KR101785300B1 - 미생물 균체 고정화 장치 및 이를 이용한 미생물 균체 고정화 방법 - Google Patents

미생물 균체 고정화 장치 및 이를 이용한 미생물 균체 고정화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 일 예는 균체-담체 함유 혼합액이 수용된 혼합탱크; 상기 혼합탱크로부터 균체-담체 함유 혼합액을 주입받아 외부로 배출하는 노즐부; 및 상기 노즐부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액과 경화제 수용액의 접촉에 의해 균체 고정화 비드가 형성되는 반응탱크를 포함하는 미생물 균체 고정화 장치를 제공한다. 본 발명의 미생물 균체 고정화 장치는 공기 분사식 노즐(air spray nozzle)을 통해 균체-담체 함유 혼합액을 분사하기 때문에 고점도의 고정화 담체 용액을 사용하는 경우에도 크기가 작고 전체적으로 구형이거나 구형에 가까운 미생물 균체 고정화 비드를 대량으로 제조할 수 있다.

Description

미생물 균체 고정화 장치 및 이를 이용한 미생물 균체 고정화 방법{Apparatus for immobilizing microorganism whole cell and method for immobilizing microorganism whole cell}
본 발명은 미생물 균체 고정화 장치 및 미생물 균체 고정화 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 고점도의 고정화 담체 용액을 사용하는 경우에도 크기가 작고 형상이 균일한 미생물 균체 고정화 비드를 제조할 수 있는 장치 및 이를 이용하여 미생물 균체 고정화 비드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
D-알룰로스(D-allulose)는 과당(fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)로서 D-알룰로스(D-psicose)라고 불리우기도 한다. 알룰로스는 설탕과 비교했을 때 70% 감미도를 갖지만(Oshima 2006) 에너지는 0.3% 밖에 없으므로 다이어트 식품의 저칼로리 감미료로 적용 가능한 기능성 단당류이다(Matsuo et al. 2002). 또한, 알룰로스는 포도당의 흡수를 억제하여 혈당 억제 작용을 하는 기능이 있어 당뇨병 환자용 음식품, 수신용 음식품 등에 응용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부지방 축적 억제를 할 수 있으므로 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다(Matsuo et al. 2001; Iida et al. 2008; Hayashi et al. 2010; Hossain et al. 2011). 위와 같은 특징으로 알룰로스는 설탕을 대체 할 수 있는 좋은 소스이나 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에 식품산업에 적용하기 위해서는 알룰로스를 효율적으로 생산하는 방법이 필요하다. 기존의 알룰로스 생산 방법으로는 주로 화학적 과정을 거쳐 생산되었다. 빌릭(Bilik)등은 몰리브산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당에서 알룰로스로 전환하는 방법을 제안하였다. 맥도날드(McDonald)는 1,2:4,5-디-δ-이소프로필리덴-베타-D-프락토피라노스(1,2:4,5-di-δ-isopropylidene-beta-D-fructopyranose)로부터 3단계의 화학적 처리과정으로 알룰로스를 생산하였다. 또한 도너 (Doner)는 에탄올과 트리메틸아민과 함께 과당을 가열하여 알룰로스를 생산하였다. 그러나 이들 화학적 생산방법은 비용이 많이 소모되는 반면 그 효율은 낮고 부산물들이 대량으로 발생하는 단점이 있다.
알룰로스를 생산하는 대표적인 생물학적 방법으로는 과당을 D-알룰로스 3-에피머화 효소와 직접 반응시켜 알룰로스로 전환하는 방법과, 세포내 효소로 D-알룰로스 3-에피머화 효소를 생산하는 균주의 균체와 과당을 반응시켜 알룰로스로 전환하는 방법이 있다. 이 중 효소와의 직접 반응을 이용한 알룰로스 생산방법은 온도, pH 등의 변화에 의해 효소의 활성이 크게 떨어질 수 있고 효소의 고정화가 쉽지 않다는 점에서 적용에 한계가 있다. 또한, D-알룰로스 3-에피머화 효소는 세포내 효소(endoenzyme)이기 때문에 정제를 위해 많은 비용 및 시간이 소요된다. 한편, 균체와의 반응을 이용한 알룰로스 생산방법은 고정화 방법이 단순하고 균체의 세포벽에 의해 세포내 효소인 D-알룰로스 3-에피머화 효소가 보호되어 장시간 동안 알룰로스를 생산할 수 있는 장점이 있다. 세포내 효소(endoenzyme)를 생산하는 균주의 균체의 고정화를 위한 담체로 주로 알긴산나트륨(soduim alginate)이 사용된다. 알긴산나트륨(soduim alginate)을 이용하여 균주의 균체를 고정화하는 방법은 균주의 균체와 알긴산나트륨 수용액을 혼합하여 균체-알긴산나트륨 혼합액을 준비하는 단계 및 상기 균체-알긴산나트륨 혼합액을 주사기 또는 노즐을 이용하여 염화칼슘 수용액에 떨어뜨려 균체가 알긴산나트륨의 비드에 포집된 균체-알지네이트 결합체를 형성하는 단계로 구성된다. 