JP2018537991A - Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ及びその塩を含むｄ−プシコースを製造するための組成物、並びにこれを用いたｄ−プシコースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、（ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物、および（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を含むＤ−プシコース生産用の組成物および前記（ａ）に前記（ｂ）を添加するステップを備えるＤ−フルクトースからＤ−プシコースを製造する方法、またはＤ−フルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める方法に関する。【選択図】図１
Description
本発明は、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ及びその塩を含むＤ−プシコースを製造するための組成物、並びにこれを用いたＤ−プシコースの製造方法に関する。
Ｄ−プシコースはイチジク、レーズンなどの果物及び糖蜜やグルコースの異性化反応過程中に極少量だけ存在する天然糖であり、砂糖に比べて７０％の甘味度を有する単糖類である。Ｄ−プシコースはフルクトースやスクロースと異なり、人体内で代謝されないのでカロリーがほとんどなく、体脂肪形成の抑制作用で体重増加に影響が少なく、脂質合成に関与する酵素の活性を抑制し、腹部肥満を減らす効能が報告されている（Ｍａｔｕｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａ Ｐａｃ． Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， １０， ２２３−２３７， ２００１； Ｍａｔｓｕｏ Ｔ． ａｎｄ Ｋ． Ｉｚｕｍｏｒｉ． ＡｓｉａＰａｃ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， １３， Ｓ１２７，２００４．）。また、最近では、Ｄ−プシコースが血糖値の上昇に影響がなく、非齲蝕及び抗齲蝕機能で歯牙健康に役立つことが分かった。
Ｄ−プシコースは甘味料として関心が高まっているが、自然界に極少量だけ存在する単糖類の希少糖に属するので、食品産業に適用するためにはプシコースを効率的に生産する技術の開発が必要である。
Ｄ−プシコースは甘味料として関心が高まっているが、自然界に極少量だけ存在する単糖類の希少糖に属するので、食品産業に適用するためにはプシコースを効率的に生産する技術の開発が必要である。
従来のプシコースの生産方法は、モリブデン酸イオンの触媒作用を用いてフルクトースからプシコースを生産する化学的方法とＤ−プシコース３−エピメラーゼを用いてフルクトースからプシコースを生産する生物学的方法がある。化学的方法によるプシコースの生産は糖蜜の処理工程またはグルコース異性化反応中にプシコースが非常に少量だけ存在して費用及び副産物の発生が多いという短所があり、生物学的方法も収率が非常に低くて生産費用が高いという問題がある。
これらの問題点を克服するために本発明者らは本出願の前に、グルコースをフルクトースに異性化した後、これをＤ−プシコース３−エピメラーゼを生産する固定化菌体と反応させてＤ−プシコースを経済的に生産する方法を報告した（韓国特許出願第１０−２００９−０１１８４６５号）。また、このように生産されたＤ−プシコースをエタノールなどの有機溶媒を使用せず、経済的にＤ−プシコースを製造し、製造工程の円滑化と商品性を有する結晶状態の純粋なＤ−プシコースの製造方法を報告した（韓国特許出願第１０−２０１０−００２７５４６号）。
しかし、前記Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ（以下、「プシコースエピメラーゼ」という）を用いたＤ−プシコースの生産方法（以下、「酵素転換方法」にいう）はまだ収率の限界があるので、産業的に大量生産するためには生産収率の向上と製造原価の低下のためにプシコースエピメラーゼによってフルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める努力が必要である。
このような背景で本発明者らは、前記プシコースエピメラーゼによってフルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める方法を開発するために鋭意研究する努力の結果、酵素転換方法でアルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）またはヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）を利用した場合、前記変換率が著しく高まることを確認して本発明を完成した。
本出願の目的は、（ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物、および（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を含む、Ｄ−プシコースを生産するための組成物を提供することである。
本出願の他の目的は、（ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物に、（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を添加するステップを備える、Ｄ−フルクトースからＤ−プシコースを製造する方法を提供することである。
