）将PCR片段克隆至原核表达质粒pET-32a-SUMO。

所述步骤4中，设计基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成体系，该体系包括Tris-HCl、磷酸钾缓冲液、甘油、MgCl₂、BSA、DMSO、β-巯基乙醇、ATP、CoA、mM 醋酸钠、NaHCO₃、4-香豆酸、ACS、ACC1、重组三功能酶。

所述步骤4中，设计基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成体系，该体系包括100 mM Tris-HCl（pH 6.8-8.1）、100 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.8-8.1）、10% 甘油、5 mMMgCl₂、0.1 mg/mL BSA、1% DMSO、1 mM β-巯基乙醇、6 mM ATP、1 mM CoA、1～20 mM 醋酸钠、5～65 mM NaHCO₃、0.3～1.5 mM 4-香豆酸、60 μg/mL ACS、60 μg/mL ACC1、60 μg/mL4CC，4CC为重组三功能酶；将配制的合成体系置于恒温摇床中，在25～35 ℃、600 rpm条件下反应6 h，加入NaOH溶液至终浓度为1 M，终止反应。

反应产物的检测：取上述已经终止反应的100 μL反应液，加入等体积乙酸乙酯，萃取2 h，吸取上层有机相。同上再次萃取，合并有机相，空气干燥，加入75 μL HPLC级甲醇溶解，再加入75 μL 50% HPLC级乙腈，混匀，经0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，进行高效液相色谱分析（HPLC）。

本发明建立了一种丙二酰辅酶A的体外再生体系，并在此基础上以4-香豆酸为原料在重组三功能酶的催化下从头合成柚皮素，其产量高达3.99 mg/L；并且本发明的柚皮素体外酶促合成体系成分简单，不存在工程菌细胞内复杂的调控作用，反应过程易于精确控制、副产物少、产品分离相对简单、生产周期明显缩短、生产成本显著降低。

附图说明

图1为本发明三功能酶纯化蛋白的SDS-PAGE电泳图。图中：1表示ACS，2表示ACC1，3表示4CC。

图2为本发明中HPLC法分析三功能酶活性的结果图。图中：A表示4-香豆酸标准品，出峰时间为6.11 min；B表示柚皮素标准品，出峰时间为11.22 min；C表示实验组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。

实施例中所涉及材料的来源：

G-418购自Gibco公司；0.4 mm玻璃珠购自柏奥易杰EASYBIO公司。毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司；非变性裂解液由本实验室配制，每升含6.9 g NaH2PO4•H2O，17.54 gNaCl，蒸馏水溶解后用10 M氢氧化钠调节pH值至8.0；pET-32a-SUMO载体由本实验室构建：将Novagen公司的pET-32a(+)载体中的硫氧还蛋白TrxA替换为小分子泛素样修饰蛋白SUMO后得到；pGAP-Neo载体由本实验室构建：将Invitrogen公司的pGAPZ A载体的博来霉素抗性基因替换为新霉素抗性基因后得到。

本实施例所涉及的其余试剂及材料均为市购，此处不再一一列举。本实施例中所涉及的“%”若没有特殊说明，一般为质量百分比。

实施例1

1.重组质粒的构建

根据GenBank数据库提供的大肠杆菌乙酰辅酶A合成酶基因ACS和酵母乙酰辅酶A羧化酶基因ACC1的核苷酸序列信息，设计两对引物序列，用于将ACS基因的编码区克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a(+),将ACC1基因的编码区克隆至毕赤酵母表达载体pGAP-Neo：

PCR扩增ACS基因的正向引物为5’-GCTGATATCGGATCCGAATTCatgagccaaattcacaaacac-3’（如SEQ ID No.3所示），斜体碱基表示酶切位点EcoRI；反向引物为5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGttacgatggcatcgcgatag-3’（如SEQ ID No.4所示），斜体碱基表示酶切位点XhoI。

PCR扩增ACC1基因的正向引物为

5’-CTATTTCGAAACGAGGAATTCATGAGCGAAGAAAGCTTATTC-3’（如SEQ ID No.5所示），斜体碱基表示酶切位点EcoRI；反向引物为5’-TCGGGCCCAAGCTGGCGGCCGCCTTTCAAAGTCTTCAACAATTTTTC-3’（如SEQ ID No.6所示），斜体碱基表示酶切位点NotI。