이와 관련된 선행기술을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제10-1995-0025097호에는 미생물 배양액을 CaCl2용액에 넣고 미량의 계면활성제와 잔싼검을 가한 후 이 용액을 주사기 안에 넣고 교반하의 소듐 알지네이트 용액위에 한방울씩 적하하여 캡슐이 소듐 알지네이트 용액안에서 형성되면 이를 수세하고 수축시킨 다음 완성된 캡슐을 성장배지에서 배양하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 칼슘 알지네이트 미생물 고정화 캡슐의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1507031호에는 a) 효소 함유물 및 부형제를 함유하는 혼합액이 투입되는 제1 탱크부; b) 상기 제1 탱크부의 하단부에 위치하는 노즐부로서, 내경이 0.1 내지 1 mm이고 하단부가 원통형 모양이며, 상기 하단부에, 노즐의 세로축에 수직인 방향으로 절단된 액체 방출구를 갖는 노즐을 포함하는 노즐부; 및 c) 상기 노즐부 아래에 위치하고, 염화칼슘액을 함유하며, 상기 염화칼슘액 내로 공기가 주입되도록 공기 주입구를 포함하는 제2 탱크부;를 포함하는, 효소 고정화 비드 제조 장치가 개시되어 있다. 그러나, 종래의 니들이나 단순한 노즐을 이용하는 경우 고점도의 알긴산나트륨 수용액 때문에 알긴산나트륨의 비드가 커지거나 형상이 구형에서 멀어지는 문제가 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 고점도의 고정화 담체 용액을 사용하는 경우에도 크기가 작고 전체적으로 구형이거나 구형에 가까운 미생물 균체 고정화 비드를 대량으로 제조할 수 있는 장치 및 이를 이용하여 미생물 균체 고정화 비드를 제조하는 방법을 제공하는데에 있다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 균체-담체 함유 혼합액이 수용된 혼합탱크; 상기 혼합탱크로부터 균체-담체 함유 혼합액을 주입받아 외부로 배출하는 노즐부; 및 상기 노즐부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액과 경화제 수용액의 접촉에 의해 균체 고정화 비드가 형성되는 반응탱크를 포함하는 장치로서, 상기 균체-담체 함유 혼합액은 미생물의 균체 현탁액 및 담체 수용액이 혼합되어 형성된 것이고, 상기 노즐부는 균체-담체 함유 혼합액 배출부와 공기 배출부를 구비하고, 상기 공기 배출부는 공기를 균체-담체 함유 혼합액 배출부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액 방향으로 분사하는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치를 제공한다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 예는 미생물의 균체 현탁액 및 담체 수용액을 혼합하여 균체-담체 함유 혼합액을 형성하는 단계; 및 상기 균체-담체 함유 혼합액을 노즐부를 통해 배출하고 경화제 수용액과 접촉시켜 균체 고정화 비드를 형성하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 노즐부는 균체-담체 함유 혼합액 배출부와 공기 배출부를 구비하고, 상기 공기 배출부는 공기를 균체-담체 함유 혼합액 배출부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액 방향으로 분사하는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 방법을 제공한다.
본 발명의 미생물 균체 고정화 장치는 공기 분사식 노즐(air spray nozzle)을 통해 균체-담체 함유 혼합액을 분사하기 때문에 고점도의 고정화 담체 용액을 사용하는 경우에도 크기가 작고 전체적으로 구형이거나 구형에 가까운 미생물 균체 고정화 비드를 대량으로 제조할 수 있다. 본 발명의 미생물 균체 고정화 장치로 제조된 미생물 균체 고정화 비드를 미생물의 세포내 효소(endoenzyme)에 대응되는 기질과 반응시키는 경우 기질과 비드의 접촉 면적이 현저히 증가하기 때문에 효소 반응 효율이 향상되고 효소 반응 생성물의 생산성이 증가한다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 미생물 균체 고정화 장치 및 미생물 균체 고정화 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 미생물 균체 고정화 장치를 구성하는 노즐부의 단면도이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 노즐부의 저면도이고, 도 4는 본 발명의 다른 예에 따른 노즐부의 저면도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1에 따라 배출부 단면이 평면인 니들을 이용하여 제조한 균체 고정화 비드의 형상을 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 내 알긴산나트륨의 농도별로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 2에 따라 공기 분사식 노즐을 이용하여 제조한 균체 고정화 비드의 형상을 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 내 알긴산나트륨의 농도별로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 미생물 균체 고정화 장치에 관한 것이다. 도 1은 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 미생물 균체 고정화 장치 및 미생물 균체 고정화 방법을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 미생물 균체 고정화 장치는 균체-담체 함유 혼합액이 수용된 혼합탱크(30); 상기 혼합탱크로부터 균체-담체 함유 혼합액을 주입받아 외부로 배출하는 노즐부(40); 및 상기 노즐부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액과 경화제 수용액의 접촉에 의해 균체 고정화 비드가 형성되는 반응탱크(60)을 포함한다. 이하, 본 발명에 따른 미생물 균체 고정화 장치를 구성요소별로 나누어 설명한다.
