CN114258909B - 一种细胞固定剂及细胞固定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞固定剂及细胞固定方法。为了解决现有细胞固化剂中需使用挥发性有机物质，对人体及环境造成危害，同时为了提高固化后的细胞的机械强度以及细胞中的抗原活性，本发明提出的细胞固定剂，其包括溶剂、有效成分和固定载体，其中，有效成分包括聚乙烯亚胺和维生素C，溶剂为PBS缓冲液和/或生理盐水。本发明通过调整细胞固定剂的配方及配比，在保证细胞固定效果的同时，可以做到不使用挥发性有机物质，降低了对使用者的危害以及对环境的影响，经本发明固定化处理后的细胞的机械性能更强，回收方便，细胞中抗原活性高，有利于高强度生产抗原。

Description

一种细胞固定剂及细胞固定方法

技术领域

本发明涉及细胞固定技术领域，具体涉及一种细胞固定剂及细胞固定方法。

背景技术

固定化细胞技术是通过物理或化学方法将游离细胞固定在特定载体上，使其能重复利用并保持活力。固定化细胞的应用范围极广，已遍及工业、医学、制药、化学分析、环境保护、能源开发等多种领域。

细胞固定的关键在于：选择合适的细胞固定剂以保持细胞形态不改变，同时保持抗原的三维结构不改变，避免抗原的失活或弥散。目前常用的细胞固定剂主要有：醛类(常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛)、醇类(常用乙醇)和酮类(如丙酮)。这些固定剂都必须使用挥发性的有机物，对人体有一定的危害、对环境有一定的影响。

专利CN110973117B提供了一种组织细胞固定液及其制备方法、应用方法，其组织细胞固定液添加了醇类物质，同时减少甲醛的使用，能对组织细胞达到较佳的固定效果，还能够降低组织细胞固定液的刺激性、毒性以及腐蚀性，同时降低了对环境的危害以及降低了对作业人员健康的危害。专利CN110973117B虽然在一定程度上降低了有毒物质的使用量，相比传统细胞固定试剂更加安全环保，但是其仍然未能避免使用醇类和醛类物质，因此仍然具有一定的毒性和危害。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞固化效果好，无需使用挥发性有机物，对人体和环境危害性基本没有危害作用的细胞固定剂。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种细胞固定剂，其包括溶剂、有效成分和固定载体，所述的有效成分包括聚乙烯亚胺和维生素C，所述的溶剂为PBS缓冲液和/或生理盐水。

优选地，所述的PBS缓冲液的配方为：每升PBS缓冲液中含有0.2～0.5g磷酸氢二钾、1～2g磷酸氢二钠、5～10g氯化钠和0.05～0.5氯化钾。

优选地，所述的PBS缓冲液的pH值范围为6.5～7.5。

优选地，所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的维生素C的投料质量的1～2倍。

进一步优选地，所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的维生素C的投料质量的1.2～1.8倍。

优选地，所述的有效成分的投料量为所述的溶剂的1％～10％g/mL。

进一步优选地，所述的有效成分的投料量为所述的溶剂的4％～8％g/mL。

优选地，所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的固定载体的投料质量的5～20倍。

根据一些实施方式，所述的聚乙烯亚胺、所述的维生素C和所述的固定载体的质量比为(10～20):(5～15):1。

优选地，所述的固定载体为硅藻土。

优选地，所述的硅藻土的粒径为100～500目，进一步优选为100～200目。

优选地，所述的硅藻土为白色精制硅藻土。

根据一些实施方式，所述的固定载体的投料量为所述的溶剂的0.1％～0.5％g/mL。

根据一些实施方式，所述的聚乙烯亚胺的投料量为所述的溶剂的1％～5％g/mL。

根据一些实施方式，所述的维生素C的投料量为所述的溶剂为1％～5％g/mL。

优选地，所述的细胞固定剂由所述的溶剂、所述的聚乙烯亚胺、所述的维生素C和所述的固定载体组成。

本发明中，所述的细胞固定剂可以各组分独立分装或混合配制成细胞固定液后封装。

本发明提供一种细胞固定方法，采用所述的细胞固定剂于20～40℃下与细胞混合、固定1～5小时。

优选地，在常温下进行固定即可。

优选地，若所述的细胞为悬浮细胞，所述的细胞固定方法为：将所述的悬浮细胞与2～8℃预冷溶剂混合得到细胞悬液，然后向所述的细胞悬液中加入聚乙烯胺、维生素C和硅藻土，混合均匀后置于室温下静置固化1～2h，固定结束后用真空抽滤的方式将固液分离，收集固体，使用PBS缓冲液清洗得到固定后的细胞。

优选地，若所述的细胞为贴壁细胞，所述的细胞固定方法为：将聚乙烯胺、维生素C和硅藻土与溶剂混合形成细胞固定液，然后将所述的细胞固定液加入含有所述的贴壁细胞的细胞培养容器中，于室温下静置固化1～5小时，固定结束后弃去固定液得到固定后的细胞。

