TWI408229B

TWI408229B - 新穎之２－脫氧蟹肌醇合成酶

Info

Publication number: TWI408229B
Application number: TW099108851A
Authority: TW
Inventors: Kazunobu Konishi; Shinichi Imazu
Original assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2013-09-11
Also published as: KR101588099B1; KR20130019452A; CN102361978A; JPWO2010109916A1; CN103320401A; US8703466B2; KR20130111639A; JP5654078B2; US20120100584A1; EP2412807A1; EP2759594A1; KR20110110372A; JP2013135697A; JP5579700B2; TW201035319A; KR101410069B1; EP2412807A4; EP2412807B1; CN102361978B; US20140206050A1

Description

新穎之2-脫氧蟹肌醇合成酶

本發明係有關耐熱性2-脫氧蟹肌醇合成酶(2-deoxy-scyllo-inosose synthase)、2-脫氧蟹肌醇合成酶基因、重組載體(recombinant vector)、轉形體(transformant)、以及2-脫氧蟹肌醇之製造方法。

目前，兒茶酚等芳香族化合物多半是以石油作為原料而生產，但從石油資源之竭盡問題或二氧化碳排量之減少等觀點來看，要求開發出利用生質(biomass)之環境協調型之新穎製造方法。

另一方面，發現2-脫氧蟹肌醇(2-deoxy-scyllo-inosose，以下有時稱為DOI)可轉換成產業上有用之芳香族化合物(兒茶酚等)(參照後述之非專利文獻1)，並且有報告指出由作為生質之構成要素之一的葡萄糖可合成此DOI(參照後述之非專利文獻1)。本DOI製造方法中之重點係將葡萄糖-6-磷酸轉換成DOI之2-脫氧蟹肌醇合成酶(以下稱為DOI合成酶)，由於DOI不僅可轉換成上述芳香族化合物，亦可成為各種有用化合物之中間體，故DOI合成酶係受到極大注目。

DOI合成酶係於1997年由屬於作為丁苷菌素(butirosin)生產菌之Bacillus circulans (環狀芽胞桿菌)的微生物所單離精製(參照後述之非專利文獻2)，然後，其基因序列亦已公開(參照後述之專利文獻1)。此外，至今亦發現源自Streptoalloteichus hindustanus (印度斯坦鏈異壁菌)JCM3268株(參照後述之非專利文獻3)之DOI合成酶等。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2000-236881號公報

[非專利文獻1]Tetrahedron Letters 41,1935-1938,2000

[非專利文獻2]The Journal of Antibiotics 50(5),424-428,1997

[非專利文獻3]The Journal of Antibiotics 59(6),358-361,2006

然而，前述DOI合成酶之安定性與比活性等各種特性並非足以滿足者，此外，幾乎未曾有過關於適合數千噸規模之工業化製法的酵素之解析和機能提升的研究。例如源自屬於Bacillus circulans 之微生物的DOI合成酶(BtrC)在安定性上有很大的問題，源自Streptoalloteichus hindustanus JCM3268株之DOI合成酶的比活性係顯著地低，難以利用於工業上。本發明欲解決之課題係提供相較於以往之酵素，對熱或pH之安定性等特性優異的DOI合成酶以及使用該酶之DOI之製造方法。

為了解決此等課題而精心研究之結果，本發明人發現一種相較於以往之酵素而使熱及/或pH安定性明顯提升之DOI合成酶，因而完成本發明。

亦即，本發明係有關以下所示之DOI合成酶、DOI合成酶基因、重組載體、轉形體、以及DOI之製造方法。

[1]　一種2-脫氧蟹肌醇合成酶，其具有下述(1)、(2)、(4)、(6)及(7)之特性，且具有下述(3)及/或(5)之特性：

(1)作用：本酵素具有將葡萄糖-6-磷酸轉換成2-脫氧蟹肌醇之功能；

(2)最適pH範圍：7.0至7.7；

(3)安定pH範圍：6.0至8.0；

(4)最適溫度範圍：55至70℃；

(5)安定溫度範圍：20至46℃；

(6)輔酶：利用NAD⁺ ；

(7)分子量：39000至42000。

[2]　如[1]記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶，其具有下述(8)之特性：

(8)比活性：1.0μmol/分鐘/mg以上(反應溫度65℃)。

[3]　如[1]或[2]記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶，其具有下述(9)之特性：

(9)輔因子(cofactor)：藉由添加Co²⁺ 離子而提升活性。

[4]　如[1]至[3]中任一項記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶，其中，安定溫度範圍為20至60℃者。

[5]　一種2-脫氧蟹肌醇合成酶，其具有下述任一胺基酸序列：

(a)序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列；

(b)相對於序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列而具有80%以上之相同性(homology)，且具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性的胺基酸序列；或

(c)相對於序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列而包含1個或數個胺基酸之缺失、加成、及/或置換，且具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性的胺基酸序列。

[6]　一種2-脫氧蟹肌醇合成酶基因，其具有編碼下述任一胺基酸序列之鹼基序列：

(a)序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列；

(b)相對於序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列而具有80%以上之相同性，且具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性的胺基酸序列；或

[7]　一種2-脫氧蟹肌醇合成酶基因，其具有下述任一鹼基序列：

(a)序列編號1、3、5、7、9或11中任一者記載之鹼基序列；

(b)相對於序列編號1、3、5、7、9或11中任一者記載之鹼基序列而具有80%以上之相同性，且編碼具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之2-脫氧蟹肌醇合成酶的鹼基序列；或

(c)相對於序列編號1、3、5、7、9或11中任一者記載之鹼基序列而包含1個或數個鹼基之缺失、加成、及/或置換，且編碼具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之2-脫氧蟹肌醇合成酶的鹼基序列。

[8]　一種重組載體，其包含[6]或[7]記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶基因。

[9]　一種轉形體，其係藉由將[6]或[7]記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶基因或是[8]記載之重組載體導入宿主中而獲得。

[10]一種2-脫氧蟹肌醇合成酶，其係藉由培養[9]記載之轉形體而獲得。

[11]一種2-脫氧蟹肌醇之製造方法，其特徵係使用[1]至[5]或[10]中任一項記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶。

[12]一種2-脫氧蟹肌醇之製造方法，其原料為葡萄糖、以葡萄糖作為構成成分之多醣類、及/或葡萄糖-6-磷酸，該製造方法之特徵係利用[6]或[7]記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶基因、或[9]記載之轉形體。

