CN114231579A - 一种连续、循环制备d-阿洛酮糖的方法 - Google Patents

一种连续、循环制备d-阿洛酮糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种连续、循环制备D‑阿洛酮糖的方法包括以下步骤:(1)用Tris‑HCl缓冲液配置10g/L D‑果糖溶液。(2)向D‑果糖溶液加入终浓度为1mM的Mn2+得到果糖底物。(3)对D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶进行固定化。(4)在串联填充床中填充固定化D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶作为催化剂和钙离子树脂。(5)通过蠕动泵将果糖底物输入到串联填充床装置中进行催化反应和吸附,(6)最后对填充柱进行脱附、冲洗,得到D‑阿洛酮糖。本发明是边反应边吸附制备D‑阿洛酮糖的方法,可以打破D‑果糖转化D‑阿洛酮糖的可逆反应平衡,消耗更多的底物,提高产率,同时反应时间短,固定化酶可重复使用,适合工业化生产。

Description

一种连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法
技术领域
本发明涉及一种连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法,属于功能糖制备技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体,是一种天然存在的稀有单糖,在自然界中存在量极少。D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70%,但是能量值是蔗糖的0.3%,同时,D-阿洛酮糖还有良好的功能特性,可以抑制脂肪酶的活性减少脂肪堆积、降低餐后血糖的水平,抑制肝脂肪酶活性清除活性氧族,预防和治疗糖尿病,因此D-阿洛酮糖是一种理想的甜味剂和蔗糖代替品。
在用于制造D-阿洛酮糖的方法中有化学方法和生物方法,由于化学方法会产生大量的副产物和使用大量化学试剂,目前制备D-阿洛酮糖以生物方法进行制备,通常是以D-果糖为底物,用D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行催化转化,但是D-果糖的差向异构化存在反应平衡,在连续化生产D-阿洛酮糖的过程中会造成D-果糖大量的浪费,为了充分利用D-果糖,提高D-阿洛酮糖的转化率,开发可以高效利用D-果糖的方法对阿洛酮糖实现工业化是有必要的。
目前,有关在串联填充床中利用固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化转化D-果糖和钙离子树脂吸附D-阿洛酮糖打破反应平衡,提高D-阿洛酮糖转化率,连续并循环反应的方法和装置尚未报道。
发明内容
为了解决现有技术不足,本发明的目的是提供一种连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法和装置。
为实现上述目的,本发明的技术方案是:
一种连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法包括以下步骤:
(1)用pH为8的50mM Tris-HCl缓冲液配置终浓度为10g/LD-果糖溶液。
(2)向步骤(1)的D-果糖溶液加入终浓度为1mM的Mn2+得到果糖底物,Mn2+作为酶反应的辅因子。
(3)对酶进行固定化:在冰浴条件下,将2-5wt%海藻酸钠和10mg/L粗酶液混合均匀后,通过10mL的注射器以一定的速度推动,形成大小均一的圆球,在1-6wt%CaCl2溶液下固定化2h;优选地,海藻酸钠和氯化钙用量均为3wt%。
(4)在串联填充床的一个填充柱中填充固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶作为催化剂,在另一填充柱中填充钙离子树脂。所述填充柱均与循环水浴锅相连,并用保温棉包裹填充柱,用于控制填充柱中反应温度。
(5)将步骤(2)配置好的果糖底物加入到带有通冷却水的反应瓶中,通过蠕动泵将果糖底物以1mL/min-10mL/min的速率输入到串联填充床装置中,在填充固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的填充柱中以40℃-80℃进行催化反应,反应产物在填充钙离子树脂的填充柱中以30℃-90℃进行D-阿洛酮糖吸附,未反应的果糖底物再次流入反应瓶中;优选地,催化反应温度为50℃,D-阿洛酮糖吸附温度为70℃,流速为5mL/min。串联填充床装置中固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的填充量为填充柱的1/3,阳离子树脂是钙离子树脂,填充量是填充柱的3/4。
(6)循环反应进行一定时间后,对填充钙离子树脂的填充柱进行脱附,用去离子水3mL/min流速冲洗,得到钙离子树脂吸附的D-阿洛酮糖。
进一步地,反应瓶中加入转子并在智能磁力搅拌器上以700rmb的速度搅拌,保证反应液浓度均匀。
所用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶是由根癌农杆菌CGMCC1.1488的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因表达的(参考Production of D-psicose from D-glucose by co-expression of D-psicose 3-epimerase and xylose isomerase),为了使基因更好的在大肠杆菌表达,将目的基因碱基序列与质粒PET28a(+)构建表达载体,且成功在大肠杆菌中表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶。所述目的基因碱基序列为ATGAAACACGGCATCTACTATAGCTACTGGGAACACGAATGGTCTGCGAAATTCGGTCCGTACATCGAAAAAGTTGCGAAACTGGGCTTCGATATCCTGGAAGTTGCGGCGCACCACATCAACGAATACAGCGATGCGGAACTGGCTACCATCCGTAAATCTGCGAAAGATAACGGTATCATTCTGACCGCGGGCATCGGCCCGAGCAAAACCAAAAACCTGTCTAGCGAAGATGCGGCGGTTCGTGCGGCGGGTAAAGCGTTCTTCGAACGTACCCTGTCTAACGTTGCGAAACTGGATATCCACACCATCGGCGGCGCGCTGCACAGCTACTGGCCGATCGATTACTCTCAGCCGGTTGACAAAGCGGGCGATTACGCGCGTGGTGTTGAAGGTATCAACGGCATTGCAGATTTCGCGAACGATCTGGGTATCAACCTGTGCATCGAAGTTCTGAACCGTTTCGAAAACCACGTTCTGAACACCGCGGCGGAAGGTGTTGCTTTCGTGAAAGACGTTGGCAAAAACAACGTTAAAGTTATGCTGGATACCTTCCACATGAACATCGAAGAAGATAGCTTCGGCGATGCGATCCGTACCGCGGGCCCGCTGCTGGGTCACTTCCACACCGGTGAATGCAACCGTCGTGTTCCGGGCAAAGGCCGTATGCCGTGGCACGAAATCGGTCTGGCGCTGCGTGATATCAACTACACCGGTGCGGTGATCATGGAACCGTTCGTTAAAACCGGCGGCACCATCGGTAGCGATATCAAAGTTTGGCGTGATCTGTCTGGTGGTGCGGATATCGCGAAAATGGATGAAGATGCGCGTAACGCGCTGGCGTTCTCTCGTTTCGTTCTGGGCGGCTAA。