本出願のさらに他の目的は、（ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物に、（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を添加するステップを備える、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼによってＤ−フルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める方法を提供することである。
本出願の目的を達成するため本発明の一実施形態では、（ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物、および（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を含む、Ｄ−プシコースを生産するための組成物を提供する。
本出願のＤ−プシコース３−エピメラーゼ（以下、「プシコースエピメラーゼ」という）は、Ｄ−フルクトースをＤ−プシコースにエピマー化させる活性を有するタンパク質であれば制限なく含むことができ、前記タンパク質を内在的に発現する菌株、前記タンパク質を発現するように形質転換された菌株、前記菌株の培養物、または前記培養物から分離されたタンパク質をプシコースエピメラーゼとして使用することができる。
本発明の一実施例で、本発明のプシコースエピメラーゼはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはカイスティア・グラヌリ（Ｋａｉｓｔｉａ ｇｒａｎｕｌｉ）から由来した野生型のプシコースエピメラーゼまたはその変異体であり、具体的には配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９９％以上、または１００％の遺伝的相同性を有するプシコースエピメラーゼである。また、この相同性を有するアミノ酸配列であって、プシコースエピメラーゼ活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、置換、または挿入されたアミノ酸配列も、本出願のアミノ酸配列の範囲に含まれると解釈されるべきである。より具体的に、配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列を有するプシコースエピメラーゼである。
本発明における用語「相同性」は、二つのポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）間の同一性の百分率を意味する。一方の部分から他方の部分までの配列間に相当性は周知の当該技術によって決定できる。例えば、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを利用し、２つのポリペプチド分子間の配列情報を直接整列して相同性を決定することができる。また、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションした後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解して分解された断片の長さを測定することで相同性を決定することができる。
本発明における用語「相同」は、すべての文法的形態やスペリング変異形態は（ｇｒａｍｍａｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｓｐｅｌｌｉｎｇ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）、スーパーファミリー由来のタンパク質（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）と他種由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含み、「共通進化起源」を有するタンパク質との間の関係を意味する。これらのタンパク質（およびそれらのコード遺伝子）は、高レベルの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。しかし、一般の使用と本発明における「相同」は「非常に高い」などの形容詞によって修飾される場合、配列類似性を意味し、共通進化起源を意味するのではない。
本発明における用語「配列類似性」は、共通進化起源の共有には関係なく、タンパク質の塩基配列やアミノ酸配列の間の同一性や相当性の程度を意味する。一実施例で、二つのアミノ酸配列が所定長さのアミノ酸配列において、ポリペプチドのマッチが少なくとも７０％（一実施例において７５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９９％）であった場合、「実質的に相同」または「実質的に類似」である。実質的に相同である配列は、データバンクで使用される標準ソフトウェアを使用して、例えば、特定システムのために厳格に定義された条件下で用いたハイブリダイゼーション実験によって配列を比較することで確認することができる。定義された適切なハイブリダイゼーション条件は、当該技術の範囲内に属する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｉｎｆｒａを参照）。
本発明の他の実施例において、本発明の菌株であるプシコースエピメラーゼを発現する菌株は、前記開示されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現する微生物であれば制限なく含まれることができ、具体的に公知のコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０４６Ｐ（韓国公開特許第１０−２０１１−００３５８０５号）、ＫＣＣＭ１１２０４Ｐ（韓国登録特許第１０−１２０３８５６号）、ＫＣＣＭ１１４０３Ｐ（韓国登録特許第１０−１４５５７５９号）またはＫＣＣＭ１１９１８Ｐ（韓国出願番号第１０−２０１６−０１５２９４７号）があるが、これらに限定されない。