根据一些具体实施方式，所述的悬浮细胞为铜绿假单胞细菌；所述的贴壁细胞为脑胶质细胞。

本发明与现有技术相比具有如下优势：

本发明通过调整细胞固定剂的配方及配比，在保证细胞固定效果的同时，可以做到不使用挥发性有机物质，降低了对使用者的危害以及对环境的影响，经本发明固定化处理后的细胞的机械性能更强，回收方便，细胞中抗原活性高，有利于其与相应抗体的特异结合，有利于抗原高强度生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

为了解决现有细胞固化剂中需使用挥发性有机物质，对人体及环境造成危害，同时为了提高固化后的细胞的机械强度以及细胞中的抗原活性，发明人对细胞固化剂的配方进行了大量的研究以及实验验证，最终提出一种新的细胞固化剂配方和细胞固化方法。

根据本发明，细胞固定剂包括溶剂、有效成分和固定载体，所述的有效成分包括聚乙烯亚胺和维生素C，所述的溶剂为PBS缓冲液和/或生理盐水。

由于细胞固定剂中不含醛类、醇类或酮类等挥发性的物质，因此对人体及环境的影响较小。

通过以聚乙烯亚胺和维生素C的组合物作为细胞固化剂的有效成分，配合固相载体，可以保证细胞固定效果，提高固化后的细胞的结构稳定性及完成性。

维生素C在对细胞固定时，还可能对细胞进行一定的通透处理，不需要额外添加细胞通透剂，可以降低细胞固化剂的成本。

根据本发明，所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的维生素C的投料质量的1～2倍，例如所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的维生素C的投料质量的1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍。当聚乙烯亚胺和维生素C的投料质量控制在该比值范围中时，可以取得最佳的细胞固化效果。

根据本发明，固定载体为硅藻土，固定的细胞机械稳定性好，能完整地保持细胞的形态和结构，还可以很好地保持抗原结构，有利于其与相应抗体的特异结合。

根据本发明，所述的聚乙烯亚胺的投料量为所述的溶剂的1％～5％g/mL，例如1％g/mL、1.5％g/mL、2％g/mL、2.5％g/mL、3％g/mL、3.5％g/mL、4％g/mL、4.5％g/mL、5％g/mL。

根据本发明，所述的维生素C的投料量为所述的溶剂的1％～5％g/mL，例如1％g/mL、1.5％g/mL、2％g/mL、2.5％g/mL、3％g/mL、3.5％g/mL、4％g/mL、4.5％g/mL、5％g/mL。

根据本发明，所述的固定载体的投料量为所述的溶剂的0.1％～0.5％g/mL，例如0.1％g/mL、0.15％g/mL、0.2％g/mL、0.25％g/mL、0.3％g/mL、0.35％g/mL、0.4％g/mL、0.45％g/mL、0.5％g/mL。

根据本发明，溶剂优选使用PBS缓冲液，所述的PBS缓冲液的配方为：每升PBS缓冲液中含有0.2～0.5g磷酸氢二钾、1～2g磷酸氢二钠、5～10g氯化钠和0.05～0.5氯化钾。

优选地，所述的PBS缓冲液的pH值范围为6.5～7.5。

根据本发明，所述的细胞固定剂可以各组分独立分装，使用时常温下混合即可，当然也可混合配制成细胞固定液后封装，本发明的细胞固定剂配置过程简单、快速、环保，无需加热，更没有有毒有害物质产生。

根据本发明，采用所述的细胞固定剂进行细胞固化时，仅需将细胞固定剂与待固定化的细胞于20～40℃下混合、静置固定1～5小时。实际操作时，在常温下进行固定即可，对温度没有特殊要求，操作方便。

具体地，当所述的细胞为悬浮细胞，所述的细胞固定方法为：将所述的悬浮细胞与2～8℃预冷溶剂混合得到细胞悬液，然后向所述的细胞悬液中加入聚乙烯胺、维生素C和硅藻土，混合均匀后置于室温下静置固化1～2h，固定结束后用真空抽滤的方式将固液分离，收集固体，使用PBS缓冲液清洗得到固定后的细胞。

具体地，若所述的细胞为贴壁细胞，所述的细胞固定方法为：将聚乙烯胺、维生素C和硅藻土与溶剂混合形成细胞固定液，然后将所述的细胞固定液加入含有所述的贴壁细胞的细胞培养容器中，于室温下静置固化1～5小时，固定结束后弃去固定液得到固定后的细胞。