[13]一種2-脫氧蟹肌醇之製造方法，其係由葡萄糖-6-磷酸製造2-脫氧蟹肌醇，該製造方法之特徵係：在含有鈷離子之培養基中培養可表現2-脫氧蟹肌醇合成酶之微生物。

[14]如[13]記載之方法，其係使用含有以葡萄糖作為構成成分之多醣類或葡萄糖的原料。

[15]如[13]或[14]記載之方法，其中，該2-脫氧蟹肌醇合成酶係[1]至[5]中任一項記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶。

若使用本發明之DOI合成酶，則在製造DOI時，可在高溫條件下使用酵素。並且，隨著製造條件之不同，而在製造時不需要嚴密之溫度管理等。此外，可在DOI為安定之pH區域之酸性條件下製造DOI。再者，隨著製造條件之不同，而在製造時不需要嚴密之pH管理等。

以下具體說明本發明。

[DOI合成酶]

用以實施本發明之型態(以下稱為本實施型態)之DOI合成酶具有下述特性：

(1)作用：本酵素具有將葡萄糖-6-磷酸轉換成DOI之功能；

(2)安定性：顯示高溫安定性及/或廣範圍pH安定性。

本發明之DOI合成酶係以具有下述(1)、(2)、(4)、(6)及(7)之特性，且具有下述(3)及/或(5)之特性者為較佳：

(2)最適pH範圍：7.0至7.7；

(3)安定pH範圍：6.0至8.0；

(4)最適溫度範圍：55至70℃；

(5)安定溫度範圍：20至46℃(較佳為20至60℃)；

(6)輔酶：利用NAD⁺ ；

(7)分子量：39000至42000。

本發明之DOI合成酶係以在上述之特性以外，再具有下述(8)及/或(9)之特性者為更佳：

(8)比活性：1.0μmol/分鐘/mg以上(反應溫度65℃)；

(9)輔因子：藉由添加Co²⁺ 離子而提升活性。

將本發明之DOI合成酶的胺基酸序列之具體例表示於序列編號2、4、6、8、10及12。具有序列編號2、4、6、8、10或12記載之胺基酸序列的DOI合成酶係以具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之特性者為佳。具有序列編號2、4、6、8、10或12記載之胺基酸序列的DOI合成酶，係以在本實施型態中具有優異之高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之特性者為較佳。

在本發明中，亦可為與選自序列編號2、4、6、8、10或12記載之胺基酸序列所成群組之至少1個胺基酸序列，具有較佳為80%以上、更佳為85%以上、再更佳為90%以上、特佳為95%以上、最佳為99%以上之相同性的蛋白質。

此外，在本發明中，在選自序列編號2、4、6、8、10或12記載之胺基酸序列所成群組之至少1個胺基酸序列中，亦可於1個或數個胺基酸包含缺失、置換及/或加成。缺失、置換及/或加成之胺基酸數目較佳為1至50個，更佳為1至30個，再更佳為1至20個，特佳為1至10個，再特佳為1至5個，最佳為1至3個。

本發明中包含如下述的酵素：具備與選自序列編號2、4、6、8、10、12記載之胺基酸序列所成群組之至少1個胺基酸序列具有80%以上之相同性的胺基酸序列，且具有優異之高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之特性，並且具有DOI合成酶活性的酵素。

本發明中包含如下述的酵素：具備相對於選自序列編號2、4、6、8、10、12記載之胺基酸序列所成群組之至少1個胺基酸序列而於1個或數個胺基酸包含缺失、置換及/或加成的胺基酸序列，且具有優異之高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之特性，並且具有DOI合成酶活性的酵素。

使DOI合成酶中之胺基酸發生缺失、置換、加成等變異的方法，可利用PCR法、易出錯PCR(error-prone PCR)法、DNA隨機改組(DNA shuffling)法、或製作嵌合酶(chimeric enzyme)之手法等公知方法。

DOI合成酶中之胺基酸序列之相同性，可使用例如UWGCG Package所供給之BESTFIT程式(Devereux et al(1984) Nucleic Acids Research 12,p387-395)、或是PILEUP或BLAST演算法(Altschul S. F.(1993) J Mol Evol 36：290-300;Altschul S. F.(1990) J Mol Biol 215：403-10)等序列分析用工具而算出。

此外，若將依上述手法所得之DOI合成酶在熱處理後進行活性測定，即可辨別出保持高溫安定性之酵素。

[DOI合成酶基因]

本實施型態之DOI合成酶基因可為從多源基因組(metagenome)或微生物所單離、萃取之天然物，亦可為依據其鹼基序列並藉由PCR法、人工合成法等公知方法而合成者。此外，若欲製作新穎之DOI酶嵌合基因，可將已知之DOI合成酶基因予以組合，並可列舉如源自Paenibacillus sp .(類芽孢桿菌) NBRC13157株、Streptoalloteichus hindustanus JCM3268株、Streptomyces fradiae (弗氏鏈黴菌) NBRC12773株等之DOI合成酶基因。

本發明之DOI合成酶基因之鹼基序列的具體例係表示於序列編號1、3、5、7、9或11。

由包含具有選自序列編號1、3、5、7、9或11記載之鹼基序列所成群組之至少1個基因序列的DOI合成酶基因之重組載體以及宿主而獲得轉形體，並培養所得之轉形體而可獲得DOI合成酶。

由具有序列編號1、3、5、7、9或11記載之鹼基序列的DOI合成酶基因所獲得的DOI合成酶，係以具有高溫安定性及/或廣範圍pH安全性之特性為佳。

在本發明中，亦可為一種DOI合成酶基因，其具備與具有序列編號1、3、5、7、9或11記載之鹼基序列的DOI合成酶基因，較佳為有80%以上、更佳為85%以上、再更佳為90%以上、特佳為95%以上、最佳為99%以上之相同性的鹼基序列。本發明中包含編碼下述酵素的DOI合成酶基因：具備與選自序列編號1、3、5、7、9或11記載之鹼基序列所成群組之至少1個鹼基序列具有80%以上之相同性的鹼基序列，且具有優異之高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之特性，並且具有DOI合成酶活性。

