KR100707989B1 - 남세균 시네코시스티스 속의 이소코리스메이트 합성효소 유전자를 이용하여 코리스메이트로부터 이소코리스메이트를 생합성하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 남세균 시네코시스티스 속의 이소코리스메이트 합성효소를 코딩하는 유전자를 이용하여 코리스메이트로부터 이소코리스메이트를 생합성하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 코리스메이트(chorismate)를 이소코리스메이트(isochorismate)로 전환하는 이소코리스메이트 합성효소(isochorismate synthase, SyMenF) 유전자를 남세균 시네코시스티스 속 PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803)으로부터 클로닝하고, 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하며, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 형질전환 균주로부터 이소코리스메이트 합성효소를 발현시켜 코리스메이트로부터 살리실산(salicylic acid), 비타민 K, 엔테로박틴(enterobactin) 생합성의 전구체인 이소코리스메이트를 생합성하는 방법에 관한 것이다.

시네코시스티스 속, 이소코리스메이트 합성효소(SyMenF)

Description

남세균 시네코시스티스 속의 이소코리스메이트 합성효소 유전자를 이용하여 코리스메이트로부터 이소코리스메이트를 생합성하는 방법{Method conversion of chorismate to isochorismate using Isochorismate synthase gene of Synechocystis sp. PCC6803}

도 1은 시네코시스티스 속 PCC6803의 이소코리스메이트 합성효소 유전자 SymenF와 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 대장균과 바실러스균 두 종류 유래의 이소코리스메이트 합성효소인 MenF와 EntC의 아미노산 서열과 비교한 결과이다.

도 2의 (a)는 시네코시스티스 속 PCC6803의 이소코리스메이트 합성효소 SyMenF를 대장균에서 대량 발현하기 위하여 제작한 발현벡터 pQE30-SyMenF의 개열지도이고, (b)는 대장균에서 발현하여 분리 정제한 시네코시스티스 속 PCC6803의 이소코리스메이트 합성효소 SyMenF를 10%의 SDS-PAGE으로 전기영동한 후 쿠마지 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색법으로 분석한 결과이다.

도 3a와 도 3b는 대장균에서 발현시킨 후 및 정제한 SyMenF 효소의 활성을 HPLC로 분석한 것으로서, 도 3a는 효소 첨가 없이 코리스메이트 기질만을 반응시킨 시료를 분석한 결과이며, 도 3b는 정제한 효소와 코리스메이트를 반응시킨 후 분석 한 결과이다.

도 4는 시네코시스티스 속 유래의 이소코리스메이트 합성효소의 생화학적 반응 특성을 조사한 결과로서, A)는 효소의 최적 pH, B)는 최적 온도, C)는 환원제 요구성, 그리고 D)는 금속 보조인자 요구성을 조사한 결과이다.

도 5는 시네코시스티스 속 유래의 이소코리스메이트 합성효소를 코딩하는 SymenF의 유전자가 대장균 세포 내에서 기능을 하는지 조사한 것으로, 1은 야생형 대장균이고, 2는 두 종의 이소코리스메이트 합성 유전자 entC와 menF가 모두 파쇄된 대장균 돌연변이 균주(ΔmenF/entC::Tn5)에 공벡터 pQE30을 형질전환한 대조군 균주이고, 3은 대장균 돌연변이균주에 SyMenF를 발현하는 벡터 pQE30-SymenF가 형질전환된 균주이다. A)는 호기 조건에서 배양한 결과이고, B)는 혐기 조건에서 배양한 결과이다.

본 발명은 남세균 시네코시스티스 속의 이소코리스메이트 합성효소를 코딩하는 유전자를 이용하여 코리스메이트를 이소코리스메이트로 생전환하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 코리스메이트를 이소코리스메이트로 전환하는 이소코리스메이트 합성효소 유전자를 남세균 시네코시스티스 속 PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803)으로부터 클로닝하고, 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하며, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 형질전환 균주로부터 이소코리스메이트 합성효소를 발현시켜 코리스메이트로부터 살리실산, 비타민 K, 엔테로박틴 생합성의 전구체인 이소코리스메이트를 생합성하는 방법에 관한 것이다.