本发明的细胞固定剂相比现有细胞固定剂具有以下优势：

1、使用本发明的固定剂固定的细胞机械稳定性好，能完整地保持细胞形态和结构，还可以很好地保持抗原结构，有利于抗原与相应抗体的特异结合。

2、本发明的细胞固定剂在对细胞固定时，其中的维生素C还可对细胞进行一定的通透处理，从而不需要额外添加细胞通透剂，配方简单，原料来源广，制备成本低。

3、本发明的细胞固定剂配置过程简单、快速、环保，无需加热，更没有有毒有害物质产生，适合大规模推广利用。

以下结合具体实施例和对比例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。

以下实施例和对比例中，使用的PBS缓冲液的制备方法为：

分别将0.27g磷酸氢二钾、1.42g磷酸氢二钠、8.00g氯化钠和0.20g氯化钾加入至无菌水中，充分溶解后定容至1L，配制成PBS缓冲液。

以下实施例和对比例中，若无特殊说明，所使用的原料、试剂或装置均为常规市售产品。

以下实施例和对比例中，PG-4细胞购自ATCC，硅藻土为200目白色精制硅藻土。

实施例1：PG-4细胞(星形脑胶质细胞)的固定

(1)固定液配置：称取0.30g聚乙烯胺、0.20g维生素C和0.02g硅藻土溶于10mL PBS缓冲液中，混匀。

(2)PG-4细胞培养：取一块6孔细胞培养板，加入1.5×10⁵个/孔(5×10⁴个/mL)PG-4细胞，补充培养液(含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基)至每孔3mL放置37℃、含5％CO₂培养箱中孵育过夜。次日取出细胞培养板，弃去培养液，然后每孔用无血清McCoys’5A培养基洗涤2次。

(3)细胞固定：在上述细胞培养的每孔内加入0.5mL固定液，室温下固定细胞4小时，弃去固定液。用吉姆萨染液(Gimsa)染色5分钟，弃去染液，用PBS溶液清洗多余的染液，PG-4细胞染色图见图1，图中显示细胞形态明显、未变形。

实施例2：铜绿假单胞细菌的固定

(1)菌体准备：铜绿假单胞菌经活化培养得到菌液，菌液离心分离得湿菌体。取0.5g湿菌体溶于10mL经2～8℃预冷的PBS中，混匀制成菌体混悬液。

(2)在菌体混悬液中依次加入0.30g聚乙烯亚胺、0.20g维生素C和0.04g硅藻土，混合均匀后置于室温静置交联2h。

(3)用真空抽滤的方式将固液分离，将固定的细胞用PBS缓冲液清洗三次，备用。

(4)将制备好的固定化细胞溶于PBS缓冲液后用玻璃珠振荡24h，用人β-内酰胺酶(LACTβ)试剂盒检测细胞固定后β-内酰胺酶残余酶活，同时取相同量的未进行细胞固定的菌体混悬液，通过相同的方法测试初始酶活，结果显示β-内酰胺酶残余酶活为初始酶活的80％。

对比例1：PG-4细胞的固定

(1)固定液配置：称取0.30g聚乙烯亚胺和0.02g硅藻土溶于10mL PBS缓冲液中，混匀。

(4)PG-4细胞培养：取一块6孔细胞培养板，加入1.5×10⁵个/孔(5×10⁴个/mL)PG-4细胞，补充培养液(含10％胎牛血清的McCoy’s 5A培养基)至每孔3mL放置37℃、含5％CO₂培养箱中孵育过夜。次日取出细胞培养板，弃去培养液，然后每孔用无血清McCoys’5A培养基洗涤2次。

(5)细胞固定：在上述细胞培养的每孔内加入0.5mL固定液，室温下固定细胞4小时，弃去固定液。用吉姆萨染液(Gimsa)染色5分钟，弃去染液，用PBS溶液清洗多余的染液，PG-4细胞染色图见图2，图中明显有部分细胞变形。

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种细胞固定剂，其由溶剂、有效成分和固定载体组成，其特征在于，所述的有效成分由聚乙烯亚胺和维生素C组成，所述的溶剂为PBS缓冲液和/或生理盐水，所述的固定载体为硅藻土，

所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的维生素C的投料质量的1～2倍，

所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的固定载体的投料质量的5～20倍，

所述的有效成分的投料量为所述的溶剂的1％～10％g/mL。

2.根据权利要求1所述的细胞固定剂，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺的投料质量为所述的维生素C的投料质量的1.2～1.8倍。

3.根据权利要求1所述的细胞固定剂，其特征在于，所述的有效成分的投料量为所述的溶剂的4％～8％g/mL。

4.一种细胞固定方法，其特征在于，采用权利要求1至3中任一项所述的细胞固定剂于20～40℃下与细胞混合、固定1～5小时。

5.根据权利要求4所述的细胞固定方法，其特征在于，若所述的细胞为悬浮细胞，所述的细胞固定方法为：将所述的悬浮细胞与2～8℃预冷溶剂混合得到细胞悬液，然后向所述的细胞悬液中加入聚乙烯亚胺、维生素C和硅藻土，混合均匀后置于室温下静置固化1～2h，固定结束后用真空抽滤的方式将固液分离，收集固体，使用PBS缓冲液清洗得到固定后的细胞；

若所述的细胞为贴壁细胞，所述的细胞固定方法为：将聚乙烯亚胺、维生素C和硅藻土与溶剂混合形成细胞固定液，然后将所述的细胞固定液加入含有所述的贴壁细胞的细胞培养容器中，于室温下静置固化1～5小时，固定结束后弃去固定液得到固定后的细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞固定方法，其特征在于，所述的悬浮细胞为铜绿假单胞细菌；所述的贴壁细胞为脑胶质细胞。