参照康为世纪Super Pfx DNA Polymerase操作说明建立如下PCR扩增体系：

试剂	100 μL反应体系
		5×Super Pfx HF Buffer	20 μL
dNTP Mix，10 mM each	2 μL
		Forward Primer，10 μM	5 μL
Reverse Primer，10 μM	5 μL
		Template DNA	1 μL
Super Pfx DNA Polymerase	1 μL
		ddH<sub>2</sub>O	66 μL

扩增ACS基因的模板DNA为培养4 h的大肠杆菌DH5α菌液1 μL，扩增ACC1基因的模板DNA为毕赤酵母GS115的cDNA，PCR反应条件如下：

步骤	温度	时间
			预变性	98 ℃	3 min
变性	98 ℃	5 s
			退火	45 ℃	15 s
延伸	72 ℃	2 min 30 s
			终延伸	72 ℃	10 min

PCR反应产物进行DNA凝胶电泳并对目的条带进行胶回收。载体pET-32a(+)和pGAP-Neo分别经EcoRI/XhoI和EcoRI/NotI双酶切，进行DNA凝胶电泳并对目的条带进行胶回收。使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（ClonExpress II One Step Cloning Kit）连接目的片段和载体，常规转化感受态大肠杆菌DH5α，均匀涂布于氨苄抗性的LB平板，37 ℃过夜培养。第二天挑单菌落，接种至3 mL氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃ 250 rpm培养15 h，提取质粒后进行测序鉴定，获得重组质粒pET-32a-ACS 和pGAP-Neo-ACC1。

用重叠延伸PCR技术拼接关键酶基因4CL1、CHS2和CHI，用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒（ClonExpress II One StepCloning Kit）将PCR片段克隆至原核表达质粒pET-32a-SUMO，构建重组质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI。构建重组质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI过程中，根据黄豆的4-香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI以及高粱的查尔酮合酶基因CHS2设计引物，克隆4CL1基因时，设计一对PCR引物：

克隆CHS2基因时，设计一对PCR引物：

克隆CHI基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GGTGGCGGGGGCAGTGAATTCATGGCAACGATCAGCGCG-3’；

2.重组蛋白的诱导表达与纯化

2.1ACS的诱导表达与纯化

取重组质粒pET-32a-ACS，常规转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，37 ℃、220 rpm培养过夜；挑取3～5个菌落，接种至含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37 ℃、250 rpm培养过夜；按照1:100转接至300 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃ 250 rpm培养约2 h，至菌液OD_600nm达0.4～0.6；向菌液中加入IPTG至终浓度0.1 mM，20 ℃诱导表达4h，4 ℃离心收集菌体；参照碧云天BeyoGold™ His-tag Purification Resin试剂说明书纯化重组蛋白；用Tris-Cl缓冲液（pH 7.5）常规透析纯化的重组蛋白，再用PEG 20000进行浓缩，收集蛋白溶液，加入甘油至终浓度10%，分装，-80 ℃保存备用。重组蛋白ACS的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.2ACC1的表达与纯化

取重组质粒pGAP-Neo-ACC1，采用LiCl法转化毕赤酵母GS115（购自Invitrogen公司），涂板为含有500 µg/mL遗传霉素G-418（购自Gibco公司）的YPD平板，30 ℃恒温培养箱中倒置培养；3 d后，挑取单菌落，接种至2 mL含有500 µg/mL G-418的YPD液体培养基中，30℃、250 rpm培养24 h；按质量比1：100转接到300 mL含有500 µg/mL G-418的YPD液体培养基，30 ℃、250 rpm继续培养12 h；4 ℃、5000 g离心10 min，收集菌体；加入16.5 g 0.4 mm玻璃珠（购自柏奥易杰EASYBIO公司）和21 mL非变性裂解液（由本实验室配制，称取6.9 gNaH₂PO₄•H₂O和17.54 g NaCl，溶于800 mL蒸馏水，用10 M氢氧化钠调节pH值至8.0，再用蒸馏水定容至1 L），在涡旋振荡仪中破碎酵母菌体；离心，收集裂解上清，进行硫酸铵沉淀，硫酸铵终浓度为40%饱和度；4 ℃、7000 g离心20 min，弃上清，沉淀用非变性裂解液溶解；参照碧云天BeyoGold™ His-tag Purification Resin试剂说明书纯化重组蛋白；配制pH7.5透析缓冲液（含100 mM Tris-HCl和100 mM磷酸钾），对纯化后的蛋白透析3次，3 h/次；PEG 20000浓缩透析后的蛋白溶液，加入甘油至终浓度10%，分装，-80 ℃保存备用。重组蛋白ACC1的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.3重组三功能酶的油道表达与纯化