本発明のプシコースエピメラーゼは基質のＤ−フルクトースと混合すること、Ｄ−フルクトースを添加して使用すること、Ｄ−フルクトースに添加して使用すること、前記酵素自体または前記酵素を発現する菌株を担体に固定化させて使用することができる。本発明で使用できる担体の例としては、アガー、アガロース、ｋ−カラギーナン、アルギン酸塩またはキトサンがあるが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、Ｄ−フルクトースをさらに含むことができる。具体的には、本発明のＤ−フルクトースは０．０１Ｍ〜１０Ｍ、０．０１Ｍ〜５Ｍ、０．０１Ｍ〜３Ｍ、０．０５〜１０Ｍ、０．０５〜５Ｍ、０．０５〜３Ｍ、０．０８〜１０Ｍ、０．０８Ｍ〜５Ｍ、０．０８Ｍ〜３Ｍ、または０．１Ｍ〜２．８Ｍのフルクトースである。本発明における塩とフルクトースのモル（Ｍ）比（塩のモル：フルクトースのモル）は、１：０．０１〜１、１：０．０５〜１、１：０．１〜１、１：０．１〜０．８、１：０．１〜０．６または１：０．２〜０．６である。前記範囲の塩のモル比で、Ｄ−プシコースへの転換率が最適な範囲で維持される。
本発明の組成物を用いた際においてＤ−フルクトースからＤ−プシコースへの転換率は、塩がなかった時の転換率に比べて、１．５〜５．０倍、１．８〜５．０倍、２．０〜５．０倍、１．５〜３．０倍、１．８〜３．０倍、２．０〜３．０倍に増加する。
本発明の組成物は任意的に、プシコース生産を促進又は補助する成分をさらに含むことができる。このような成分として、例えば、マンガン、マグネシウム、鉄、コバルトおよび／またはアルミニウムなどの金属イオン物質または金属塩があるが、これらに限定されない。前記金属塩は、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４及びＺｎＳＯ４からなる群より選択される一つ以上である。前記金属イオン物質または金属塩は、０．５〜１０ｍＭ、０．５〜５ｍＭ、または０．５〜３ｍＭで添加される。
本発明の他の実施形態では、（ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物に、（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を添加するステップを備えるＤ−フルクトースからＤ−プシコースを製造する方法を提供する。
本発明の他の実施形態では、（ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物に、（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）にからなる群より選択される一つ以上の塩を添加するステップを備える、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼによってＤ−フルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める方法を提供する。
以下、本発明の実施形態によってＤ−フルクトースからＤ−プシコースを製造する方法、およびＤ−フルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める方法について説明する。
本発明の一実施例において、本発明のＤ−フルクトースはスクロースの加水分解により製造されるか、グルコースを異性化して製造されたものであり得る。これにより、フルクトース、砂糖とグルコースのように広く使用されて安価な原料を用いて、高収率でＤ−プシコースを製造することができ、プシコースの大量生産が可能になる。具体的に本発明の方法は、各々、本発明のステップ（ａ）の前に、グルコースを異性化してＤ−フルクトースを得るステップ（ｐｒｅ−ａ）をさらに備えることができる。前記ステップ（ｐｒｅ−ａ）は、グルコースを異性化する活性を有するタンパク質（例えば、グルコースイソメラーゼまたはホスホグルコイソメラーゼ）が利用されるが、これらに限定されない。
本発明の一実施例において本発明の方法は、各々、本発明の塩を添加する前、後、または同時にＤ−フルクトースを添加するステップ（ｃ）をさらに備えることができる。本発明の一実施例において前記方法は、本発明の塩添加と同時にＤ−フルクトースを添加するステップをさらに備えることができ、具体的に前記塩と前記Ｄ−フルクトースが混合されなかった状態で別々に同時に添加すること、または前記塩と前記Ｄ−フルクトースを混合して同時に添加することができる。
本発明の方法は各々、本発明の塩を添加する前、後、または同時に、プシコース生産を促進又は補助することができる任意成分を添加するステップ（ｃ’）をさらに備えることができる。具体的に前記成分は、金属イオン物質（例えば、マンガン、マグネシウム、鉄、コバルトおよび／またはアルミニウムなど）または金属塩であり、より具体的に、前記金属塩は、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４及びＺｎＳＯ４で構成される群から選択される一つ以上である。本発明の一実施例において、本発明の方法は各々、前記のステップ（ｂ）、（ｃ）または（ｃ’）の後に、Ｄ−フルクトースのエピマー化反応を実施するステップ（ｄ）をさらに備えることができる。本発明の反応は、ｐＨ７〜９．０、ｐＨ７．５〜９．０、ｐＨ７．８〜９．０、ｐＨ８．０〜９．０、ｐＨ７．５〜８．５、ｐＨ７．８〜８．５、ｐＨ７．８〜８．３またはｐＨ８．０で実施する。また、本発明の反応は３０〜６５℃、４０〜６５℃、５０〜６５℃、５０〜６０℃、５３〜５７℃または５５℃の温度で実施する。さらに、本発明の反応は、２時間以上、または３時間以上および／または、１６時間以下、２４時間以下、３６時間以下、または４８時間以下で実施する。