在本發明中，亦可為一種DOI合成酶基因，其具有相對於序列編號1、3、5、7、9或11記載之鹼基序列而包含1個或數個鹼基之缺失、加成、及/或置換的鹼基序列。本發明中包含具有編碼下述DOI合成酶之鹼基序列的DOI合成酶基因：相對於選自序列編號1、3、5、7、9或11記載之鹼基序列而包含1個或數個鹼基之缺失、加成、及/或置換，且具備編碼具有優異之高溫安定性及/或廣範圍pH安定性。缺失、加成及/或置換之鹼基之數目較佳為1至50個，更佳為1至30個，再更佳為1至20個，特佳為1至10個，再特佳為1至5個，最佳為1至3個。

在本實施型態中，可使用具有編碼下述(a)、(b)或(c)任一胺基酸序列之鹼基序列的DOI合成酶基因：

(a)序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列；

[重組載體及轉形體]

本實施型態之重組載體係可藉由將本實施型態之基因連結(插入)於質體(plasmid)等公知載體而獲得。前述載體只要是可在宿主中複製者即可，並無特別限定，可列舉如質體DNA、噬菌體DNA(phage DNA)等。

前述質體DNA可列舉如源自大腸菌之質體(例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC119、pTrcHis、pBlueBacHis等)、源自枯草菌之質體(例如pUB110、pTP5等)、源自酵母之質體(例如YEp13、YEp24、YCp50、pYE52等)等，噬菌體DNA可列舉如λ噬菌體等。

要將本實施型態之基因插入前述載體時，係採用首先以適當之限制酶(restriction enzyme)切斷經精製之DNA，再將其插入載體DNA之適當之限制酶部位或多重選殖部位(multiple-cloning site)而連結至載體的方法。

為了於宿主表現外來基因，必須在結構基因之前，配置適當之啟動子(promoter)。前述啟動子並無特別限定，可使用在宿主內發揮功能之任意者。又，關於啟動子，係在後述之轉形體中與宿主一起詳述。此外，若有需要，亦可配置增強子(enhancer)等順式元件(cis-element)、剪接信號(splicing signal)、聚腺核苷酸(Poly A)加成信號、核糖體結合序列(SD序列)、終結子(terminator)序列等。

本實施型態之轉形體係可藉由以表現目的基因之方式將本實施型態之重組載體導入宿主中而獲得。此處，宿主只要是可表現本實施型態之DNA者即可，並無特別限定，可列舉如屬於大腸桿菌(Escherichia coli )等埃希氏菌(Escherichia )屬、枯草桿菌(Bacillus subtilis )等桿菌(Bacillus )屬、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida )等假單胞菌(Pseudomonas )屬、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti )等根瘤菌(Rhizobium )屬之細菌、或是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )等酵母、其他COS細胞、CHO細胞等動物細胞、或是Sf19、Sf21等昆蟲細胞。

此外，本實施型態之轉形體所利用之宿主，係以具有由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等單醣類合成葡萄糖-6-磷酸之功能者為佳。此外，視需要而亦以具有將由2個以上之單醣連結成之多醣類予以分解的功能者為佳。

當以大腸菌等細菌作為宿主時，從使DOI合成酶有效率地表現之觀點來看，本實施型態之重組載體係以可在各細菌中自主複製(autonomously replicating)且同時由啟動子、核糖體結合序列、本實施型態之基因、轉錄終結序列所構成者為佳。此外，亦可包含調控啟動子之基因。大腸菌可列舉如大腸桿菌K12、DH1、DH10B(Invitrogen公司)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Stratagene公司)、TOP10F等，枯草菌可列舉如枯草桿菌MI114、207-21等。

就啟動子而言，只要是在大腸菌等宿主中會發揮功能者即可，並無特別限定，例如可使用gapA啟動子、gadA啟動子、trp啟動子、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子等源自大腸菌之啟動子，或是T7啟動子等源自噬菌體之啟動子。

就將重組載體導入細菌中之方法而言，只要是可將DNA導入細菌中之方法即可，並無特別限定，可列舉如使用鈣離子之方法(Cohen,SN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69：2110(1972))、電穿孔法(electroporation)等。

當以酵母作為宿主時，係使用釀酒酵母、嗜甲基酵母(Pichia pastoris )等。此時，啟動子係列舉如可在酵母中表現者，例如gal1啟動子、gal10啟動子、熱休克蛋白質(heat shock protein)啟動子、MFα1啟動子、PH05啟動子、AOX啟動子等。

就將重組載體導入酵母中之方法而言，可列舉如電穿孔法(Becker,D.M. et al.：Method. Enzymol.,194：180(1990))、原生質球狀體(spheroplast)法(Hinnen,A. et al.：Proc Natl. Acad. Sci. USA,75：1929(1978))、乙酸鋰法(Itoh,H.：J. Bacteriol.,153：163(1983))等。

[DOI合成酶之生產]

本實施型態之酵素係可藉由在適當培養基中培養本實施型態之轉形體，並從其培養物採取具有該酵素活性之蛋白質而獲得。培養本實施型態之轉形體的方法係可依據宿主而決定。例如，就以大腸菌或酵母等微生物作為宿主之轉形體而言，只要是含有微生物可資化(作為營養源利用)之碳源、氮源、無機鹽類等且可有效率地培養轉形體的培養基即可，可使用天然培養基、合成培養基之任一者。

於培養時，亦可視需要而將安比西林(ampicillin)或四環素(tetracycline)等抗生物質添加至培養基中。當以使用具誘導性者作為啟動子之表現載體來培養經轉形之微生物時，亦可視需要而在培養基中添加誘導劑(inducer)。例如，當以使用lac啟動子之表現載體來培養經轉形之微生物時，可在培養基中添加異丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-β-thiogalactopyranoside，亦即IPTG)等，當以使用trp啟動子之表現載體來培養經轉形之微生物時，可在培養基中添加吲哚丙烯酸(IAA)等。

在培養後，當本實施型態之酵素蛋白質係生產於菌體內或細胞內時，係將細胞予以破碎。另一方面，當本實施型態之蛋白質係分泌於菌體外或細胞外時，係直接使用培養液、或藉由離心分離而回收。

就蛋白質之單離、精製而言，可單獨使用或適當組合使用例如硫酸銨沉澱法、凝膠過濾、離子交換層析法、親和層析法等。

又，活性係表示將葡萄糖-6-磷酸轉換成DOI。活性值之測定方法係如下所示。

本實施型態之DOI合成酶活性，係可藉由在含有可成為基質之適當之葡萄糖-6-磷酸之反應液中添加該酵素並檢測所生成之DOI的方法而確認。生成之DOI之確認係可使用非專利文獻(Journal of Biotechnology 129,502-509(2007))記載之方法等。

