CN103320401A

CN103320401A - 新型2-脱氧青蟹肌糖合成酶的制造方法

Info

Publication number: CN103320401A
Application number: CN2013102709944A
Authority: CN
Inventors: 小西一诚; 今津晋一
Original assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Current assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2013-09-25
Also published as: CN102361978A; KR20110110372A; KR20130111639A; CN102361978B; EP2759594A1; US20140206050A1; WO2010109916A1; JP5654078B2; TWI408229B; EP2412807A4; EP2412807A1; TW201035319A; EP2412807B1; US8703466B2; US20120100584A1; JPWO2010109916A1; KR101410069B1; JP2013135697A; JP5579700B2; KR20130019452A

Abstract

本发明的目的在于提供一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶的DOI制造方法，所述DOI合成酶对于热和pH的稳定性等特性比现有的酶更优异，并且具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性、且具有下述(3)和/或(5)的特性。(1)作用：本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为2-脱氧青蟹肌糖的功能。(2)最适pH范围：7.0～7.7。(3)稳定pH范围：6.0～8.0。(4)最适温度范围：55～70℃。(5)稳定温度范围：20～46℃。(6)辅酶：利用NAD⁺。(7)分子量：39000～42000。

Description

新型2-脱氧青蟹肌糖合成酶的制造方法

本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/JP2010/002210，国际申请日为2010年3月26日，中国国家申请号为201080013139.X，进入中国国家阶段的进入日为2011年9月22日，国际公开发明名称译文为“新型2-脱氧青蟹肌糖合成酶”。

技术领域

本发明涉及耐热性2-脱氧青蟹肌糖合成酶、2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因、重组载体、转化体以及2-脱氧青蟹肌糖的制造方法。

背景技术

目前，许多邻苯二酚等芳香族化合物是以石油为原料而进行生产的，但从石油资源枯竭的问题、削减二氧化碳排放量等方面出发，要求开发出利用生物物质的环境协调型的新型制造工艺。

另一方面，有文献发现2-脱氧青蟹肌糖(以下称为DOI)能够转换为工业上有用的芳香族化合物(邻苯二酚等)(非专利文献1)，此外，有文献报道能够由作为生物物质的构成要素之一的葡萄糖来合成该DOI(非专利文献1)。在该DOI制造工艺中重要的是由葡萄糖-6-磷酸向DOI转换的2-脱氧青蟹肌糖合成酶(以下称为DOI合成酶)，DOI不仅能够转换为上述芳香族化合物，还能够成为各种有用化合物的中间体，因而DOI合成酶备受瞩目。

DOI合成酶是于1997年由属于丁酰苷菌素生产菌环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)的微生物分离纯化的(非专利文献2)，随后其基因序列也被公开(专利文献1)。除此之外，迄今为止还发现了来自印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)JCM3268株(非专利文献3)的DOI合成酶等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2000-236881号公报

非专利文献

非专利文献1：Tetrahedron Letters41,1935-1938,2000

非专利文献2：The Journal of Antibiotics50(5),424-428,1997

非专利文献3：The Journal of Antibiotics59(6),358-361,2006

发明内容

发明所要解决的课题

但是，上述DOI合成酶的稳定性和比活性等各种特性并不令人满意，而且基本上没有进行与适合于数千吨规模的工业化制法的酶的分析和功能提高有关的研究。例如，来自属于环状芽胞杆菌的微生物的DOI合成酶(BtrC)在稳定性等方面存在很大的问题，来自印度斯坦链异壁菌JCM3268株的DOI合成酶的比活性明显较低，工业上难以利用。本发明所要解决的课题在于提供一种对于热和pH的稳定性等特性比现有的酶更优异的DOI合成酶，以及提供一种使用了该酶的DOI制造方法。

用于解决课题的方案

为了解决这些课题，本发明人进行了深入研究，结果发现了一种与现有的酶相比热和/或pH稳定性得到了提高的DOI合成酶，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下所示的DOI合成酶、DOI合成酶基因、重组载体、转化体以及DOI制造方法。

[1]一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性，且具有下述(3)和/或(5)的特性：

(1)作用：本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为2-脱氧青蟹肌糖的功能；

(2)最适pH范围：7.0～7.7；

(3)稳定pH范围：6.0～8.0；

(4)最适温度范围：55～70℃；

(5)稳定温度范围：20～46℃；

(6)辅酶：利用NAD⁺；

(7)分子量：39000～42000。

[2]如[1]所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(8)的特性：

(8)比活性：1.0μmol/min/mg以上(反应温度65℃)。

[3]如[1]或[2]所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，其具有下述(9)的特性：

(9)辅因子：通过添加Co²⁺离子提高活性。

[4]如[1]～[3]的任一项所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其中，稳定温度范围为20～60℃。