本発明の更に他の実施例において本発明の方法は、各々、本発明のステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｃ’）、または（ｄ）の後に、Ｄ−プシコースを分離および／または精製するステップ（ｅ）をさらに備えることができる。前記精製方法は特に制限されなく、本発明の技術分野における通常の方法を用いることができる。非限定的な例として、クロマトグラフィー、分別結晶、イオン精製、透析、沈殿、吸着、電気泳動などがある。前記精製方法は１つだけ実施することも、二つ以上の方法を共に実施することもできる。例えば、クロマトグラフィーでＤ−プシコースを精製することができ、前記クロマトグラフィーによる糖の分離は分離しようとする糖とイオン樹脂に付着した金属イオンとの間の弱い結合力の差を利用して行うことができる。
また、本発明の方法は各々、本発明の精製するステップの前または後に、脱色、脱塩またはその組み合わせを実施するステップ（ｆ）をさらに備えることができる。前記脱色および／または脱塩を行うことで、不純物がなく、より精製されたＤ−プシコースを得ることができる。
本発明の更に他の実施例において本発明の方法は、各々、本発明のステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｃ’）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）の後に、Ｄ−プシコースを結晶化するステップ（ｇ）をさらに備えることができる。前記結晶化する方法は特に制限されず、通常の結晶化方法が使用できる。例えば、冷却結晶化方法を用いた結晶化方法がある。前記結晶化するステップを経て、最終的に精製されたＤ−プシコースを高収率で得ることができる。
本発明の一実施例において本発明の方法は各々、本発明の結晶化するステップの前に得られたＤ−プシコース液を濃縮するステップ（ｐｒｅ−ｇ）をさらに備えることができる。前記濃縮は精製されたＤ−プシコースの濃度を約２．５〜３倍に濃縮することであり、前記濃縮するステップを経てより効率的に結晶化する。
本発明の更に他の実施例において本発明の方法は各々、本発明の精製ステップ（ｅ）の後に未反応されたＤ−フルクトースをエピマー化するステップ（ｄ）で再使用すること、本発明の結晶化ステップ（ｇ）の後に結晶が分離された母液を前記精製ステップ（ｅ）で再使用すること、またはその組み合わせを実施するステップ（ｈ）をさらに備えることができる。前記ステップによってＤ−プシコースをさらに高収率で得ることと、廃棄されるＤ−フルクトースの量を減らすことが可能となって、経済的に利点がある。
本発明のＤ−フルクトースからＤ−プシコースを製造する方法、およびＤ−フルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める方法は、本発明のＤ−プシコース生産用の組成物と酵素、菌株、培養物と塩を共通的に用いるため、共通事項については本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明に係るＤ−プシコースの生産方法は、微生物から得られた酵素を利用するので環境にやさしいし、酵素反応の変換率を高めるためにアルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）、ヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）などを添加する簡単な工程により、以前に比べて生産収率が著しく高められるので生産効果を極大化することができる。
以下、本発明に関してより詳しく説明する。本明細書に記載のない内容は、本発明の技術分野または類似分野における熟練者なら十分に認識と類推できるため、その説明を省略する。
１．比較例：酵素転換方法を用いたＤ−プシコースの生産
＜比較例１＞
アグロバクテリウム・ツメファシエンスから由来したプシコースエピメラーゼの変異体を発現する組換え菌株として、公知（韓国登録特許第１０−１４５５７５９号）のコリネバクテリウム・グルタミカム（ＫＣＣＭ１１４０３Ｐ）を用いて酵素転換反応を行った。０．１Ｍのフルクトースを水に溶解させた後、１０ｍＭのＭｎＣｌ２を添加して酵素転換反応のための原料を製造し、これに前記菌株［２０％（ｗ／ｗ）］を添加してｐＨ８．０、５５℃の条件で３時間反応を進めた。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスから由来したプシコースエピメラーゼの変異体を発現する組換え菌株として、公知（韓国登録特許第１０−１４５５７５９号）のコリネバクテリウム・グルタミカム（ＫＣＣＭ１１４０３Ｐ）を用いて酵素転換反応を行った。０．１Ｍのフルクトースを水に溶解させた後、１０ｍＭのＭｎＣｌ２を添加して酵素転換反応のための原料を製造し、これに前記菌株［２０％（ｗ／ｗ）］を添加してｐＨ８．０、５５℃の条件で３時間反応を進めた。
その後、ＨＰＬＣ分析で前記プシコースエピメラーゼの基質（Ｄ−フルクトース）と生成物（Ｄ−プシコース）のピーク面積（ａｒｅａ）値を比較定量して転換率を計算し、前記ＨＰＬＣ分析は８０℃で設定されたカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃ ｃｏｌｕｍｎ）に試料を注入した後、移動相溶媒として水を０．６ｍｌ／ｍｉｎの速度で通過させる条件で実行した。
その結果、前記酵素転換方法によるＤ−プシコースへの転換率は２５％であることを確認した（表１）。
＜比較例２＞