測定DOI合成酶活性之方法可列舉如：在含有1000mM之葡萄糖-6-磷酸溶液20μL、100mM之NAD⁺ 溶液50μL、100mM之氯化鈷六水合物溶液50μL的pH7.0之150mM之Bis-Tris緩衝液900μL中，混合適當濃度之DOI合成酶液100μL，使其反應5至60分鐘左右後，令酵素失活，而定量DOI的方法等。

若欲確認所精製之DOI合成酶之精製度或測定分子量，則可藉由電泳或凝膠過濾層析等而進行。此外，酵素之最適溫度範圍或最適pH範圍係可藉由使反應溫度或反應pH變化並測定酵素活性而測得。並且，藉由將DOI合成酶於種種的pH條件下或溫度條件下一定時間後再測定酵素活性，則可調查安定pH範圍及安定溫度範圍。例如，在各pH條件之DOI合成酶的評估時，可使用Bis-Tris緩衝液(pH5.5至8.0)及Tris緩衝液(pH7.4至8.0)。

最適pH範圍係指當改變pH以進行測定時，若以顯示最高活性之活性值作為100，則活性值為70以上之pH範圍。

安定pH範圍係指當改變pH以進行測定時，若以顯示最高活性之活性值作為100，則活性值為70以上之pH範圍。

最適溫度範圍係指當改變溫度以進行測定時，若以顯示最高活性之活性值作為100，則活性值為50以上之溫度範圍。

安定溫度範圍係指當改變溫度以進行測定時，若以顯示最高活性之活性值作為100，則活性值為50以上之溫度範圍。

本實施型態之DOI合成酶之高溫安定性，係指安定溫度範圍之上限為46℃、較佳為50℃、更佳為60℃、再更佳為70℃、特佳為80℃、再特佳為90℃、最佳為95℃。下限雖無特別限定，但就通常之操作而言，安定溫度範圍之下限例如可為10℃、較佳為5℃、更佳為1℃。

本實施型態之具有高溫安定性之2-脫氧蟹肌醇合成酶，可選用於50℃培養1小時後之殘存酵素活性為50以上的酵素。殘存酵素活性係指以顯示最高活性之活性值作為100的相對活性。

在DOI之製造條件中，不需嚴格地管理溫度。在通常之工業生產之現場，溫度控制是非常重要之因子。必須控制在酵素具有高活性之溫度範圍內。

在合成DOI時，從以往之菌活性之觀點來看，必須進行將溫度控制在37℃以下之嚴格之溫度管理。但若使用本發明之具有高溫安定性之DOI合成酶，則因即使在高溫範圍下亦可保有高活性，故不需進行嚴格之溫度管理，即可製造DOI。

本實施型態之具有廣範圍之pH安定性的DOI合成酶，較佳為具有安定pH範圍為pH4.0至9.0之特性，更佳為pH6.0至8.0，更佳為pH6.0至7.7，更佳為pH6.0至7.4，最佳為pH6.0至7.0之特性。

在合成DOI時，從以往之菌之高活性之觀點來看，必須進行將pH控制在pH6.0至7.0之嚴格之pH管理。但若使用本發明之具有廣範圍之pH安定性之DOI合成酶，則因即使在廣範圍之pH範圍內亦可保有高活性，故不需進行嚴格之pH管理，即可製造DOI。

若依據本實施型態，則在使用前述酵素時，只要不阻礙本實施型態之酵素之作用，精製程度等即無特別限定，除了經精製之本實施型態之酵素以外，亦可使用含有該酵素之物。

本實施型態之DOI係可藉由從培養本實施型態之轉形體所得之培養物採取DOI的醱酵生產法而獲得。

前述培養之營養源可使用含有碳源、氮源、無機鹽類、其他有機營養源之培養基。培養溫度只要是該菌可生長之溫度即可。培養時間並無特別限制，可為1天至7天左右。然後，只要從所得之培養菌體或培養上清液回收DOI即可。

就培養所用之碳源而言，只要是轉形體可資化者即可，亦可直接使用以葡萄糖作為構成成分之多醣類，更佳例可列舉如單糖類、或是源自含有澱粉或米糠或廢糖蜜(molasses)等多醣類之原料的單糖類，具體而言可列舉如D-葡萄糖等。此外，啟動子之表現為誘導型時，只要適時添加誘導物質即可。

碳源可使用D-葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖(trehalose)等糖類或油脂類或脂肪酸類、甚至正石蠟(n-paraffin)等。油脂可列舉如菜籽油、椰子油、棕櫚油、棕櫚仁油等。脂肪酸可列舉如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕櫚酸、亞麻油酸、亞麻仁油酸、肉豆蔻酸等飽和或不飽和脂肪酸、或是此等脂肪酸之酯或鹽等脂肪酸衍生物等。

有機營養源可列舉如胺基酸類，例如丙胺酸(alanine)、組胺酸(histidine)、白胺酸(leucine)、離胺酸(lysine)、色胺酸(tryptophan)等。

氮源可列舉如氨、氯化銨、硫酸銨、磷酸銨等銨鹽、以及蛋白腖(peptone)、肉萃取物、酵母萃取物等。無機鹽可列舉如磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉等。

在本發明中，藉由在含有鈷離子之培養基中培養可表現DOI合成酶之微生物，而可從葡萄糖-6-磷酸製造DOI。

在本實施型態之DOI生產法中，鈷離子係以使用二價鈷離子之鹽為佳。具體上可列舉如氯化鈷、硫酸鈷、醋酸鈷等。

若在培養液中添加鈷離子，則相較於不添加鈷離子之培養，DOI生產性上升。當在培養液中添加過多鈷離子時，有時會引起微生物之生長阻礙。因此，培養中之鈷濃度係以足以使該酵素具有活性且不致於阻礙微生物生長的範圍為佳。雖然依宿主而有所不同，但例如在使用大腸菌時，剛開始培養時之鈷濃度較佳係維持在以氯化鈷六水合物換算為0.1至200mg/L、更佳為0.1至100mg/L、再佳為0.1至50mg/L之範圍內。所謂「剛開始培養時」係指開始培養後菌液OD達到5為止之範圍。菌液OD係指培養液之600nm吸收強度。