取原核表达质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI，按常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3),经0.05 mM IPTG于16 ℃诱导表达12 h，利用镍柱亲和纯化重组三功能酶蛋白4CC，透析，PEG 20000浓缩，加入甘油至终浓度10%，分装，-80℃保存备用。

对上述三种纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果见图1，图中1表示ACS，2表示ACC1,3表示4CC。

3.基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成体系的建立

设计丙二酰辅酶A的体外合成体系，该体系含有100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100mM 磷酸钾缓冲液（pH 7.5）、10% 甘油、5 mM MgCl₂、0.1 mg/mL BSA、1% DMSO、1 mM β-巯基乙醇、6 mM ATP、1 mM CoA、10 mM 醋酸钠、50 mM NaHCO₃、0.6 mM 4-香豆酸、60 μg/mLACS、60 μg/mL ACC1、60 μg/mL 4CC。将配制的合成体系置恒温摇床中， 30 ℃、600 rpm反应6 h，加入NaOH溶液至终浓度为1 M，终止反应。

4.产品柚皮素的检测条件

取上述已经终止反应的反应液100 μL，加入等体积乙酸乙酯，萃取2 h，吸取上层有机相。同上再次萃取，合并有机相，空气干燥，加入75 μL HPLC级甲醇溶解，再加入75 μL50% HPLC级乙腈，混匀，经0.22 μm有机系微孔滤膜过滤，进行高效液相色谱分析（HPLC），HPLC检测结果如图2所示，图中A表示4-香豆酸标准品，出峰时间为6.11 min；B表示柚皮素标准品，出峰时间为11.22 min；C表示实验组（即上述丙二酰辅酶A的体外合成体系反应后的产物）。HPLC检测条件如下：

仪器设备：美国安捷伦公司1260液质联用仪(Agilent 1260)。

色谱柱：Agilent C18column(150×4.6 mm，5 μm，ThermoFisherScientific.Inc.，San Jose，CA，USA)。柱温：35 ℃。

流动相：A(乙腈)，B(Milli Q水)，梯度洗脱：0-4 min，A：20％-22％，B：80％-78％；4-7 min，A：22％-42％，B：78％-58％；7-10 min，A：42％-38％，B：58％-62％；10-15 min，A：38％-95％，B：62％-5％；15-24 min，A：95％，B：5％；24-25 min，A：95％-20％，B：5％-80％。

进样量：20 μL；流速：1 mL/min；

检测器：紫外检测器(VWD)；

检测波长：λ＝280 nm；330 nm。

经测定，柚皮素的产量为3.99 mg/L。

柚皮素具有多种药理生理活性，在生物医药领域具有广泛的应用前景。与微生物细胞工厂发酵法相比较，本发明提供了一种操作简便、产品分离相对简单、生产周期明显缩短、生产成本显著降低的制备方法。以酿酒酵母生产柚皮素为例，发酵培养一般超过48小时，而使用本发明的制备方法，每次耗时仅3小时，受原材料和人力的限制较小，易于放大。如果算上人工成本，则相对生产成本还会进一步降低，因此潜在的经济效益将是相当可观的。

以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Met Ser Gln Ile His Lys His Thr Ile