혼합탱크(30)
상기 혼합탱크는 미생물의 균체 현탁액 및 담체 수용액이 혼합되어 형성된 균체-담체 함유 혼합액이 수용되는 공간으로서, 균체 현탁액 및 담체 수용액의 균일한 혼합 또는 혼합액 내에서의 균체와 담체의 균일한 분포를 위해서 바람직하게는 내부에 소정의 교반 수단(예를 들어, 임펠러)이 구비되어 있다. 상기 혼합탱크에 수용된 균체-담체 함유 혼합액은 정량펌프에 의해 이송라인을 따라 노즐부로 이송된다. 상기 혼합탱크 내에 수용된 균체-담체 함유 혼합액의 균체 농도는 크게 제한되지 않으나, 담체에 포집되는 균체의 최대량을 고려할 때 혼합액 전체 부피를 기준으로 5~15%(w/v)인 것이 바람직하고 5~12%(w/v)인 것이 더 바람직하다. 또한, 균체-담체 함유 혼합액의 담체 농도는 크게 제한되지 않으나 담체의 점성으로 인한 이송의 문제, 후술하는 노즐부에서의 배출 문제, 비드 형성 문제 등을 고려할 때 혼합액 전체 부피를 기준으로 1~4%(w/v)인 것이 바람직하고, 1~2.5%(w/v)인 것이 더 바람직하다. 균체-담체 함유 혼합액의 담체 농도가 혼합액 전체 부피를 기준으로 1%(w/v) 미만이면 비드 형성이 어려울 수 있고, 4%(w/v)를 초과하면 노즐부로의 이송 또는 노즐부에서의 배출이 어려울 수 있다.
본 발명에서 상기 미생물의 균체 현탁액은 배양 후 회수된 미생물의 균체를 소정의 버퍼 용액에 현탁한 것이다. 상기 버퍼 용액은 미생물의 활성을 유지할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 공지의 다양한 버퍼 용액에서 선택될 수 있다. 상기 미생물은 세포내 효소(endoenzyme)를 생산하는 균주인 것이 바람직하고, 케토오스 3-에피머화 효소를 코딩하는 유전자의 도입 또는 케토오스 3-에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입에 의해 형질전환된 재조합 균주인 것이 바람직하다. 또한, 상기 재조합 균주의 숙주 균주는 식품학적으로 안전한 균주인 것이 바람직하다. 상기 식품학적으로 안전한 균주는 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 GRAS(generally accepted as safe)급 균주를 의미하며, 예를 들어 사카로마이세스속 균주(Saccharomyces sp.), 바실러스속 균주(Bacillus sp.), 코리네박테리움속 균주(Corynebacterium sp.) 등에서 선택될 수 있다. 상기 균주들은 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는 산업용 미생물이다. 이러한 균주들은 유전자 조작 및 대량 배양에 용이하거나, 다양한 공정 조건에서 높은 안정성을 가지는 균주이다. 또한, 이러한 균주들은 다른 세균에 비하여 상대적으로 단단한 세포막 구조를 보유하고 있기 때문에 높은 당 농도 등에 의한 삼투압의 영향 하에서도 균체가 안정적인 상태로 존재하는 생물학적 특성을 보인다. 상기 GRAS(generally accepted as safe)급 균주의 구체적인 예로는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 등이 있다. 또한, 상기 세포내 효소는 이성화 효소, 에피머화 효소 등 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 효소 반응 산물의 유용성을 고려할 때 케토오스 3-에피머화 효소인 것이 바람직하다. 본 발명에서 케토오스 3-에피머화 효소는 D- 또는 L-케토헥소스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토헥소스를 생성하는 활성을 갖고, D- 또는 L-프럭토스와 D- 또는 L-알룰로스 사이의 상호 변환, D- 또는 L-타가토스와 D- 또는 L-소르보스 사이의 상호 변환을 촉매한다. 또한, 본 발명에서 케토오스 3-에피머화 효소는 D- 또는 L-케토펜토스의 3 위치를 에피머화하여, 대응하는 D- 또는 L-케토펜토스를 생성하는 활성을 갖고, D- 또는 L-크실로스와 D- 또는 L-리불로스 사이의 상호 변환을 촉매한다. 상기 케토헥소스는 케토오스 구조를 갖는 6탄당이며, 구체적으로는 프럭토스, 알룰로스, 타가토스, 소르보스를 의미하고, D- 또는 L-케토헥소스는 이들의 D-체 및 L-체를 의미한다. 또한, 상기 케토펜토스는 케토오스 구조를 갖는 5탄당이며, 구체적으로는 크실로스(xylose) 및 리불로스(ribulose)를 의미하고, D- 또는 L-케토펜토스는 이들의 D-체 및 L-체를 의미한다. 본 발명의 일 예에 따른 방법에서 케토오스 3-에피머화 효소는 알룰로스 3-에피머화 효소 또는 타가토스 3-에피머화 효소인 것이 바람직하고, 알룰로스 3-에피머화 효소인 것이 더 바람직하다. 상기 알룰로스 3-에피머화 효소는 프럭토스와 알룰로스 사이의 상호 변환을 촉매하며, 구체적인 예로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 담체 수용액은 담체를 물에 녹인 것으로서, 이때 상기 담체는 수용성이면서 동시에 미생물을 가두기 위한 매트릭스 형태로 이루어진 내부 구조를 가지는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어, 아가, 아가로스, 카라기난, 알지네이트 또는 키토산 등에서 선택될 수 있고 알지네이트인 것이 바람직하다. 또한, 상기 알지네이트는 알긴산나트륨, 알기산칼륨 등에서 선택될 수 있다.
노즐부 (40)
혼합탱크에서 이송된 균체-담체 함유 혼합액은 노즐부로 주입되고 소정의 형태로 배출된다. 상기 노즐부는 균체-담체 함유 혼합액 배출부와 공기 배출부를 구비하고, 공기 배출부는 공기를 균체-담체 함유 혼합액 배출부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액 방향으로 분사하여 노즐부에서 배출되는 균체-담체 함유 혼합액의 크기를 조절하고 균체-담체 함유 혼합액의 형상을 구형 또는 구형에 가깝게 조절한다.