此外，當適當使用高密度培養時，伴隨著培養液中之菌體濃度之上升，作為微生物菌體中之蛋白質或核酸、脂質、維他命等構成成分之原料且為微生物生長所需之能源的葡萄糖等碳源會不足。在如此之情形下，係連續或間斷地將碳源供給至培養液。在本實施型態中，較佳係再添加鈷離子，並連續或間斷地將表現該酵素活性所需之鈷離子予以適量供給。

在本實施型態之DOI生產法中，較佳係將添加鈷值調控在0.0003至70，以0.001至15為佳，以0.01至5為更佳。添加鈷值之計算係依據以下之式而計算出。

添加鈷值=[培養液中之氯化鈷六水合物添加量(mg)]/培養液量(L)/菌液OD

菌液OD為菌液之600nm吸收強度。

當使用氯化鈷六水合物以外之鈷鹽時，計算出以氯化鈷六水合物換算之添加鈷值，並可依使鈷離子量成為適當值之方式來添加鈷鹽。

在本實施型態中，從培養液回收DOI之方法可列舉如下述之方法。

培養結束後，以離心分離器或過濾裝置等從培養液去除菌體，獲得培養上清液。對此培養上清液再進行過濾處理，去除菌體等固形物，在其濾液中添加離子交換樹脂，以蒸餾水進行洗提(elution)。一邊測定ICP發光分析、pH等，一邊分取不含雜質之組分(fraction)，藉由去除該水溶液之溶媒而可回收DOI。

所得之DOI之分析可藉由例如高效液體層析法(high performance liquid chromatography)或核磁共振法等而進行。

此外，前述醱酵生產法以外之方法可列舉如利用藉由葡萄醣激酶(glucokinase)等而從葡萄糖轉換之葡萄糖-6-磷酸的方法，並可藉由本實施型態之DOI合成酶或轉形體而從葡萄糖-6-磷酸獲得DOI。

在使用本實施型態之DOI合成酶及/或轉形體來製造DOI時之反應溫度，從反應速度或酵素安定性的觀點來看，較佳為10至95℃，更佳為20至70℃，特佳為30至60℃。

反應pH可於廣範圍中調整，從酵素安定性的觀點來看，較佳為pH2.0至10.0，更佳為pH4.0至8.0，特佳為pH6.0至8.0。

反應時間係依酵素之使用量而異，但考慮到工業上之利用，通常較佳為20分鐘至200小時，更佳為6小時至80小時。當利用轉形體作為DOI合成觸媒時，可事先進行凍結處理或各種破碎處理。

但是，本實施型態不受以上之反應條件或反應型態所限制，可予以適當選擇。

以下依據實施例而具體說明，但本發明不因此等實施例而有任何限制。

(實施例) [實施例1] (1)染色體DNA之調製

依據常法而調製Paenibacillus sp .(類芽孢桿菌)NBRC13157株之染色體DNA。

將類芽孢桿菌NBRC13157株以NR洋菜培養基(1%之Bacto Tryptone、0.2%酵母萃取物、1%埃里克鰹魚萃取物、1.5%之Bacto Agar，pH7.0)於30℃培養1天，而形成菌落。將其1鉑圈(platinum loop)接種至在150mL三角燒瓶中分注NR培養基(1%之Bacto Tryptone、0.2%Extract Yeast、1%埃里克鰹魚萃取物、1.5%之BactoAgar，pH7.0)30mL而成者，於30℃以180rpm培養1天。將此培養液於4℃進行12,000g之離心分離1分鐘，去除上清液，回收菌體。

使所得之菌體懸浮於裂解緩衝液(Lysis buffer)(50mM之Tris-HCl(pH8.0)、20mM之EDTA、50mM之葡萄糖)中，並予以仔細洗淨。經離心分離而回收菌體後，再度以裂解緩衝液進行懸浮，於其中添加溶菌酶(lysozyme)並於37℃培養45分鐘。其次，添加SDS與RNase，於37℃培養45分鐘。之後，添加蛋白酶K(proteinase K)，於50℃和緩地振盪60分鐘。在此，將所得之溶液以酚(phenol)-氯仿、氯仿進行處理後，予以乙醇沉澱，哨析出之核酸捲取於玻璃吸管(Glass Pipette)而回收。將此核酸以70%乙醇洗淨後，予以乾燥，再溶解於TE。藉由此操作而調製約100μg之染色體DNA。

(2)DOI合成酶基因之單離

從上述(1)所調製之染色體DNA中，就用以使DOI合成酶基因增幅之PCR引子(primer)而言，分別合成訊息股引子(Sense primer)為具有序列編號15之序列的寡聚DNA、非訊息股引子(anti-sense primer)為具有序列編號16之序列的寡聚DNA。

在此，使用所得之PCR引子，將上述(1)所調製之染色體DNA作為模板，以PCR法進行DOI合成酶基因之增幅，取得由1107鹼基對所構成之PCR產物。

在此，將所得之PCR產物之基因序列以DNA定序儀進行解析而確認，獲得具有序列編號13之鹼基序列的已知DOI合成酶(BtrC)基因。將對應於本基因之胺基酸序列示為序列編號14(BtrC)。

(3)DOI合成酶基因之表現質體載體之建構及轉形

進行上述(2)所取得之PCR產物之平滑末端化、磷酸化，對於在pUC19連結有源自大腸菌之gapA啟動子、SD序列、終結子的質體進行接合(ligation)。對於此質體載體，導入可使在大腸菌中作為外來基因而連結之基因有效率地運轉的gapA啟動子，而在含有葡萄糖之培養基中培養重組微生物時，亦可有效率地表現、製造DOI合成酶基因。

在此，將所得之質體載體，對於依氯化鈣法調製之大腸菌JM109株之勝任細胞(competent cell)以熱休克法進行轉形，而製作重組微生物。

(4)新穎之DOI合成酶基因之取得

依常法對上述(3)所取得之質體載體進行突變導入，而可獲得具有序列編號1(DOIS-1)、序列編號3(DOIS-2)、序列編號5(DOIS-3)、序列編號7(DOIS-4)、序列編號9(DOIS-5)及序列編號11(DOIS-6)記載之鹼基序列的耐熱性DOI合成酶基因。在此，對於所取得之DOI合成酶基因亦與(3)同樣地進行取得轉形體。此外，將對應於序列編號1、序列編號3、序列編號5、序列編號7、序列編號9及序列編號11之鹼基序列的胺基酸序列，表示為序列編號2(DOIS-1)、序列編號4(DOIS-2)、序列編號6(DOIS-3)、序列編號8(DOIS-4)、序列編號10(DOIS-5)及序列編號12(DOIS-6)。