有益效果:本发明是一种边反应边吸附制备D-阿洛酮糖的方法,可以打破D-果糖转化D-阿洛酮糖的可逆反应平衡,消耗更多的底物,提高D-阿洛酮糖的产率,同时反应时间短,固定化酶可重复使用,适合工业化生产。
附图说明
图1是本发明的连续、循环制备D-阿洛酮糖的装置示意图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
参照图1,连续、循环制备D-阿洛酮糖的装置由依次连接的反应瓶、蠕动泵、填充柱1、填充柱2组成,其中反应瓶用于放置果糖底物,并与循环冷却水想通,控制果糖底物温度。填充柱1填充有固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,且与水浴锅1相连,用于控制填充柱1中反应温度。填充柱2填充有用于吸附D-阿洛酮糖的钙离子树脂,且填充柱2的末端与反应瓶相连,未反应的果糖底物重新回流到反应瓶中再次进行反应。
实施例1
将0.3gD-果糖、0.006gMn2+、300mLpH为8的Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入到500mL自制反应瓶中,磁力搅拌转速设定为700rpm, 冷却水连通反应瓶,固定化酶和钙离子树脂分别填充到填充柱1和填充柱2中,填充量分别为1/3和3/4,水浴锅设定为40℃和70℃分别作为酶促反应温度和钙离子树脂吸附温度,蠕动泵设定流速为5mL/min,反应1h取一次样,持续12h,通过高效液相色谱测样,测定转化率为24.326%。
实施例2
将0.3gD-果糖、0.006gMn2+、300mLpH为8的Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入到500mL自制反应瓶中,磁力搅拌转速设定为700rpm, 冷却水连通反应瓶,固定化酶和钙离子树脂分别填充到填充柱1和填充柱2中,填充量分别为1/3和3/4,水浴锅设定为50℃和70℃分别作为酶促反应温度和钙离子树脂吸附温度,蠕动泵设定流速为5mL/min,反应1h取一次样,持续12h,通过高效液相色谱测样,测定转化率为27.103%。
实施例3
将0.3gD-果糖、0.006gMn2+、300mLpH为8的Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入到500mL自制反应瓶中,磁力搅拌转速设定为700rpm, 冷却水连通反应瓶,固定化酶和钙离子树脂分别填充到填充柱1和填充柱2中,填充量分别为1/3和3/4,水浴锅设定为60℃和70℃分别作为酶促反应温度和钙离子树脂吸附温度,蠕动泵设定流速为5mL/min,反应1h取一次样,持续12h,通过高效液相色谱测样,测定转化率为25.175%。
对比例1
将0.3gD-果糖、0.006gMn2+、300mLpH为8的Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入到500mL自制反应瓶中,磁力搅拌转速设定为700rpm,固定化酶充到填充柱1中,填充量为1/3,水浴锅设定为40℃为酶促反应温度,蠕动泵设定流速为5mL/min,反应1h取一次样,持续12h,通过高效液相色谱测样,测定转化率为21.326%。
对比例2
将0.3gD-果糖、0.006gMn2+、300mLpH为8的Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入到500mL自制反应瓶中,磁力搅拌转速设定为700rpm,固定化酶充到填充柱1中,填充量为1/3,水浴锅设定为50℃为酶促反应温度,蠕动泵设定流速为5mL/min,反应1h取一次样,持续12h,通过高效液相色谱测样,测定转化率为22.324%。
对比例3
将0.3gD-果糖、0.006gMn2+、300mLpH为8的Tris-HCl缓冲液混合均匀后加入到500mL自制反应瓶中,磁力搅拌转速设定为700rpm,固定化酶充到填充柱1中,填充量为1/3,水浴锅设定为60℃为酶促反应温度,蠕动泵设定流速为5mL/min,反应1h取一次样,持续12h,通过高效液相色谱测样,测定转化率为19.532%。
各实施例与对比例转化率列于表1,由表1可知使用串联填充床边反应边吸附D-阿洛酮糖,可以明显的提高转化率。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学,清源创新实验室
<120> 一种连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaacacg gcatctacta tagctactgg gaacacgaat ggtctgcgaa attcggtccg 60
tacatcgaaa aagttgcgaa actgggcttc gatatcctgg aagttgcggc gcaccacatc 120
aacgaataca gcgatgcgga actggctacc atccgtaaat ctgcgaaaga taacggtatc 180
attctgaccg cgggcatcgg cccgagcaaa accaaaaacc tgtctagcga agatgcggcg 240
gttcgtgcgg cgggtaaagc gttcttcgaa cgtaccctgt ctaacgttgc gaaactggat 300
atccacacca tcggcggcgc gctgcacagc tactggccga tcgattactc tcagccggtt 360
gacaaagcgg gcgattacgc gcgtggtgtt gaaggtatca acggcattgc agatttcgcg 420
aacgatctgg gtatcaacct gtgcatcgaa gttctgaacc gtttcgaaaa ccacgttctg 480
aacaccgcgg cggaaggtgt tgctttcgtg aaagacgttg gcaaaaacaa cgttaaagtt 540
atgctggata ccttccacat gaacatcgaa gaagatagct tcggcgatgc gatccgtacc 600
gcgggcccgc tgctgggtca cttccacacc ggtgaatgca accgtcgtgt tccgggcaaa 660
ggccgtatgc cgtggcacga aatcggtctg gcgctgcgtg atatcaacta caccggtgcg 720
gtgatcatgg aaccgttcgt taaaaccggc ggcaccatcg gtagcgatat caaagtttgg 780
cgtgatctgt ctggtggtgc ggatatcgcg aaaatggatg aagatgcgcg taacgcgctg 840
gcgttctctc gtttcgttct gggcggctaa 870