도 2는 본 발명에 따른 노즐부의 단면도이다. 본 발명에 따른 노즐부(40)는 도 2에 도시된 바와 같이, 크게 몸체부(41), 제1 주입부(42), 제1 배출부(43), 제2 주입부(44), 제2 배출부(45) 및 커버(47)로 구성된다.
몸체부(41)는 노즐부에서 배출되는 균체-담체 함유 혼합액(L)을 사용양태에 소정의 크기 및 형상으로 조절하기 위하여 제1 주입부(42), 제1 배출부(43), 제2 주입부(44), 제2 배출부(45) 및 커버(47)가 구비될 수 있는 공간을 제공한다.
제1 주입부(42)는 몸체부(41)의 일측에 형성되어 균체-담체 함유 혼합액(L)이 몸체부(41) 내부로 주입될 수 있도록 연결부 역할을 수행하는 것이다. 이러한 제1 주입부(42)는 균체-담체 함유 혼합액이 수용된 혼합탱크와 파이프 또는 호스 등에 의해 연결될 수 있도록 몸체부(41)의 일측에 외측으로 돌출되거나, 내측으로 삽입되도록 구비될 수 있다. 이때, 제1 주입부(42)는 도 2에 도시된 바와 같이, 몸체부(41)와 일체로 형성될 수 있으며, 사용양태에 따라서는 별도의 연결 브래킷 등을 통해 몸체부(41)와 결합되도록 구성될 수 있다.
제1 배출부(43)는 제1 주입부(42)를 통해 몸체부(41)의 내부로 유입된 균체-담체 함유 혼합액(L)을 몸체부(41) 외부로 배출시키는 역할을 한다. 이러한 제1 배출부(43)의 일단은 몸체부(41)의 내부로 균체-담체 함유 혼합액(L)을 주입하는 제1주입부(42)와 연결되도록 구비되고, 타단은 몸체부(41)의 외부로 균체-담체 함유 혼합액(L)을 배출할 수 있도록 몸체부(41)의 일측에 소정간격 노출되도록 구비된다. 이때, 제1 배출부(43)는 제1 주입부(42)를 통해 주입된 균체-담체 함유 혼합액(L)을 몸체부(41)를 통과하여 외부로 배출 또는 분사할 수 있다면 어떠한 형상으로 이루어져도 무방하지만, 몸체부(41) 내부를 관통하는 파이프 형상으로 이루어지는 것이 바람직하다. 제1 배출부의 내경은 균체 고정화 비드의 크기 및 형상을 고려할 때 0.5~1.5 ㎜인 것이 바람직하다.
제2 주입부(44)는 몸체부(41)의 일측에 형성되어 몸체부(41)의 내부를 통과하는 공기(A)를 주입하는 역할을 한다. 이러한 제2 주입부(44)는 파이프 또는 호스를 통해 공기(A)를 공급하는 에어펌프 등의 공기 공급장치와 연결될 수 있도록 몸체부(41)의 일측에 내측으로 삽입되거나, 외부로 돌출되도록 구비될 수 있다. 이러한 제2 주입부(44)는 제1 주입부(42)와 마찬가지로 몸체부(41)와 일체로 형성되거나, 사용양태에 따라서는 별도의 연결 브래킷 등을 통해 몸체부(41)와 결합되도록 구성될 수 있다.
이때, 제2 주입부(44)와 대응되는 몸체부(41)의 내부 일측은 소정의 공기(A)를 저장할 수 있도록 중공부(46)가 형성될 수 있다. 이러한 중공부(46)는 제2 배출부(45)와 연결되는 연결장치 없이도 몸체의 내부로 주입된 공기(A)가 원활하게 배출될 수 있도록 한다. 상기 중공부(46)는 몸체부(41) 내부에 전체적으로 형성되거나, 제2 주입부(44)와 제2 배출부(45) 사이 공간에만 형성되어도 무방하다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 노즐부의 저면도이고 도 4는 본 발명 다른 예에 따른 노즐부의 저면도이다. 제2 배출부(45)는 제1 주입부(42)가 외부로 노출된 몸체부(41)의 일측과 대응되도록 형성되어 제1 배출부(43)에서 배출되는 균체-담체 함유 혼합액(L) 방향으로 제2 주입부(44)에서 공급되거나, 몸체부(41)의 중공부(46)에 저장된 공기(A)를 분사 또는 배출하는 역할을 한다. 이러한 제2 배출부(45)는 몸체부(41)의 일측 벽면, 바람직하게는 제1 배출부(43)가 노출된 일측과 대응되는 몸체부(41)의 일측 벽면을 관통하도록 적어도 하나 이상 형성될 수 있다. 이때, 제2 배출부(45)는 다양한 형상을 가질 수 있고, 다양한 형태로 배치될 수 있다. 일 예로, 도 3에 도시된 바와 같이 제2 배출부(45)는 몸체부(41)의 외부로 노출되는 제1 배출부(43)를 중심으로 방사상으로 복수 개가 구비될 수 있다. 또한, 다른 예로 도 4에 도시된 바와 같이 제2 배출부(45)는 제1 배출부(43)를 중심으로 원호 형상 등과 같이 장공 형상으로 이루어질 수 있으며, 사용양태에 따라서는 폐루프를 이루도록 형성될 수 있다. 제2 배출부(45)의 내경은 균체 고정화 비드의 크기 및 형상을 고려할 때 0.5~1.5 ㎜인 것이 바람직하다.