新穎之DOI合成酶之選拔，可藉由將依常法製作之各式各樣之DOI合成酶進行熱處理或各種pH處理後再測定活性而實施。

[實施例2] [精製酵素之取得]

將實施例1製作之DOI合成酶(DOIS-1)之轉形體在含有100mg/L之安比西林的LB培養盤中於37℃培養1天，形成菌落。

其次，將含有100mg/L之安比西林的LB培養基30mL置入容量150mL之三角燒瓶中，從上述培養基將菌落以鉑圈進行植菌，於37℃以180rpm進行旋轉振盪培養3至8小時直到OD(600nm)成為0.5左右，將此作為本培養之前培養液。

在36個容量500mL之三角燒瓶中，各加入含有2g/L之葡萄糖與100mg/L之安比西林的LB培養基100mL，並分別在各個三角燒瓶中添加0.5mL之前培養液，於37℃以180rpm進行旋轉振盪培養16小時。

然後，將此培養液於4℃進行10,000g×30分鐘之離心分離而去除上清液，以含有0.2mg/L氯化鈷六水合物之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)洗淨數次，同時回收菌體。回收之菌體係於-80℃凍結保存。

使此凍結保存菌體懸浮於含有0.2mg/L氯化鈷六水合物之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)中，添加溶菌酶(Sigma公司製，源自蛋白)180mg與脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I)(WaKo公司製，源自牛，重組體溶液)60μL，於37℃以120rpm振盪5小時，進行菌體破碎。

將菌體破碎後之溶液於4℃進行10,000g×30分鐘之離心分離而去除菌體殘渣，回收上清液。

在此上清液中添加硫酸銨並使其成為30%飽和，於4℃稍微攪拌後，將所產生之沉澱物於4℃進行10,000g×30分鐘之離心分離而予以去除，並回收上清液。

在此上清液中添加硫酸銨並使其成為40%飽和，於4℃稍微攪拌後，將所產生之沉澱物於4℃進行10,000g×30分鐘之離心分離而去除上清液，並回收沉澱物。其次，將此沉澱物溶解於含有0.2mg/L氯化鈷六水合物之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)。

將此溶解液於4℃使用平均截留分子量(molecular weight cut-off)10,000之超濾膜進行濃縮，添加含有0.2mg/L氯化鈷六水合物之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)，再度予以濃縮，重覆進行2至3次如上述之脫鹽操作。

使上述所得之酵素溶液吸附於經以50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)平衡化的「DEAE Sepharose FF」(GE Healthcare Bioscience股份公司)後，以含有0至0.4M之氯化鈉的50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)的濃度梯度法而洗提酵素。

收集上述經洗提之酵素之DOI合成酶之活性組分，使用平均截留分子量10,000之超濾膜進行濃縮，以含有10重量%硫酸銨之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)懸浮，並使其吸附於經含有10重量%硫酸銨之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)平衡化的「HiTrap Phenyl FF(high sub)」(GE Healthcare Bioscience股份公司)後，以含有10至0重量%硫酸銨之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)的濃度梯度法而洗提酵素。

收集上述經洗提之活性組分，使用平均截留分子量10,000之超濾膜進行濃縮，並使其吸附於經以50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)平衡化的「MonoQ 5/50 GL」(GE Healthcare Bioscience股份公司)後，以含有0至0.2M之氯化鈉的50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)的濃度梯度法而洗提酵素。

收集上述經洗提之活性組分，使用平均截留分子量10,000之超濾膜進行濃縮，將其填充於經含有0.2mg/L氯化鈷六水合物與0.1M NaCl之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)平衡化的「HiLoad 16/60 Superdex 200」(GE Healthcare Bioscience股份公司)後，以同樣之緩衝液進行洗提。

收集上述經洗提之活性組分，使用平均截留分子量10,000之超濾膜進行濃縮，獲得精製DOI合成酶(DOIS-1)。

進行與上述流程之精製酵素取得實驗同樣的操作，而取得精製DOI合成酶(DOIS-2)、精製DOI合成酶(DOIS-3)、精製DOI合成酶(DOIS-4)、精製DOI合成酶(DOIS-5)、精製DOI合成酶(DOIS-6)及精製之已知DOI合成酶(BtrC)。

[實施例3] [新穎之DOI合成酶之評估]

使用實施例2所得之精製DOI合成酶，進行關於其作用之實驗。

(1)最適pH範圍

在各pH之活性測定中，於反應液中添加適量之精製DOI合成酶(DOIS-1)，以使葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)成為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)成為5mM、氯化鈷六水合物成為5mM、各種緩衝液成為100mM之方式調整反應液。緩衝液係使用Bis-Tris緩衝液(pH6.0至7.7)及Tris緩衝液(pH7.4至8.0)。反應溫度設為30℃，藉由將生成之DOI定量而測定活性。求出以顯示最高活性之活性值作為100的相對活性，將此結果示於第1圖。本發明酵素之最適pH範圍為pH7.0至7.7。

(2)安定pH範圍

使用pH5.5至8.0之範圍的100mM之緩衝液，將精製DOI合成酶(DOIS-1)以各pH於30℃培養60分鐘，測定其殘存酵素活性。培養所使用之緩衝液係使用Bis-Tris緩衝液(pH5.5至8.0)及Tris緩衝液(pH7.4至8.0)。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。求出以顯示最高活性之活性值作為100的相對活性，將此結果示於第2圖。本發明酵素之安定pH範圍為pH6.0至8.0。精製DOI合成酶(DOIS-2)及精製DOI合成酶(DOIS-3)亦顯示同樣之結果。此等廣範圍pH之安定性為現存之酵素未具有的新穎特性。

(3)最適溫度範圍

在反應溫度10至70℃之各反應溫度條件下，於葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，實施精製DOI合成酶(DOIS-1)之酵素活性測定。求出以顯示最高活性之活性值作為100的相對活性，將此結果示於第3圖。最適溫度範圍為55至70℃，在反應溫度65℃之比活性為1.8μmol(DOI)/分鐘/mg(酵素)而顯示非常高之值。