165 170 175

Pro Ala Asn Ile Ala Asp Arg Cys Leu Ile Asn Pro Gln Gln Tyr Glu

180 185 190

Ala Met Tyr Gln Gln Ser Ile Asn Val Pro Asp Thr Phe Trp Gly Glu

195 200 205

Gln Gly Lys Ile Leu Asp Trp Ile Lys Pro Tyr Gln Lys Val Lys Asn

210 215 220

Thr Ser Phe Ala Pro Gly Asn Val Ser Ile Lys Trp Tyr Glu Asp Gly

225 230 235 240

Thr Leu Asn Leu Ala Ala Asn Cys Leu Asp Arg His Leu Gln Glu Asn

245 250 255

Gly Asp Arg Thr Ala Ile Ile Trp Glu Gly Asp Asp Ala Ser Gln Ser

260 265 270

Lys His Ile Ser Tyr Lys Glu Leu His Arg Asp Val Cys Arg Phe Ala

275 280 285

Asn Thr Leu Leu Glu Leu Gly Ile Lys Lys Gly Asp Val Val Ala Ile

290 295 300

Tyr Met Pro Met Val Pro Glu Ala Ala Val Ala Met Leu Ala Cys Ala

305 310 315 320

Arg Ile Gly Ala Val His Ser Val Ile Phe Gly Gly Phe Ser Pro Glu

325 330 335

Ala Val Ala Gly Arg Ile Ile Asp Ser Asn Ser Arg Leu Val Ile Thr

340 345 350

Ser Asp Glu Gly Val Arg Ala Gly Arg Ser Ile Pro Leu Lys Lys Asn

355 360 365

Val Asp Asp Ala Leu Lys Asn Pro Asn Val Thr Ser Val Glu His Val

370 375 380

Val Val Leu Lys Arg Thr Gly Gly Lys Ile Asp Trp Gln Glu Gly Arg

385 390 395 400

Asp Leu Trp Trp His Asp Leu Val Glu Gln Ala Ser Asp Gln His Gln

405 410 415

Ala Glu Glu Met Asn Ala Glu Asp Pro Leu Phe Ile Leu Tyr Thr Ser

420 425 430

Gly Ser Thr Gly Lys Pro Lys Gly Val Leu His Thr Thr Gly Gly Tyr

435 440 445

Leu Val Tyr Ala Ala Leu Thr Phe Lys Tyr Val Phe Asp Tyr His Pro

450 455 460

Gly Asp Ile Tyr Trp Cys Thr Ala Asp Val Gly Trp Val Thr Gly His

465 470 475 480

Ser Tyr Leu Leu Tyr Gly Pro Leu Ala Cys Gly Ala Thr Thr Leu Met

485 490 495

Phe Glu Gly Val Pro Asn Trp Pro Thr Pro Ala Arg Met Ala Gln Val

500 505 510

Val Asp Lys His Gln Val Asn Ile Leu Tyr Thr Ala Pro Thr Ala Ile

515 520 525

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530 535 540

Ser Ser Leu Arg Ile Leu Gly Ser Val Gly Glu Pro Ile Asn Pro Glu

545 550 555 560

Ala Trp Glu Trp Tyr Trp Lys Lys Ile Gly Asn Glu Lys Cys Pro Val

565 570 575

Val Asp Thr Trp Trp Gln Thr Glu Thr Gly Gly Phe Met Ile Thr Pro

580 585 590

Leu Pro Gly Ala Thr Glu Leu Lys Ala Gly Ser Ala Thr Arg Pro Phe

595 600 605

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610 615 620

Gly Ala Thr Glu Gly Ser Leu Val Ile Thr Asp Ser Trp Pro Gly Gln

625 630 635 640

Ala Arg Thr Leu Phe Gly Asp His Glu Arg Phe Glu Gln Thr Tyr Phe

645 650 655

Ser Thr Phe Lys Asn Met Tyr Phe Ser Gly Asp Gly Ala Arg Arg Asp

660 665 670

Glu Asp Gly Tyr Tyr Trp Ile Thr Gly Arg Val Asp Asp Val Leu Asn

675 680 685

Val Ser Gly His Arg Leu Gly Thr Ala Glu Ile Glu Ser Ala Leu Val

690 695 700

Ala His Pro Lys Ile Ala Glu Ala Ala Val Val Gly Ile Pro His Asn

705 710 715 720

Ile Lys Gly Gln Ala Ile Tyr Ala Tyr Val Thr Leu Asn His Gly Glu

725 730 735

Glu Pro Ser Pro Glu Leu Tyr Ala Glu Val Arg Asn Trp Val Arg Lys

740 745 750

Glu Ile Gly Pro Leu Ala Thr Pro Asp Val Leu His Trp Thr Asp Ser

755 760 765

Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg Lys

770 775 780

Ile Ala Ala Gly Asp Thr Ser Asn Leu Gly Asp Thr Ser Thr Leu Ala

785 790 795 800

Asp Pro Gly Val Val Glu Lys Leu Leu Glu Glu Lys Gln Ala Ile Ala

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Met Pro Ser

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<211> 2260

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Ile Gly Leu Asn Thr Val Asp Lys Leu Glu Glu Ser Pro Leu Arg Asp

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Phe Val Lys Ser His Gly Gly His Thr Val Ile Ser Lys Ile Leu Ile