또한, 제2 배출부(45)에서 분사되는 공기(A)가 제1 배출부(43)에서 분사되는 균체-담체 함유 혼합액(L) 방향으로 원활하게 분사될 수 있도록 제2 배출부(45)는 몸체부(41)의 하부 방향으로 갈수록 점차 내측으로 경사지게 형성될 수 있다. 이처럼 제2 배출부(45)가 경사지게 형성됨에 따라 제2 배출부(45)에서 분사되는 공기(A)는 제1 배출부(43)에서 분사 또는 배출되는 균체-담체 함유 혼합액(L) 방향으로 원활하게 분사될 수 있다.
전술한 구성에서는 제2 배출부(45)가 몸체부(41)를 관통하여 관통공 형상으로 이루어지도록 설명하였지만, 사용양태에 따라 도 2에 도시된 바와 같이, 제조하고자 하는 균체 고정화 비드의 크기 또는 형상 등에 따라 제2 배출부(45)의 크기 및 형상 등을 변경할 수 있도록 커버(47)를 이용할 수 있다. 이처럼, 커버(47)를 이용하는 경우를 상세하게 설명하면 다음과 같다. 교체 가능한 커버(47)를 결합하기 위해서는 몸체부(41)의 일측에 개방부가 형성된다. 이때, 몸체부(41)의 개방부는 제1 배출부(43)가 노출되는 몸체부(41)의 일측에 형성된다. 커버(47)는 제1 배출부(43)가 노출되는 몸체부(41)의 일측과 대응되는 일측면에 개방된 개방부를 밀폐하도록 결합될 수 있다. 이때, 커버(47)의 중심 일측에는 제1 배출부(43)가 관통될 수 있는 관통공이 형성되며, 제1 배출부(43)가 관통되는 관통공을 중심으로 적어도 하나 이상의 제2 배출부(45)가 형성된다. 이때, 제2 배출부(45)의 형상은 전술한 구성과 유사한 구성으로 이루어질 수 있기 때문에 상세한 설명은 생략하기로 한다.
전술한 구성을 갖는 노즐부(40)의 사용양태를 상세하게 설명하면 다음과 같다. 도 2에 도시된 바와 같이, 혼합탱크(30)에서 균체-담체 함유 혼합액(L)이 이송파이프 또는 호스 등을 통해 유동하여 제1 주입부(42)를 통해 몸체부(41)로 공급된다. 이와 같이, 제1 주입부(42)를 통해 주입된 균체-담체 함유 혼합액(L)은 파이프 형상의 제1 배출부(43)를 통과하여 몸체부(41)의 외부로 분사된다.
이와 동시에, 제2 주입부(44)에서는 에어펌프 등의 공기 공급장치를 통해 고압의 공기(A)가 주입되어, 몸체부(41) 내부의 중공부(46) 및 제2 배출부(45)를 순차적으로 통과하여 외부로 분사된다. 이때, 제2 배출부(45)에서 분사되는 공기(A)는 제1 배출부(43)에서 분사되는 균체-담체 함유 혼합액(L) 방향으로 배출되기 때문에 제1 배출부(43)에서 배출 또는 분사되는 고점도의 균체-담체 함유 혼합액(L)은 제2 배출부(45)에서 고압으로 분사되는 공기(A)에 의해 절단되며 작은 크기와 구형 또는 구형에 가까운 형상을 가지게 된다. 또한, 제2 배출부(45)에서 분사되는 공기(A)의 분사 압력 및 분사 주기를 조절하여 배출되는 균체-담체 함유 혼합액(L)의 형상 또는 크기를 조절할 수 있다. 노즐부의 제1 배출부(43)에서 배출 또는 분사된 균체-담체 함유 혼합액은 반응탱크 내부로 떨어지고 반응탱크 내부에 수용된 경화제 수용액과 반응하여 단단한 비드 형태로 경화된다.
반응탱크(60)
노즐부에서 소정의 크기 및 형상으로 배출된 균체-담체 함유 혼합액은 반응탱크(60) 내부로 떨어지고, 반응탱크 내부에 수용된 경화제 수용액과 접촉하면 경화반응이 일어나 단단한 균체 고정화 비드가 형성된다. 반응탱크에는 균체-담체 함유 혼합액과 경화제 수용액의 균일한 접촉을 위해서 내부에 소정의 교반 수단(예를 들어, 임펠러)이 구비되어 있다.
상기 경화제 수용액을 경화제를 물에 녹인 것으로서, 이때 상기 경화제는 담체와 경화 반응을 하여 단단한 비드를 형성할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않는다. 상기 경화제는 담체의 종류에 따라 다양하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 담체가 알긴산나트륨 또는 알긴산칼륨인 경우 경화제는 담체와 칼슘 치환반응을 할 수 있는 칼슘 화합물에서 선택될 수 있고, 염화칼슘인 것이 바람직하다. 상기 경화제 수용액의 경화제 농도는 크게 제한되지 않으나, 균체-담체 함유 혼합액과의 적절한 경화 반응 속도를 담보하는 측면에서 200~600 mM인 것이 바람직하고 300~500 mM인 것이 더 바람직하다.