(4)安定溫度範圍

將經添加精製DOI合成酶(DOIS-1)且NAD⁺ (Oriental酵母公司製)調整為5mM、氯化鈷六水合物調整為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)，在溫度範圍25至60℃之各溫度進行1小時之培養，測定各自之殘存酵素活性。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。求出以顯示最高活性之活性值作為100的相對活性，將此結果示於第4圖。精製DOI合成酶(DOIS-1)之安定溫度範圍為50℃以下，精製DOI合成酶(DOIS-2)及精製DOI合成酶(DOIS-3)亦顯示同樣之結果。此等高溫安定性為現存之酵素未具有的新穎特性。

此外，在已知會發揮作為安定化劑作用之NAD⁺ 及鈷離子不存在下培養而實施安定溫度範圍試驗時，精製DOI合成酶(DOIS-1)在培養溫度46℃之相對活性為38，在培養溫度42℃之相對活性為89，在培養溫度37℃之相對活性為100。

(5)分子量

藉由使用分離凝膠濃度為10%之「Ladygel J」(日本Bio-Rad Laboratories股份公司)的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳而求得分子量，精製DOI合成酶(DOIS-1)之分子量為約40,000，與從胺基酸序列推定之分子量40,656為幾乎一致。

[實施例4] [新穎之DOI合成酶之評估]

使用實施例2所得之精製DOI合成酶(DOIS-4)，進行關於其作用之實驗。

(溫度安定性之評估)

將經添加精製DOI合成酶(DOIS-1)且氯化鈷六水合物調整為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)在溫度範圍25℃及45℃之各溫度下進行1小時之培養，測定各自之殘存酵素活性。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。若以在25℃培養之殘存活性作為100，則在42℃培養之活性值為74而顯示非常高之值。

(比活性之測定)

此外，反應溫度60℃之比活性為1.2μmol(DOI)/分鐘/mg(酵素)而顯示非常高之值。

[實施例5] [新穎之DOI合成酶之評估]

使用實施例2所得之精製DOI合成酶(DOIS-5)，進行關於其作用之實驗。

(pH安定性之評估)

使用pH5.5至8.0之範圍的100mM之緩衝液，將精製DOI合成酶(DOIS-5)以各pH於30℃培養60分鐘，測定其殘存酵素活性。培養所使用之緩衝液係使用Bis-Tris緩衝液(pH5.5至8.0)及Tris緩衝液(pH7.4至8.0)。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。求出最大活性為100的相對活性，將此結果示於第5圖。如第5圖所示，本酵素在非常廣範圍之pH區域顯示高安定性。此高安定性為現存之酵素未具有的新穎特性。

[實施例6] [新穎之DOI合成酶之評估]

使用實施例2所得之精製DOI合成酶(DOIS-6)，進行關於其作用之實驗。

(pH安定性之評估)

使用pH5.5至8.0之範圍的100mM之緩衝液，將精製DOI合成酶(DOIS-6)以各pH於30℃培養60分鐘，測定其殘存酵素活性。培養所使用之緩衝液係使用Bis-Tris緩衝液(pH5.5至8.0)。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。若以顯示最大活性之pH8.0之殘存活性作為100，則在pH6.5至8.0之範圍的活性值為70以上，pH6.0之殘存活性為53而顯示非常高之值。此高之pH安定性為現存之酵素未具有的新穎特性。

[實施例7] [DOI之生產方法]

合成DOI時，係使用令上述凍結菌體懸浮於含有0.2mg/L氯化鈷六水合物之50mM之Tris-HCl緩衝液(pH7.7)而成之液作為DOI合成觸媒。DOI合成反應之反應液組成係葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為85mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為0.1mM、氯化鈷六水合物為1mM、菌體OD為30，而開始DOI之合成反應。反應開始時之pH係調整為7.7，於反應溫度46℃進行合成反應2.5小時，生成1重量%之DOI。反應結束後，添加鹽酸，使pH降低至6以下。然後，將此反應溶液於4℃進行10,000g×30分鐘之離心分離而回收上清液，並以過濾器過濾而去除菌體殘渣。

上述合成之DOI溶液，係使用將amberlite IR120Bna(Organo公司製)再生成H⁺ 型之陽離子交換樹脂及將amberlite IRA96SB(Organo公司製)再生成OH^- 型之陰離子交換樹脂而進行精製處理。在本精製處理中係併用管柱處理及批次處理，並依據ICP發光分析法而回收未檢測出P、Co、Na且含有DOI溶液之組分。

其次，在上述所得之DOI溶液中，相對於溶液中1g之DOI而添加0.5g之活性碳Carboraffin(日本EnviroChemicals公司製)，於室溫攪拌1小時而使活性碳吸附微量雜質。1小時後，藉由過濾操作而去除活性碳，回收DOI溶液。藉由將本DOI溶液減壓濃縮而濃縮DOI，並以凍結乾燥而獲得DOI之粉末。

[實施例8]

分別將表1所示之含有不同濃度之氯化鈷六水合物的培養基A以100mL置入容量500mL之三角燒瓶中，再添加0.5mL之前培養液，於37℃以180rpm進行旋轉振盪培養18小時。將培養18小時後之各培養基條件之菌液OD、添加鈷值、以及未添加鈷離子之培養基之上清液DOI濃度為100時之相對值(DOI生產性)示於表2。

(*)以蒸餾水溶解，調整成pH7.0。

比較例1 [已知DOI合成酶之評估]

關於具有序列編號14記載之胺基酸序列的精製之已知DOI合成酶(BtrC)，進行與實施例3-(4)安定溫度範圍同樣之操作，施行以下之實驗。

將經添加精製之已知DOI合成酶(BtrC)且NAD⁺ (Oriental酵母公司製)調整為5mM、氯化鈷六水合物調整為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)，在溫度範圍25至60℃之各溫度進行1小時之培養，測定各自之殘存酵素活性。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝淺(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。求出最大活性為100的相對活性，將此結果示於第6圖。精製之已知DOI合成酶(BtrC)之安定溫度範圍為42℃以下，46℃之相對活性為23，50℃之相對活性為0而顯示低之熱安定性。

此外，在已知會發揮作為安定化劑作用之NAD⁺ 及鈷離子不存在下培養而實施安定溫度範圍試驗時，精製之已知DOI合成酶(BtrC)在培養溫度42℃及46℃之相對活性為0，在培養溫度37℃之相對活性為14。由本實驗亦顯示現存之酵素係具有明顯低之熱安定性。