50 55 60

Ala Asn Asn Gly Ile Ala Ala Val Lys Glu Ile Arg Ser Val Arg Lys

65 70 75 80

Trp Ala Tyr Glu Thr Phe Gly Asp Asp Arg Thr Val Gln Phe Val Ala

85 90 95

Met Ala Thr Pro Glu Asp Leu Glu Ala Asn Ala Glu Tyr Ile Arg Met

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Ala Val Trp Ala Gly Trp Gly His Ala Ser Glu Asn Pro Leu Leu Pro

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Glu Lys Leu Ser Gln Ser Lys Arg Lys Val Ile Phe Ile Gly Pro Pro

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Gly Lys Leu Val Gly Tyr Val Ser Ala Gly Thr Val Glu Tyr Leu Tyr

355 360 365

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385 390 395 400

Ala Ala Gln Leu Gln Ile Ala Met Gly Ile Pro Met His Arg Ile Ser

405 410 415

Asp Ile Arg Thr Leu Tyr Gly Met Asn Pro His Ser Ala Ser Glu Ile

420 425 430

Asp Phe Glu Phe Lys Thr Gln Asp Ala Thr Lys Lys Gln Arg Arg Pro

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Ile Pro Lys Gly His Cys Thr Ala Cys Arg Ile Thr Ser Glu Asp Pro

450 455 460

Asn Asp Gly Phe Lys Pro Ser Gly Gly Thr Leu His Glu Leu Asn Phe

465 470 475 480

Arg Ser Ser Ser Asn Val Trp Gly Tyr Phe Ser Val Gly Asn Asn Gly

485 490 495

Asn Ile His Ser Phe Ser Asp Ser Gln Phe Gly His Ile Phe Ala Phe

500 505 510

Gly Glu Asn Arg Gln Ala Ser Arg Lys His Met Val Val Ala Leu Lys

515 520 525

Glu Leu Ser Ile Arg Gly Asp Phe Arg Thr Thr Val Glu Tyr Leu Ile

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Lys Leu Leu Glu Thr Glu Asp Phe Glu Asp Asn Thr Ile Thr Thr Gly

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565 570 575

Pro Thr Leu Ala Val Ile Cys Gly Ala Ala Thr Lys Ala Phe Leu Ala

580 585 590

Ser Glu Glu Ala Arg His Lys Tyr Ile Glu Ser Leu Gln Lys Gly Gln

595 600 605

Val Leu Ser Lys Asp Leu Leu Gln Thr Met Phe Pro Val Asp Phe Ile

610 615 620

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Arg Tyr Thr Leu Phe Ile Asn Gly Ser Lys Cys Asp Ile Ile Leu Arg

645 650 655

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900 905 910

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Ser Ala Ala Phe Ser Thr Phe Pro Thr Val Lys Ser Lys Met Gly Met

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1155 1160 1165

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Asp Val Asp Glu Ile Leu Ser Gln Ser Leu Glu Val Ile Pro Arg His

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Gln Ser Ser Ser Asn Gly Pro Ala Pro Asp Arg Ser Gly Ser Ser Ala

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Glu Ser Glu Glu Glu Ile Leu Val Arg Leu Arg Glu Ile Leu Asp Leu

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Asn Lys Gln Glu Leu Ile Asn Ala Ser Ile Arg Arg Ile Thr Phe Met

1250 1255 1260

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1285 1290 1295

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Gly His Ile Arg Asp Asp Ile Ser Ile Gln Glu Tyr Leu Thr Ser Glu

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Ala Asn Arg Leu Met Ser Asp Ile Leu Asp Asn Leu Glu Val Thr Asp

1365 1370 1375

Thr Ser Asn Ser Asp Leu Asn His Ile Phe Ile Asn Phe Ile Ala Val

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Glu Arg Phe Gly Lys Arg Leu Leu Arg Leu Arg Val Ser Ser Ala Glu

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Tyr Thr Glu Val Lys Asn Ala Lys Gly Glu Trp Val Phe Lys Ser Leu

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Gly Lys Pro Gly Ser Met His Leu Arg Pro Ile Ala Thr Pro Tyr Pro

1475 1480 1485

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Val Ile Asn Gly Glu Glu Arg Phe Val Ile Lys Thr Ile Ile Gly Ser

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Glu Asp Gly Leu Gly Val Glu Cys Leu Arg Gly Ser Gly Leu Ile Ala