그 밖의 구성요소
본 발명의 바람직한 예에 따른 미생물 균체 고정화 장치는 도 1에 도시된 바와 같이 미생물 배양탱크(10), 미생물 균체 회수부(15), 담체 수용액 저장탱크(20), 경화제 수용액 저장탱크(50) 또는 균체 고정화 비드 세척/저장 탱크(70)를 더 포함할 수 있다. 상기 미생물 배양탱크(10)는 미생물을 소정의 배지에서 배양하여 미생물의 균체를 증식시키는 역할을 한다. 상기 미생물 배양탱크(10)의 미생물 배양액은 이후 미생물 균체 회수부(15)로 이송된다. 상기 미생물 균체 회수부(15)는 미생물 배양액으로부터 미생물 균체를 분리하는 역할을 하며, 예를 들어, 원심분리 장치일 수 있다. 상기 담체 수용액 저장탱크(20)는 담체 수용액을 저장하면서 필요한 경우 담체 수용액을 혼합탱크(30)로 공급하는 역할을 한다. 상기 경화제 수용액 저장탱크(50)는 경화제 수용액을 저장하면서 필요한 경우 경화제 수용액을 반응탱크(60)으로 공급하는 역할을 한다. 상기 균체 고정화 비드 세척/저장 탱크(70)는 반응탱크에서 이송되는 균체 고정화 비드를 소정의 용매(예를 들어, 물)로 세척하여 불순물을 제거하고 불순물이 제거된 균체 고정화 비드를 적합한 조건에서 보관하는 역할을 한다. 균체 고정화 비드 세척/저장 탱크(70)에 저장된 균체 고정화 비드는 균체 내에 존재하는 세포내 효소(endoenzyme)를 통해 이성화 반응 등 다양한 효소 반응 공정에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 미생물 균체 고정화 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미생물 균체 고정화 방법은 미생물의 균체 현탁액 및 담체 수용액을 혼합하여 균체-담체 함유 혼합액을 형성하는 단계; 및 상기 균체-담체 함유 혼합액을 노즐부를 통해 배출하고 경화제 수용액과 접촉시켜 균체 고정화 비드를 형성하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 노즐부는 균체-담체 함유 혼합액 배출부와 공기 배출부를 구비하고, 상기 공기 배출부는 공기를 균체-담체 함유 혼합액 배출부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액 방향으로 분사하여 노즐부에서 배출되는 균체-담체 함유 혼합액의 크기 및 형상을 조절한다. 본 발명에 따른 미생물 균체 고정화 방법은 바람직하게는 균체-담체 함유 혼합액과 경화제 수용액과의 반응에 의해 형성된 균체 고정화 비드를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 미생물은 알룰로스 3-에피머화 효소를 세포내 효소로 생산하는 재조합 균주인 것이 바람직하고, 상기 담체는 알지네이트인 것이 바람직하고, 상기 경화제는 염화칼슘인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 미생물 균체 고정화 방법은 전술한 미생물 균체 고정화 장치의 내용을 모두 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확히 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. D-알룰로스 3-에피머화 효소를 생산하는 재조합 균주의 제조
한국 미생물자원센터에서 분양받은 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii) KCTC 5970으로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후 이를 주형으로 이용하고, D-알룰로스 3-에피머화 효소를 코딩하는 유전자(서열번호 2의 폴리뉴클레오티드)를 클로닝하기 위한 프라이머 및 Ex-Taq(TAKARA) 중합효소를 이용하여 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 하기 표 1은 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plautii)의 유전체 DNA(genomic DNA)로부터 D-알룰로스 3-에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 사용된 프라이머를 나타낸 것이다. 하기 표 1에 나타난 프라이머는 Bioneer co.,KR에 의뢰하여 제작하였다.
서열번호 프라이머 종류 염기서열(5'→3') 프라이머에 포함된 제한효소 인식부위
3 알룰로스 에피머화 효소 유전자 클로닝용 forward primer agtcactgcagaccctacttagctgccaa Pst I
4 알룰로스 에피머화 효소 유전자 클로닝용 reverse primer aattcggatccttacgcggtcagctccttg BamH I
이후, gel extraction kit(Qiagen)를 이용하여 PCR 산물로부터 원하는 목적 DNA만을 분리한 후 Easy T-벡터(promega)에 결합하고, 분리한 목적 DNA의 염기서열 분석을 Bioneer co.,KR에 위탁하여 측정하였다. 그 결과, PCR을 통해 증폭된 목적 DNA가 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 해당하는 것을 확인하였다. 이후, PCR 반응에 의해 증폭된 목적 DNA를 제한효소인 Pst I과 BamH I을 이용하여 코리네박테리움(Corynebacterium) 셔틀벡터(shuttle vector)인 PDS 벡터의 동일한 제한효소 인식부위에 삽입하여 재조합 플라스미드 pDSFDPE를 제작하였다. 이후, 전기천공법으로 재조합 플라스미드 pDSFDPE를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 균주의 균체 내로 삽입하여 재조합 균주를 제조하였다. 재조합 플라스미드 pDSFDPE가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) DS00001로 명명하고, 한국생명공학연구원 미생물보존센터에 2015년 10월 7일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM 80101을 부여받았다.
