CN104962546B - 一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法，所述方法是将含葡萄糖异构酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液中，制成菌悬液；向菌悬液中添加载体，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，然后加入戊二醛进行交联，0～30℃搅拌交联1～2h后，过滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒，得含葡萄糖异构酶的固定化葡萄糖异构酶细胞；本发明所提供的固定化方法具有固定化材料成本低，操作简单，机械强度高，在高温条件下较稳定，制备的固定化产葡萄糖异构酶重组大肠杆菌全细胞用于高温条件下催化D‑葡萄糖生产D‑果糖，在85℃的条件下，转化率高达54％，重复使用10批次后，仍具有90％以上的酶活，具有良好的工业化应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种细胞的固定化方法，特别涉及一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法。
(二)背景技术
葡萄糖异构酶(Glucose isomerase，GI)，又称木糖异构酶，可以催化D-葡萄糖生成D-果糖，是食品工业中以淀粉为原料生产高果糖浆(High fructose corn syrup，HFCS)的关键酶之一。HFCS是一种天然食品添加剂(甜味剂)，被广泛应用于食品、饮料行业。每年，世界上生产的HFCS就有千万吨，人们对HFCS日益增长的需求和HFCS产业的蓬勃发展，推动了对GI的深入研究和固定化GI技术的飞速发展。何家明等(何家明等，申请号85100412)用大孔强碱性苯乙烯系季氨基阴离子交换树脂吸附发酵液中的酶，制备固定化GI。曹龙奎等(曹龙奎等，申请号200910073264.9)利用磁性壳聚糖复合微球制备固定化GI；吴敬等(吴敬等，申请号201210581801.2)利用壳聚糖絮凝菌体，戊二醛交联絮凝物的方法制备固定化GI。
目前，Genencor/DuPont和Novozymes A/S两家公司生产的固定化GI酶制剂占据市场的主导地位，其固定化方法均是使用戊二醛交联细胞的方法。Novozymes A/S是使用戊二醛交联匀浆细胞，结合使用阳离子絮凝剂(如壳聚糖)、无机载体；Genencor/DuPont使用聚乙烯亚胺和戊二醛结合，并混合无机载体如膨润土、高岭土、硅藻土等。他们制备的固定化GI性质十分稳定，在工业生产条件下，可以使用半年到一年之久。我国固定化GI完全依赖进口，造成我国HFCS生产成本过高，竞争力减弱。
在生产HFCS转化率较低，只能获得果糖浓度为42％的HFCS，想要得到高果糖浓度的糖浆只有经过分离浓缩。异构化反应平衡随温度升高向果糖方向移动，如果GI在90～95℃依然稳定，则有可能直接生成果糖浓度为55％HFCS。
因此，研究一种成本低，在高温条件下转化率高、热稳定性好且可实现工业化生产的GI的固定化方法具有非常重要的现实意义。
(三)发明内容
本发明目的在于克服GI催化生产高果糖浆转化率低等问题，提供了一种提高果糖转化率的含GI细胞的固定化颗粒及固定化方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种含葡萄糖异构酶(GI)细胞的固定化方法，所述方法为：将含GI基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液中，制成菌悬液；向菌悬液中添加硅藻土，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，然后加入戊二醛进行交联，0～30℃(优选20～25℃)搅拌交联1～2h后，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，粉碎成粒(优选粒径为0.5～2mm)，得含GI细胞的固定化颗粒；所述硅藻土与菌悬液中湿菌体重量比为0.01～0.1：1。
进一步，所述GI基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述缓冲液为pH＝6.0～7.5、50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液或pH＝6.0～7.5、50mM Tris-HCl缓冲液。
进一步，所述缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为5～15mL/g。
进一步，所述戊二醛以体积浓度25％(v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25％(v/v)戊二醛水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.05～0.3mL/g(优选0.05mL/g)。
进一步，所述聚乙烯亚胺以体积浓度10％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液形式加入，所述10％(v/v)聚乙烯亚胺水溶液体积用量以湿菌体重量计为0.1～0.7mL/g(优选0.2mL/g)，本发明所述聚乙烯亚胺分子量70000，聚合度1600。
进一步，所述重组基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示GI基因与PGEM-T载体连接后导入E.coli JM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切后，连接过夜，将连接产物导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI。
进一步，所述湿菌体的制备方法为：
(1)将含GI基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为去离子水，pH自然。
(2)将斜面菌体接种至种子培养基，37℃培养8h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水，pH自然。
(3)将种子液以体积浓度2％接种量接种至发酵培养基，37℃、400rpm条件下培养3.5h，然后加入终浓度10g/L乳糖诱导剂，在30℃、400rpm条件下诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成：甘油10g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO4 2.28g/L，MgSO4 0.375g/L，(NH4)2SO4 5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
本发明所述重组基因工程菌最优选在85℃下果糖转化率为55％的产耐热GI的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI，所述重组大肠杆菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，引入嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus的耐热GI基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI(郑裕国等：葡萄糖异构酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用，专利申请号201410484596)。
本发明所述硅藻土分子式为SiO2，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，优选购自阿拉丁公司。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明所述GI的固定化方法简单易操作，经济实用。用该法制备的固定化GI，机械强度满足填充床使用的要求，在85℃条件下催化葡萄糖生成果糖，转化率高达54％，重复使用10批，仍有90％的残余酶活，室温保存30天后，酶活没有明显变化。