1700 1705 1710

Gly Ala Thr Ser Arg Ala Tyr His Asp Ile Phe Thr Ile Thr Leu Val

1715 1720 1725

Thr Cys Arg Ser Val Gly Ile Gly Ala Tyr Leu Val Arg Leu Gly Gln

1730 1735 1740

Arg Ala Ile Gln Val Glu Gly Gln Pro Ile Ile Leu Thr Gly Ala Pro

1745 1750 1755 1760

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1810 1815 1820

Asp Thr Trp Asp Arg Pro Val Asp Phe Thr Pro Thr Asn Asp Glu Thr

1825 1830 1835 1840

Tyr Asp Val Arg Trp Met Ile Glu Gly Arg Glu Thr Glu Ser Gly Phe

1845 1850 1855

Glu Tyr Gly Leu Phe Asp Lys Gly Ser Phe Phe Glu Thr Leu Ser Gly

1860 1865 1870

Trp Ala Lys Gly Val Val Val Gly Arg Ala Arg Leu Gly Gly Ile Pro

1875 1880 1885

Leu Gly Val Ile Gly Val Glu Thr Arg Thr Val Glu Asn Leu Ile Pro

1890 1895 1900

Ala Asp Pro Ala Asn Pro Asn Ser Ala Glu Thr Leu Ile Gln Glu Pro

1905 1910 1915 1920

Gly Gln Val Trp His Pro Asn Ser Ala Phe Lys Thr Ala Gln Ala Ile

1925 1930 1935

Asn Asp Phe Asn Asn Gly Glu Gln Leu Pro Met Met Ile Leu Ala Asn

1940 1945 1950

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1955 1960 1965

Lys Tyr Gly Ser Phe Ile Val Asp Ala Leu Val Asp Tyr Lys Gln Pro

1970 1975 1980

Ile Ile Ile Tyr Ile Pro Pro Thr Gly Glu Leu Arg Gly Gly Ser Trp

1985 1990 1995 2000

Val Val Val Asp Pro Thr Ile Asn Ala Asp Gln Met Glu Met Tyr Ala

2005 2010 2015

Asp Val Asn Ala Arg Ala Gly Val Leu Glu Pro Gln Gly Met Val Gly

2020 2025 2030

Ile Lys Phe Arg Arg Glu Lys Leu Leu Asp Thr Met Asn Arg Leu Asp

2035 2040 2045

Asp Lys Tyr Arg Glu Leu Arg Ser Gln Leu Ser Asn Lys Ser Leu Ala

2050 2055 2060

Pro Glu Val His Gln Gln Ile Ser Lys Gln Leu Ala Asp Arg Glu Arg

2065 2070 2075 2080

Glu Leu Leu Pro Ile Tyr Gly Gln Ile Ser Leu Gln Phe Ala Asp Leu

2085 2090 2095

His Asp Arg Ser Ser Arg Met Val Ala Lys Gly Val Ile Ser Lys Glu

2100 2105 2110

Leu Glu Trp Thr Glu Ala Arg Arg Phe Phe Phe Trp Arg Leu Arg Arg

2115 2120 2125

Arg Leu Asn Glu Glu Tyr Leu Ile Lys Arg Leu Ser His Gln Val Gly

2130 2135 2140

Glu Ala Ser Arg Leu Glu Lys Ile Ala Arg Ile Arg Ser Trp Tyr Pro

2145 2150 2155 2160

Ala Ser Val Asp His Glu Asp Asp Arg Gln Val Ala Thr Trp Ile Glu

2165 2170 2175

Glu Asn Tyr Lys Thr Leu Asp Asp Lys Leu Lys Gly Leu Lys Leu Glu

2180 2185 2190

Ser Phe Ala Gln Asp Leu Ala Lys Lys Ile Arg Ser Asp His Asp Asn

2195 2200 2205

Ala Ile Asp Gly Leu Ser Glu Val Ile Lys Met Leu Ser Thr Asp Asp

2210 2215 2220

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2225 2230 2235 2240

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His

2245 2250 2255

His His His His

2260

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgatatcg gatccgaatt catgagccaa attcacaaac ac 42

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtggtggtgg tggtgctcga gttacgatgg catcgcgata g 41

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctatttcgaa acgaggaatt catgagcgaa gaaagcttat tc 42