カイスティア・グラヌリから由来したプシコースエピメラーゼを用いて酵素転換反応を行った。前記酵素は配列番号４のプシコースエピメラーゼを発現する組換え菌株［（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＫＧＤＰＥ（ＫＣＣＭ１１９１８Ｐ）］を５ｍｌのＬＢ−アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ）にそれぞれ接種し、６００ｎｍにおける吸光度が１．５になるまで３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養した後、この培養液を５００ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地に接種して本培養を行った。その後、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの過発現を誘導するため６００ｎｍにおける吸光度が０．７になるとき、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して、１６°Ｃ、１５０ｒｐｍで調整して１６時間培養して酵素を大量発現させた。発現された酵素を精製するために、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体のみを回収して０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回洗浄し、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に混濁させた後、音波振動機を用いて４℃で２０分間破砕した。前記破砕液を１３，０００ｒｐｍと４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を回収した後、予め溶解緩衝液で平衡させたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ）に適用させた後、２０ｍＭのイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と２５０ｍＭのイミダゾールを含まれた緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を順次に流して精製された酵素を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで酵素の単量体のサイズが約３２ｋＤａであることを確認した。
カイスティア・グラヌリから由来したプシコースエピメラーゼを用いて酵素転換反応を行った。前記酵素は配列番号４のプシコースエピメラーゼを発現する組換え菌株［（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ＫＧＤＰＥ（ＫＣＣＭ１１９１８Ｐ）］を５ｍｌのＬＢ−アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ）にそれぞれ接種し、６００ｎｍにおける吸光度が１．５になるまで３７℃、２００ｒｐｍで振とう培養した後、この培養液を５００ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地に接種して本培養を行った。その後、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼの過発現を誘導するため６００ｎｍにおける吸光度が０．７になるとき、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して、１６°Ｃ、１５０ｒｐｍで調整して１６時間培養して酵素を大量発現させた。発現された酵素を精製するために、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して菌体のみを回収して０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで２回洗浄し、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）に混濁させた後、音波振動機を用いて４℃で２０分間破砕した。前記破砕液を１３，０００ｒｐｍと４℃で２０分間遠心分離して上澄み液を回収した後、予め溶解緩衝液で平衡させたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、Ｑｉａｇｅｎ）に適用させた後、２０ｍＭのイミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）と２５０ｍＭのイミダゾールを含まれた緩衝溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を順次に流して精製された酵素を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで酵素の単量体のサイズが約３２ｋＤａであることを確認した。
０．１Ｍフルクトースを水に溶解させた後、１０ｍＭのＭｎＣｌ２を添加して酵素転換反応のための酵素反応液を製造し、これに前記精製酵素０．４ｍｇ／ｍｌを加えてｐＨ８．０と５５℃の条件で３時間反応を進めた。
その後、ＨＰＬＣ分析で前記プシコースエピメラーゼの基質（フルクトース）と生成物（プシコース）のピーク面積（ａｒｅａ）値を比較定量して転換率を計算し、前記ＨＰＬＣ分析は８０℃に設定されたカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃ ｃｏｌｕｍｎ）に試料を注入した後、移動相溶媒として水を０．６ｍｌ／ｍｉｎの速度で通過させる条件で行った。
その結果、前記酵素転換方法によるＤ−プシコースへの転換率は２５％であることを確認した（表２）。
２．実施例１：アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）添加によるＤ−プシコースの生産
＜実施例１−１＞
前記比較例１のフルクトースを含有する原料に含まれるフルクトースの濃度（０．１Ｍ、１．７Ｍおよび２．８Ｍ）を調整し、前記原料の各々に０．０５Ｍ、０．８５Ｍ、１．４Ｍのアルミン酸ナトリウム（ＮａＡｌＯ２）をそれぞれ添加し、比較例１と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例１と同様に分析した。