이소코리스메이트(isochorismate)는 인체에서 항출혈성인자 등의 의료용 치료제 및 전자전달체 등 다양한 역할을 하는 비타민 K, 미생물의 철 수송을 담당하는 철분동화체(Siderophore), 그리고 식물체에서 미생물 감염 방어기작 및 화장품 등 다방면의 산업적 응용이 가능한 살리실산(salicylic acid) 생합성 등의 전구체로 사용된다[Daruwala et al., Journal of Bacteriology, 179, 10(1997); Liu, Biochemistry, 13, 29(1990); Jyoti, Current Opinion in Plant Biology, 6(2003); Monice, International Journal of Toxicology, 22(2003)]. 대장균을 비롯한 여러 미생물의 이소코리스메이트 합성효소를 이용한 전환과정의 연구가 다수 이루어졌지만 현재까지 이를 이용한 산업적 활용은 거의 이루어지지 않고 있다[Daruwala et al., Journal of Bacteriology, 179, 10(1997); Catherine et al., Journal of Biological Chemistry, 277, 24(2002); Franke et al., US20030224495A1(2003)]

미생물의 이소코리스메이트는 시키메이트(Shikimate) 경로를 통해 합성된 코리스메이트를 기질로 하는 이소코리스메이트 합성효소(MenF, EntC)에 의해 만들어지고 이후 각기 다른 효소들의 작용으로 비타민 K, 철분동화체, 살리실산 등으로 전환된다. 그러나, 고부가가치의 비타민 K와 살리실산의 생물학적 및 효소학적 생산은 현재까지 이루어지지 않고 있다. 현재 이소코리스메이트 유래의 비타민 K와 살리신산은 모두 화학적인 방법에 의해 생산되어 의료용, 식품 혹은 사료 첨가물로 사용되고 있다[Monice, International Journal of Toxicology, 22(2003)]. 따라서, 다양한 용도의 고부가가치 물질로 전환될 수 있는 이소코리스메이트의 대사공학적 생산방법의 수립이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 다양한 용도의 고부가가치 물질로 전환될 수 있는 이소코리스메이트를 대량 생산하기 위래 연구 노련한 결과, 최근 유전체 정보가 밝혀진 시네코시스티스 속 PCC6803으로부터 이소코리스메이트 합성효소 유전자를 분리 확보하는데 성공하고, 이를 대장균에서 대량 발현하여 그 생화학적 반응 특성을 규명하고 코리스메이트를 이소코리스메이트로 생전환하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 시네코시스티스 속 PCC6803의 이소코리스메이트 합성효소 유전자 SymenF, 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 발현된 이소코리스메이트 합성효소를 사용하여 코리스메이트로부터 이소코리스메이트를 생합성하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 남세균 시네코시스티스 속 PCC6803로부터 분리된 신규 이소코리스메이트 합성효소(SyMenF) 유전자 및 이소코리스메이트 합성효소(SyMenF)에 그 특징이 있다.

또한, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 형질전환시킨 형질전환체를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체로부터 발현된 이소코리스메이트 합성효소를 사용하여 코리스메이트로부터 이소코리스메이트를 생합성하는 방법을 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 코리스메이트를 이소코리스메이트로 전환하는 이소코리스메이트 합성효소(isochorismate synthase, SyMenF) 유전자를 남세균 시네코시스티스 속PCC6803(Synechocystis sp. PCC6803)으로부터 클로닝하고, 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하며, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시킨 형질전환 균주로부터 이소코리스메이트 합성효소를 발현시켜 코리스메이트로부터 살리실산, 비타민 K, 엔테로박틴 생합성의 전구체인 이소코리스메이트를 생합성하는 방법에 관한 것이다.