關於具有序列編號14記載之胺基酸序列的精製之已知DOI合成酶(BtrC)，進行與實施例3-(2)安定pH範圍同樣之操作，施行以下之實驗。

將精製之已知DOI合成酶(BtrC)以各pH於30℃培養60分鐘，測定其殘存酵素活性。培養所使用之緩衝液係使用Bis-Tris緩衝液(pH5.5至7.0)及Tris緩衝液(pH7.4至8.0)。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。求出最大活性為100的相對活性，將此結果示於第7圖。如第7圖所示，pH6之相對活性為27而為非常低之值，pH5.5幾乎完全失去活性。

[比較例2] [已知DOI合成酶之評估]

關於具有序列編號14記載之胺基酸序列的精製之已知DOI合成酶(BtrC)，進行與實施例3同樣之操作，施行以下之實驗。

將經添加精製之已知DOI合成酶(BtrC)且氯化鈷六水合物調整為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)，在溫度範圍25℃及42℃之各溫度進行1小時之培養，測定各自之殘存酵素活性。

殘存酵素活性之測定，係在葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(Oriental酵母公司製)為20mM、NAD⁺ (Oriental酵母公司製)為5mM、氯化鈷六水合物為5mM的100mM之Bis-Tris緩衝液(pH7.0)中，以反應溫度30℃實施。若以25℃培養時之殘存活性作為100，則在46℃培養之活性值為0，而顯示明顯低之熱安定性。

(產業上之可利用性)

依據本發明，可藉由有效率之製造方法而生產作為產業上有用之芳香族化合物(兒茶酚等)之前驅物而利用價值高的DOI。

第1圖表示精製DOI合成酶(DOIS-1)之最適pH範圍(實施例3)。

第2圖表示精製DOI合成酶(DOIS-1)之安定pH範圍(實施例3)。

第3圖表示精製DOI合成酶(DOIS-1)之最適溫度範圍(實施例3)。

第4圖表示精製DOI合成酶(DOIS-1)之安定溫度範圍(實施例3)。

第5圖表示精製DOI合成酶(DOIS-5)之安定pH範圍(實施例5)。

第6圖表示精製之已知DOI合成酶(BtrC)的安定溫度範圍(比較例1)。

第7圖表示精製之已知DOI合成酶(BtrC)的安定pH範圍(比較例1)。

本案圖式皆為實驗數據，故不具代表性

Claims

一種2-脫氧蟹肌醇合成酶，其具有下述任一胺基酸序列：(a)序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列；(b)相對於序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列具有80%以上之相同性，且具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性的胺基酸序列；或(c)相對於序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列且包含1至50個胺基酸之缺失、加成、及/或置換，且具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性的胺基酸序列；其具有下述(1)、(2)、(4)、(6)及(7)之特性，且具有下述(3)及/或(5)之特性：(1)作用：本酵素具有將葡萄糖-6-磷酸轉換成2-脫氧蟹肌醇之功能；(2)最適pH範圍：7.0至7.7；(3)安定pH範圍：6.0至8.0；(4)最適溫度範圍：55至70℃；(5)安定溫度範圍：20至50℃；(6)輔酶：利用NAD⁺ ；(7)分子量：39000至42000。
如申請專利範圍第1項之2-脫氧蟹肌醇合成酶，其具有下述(8)之特性： (8)比活性：1.0μmol/分鐘/mg以上(反應溫度65℃)。
如申請專利範圍第1項或第2項之2-脫氧蟹肌醇合成酶，其具有下述(9)之特性：(9)輔因子：藉由添加Co²⁺ 離子而提升活性。
一種申請專利範圍第1項之2-脫氧蟹肌醇合成酶的基因，其具有編碼下述任一胺基酸序列之鹼基序列：(a)序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列；(b)相對於序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列具有80%以上之相同性，且具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性的胺基酸序列；或(c)相對於序列編號2、4、6、8、10或12中任一者記載之胺基酸序列且包含1至50個胺基酸之缺失、加成、及/或置換，且具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性的胺基酸序列。
一種申請專利範圍第1項之2-脫氧蟹肌醇合成酶的基因，其具有下述任一鹼基序列：(a)序列編號1、3、5、7、9或11中任一者記載之鹼基序列；(b)相對於序列編號1、3、5、7、9或11中任一者記載之鹼基序列係具有80%以上之相同性，且編碼具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之2-脫氧蟹肌醇合成酶的鹼基序列；或(c)相對於序列編號1、3、5、7、9或11中任一者記載之鹼基序列且包含1至50個鹼基之缺失、加成、及/或置換，且編碼具有高溫安定性及/或廣範圍pH安定性之2-脫氧蟹肌醇合成酶的鹼基序列。
一種重組載體，其包含申請專利範圍第4項或第5項之2-脫氧蟹肌醇合成酶的基因。
一種轉形細胞，其係藉由將申請專利範圍第4項或第5項之2-脫氧蟹肌醇合成酶的基因或是申請專利範圍第6項之重組載體導入宿主細胞中而獲得。
一種2-脫氧蟹肌醇合成酶，其係藉由培養申請專利範圍第7項之轉形細胞而獲得。
一種2-脫氧蟹肌醇之製造方法，其特徵係使用申請專利範圍第1項至第3項或第8項中任一項之2-脫氧蟹肌醇合成酶。
一種2-脫氧蟹肌醇之製造方法，其原料為葡萄糖、以葡萄糖作為構成成分之多醣類、及/或葡萄糖-6-磷酸，該製造方法之特徵係：利用申請專利範圍第4項或第5項之2-脫氧蟹肌醇合成酶的基因、或申請專利範圍第7項之轉形細胞。
一種申請專利範圍第1至3項中任一項之2-脫氧蟹肌醇之製造方法，其係由葡萄糖-6-磷酸製造2-脫氧蟹肌醇，該製造方法之特徵係：在含有鈷離子之培養基中培養可表現2-脫氧蟹肌醇合成酶之微生物。
如申請專利範圍第11項之方法，其係使用含有以葡萄糖作為構成成分之多醣類或葡萄糖的原料。
如申請專利範圍第11項或第12項之方法，其中，該2-脫氧蟹肌醇合成酶係申請專利範圍第1項至第3項中任一項記載之2-脫氧蟹肌醇合成酶。