前記比較例１のフルクトースを含有する原料に含まれるフルクトースの濃度（０．１Ｍ、１．７Ｍおよび２．８Ｍ）を調整し、前記原料の各々に０．０５Ｍ、０．８５Ｍ、１．４Ｍのアルミン酸ナトリウム（ＮａＡｌＯ２）をそれぞれ添加し、比較例１と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例１と同様に分析した。
その結果、下記の表１に示すように、アルミニウム塩であるアルミン酸ナトリウムを添加した時の転換率は、フルクトース濃度０．１Ｍで比較例１の転換率に比べて２６８％であり、フルクトース濃度を１．７Ｍおよび２．８Ｍに高めた場合の転換率も比較例１の転換率に比べて各々２６８％と２１２％であって、Ｄ−プシコース転換反応でアルミン酸塩を添加した時にＤ−プシコースの転換率が著しく高まったことを確認した（図１ａ〜図１ｃおよび図３ａを参照）。
＜実施例１−２＞
前記比較例２において０．１Ｍフルクトースを含有する酵素反応液に５０ｍＭのアルミン酸ナトリウム（ＮａＡｌＯ２）を添加して、比較例２と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例２と同様に分析した。
前記比較例２において０．１Ｍフルクトースを含有する酵素反応液に５０ｍＭのアルミン酸ナトリウム（ＮａＡｌＯ２）を添加して、比較例２と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例２と同様に分析した。
その結果、下記の表１に示すように、アルミン酸塩であるアルミン酸ナトリウムを添加した時の転換率は比較例１の転換率に比べて２００％であり、実施例１−１と同様にＤ−プシコース転換反応でアルミン酸塩を添加した時にＤ−プシコースの転換率が著しく高まったことを確認した（図１ｄ及び図３ｂ）。
３．実施例２：ヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）添加によるＤ−プシコースの生産
＜実施例２−１＞
前記比較例１において０．１Ｍフルクトースを含有する原料に２５ｍＭのヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ３）を添加し比較例１と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例１と同様に分析した。
前記比較例１において０．１Ｍフルクトースを含有する原料に２５ｍＭのヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ３）を添加し比較例１と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例１と同様に分析した。
その結果、下記に表１に示すように、ヨウ素酸塩を添加した時の転換率は比較例１の転換率に比べて２０８％であり、Ｄ−プシコース転換反応でヨウ素酸塩を添加した時のＤ−プシコースの転換率が著しく高まったことを確認した（図２ａ及び図３ａ参照）。
＜実施例２−２＞
前記比較例２において０．１Ｍフルクトースを含有する酵素反応液に２５ｍＭのヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ３）を添加し比較例１と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例１と同様に分析した。
前記比較例２において０．１Ｍフルクトースを含有する酵素反応液に２５ｍＭのヨウ素酸カリウム（ＫＩＯ３）を添加し比較例１と同じ条件でＤ−プシコースへの転換反応を行い、転換率も比較例１と同様に分析した。
その結果、下記に表１に示すように、ヨウ素酸塩を添加した時の転換率は比較例１の転換率に比べて１４０％であり、Ｄ−プシコース転換反応でヨウ素酸塩を添加した時のＤ−プシコースの転換率が著しく高まったことを確認した（図２ｂおよび図３ｂ）。
以上で、本発明の一部を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者においてこのような具体的な記述は単に好適実施例であり、これによって本発明の範囲が限定されないことは自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求範囲とその均等物によって定義されるべきである。
Claims (5)
- （ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物、および（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を含むＤ−プシコースを生産するための組成物。
- 前記組成物はＤ−フルクトースをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
- （ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物に、（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を添加するステップを備える、Ｄ−フルクトースからＤ−プシコースを製造する方法。
- （ａ）Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ、前記酵素を発現する菌株又は前記菌株の培養物に、（ｂ）アルミン酸塩（ａｌｕｍｉｎａｔｅ）及びヨウ素酸塩（ｉｏｄａｔｅ）からなる群より選択される一つ以上の塩を添加するステップを備えて、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼによるＤ−フルクトースからＤ−プシコースへの転換率を高める方法。
- 前記方法は、前記塩の添加前、添加後、または添加と同時に、Ｄ−フルクトースを添加するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
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