남세균인 시네코시스티스 속 PCC6803의 게놈 정보를 토대로 이소코리스메이트 합성효소를 코딩할 것으로 추정되는 1,425 bp의 SymenF(slr0817) 유전자를 분리하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction:PCR)으로 확보하고, 발현벡터인 pQE30에 클로닝하여 재조합 발현벡터 pQE30-SyMenF을 제작하였다. 상기 벡터 pQE30-SyMenF을 대장균 M15/pREP4에 형질전환하였으며, 상기 형질전환체 M15/pQE30-SyMenF, pREP4를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2005년 3월 29일자로 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 10788BP를 부여받았다.

한편, 본 발명은, 시네코시스티스 속 PCC6803의 이소코리스메이트 합성효소를 코딩하는 유전자 SymenF를 포함하는 벡터로 형질전환된 상기 형질전환체 M15/pQE30-SyMenF, pREP4로부터 이소코리스메이트 합성효소를 발현시켜 분리 정제하여 코리스메이트를 이소코리스메이트로 전환하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 pQE30-SyMenF 벡터를 두 가지 이소코리스메이트 합성효소 유전자 entC와 menF가 동시에 파쇄된 대장균 균주에 형질전환하여 이소코리스메이트를 필요로 하는 비타민 K 생합성 경로와 엔테로박틴 생합성 경로가 복원됨을 확인함으로써 SymenF가 이소코리스메이트 합성효소를 코딩하는 유전자임을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 이소코리스메이트 합성효소 SyMenF는 분자량이 53 kD 정도이며, pH 7 ~ 9, 20 ~ 60 ℃에서도 효소활성이 우수하였으며, 기존에 알려진 EcMenF에 비해 환원제 요구성이 낮았으며, 특히 마그네슘 존재 하에서 그 활성이 극대화되었음을 확인하였다. 이와 같이, SyMenF는 기존에 보고된 MenF와는 달리 넓은 범위의 반응 조건을 갖고 있으며, 고온에서도 비교적 안정적인 단백질임을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 코리스메이트로부터 이소코리스메이트를 생전환하는 효소(SyMenF)를 대량 생산할 수 있고, 나아가 이소코리스메이트 합성효소 단계를 증폭 하는 대사공학 도구로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 남세균 시네코시스티스 속 PCC6803으로부터 SyMenF 유전자( SymenF ) 분리

시네코시스티스 속 PCC6803의 SymenF 유전자 탐색을 위해 NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/Synechocystis_PCC6803)에서 제공하는 서열을 내려 받아 대장균과 바실러스균의 이소코리스메이트 합성효소 유전자들(menF, entC)과 높은 상동성을 보이는 SymenF(slr0817) 서열을 동정하였다(서열번호 1). 상동성 분석 결과, 철포획체 생합성에 관련된 이소코리스메이트 합성효소와는 35%의 유사성을 보였으나 비타민 K 생합성에 관련된 이소코리스메이트 합성효소와는 45%의 높은 서열 상동성을 갖는다[도 1]. 따라서, 본 발명에 따른 이소코리스메이트 합성효소는 SyMenF라 명명하였다.

실시예 2: 대장균에서 SyMenF 대량 발현하기 위한 벡터 구축 및 정제

상기 실시예 1에서의 상동성 조사 결과로부터 SymenF 유전자를 획득하기 위하여 5'-프라이머(서열번호 2)와 3'-프라이머(서열번호 3)를 사용하여 야생형 시네코시스티스에서 추출한 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 실시하여 1,425 bp 크기의 DNA 절편을 획득하였다. 증폭된 SymenF 서열과 IPTG(Isopropyl -D- thiogalactopyranoside)로 발현을 유도하는 벡터 pQE30[Qiagen 사]를 BamHI과 PstI 제한효소 처리하여 클로닝하여 SyMenF 발현 벡터 pQE30-SyMenF를 구축하였다[도 2의 (a)]. SyMenF를 대량 발현하기 위하여 대장균 발현 균주인 M15/pREP4(Qiagen) 균주에 형질전환하였다.