(四)附图说明
图1为固定化葡萄糖异构酶的制备过程图，a交联的菌体，b抽滤后的滤饼，c挤压成型，d干燥后的颗粒。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用硅藻土分子式为SiO2，分子量为60.08，中位粒径19.6μm，比重0.32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，购自阿拉丁公司。
实施例1重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI的构建及湿菌体的制备及性能测定
以本实验室构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI为生产菌种，方法为：
(1)重组菌的构建：将嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus的耐热GI基因TEGI(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，已在中国专利201410484596中公开)与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，对TEGI/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b(+)-TEGI导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI。
PGEM-T载体连接条件为：10μL连接体系在PCR管中依次加入2×Buffer 5μL，T4连接酶1μL，GI目的基因3μL，PGEM-T载体1μL；振荡器上充分混匀后16℃条件下连接过夜。
双酶切体系：首先对目的基因进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入GI目的基因40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；然后对表达载体进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入pET28b 40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；分别将其放在37℃，200rpm条件下酶切4～5h。
(2)湿菌体的制备
将重组大肠杆菌E.col iBL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为去离子水，pH自然；将斜面菌体接种至种子培养基，37℃培养8h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水，pH自然。
将种子液以体积浓度2％接种量接种至发酵培养基，37℃，150rpm条件下培养3.5h，然后在30℃，400rpm条件下，添加终浓度10g/L乳糖诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成：甘油10g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 1.36g/L，K2HPO4 2.28g/L，MgSO4 0.375g/L，(NH4)2SO4 5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
实施例2
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5，50mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100mL Tris-HCl缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，再与3mL浓度为10％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，然后加入1mL浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联2h后，反应液抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后，用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，制成小的颗粒(粒径为0.5～2mm)，即含GI的固定化细胞颗粒。同样条件下，将聚乙烯亚胺与戊二醛加入顺序调换，即先加入戊二醛，再加入聚乙烯亚胺。
(3)酶活定义：在85℃，pH为7.0条件下反应，1h转化产生1mg果糖所需的酶量，即为一个酶活力单位，以U表示。酶活回收率指固定化酶活力占溶液酶活力的百分数。取一定量的菌体固定化，将相同量的菌体和固定化后的菌体在相同的条件下转化后检测酶活，固定化后菌体的酶活与固定化前菌体的酶活之比即为酶活回收率。
所得固定化细胞性能如下：先加戊二醛所得固定化细胞的酶活收率92.84％，初始酶活为1000U/g；先加聚乙烯亚胺所得固定化细胞的酶活收率为79.84％，初始酶活力为860U/g。在85℃下，重复使用10批后，戊二醛先加残留活力30％，聚乙烯亚胺先加残留活力40％。先加聚乙烯亚胺制备的固定化GI稳定性更好。
实施例3
(1)取实施例1方法制备的湿菌体，按菌体湿重：Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5，50mM)＝1:10(m/v)混合得到菌悬液，即取10g湿菌体加入100mL Tris-HCl缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)100mL菌悬液中添加0.6g的硅藻土，磁力搅拌器上混合均匀，再与3mL浓度为10％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液混合，然后加入1.5mL浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联1.5h后，反应液抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤，用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，制成小的颗粒(粒径0.5～2mm)，得到固定化细胞。
残留酶活测试方法为重复使用固定化的GI转化葡萄糖，反应后测不同使用批次的酶活，第十批的酶活与第一批酶活之比即为重复使用10批后的残留酶活。
根据上述方法，所得固定化细胞性能如下：在85℃下，初始酶活为963.5U/g，在85℃下，重复使用10批后，残留酶活62.5％。
实施例4
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH＝6.0，50mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)向步骤(1)获得的100mL菌悬液中添加0.6g硅藻土，磁力搅拌器上混匀，然后与2mL浓度为10％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，再加入0.5mL浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联1.5h后，将反应液抽滤，滤饼用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，制成小的颗粒(粒径为0.5～2mm)，得到固定化细胞颗粒。