Claims (6)

1.一种连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)配置果糖底物:将D-果糖、Mn2+、Tris-HCl混合得到果糖底物;
(2)D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化;
(3)在串联填充床装置一个反应柱内填充步骤(2)得到固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶,另一个反应柱填充阳离子树脂;
(4)以步骤(1)的果糖底物为反应液,输送到串联填充床装置中,在填充固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的填充柱中进行催化反应,反应产物在填充钙离子树脂的填充柱中进行D-阿洛酮糖吸附;
(5)对填充钙离子树脂的填充柱进行脱附,得到D-阿洛酮糖。
2.根据权利要求1所述的连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法,其特征在于,步骤(1)中果糖底物由10g/L果糖、1mM的Mn2+、50mM pH为8的Tris-HCl组成。
3.根据权利要求1所述的连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法,其特征在于,步骤(2)中D-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化具体为:在冰浴条件下,将海藻酸钠和粗酶液混合均匀后,通过注射器推动,形成大小均一的圆球,并在CaCl2溶液下固定化。
4.根据权利要求3所述的连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法,其特征在于,海藻酸钠和氯化钙,用量范围分别是2wt%-5wt%、1wt%-6wt%。
5.根据权利要求1所述的连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法,其特征在于,串联填充床装置中固定化D-阿洛酮糖3-差向异构酶的填充量为填充柱的1/3,阳离子树脂是钙离子树脂,填充量是填充柱的3/4。
6.根据权利要求1所述的连续、循环制备D-阿洛酮糖的方法,其特征在于,步骤(4)中催化反应的温度为40-80℃,D-阿洛酮糖吸附的温度为30-90℃,反应液流速为1mL/min-10mL/min。
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