본 발명에서 획득한 상기 형질전환 균주 M15/pQE30-SyMenF, pREP4을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2005년 3월 29일자로 기탁하였고, 수탁번호 KCTC 10788BP를 부여받았다.

SyMenF를 대량 발현시키기 위하여 발현 균주를 LB(Bacto trypton 1%, NaCl 1%, Yeast extract 0.5%) 액체 배지에 접종하였다. 우선, 과발현 균주를 10 mL의 LB 액체배지에 약 12시간 동안 전배양하여 500 mL의 LB 액체배지에 본 배양(37 ℃, 200 rpm)하였다. 배양액이 OD₆₀₀=0.6에 도달할 때까지 배양한 후 1 mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 SyMenF 과발현을 유도하였다. 발현 후 세포는 원심분리(4000 rpm, 10 min)하여 회수하고 용해 완충용액(50 mM Tris, 10 mM imidazol, 0.5M NaCl, 0.1% triton, 20 mM β-mercaptoethanol, pH 8.0)으로 용해시키고 프렌취 프레져(French Pressure)를 사용하여 완벽히 용해시켰다. 세포 추출액을 원심분리(1200 rpm, 15 min)하여 상등액을 회수하였고, 이를 패스트 프로테인 리퀴드 크로마토그래피(Fast protein liquid chromatography, AKTAprime, Amersham pharmacia biotech)를 이용하여 정제하였다. 정제 후 단백질은 40% 글리세롤 용액에 넣어 -20 ℃에 보관하였다. SDS(Sodium dodecyl sulfate) 폴리아크릴아 마이드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 분석 결과, SyMenF는 예상대로 53 kD 정도의 분자량을 가지고 있었다[도 2의 (b)].

실시예 3 : HPLC를 이용한 SyMenF의 효소활성 측정

정제한 SyMenF의 효소활성을 HPLC를 사용하여 정성적으로 분석을 하였다. 정제한 SyMenF 2 ㎍을 반응액(200 mM Tris-HCl(pH 7.9), 1.12 mM chorismate, 1 mM MgCl₂, 20 mM β-mercaptoethanol) 0.5 ml에 첨가한 후 37 ℃에서 한 시간 동안 반응하였다. 반응은 농축 HCl을 첨가하여 종료시켰고 에틸 아세테이트로 4번 추출하고 스피드 백(Speed Vac)을 이용하여 건조시켰다. 반응산물은 에틸 아세테이트에 녹여 C18 역상 컬럼(reverse-phase column)을 이용하여 HPLC 분석을 하였다. 분석 결과, 코리스메이트가 SyMenF에 의해 이소코리스메이트로 전환됨을 확인하였다[도 3a 및 도 3b].

실시예 4 : SyMenF의 반응 생화학적 특성 조사

SyMenF의 최적 반응조건을 조사하기 위하여 반응 온도, 반응액의 pH, 금속이온 요구성, 그리고 환원제의 영향을 알아보았다. 반응 후 살리신산 분석법을 통하여 이소코리스메이트 생성량을 측정하였다. 살리신산 분석법은 반응 후 반응액을 100 ℃에서 10분간 가열하여 이소코리스메이트를 살리실산으로 전환하였고, 전환된 살리실산을 분광광도계(Spectrofluorophotometer, Shimadzu, RF-5301PC)를 사용하여 측정(emission; 410nm, excitation; 300 nm)하였다.