根据上述方法，所得固定化细胞在85℃下性能如下：酶活回收率为90％，做固定化酶在85℃的反应进程曲线，其最大转化率为54％。对一定量的固定化GI颗粒进行批次转化实验，重复使用10批后，仍有90％的残余酶活，每批的转化率均保持在46.7％。85℃保温20h后，颗粒仍硬，根据国标GB/T23533-2009对固定化GI颗粒强度的要求，该方法制备的固定化GI颗粒强度能满足填充床使用要求。
对比例1
(1)取实施例1获得的湿菌体，按菌体：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH＝6，50mM)＝1:10(m/v)混合得到菌悬液，即取10g湿菌体加入100mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)在搅拌条件下，向步骤(1)100mL菌悬液中添加3mL浓度为10％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，然后再加入1mL浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联2h，反应液于-20℃冰箱冻存过夜，冻存样品取出室温融化后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后，用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，制成小的颗粒(粒径为0.5～2mm)，得到固定化细胞。
经冻存处理制得的固定化GI，较不经冻存处理制的的固定化GI初始酶活提高了1.5倍。
对比例2
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5，50mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100mL Tris-HCl缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)在搅拌条件下，分别向步骤(1)100mL菌悬液中添加0mL、0.5mL，1mL，2mL，3mL浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联2h后，反应液抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后，用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，制成小的颗粒(粒径为0.5～2mm)，即含GI的固定化颗粒。
只用戊二醛交联制备的固定化GI颗粒，在85℃保温20h后，颗粒不会散掉，有弹性，但是不能承受较大的压力。所得湿的固定化GI在不同的戊二醛浓度条件下，酶活回收率变化如下表1。单独使用戊二醛固定化对细胞酶活的影响较大。
表1固定化细胞的酶活回收率
对比例3
(1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：Tris-HCl缓冲液(pH＝7.5，50mM)＝1:10(m/v)混合，即取10g湿菌体加入100mL Tris-HCl缓冲液中制成100mL菌悬液。
(2)在搅拌条件下，分别向步骤(1)100mL菌悬液中添加0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL浓度为10％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，然后加入0.5mL浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联2h后，反应液抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后，用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，制成小的颗粒(粒径为0.5～2mm)，即含GI的固定化颗粒。
加入聚乙烯亚胺和戊二醛交联制备的固定化GI颗粒，在85℃保温20h后，用两手指用力碾压，失少成浆，仍硬，满足填充床上使用的要求。所得湿的固定化GI在不同的聚乙烯亚胺浓度条件下，转化率变化如表2，聚乙烯亚胺的加入大大提高了酶活收回收率和颗粒强度。
表2固定化细胞的酶活回收率
Claims (1)
1.一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法，其特征在于所述方法为：
(1)将嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus的耐热GI基因TEGI与PGEM-T载体进行连接后导入E.coli JM109中，所述耐热GI基因TEGI的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，对TEGI/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b(+)-TEGI导入宿主E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI；
所述PGEM-T载体连接条件为：10μL连接体系在PCR管中依次加入2×Buffer 5μL，T4连接酶1μL，GI目的基因3μL，PGEM-T载体1μL；振荡器上充分混匀后16℃条件下连接过夜；
所述双酶切体系为，首先对GI目的基因进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入GI目的基因40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；然后对表达载体进行双酶切，60μL双酶切体系在PCR管中依次加入pET28b 40μL，2×Buffer Tango 12μL，Nco I 1μL，Xho I 1μL，ddH2O 6μL，振荡器上充分混匀；分别将其放在37℃，200rpm条件下酶切4～5h；
(2)将重组大肠杆菌E.col iBL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为去离子水，pH自然；将斜面菌体接种至种子培养基，37℃培养8h，获得种子液；种子培养基组成：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水，pH自然；
将种子液以体积浓度2％接种量接种至发酵培养基，37℃，150rpm条件下培养3.5h，然后在30℃，400rpm条件下，添加终浓度10g/L乳糖诱导12h，取发酵液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成：甘油10g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 1.36g/L，K2HPO42.28g/L，MgSO4 0.375g/L，(NH4)2SO4 5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0；
(3)取10g湿菌体加入100mL Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中制成100mL菌悬液；所述Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液为pH＝6、50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液；在搅拌条件下，向100mL菌悬液中添加3mL浓度为10％(v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，然后再加入1mL浓度为25％(v/v)的戊二醛水溶液，20℃交联2h，反应液于-20℃冰箱冻存过夜，冻存样品取出室温融化后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后，用轴向挤压机挤压成长条状，室温风干后，制成小的颗粒，所述颗粒粒径为0.5～2mm，得到固定化细胞。
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