이후, 재조합 균주의 단일 콜로니를 15㎖의 LB-ampicilline 배지(Difco)에 접종한 후 37℃ 및 200rpm의 조건에서 약 6시간 동안 전 배양(pre culture) 하였다. 이후 전 배양액을 500㎖의 LB-ampicilline 배지에 접종하고 37 ℃ 및 200rpm의 조건에서 진탕배양하였다. 이후, 배양액의 흡광도(at 600㎚)가 0.5일 때 IPTG를 0.1mM의 농도가 되도록 첨가하여 목적 효소의 과발현을 유도하였다. 이때 과발현 유도 시점부터 배양은 16℃ 및 150rpm의 조건으로 전환하여 약 16시간 동안 유지하였다. 이후, 재조합 균주의 배양액을 13000rpm에서 2분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 재조합 균주의 균체를 회수하였다.
회수된 재조합 균주의 균체를 lysis buffer(50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 10 mM imidazol)에 현탁시킨 후 초음파로 처리하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 13000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상등액만을 모은 후, 미리 lysis buffer로 평형시킨 Ni-NTA 칼럼(Bio-Rad, Profinia)에 적용시킨 다음 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0에 20 mM imidazol과 200 mM imidazol이 함유된 완충용액을 순차적으로 흘려주었다. 마지막으로 50mM Tris_HCl 300mM NaCl pH8.0, 200 mM imidazol을 흘려주어 목적 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 D-알룰로스 3-에피머화 효소인 것으로 확인되었다.
2. 균체 현탁액, 알긴산나트륨 수용액 및 염화칼슘 수용액의 제조
(1) 균체 현탁액의 제조
BHI 배지(Brain heart infusion Broth)가 들어있는 배양 용기에 앞에서 제조한 재조합 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) DS00001의 균체를 배지 전체 부피를 기준으로 2 부피%(vol %)의 양으로 첨가한 후, 배양 용기를 진탕 배양기 안으로 옮기고 30℃ 및 200 rpm의 조건에서 48시간 동안 진탕 배양하였다. 이후, 배양액을 원심분리하여 재조합 균주의 균체를 회수하였다. 이후, 회수된 재조합 균주의 균체를 50mM 농도의 PIPES[piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid)] 버퍼 용액에 현탁하여 pH가 약 7.0이고 현탁액 전체 부피를 기준으로 균체의 농도가 16%(dry cell weight/현탁액 vloume)인 균체 현탁액을 제조하였다.
(2) 알긴산나트륨 수용액의 제조
알긴산나트륨(Sodium alginate)을 물에 녹여 전체 용액 부피를 기준으로 알긴산나트륨의 농도가 각각 2.0%(w/v), 3.0%(w/v), 4.0%(w/v), 5.0%(w/v)인 알긴산나트륨 수용액을 제조하였다.
(3) 염화칼슘 수용액의 제조
염화칼슘(CaCl2)을 물에 녹여 염화칼슘 농도가 400 mM인 염화칼슘 수용액을 제조하였다.
3. 균체 고정화 비드의 제조
실시예 1 : 배출부 단면이 평면인 니들을 이용한 균체 고정화 비드의 제조
앞에서 준비한 균체 현탁액과 소정의 농도를 가진 알긴산나트륨 수용액을 제1 혼합탱크에서 1:1의 부피비로 혼합하여 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 4 종류를 제조하였다. 상기 4 종류의 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액은 혼합액 전체 부피를 기준으로 균체 농도가 8%(w/v)이고 알긴산나트륨의 농도는 각각 1.0%(w/v), 1.5%(w/v), 2.0%(w/v), 2.5%(w/v) 이다. 이후, 제1 혼합탱크에 수용된 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액을 정량 펌프를 이용하여 60 ㎖/min의 유량으로 니들(배출부 단면 형태가 평면이고 배출부 내경이 약 1㎜임)에 주입하였다. 니들에 주입된 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액은 니들의 배출부를 통해 염화칼슘 수용액이 수용된 제2 혼합탱크에 떨어지고 염화칼슘과 반응하여 균체가 내부에 포집된 형태의 비드가 형성되었다.
도 5는 배출부 단면이 평면인 니들을 이용하여 제조한 균체 고정화 비드의 형상을 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 내 알긴산나트륨의 농도별로 나타낸 것이고, 균체 고정화 비드의 크기를 하기 표 2에 나타내었다.
알긴산나트륨 농도(%, w/v) 1.0 1.5 2.0 2.5
균체 고정화 비드 크기(㎜) 1.97 2.07 3.11 3.28
도 5 및 상기 표 2에서 보이는 바와 같이 배출부 단면이 평면인 니들을 이용하여 균체 고정화 비드를 제조하는 경우 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 내 알긴산나트륨 농도가 2.0%(w/v) 이상인 경우에는 구형의 비드 대신 타원형이나 펠렛형 비드가 형성되었고, 형상 및 크기가 일정하지 않았다. 또한, 모든 알긴산나트륨 농도에서 균체 고정화 비드의 크기가 니들의 배출부 내경보다 컸고 니들의 배출부 내경의 약 2배 내지 3.5배로 나타났다.