SyMenF는 pH 8에서 가장 높은 활성을 보였다[도 4의 A)]. 그리고 약알칼리 환경인 pH 9에서도 활성이 거의 유지됨을 확인할 수 있었으나 약산성 조건인 pH 6에서는 활성이 현저히 감소하였다. 그리고 활성 최적 온도는 40 ℃로 60 ℃에서도 높은 수준의 활성이 잔존함을 확인하였으며, 따라서 고온에서도 비교적 안정적인 단백질임을 알 수 있었다[도 4의 B)]. 그러나 저온으로 갈수록 활성이 급격히 감소함을 확인하였고, 10 ℃에서는 활성이 40 ℃에 비해 약 30% 정도만이 남아있었다. SyMenF는 기존에 알려진 EcMenF에 비해 환원제 요구성이 낮았다[도 4의 C)]. SyMenF는 20 mM의 환원제 존재시 활성이 가장 높았으나 EcMenF처럼 2배 이상의 활성증가는 보이지 않았으며, 20 mM 이상의 환원제 존재 시 활성이 급격히 감소하였다[Daruwala et al., Journal of Bacteriology, 179, 10(1997)]. 마지막으로 SyMenF의 금속이온 요구성을 확인하였다[도 4의 D)]. 마그네슘 이온 등 총 9 종류의 금속이온을 첨가하여 반응시킨 결과, SyMenF는 마그네슘 이온 존재 시 4배 이상 효소활성이 증가하였다. 따라서, 마그네슘 이온을 절대적으로 요구함을 알 수 있었다. 효소 반응의 최적 조건을 조사한 결과 SyMenF는 기존에 보고된 MenF와는 달리 넓은 범위의 반응 조건을 갖고 있으며, 고온에서도 비교적 안정적인 단백질임을 확인하였다[서열번호 4].

실시예 5 : SymenF 를 이용한 대장균 menF/entC 돌연변이 균주의 기능 보완

SyMenF가 대장균 menF/entC 돌연변이 균주의 이소코리스메이트 합성효소 기 능을 보완하는지 여부를 조사하기 위해 최소배지(M9 minimal salt, glycerol 0.4%, 40 mM TMAO, casamino acids 0.1%, thiamine 0.001%, 1 mM IPTG) 상에서 혐기성 생장 유무를 조사하였다[도 5]. 우선 SyMenF 발현에 사용한 pJK28과 pQE30을 각각 menF/entC 돌연변이 대장균 균주에 형질전환시켰다. 제작된 균주와 야생형을 글리세롤-TMAO와 IPTG 최소배지에 혐기[도 5의 (A)] 및 호기[도 5의 (B)] 배양을 하였다. 실험결과 야생형과 돌연변이 균주 모두 호기 상태에서 생장을 하였지만 혐기 조건에서는 상이한 생장을 보여주었다. 야생형과 SyMenF를 발현하는 돌연변이 균주는 혐기조건에서도 좋은 생장하였지만, pQE30 벡터가 형질전환된 돌연변이 균주는 생장하지 못하였다. 따라서, 시네코시스티스의 SymenF 유전자가 대장균의 menF와 entC 유전자의 기능을 보안함을 확인하였다. 즉, SyMenF의 이소코리스메이스 합성효소 활성을 in vivo 상에서 확인하였다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 시네코시스티스 속 PCC6803 유래의 이소코리스메이트 합성효소인 SyMenF는 비교적 넓은 범위의 조건에서 잔존 활성이 크게 변하지 않으며, 이러한 생화학적 특성은 본 효소의 산업적 적용에 큰 이점이 될 것으로 평가된다. 또한, 본 발명은 이소코리스메이트 합성효소 유전자의 개량 및 대사공학적 접근을 통해 효율적인 고부가가치 산물 생산 체계 구축에 활용될 수 있을 것이다.

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Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 서열번호 1로 표시되는 SyMenF 유전자를 포함하며, 도 2 (a)의 개열지도로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터 pQE30-SyMenF.
4. 재조합 발현벡터 pQE30-SyMenF를 대장균에 형질전환시킨 것을 특징으로 하는 형질전환 대장균M15/pQE30-SyMenF, pREP4[KCTC 10788BP].
5. 형질전환 대장균 M15/pQE30-SyMenF, pREP4[KCTC 10788BP]로부터 이소코리스메이트 합성효소 SyMenF를 발현시켜 코리스메이트로부터 이소코리스메이트를 생 합성하는 방법.

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