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgggcccaa gctggcggcc gcctttcaaa gtcttcaaca atttttc 47

Claims

1.一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、从大肠杆菌中克隆ACS基因，构建重组质粒pET-32a-ACS，从毕赤酵母中克隆ACC1基因，构建重组质粒pGAP-Neo-ACC1；

步骤2、将重组质粒pET-32a-ACS转化感受态大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组蛋白ACS；同时将重组质粒pGAP-Neo-ACC1转化毕赤酵母，经过表达和纯化，得到重组蛋白ACC1；

步骤3、将大豆的4-香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI以及高粱的查尔酮合酶基因CHS2用柔性连接肽(GGGGS)₂相连接，构建原核表达质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI，将原核表达质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI转化大肠杆菌，IPTG诱导表达、纯化，得到重组三功能酶；

步骤4、建立基于丙二酰辅酶A再生的体外酶促合成体系，该体系至少包含Tris-HCl、磷酸钾缓冲液、甘油、MgCl₂、ATP、CoA、醋酸钠、NaHCO₃、ACS、ACC1、重组三功能酶，然后在一定条件下反应得到反应产物。

2.根据权利要求1所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于：所述步骤3中，利用重叠延伸PCR技术将大豆的4-香豆酰辅酶A连接酶基因4CL1和查尔酮异构酶基因CHI，高梁的查尔酮合酶基因CHS2克隆至原核表达载体pET-32a-SUMO，构建重组质粒

pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI，将该重组质粒按常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达，利用镍柱亲和纯化获得重组三功能酶蛋白。

3.根据权利要求2所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，构建重组质粒pET-32a-SUMO-4CL1-(GGGGS)₂-CHS2-(GGGGS)₂-CHI过程中，克隆4CL1基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GAACAGATTGGTGGT GGATCC ATGGCACCTTCTCCACAA-3’；反向引物为5’-CGACCCACCTCCGCCCGACCCACCTCCGCCACTAGTATTGGCCACCACCAAACC-3’。

4.根据权利要求2所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，

克隆CHS2基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GGCGGAGGTGGGTCGGCTAGCATGGCCGGCGCGACTGTG-3’；反向引物为5’-ACTGCCCCCGCCACCCGATCCCCCGCCACCGGATCCGGCGGTGATGGCCGCTCCG-3’。

5.根据权利要求2所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，克隆CHI基因时，设计一对PCR引物：

正向引物为5’-GGTGGCGGGGGCAGTGAATTCATGGCAACGATCAGCGCG-3’；

反向引物为5’-GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAG TCAGACTATAATGCCGTGGC-3’。

6.根据权利要求1所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，所述步骤4中，设计基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成体系，该体系包括Tris-HCl、磷酸钾缓冲液、甘油、MgCl₂、BSA、DMSO、β-巯基乙醇、ATP、CoA、mM 醋酸钠、NaHCO₃、4-香豆酸、ACS、ACC1、重组三功能酶。

7.根据权利要求6所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，所述步骤4中，设计基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成体系，该体系包括100 mM Tris-HCl、100 mM 磷酸钾缓冲液、10% 甘油、5 mM MgCl₂、0.1 mg/mL BSA、1%DMSO、1 mM β-巯基乙醇、6 mM ATP、1 mM CoA、1～20 mM 醋酸钠、5～65 mM NaHCO₃、0.3～1.5 mM 4-香豆酸、60 μg/mL ACS、60 μg/mL ACC1、60 μg/mL重组三功能酶。

8.根据权利要求7所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，将配制的合成体系置于恒温摇床中，在25～35 ℃、600 rpm条件下反应6 h，加入NaOH至终浓度为1 M，终止反应。

9.根据权利要求1所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，所述步骤1中，克隆ACS基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5’-GCTGATATCGGATCC G AATTC atgagccaaattcacaaacac-3’；反向引物为5’-GTGGTGGTGGTGGTG CTCGAG ttacgatggcatcgcgatag-3’。

10.根据权利要求1所述一种基于丙二酰辅酶A再生的柚皮素体外酶促合成方法，其特征在于，所述步骤1中，克隆ACC1基因时，设计一对PCR引物：正向引物为5’-CTATTTCGAAACGAG GAATTC ATGAGCGAAGAAAGCTTATTC-3’；反向引物为5’-TCGGGCCCAAGCTG GCGGCCGC CTTTCAAAGTCTTCAACAATTTTTC-3’。