실시예 2 : 공기 분사식 노즐(air spray nozzle)을 이용한 균체 고정화 비드의 제조
앞에서 준비한 균체 현탁액과 소정의 농도를 가진 알긴산나트륨 수용액을 제1 혼합탱크에서 1:1의 부피비로 혼합하여 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 4 종류를 제조하였다. 상기 4 종류의 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액은 혼합액 전체 부피를 기준으로 균체 농도가 8%(w/v)이고 알긴산나트륨의 농도는 각각 1.0%(w/v), 1.5%(w/v), 2.0%(w/v), 2.5%(w/v) 이다. 이후, 제1 혼합탱크에 수용된 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액을 정량 펌프를 이용하여 60 ㎖/min의 유량으로 공기 분사식 노즐(도 2에 도시된 단면 및 도 3에 도시된 저면을 가지는 노즐로서, 혼합액이 배출되는 제1 배출부의 내경이 약 1㎜이고 공기가 분사되는 제2 배출부의 내경이 약 1㎜임)에 주입하였다. 노즐에 주입된 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액은 노즐의 제1 배출부를 통해 배출되고, 동시에 배출된 혼합액 방향으로 제2 배출부를 통해 공기가 분사되었다. 노즐에서 배출된 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액은 염화칼슘 수용액이 수용된 제2 혼합탱크에 떨어지고 염화칼슘과 반응하여 균체가 내부에 포집된 형태의 비드가 형성되었다.
도 6은 공기 분사식 노즐을 이용하여 제조한 균체 고정화 비드의 형상을 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 내 알긴산나트륨의 농도별로 나타낸 것이고, 균체 고정화 비드의 크기를 하기 표 3에 나타내었다.
알긴산나트륨 농도(%, w/v) 1.0 1.5 2.0 2.5
균체 고정화 비드 크기(㎜) 0.82 0.89 1.03 1.08
도 6 및 상기 표 3에서 보이는 바와 같이 공기 분사식 노즐을 이용하여 균체 고정화 비드를 제조하는 경우 균체-알긴산나트륨 함유 혼합액 내 알긴산나트륨 농도가 2.0%(w/v) 이상인 경우에도 구형이거나 구형에 가까운 균일한 형태의 비드가 형성되었다. 또한, 모든 알긴산나트륨 농도에서 균체 고정화 비드의 크기가 노즐의 제1 배출부 내경보다 작거나 동일하였다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
10 : 미생물 배양탱크 15 : 미생물 균체 회수부
20 : 담체 수용액 저장탱크 30 : 혼합탱크
40 : 노즐부 50 : 경화제 수용액 저장탱크
60 : 반응탱크 70 : 경화제 수용액 저장탱크
41 : 몸체부 42 : 제1 주입부
43 : 제1 배출부 44 : 제2주입부
45 : 제2 배출부 46 : 중공부
47 : 커버 L : 혼합액
A : 공기
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Claims (12)

  1. 균체-담체 함유 혼합액이 수용된 혼합탱크; 상기 혼합탱크로부터 균체-담체 함유 혼합액을 주입받아 외부로 배출하는 노즐부; 및 상기 노즐부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액과 경화제 수용액의 접촉에 의해 균체 고정화 비드가 형성되는 반응탱크를 포함하는 장치로서,
    상기 균체-담체 함유 혼합액은 미생물의 균체 현탁액 및 담체 수용액이 혼합되어 형성된 것이고,
    상기 노즐부는 균체-담체 함유 혼합액 배출부와 공기 배출부를 구비하고,
    상기 공기 배출부는 공기를 균체-담체 함유 혼합액 배출부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액 방향으로 분사하는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 노즐부는 몸체부; 상기 몸체부의 일측에 구비되고 균체-담체 함유 혼합액이 주입되는 제1 주입부; 일단이 상기 제1 주입부와 연결되도록 구비되고 타단이 제1 주입부로 주입되는 균체-담체 함유 혼합액을 외부로 배출할 수 있도록 몸체부의 외부로 소정간격 노출되도록 구비되는 제1 배출부; 상기 몸체부의 일측에 구비되고 공기가 주입되는 제 2주입부; 및 상기 제2 주입부를 통해 주입된 공기를 제1 배출부에서 배출되는 균체-담체 함유 혼합액 방향으로 분사하는 적어도 하나 이상의 제2 배출부를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 세포내 효소(endoenzyme)를 생산하는 균주인 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 세포내 효소(endoenzyme)는 케토오스 3-에피머화 효소인 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 균주는 케토오스 3-에피머화 효소를 코딩하는 유전자의 도입 또는 케토오스 3-에피머화 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 도입에 의해 형질전환된 재조합 균주인 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 재조합 균주의 숙주 균주(Host strain)는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 담체는 알지네이트이고 상기 경화제는 염화칼슘인 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 제2 주입부와 연결되는 상기 몸체부의 내부 일측은 소정의 공기가 저장될 수 있도록 중공부로 이루어지는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  9. 제 2항에 있어서, 상기 제2 배출부는 제1 배출부를 중심으로 방사상으로 복수 형성되는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 제2 배출부는 제1 배출부를 중심으로 하는 장공 형상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 장치.
  11. 미생물의 균체 현탁액 및 담체 수용액을 혼합하여 균체-담체 함유 혼합액을 형성하는 단계; 및 상기 균체-담체 함유 혼합액을 노즐부를 통해 배출하고 경화제 수용액과 접촉시켜 균체 고정화 비드를 형성하는 단계를 포함하는 방법으로서,
    상기 노즐부는 균체-담체 함유 혼합액 배출부와 공기 배출부를 구비하고,
    상기 공기 배출부는 공기를 균체-담체 함유 혼합액 배출부에서 배출된 균체-담체 함유 혼합액 방향으로 분사하는 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 미생물은 알룰로스 3-에피머화 효소를 세포내 효소로 생산하는 재조합 균주이고 상기 담체는 알지네이트이고 상기 경화제는 염화칼슘인 것을 특징으로 하는 미생물 균체 고정화 방법.
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