[5]一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其具有下述任一种氨基酸序列：

(a)序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列；

(b)与序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列具有80%以上的同源性、且具有高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的氨基酸序列；或

(c)在序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列中包含1个或2个以上的氨基酸的缺失、添加、和/或置换，且具有高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的氨基酸序列。

[6]一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有编码下述任一种氨基酸序列的碱基序列：

(a)序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列；

[7]一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因，其具有下述任一种碱基序列：

(a)序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列；

(b)与序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列具有80%以上的同源性、且编码具有高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的2-脱氧青蟹肌糖合成酶的碱基序列；或

(c)在序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列中包含1个或2个以上的碱基的缺失、添加、和/或置换，且编码具有高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的2-脱氧青蟹肌糖合成酶的碱基序列。

[8]一种重组载体，其含有[6]或[7]所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因。

[9]一种转化体，其是通过将[6]或[7]所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因或[8]所述的重组载体导入宿主中而得到的。

[10]一种2-脱氧青蟹肌糖合成酶，其是通过培养[9]所述的转化体而得到的。

[11]一种2-脱氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，该方法中使用[1]～[5]或[10]的任一项所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶。

[12]一种2-脱氧青蟹肌糖的制造方法，该方法将葡萄糖、以葡萄糖为构成成分的多糖类和/或葡萄糖-6-磷酸作为原料来制造2-脱氧青蟹肌糖，其特征在于，该方法中利用[6]或[7]所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶基因、或者[9]所述的转化体。

[13]一种由葡萄糖-6-磷酸制造2-脱氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，在含有钴离子的培养基中培养能够表达2-脱氧青蟹肌糖合成酶的微生物。

[14]如[13]所述的方法，其特征在于，该方法中使用含有以葡萄糖为构成成分的多糖类或者葡萄糖的原料。

[15]如[13]或[14]所述的方法，其中，2-脱氧青蟹肌糖合成酶为[1]～[5]的任一项所述的2-脱氧青蟹肌糖合成酶。

发明的效果

若使用本发明的DOI合成酶，则在DOI的制造中能够在高温条件下利用酶。此外，在某些制造条件下，制造时不需要严格的温度管理等。另外，能够在DOI稳定的pH范围即酸性条件下制造DOI。此外，在某些制造条件下，制造时不需要严格的pH管理等。

附图说明

图1示出纯化DOI合成酶(DOIS-1)的最适pH范围(实施例3)。

图2示出纯化DOI合成酶(DOIS-1)的稳定pH范围(实施例3)。

图3示出纯化DOI合成酶(DOIS-1)的最适温度范围(实施例3)。

图4示出纯化DOI合成酶(DOIS-1)的稳定温度范围(实施例3)。

图5示出纯化DOI合成酶(DOIS-5)的稳定pH范围(实施例5)。

图6示出纯化已知DOI合成酶(BtrC)的稳定温度范围(比较例1)。

图7示出纯化已知DOI合成酶(BtrC)的稳定pH范围(比较例1)。

具体实施方式

以下，对本发明进行具体说明。

[DOI合成酶]

本发明的具体实施方式(以下称为本实施方式)的DOI合成酶具有下述特性：

(1)作用：本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为DOI的功能。

(2)稳定性：显示出高温稳定性和/或宽范围pH稳定性。

优选的是，本发明中的DOI合成酶具有下述(1)、(2)、(4)、(6)和(7)的特性，且具有下述(3)和/或(5)的特性。

(1)作用：本酶具有将葡萄糖-6-磷酸转换为2-脱氧青蟹肌糖的功能。

(2)最适pH范围：7.0～7.7

(3)稳定pH范围：6.0～8.0

(4)最适温度范围：55～70℃

(5)稳定温度范围：20～46℃(优选为20～60℃)

(6)辅酶：利用NAD⁺

(7)分子量：39000～42000

进一步优选本发明中的DOI合成酶除了具有上述特性之外，还具有下述(8)和/或(9)的特性。

(8)比活性：1.0μmol/min/mg以上(反应温度65℃)

(9)辅因子：通过添加Co²⁺离子提高活性

本发明的DOI合成酶的氨基酸序列的具体例示于序列号2、4、6、8、10以及12。具有序列号2、4、6、8、10或12记载的氨基酸序列的DOI合成酶优选具有高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的特性。具有序列号2、4、6、8、10或12记载的氨基酸序列的DOI合成酶优选在本实施方式中具有优异的高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的特性。

本实施方式中，DOI合成酶可以是与选自由序列号2、4、6、8、10或12记载的氨基酸序列组成的组中的至少一种氨基酸序列具有优选为80%以上、进一步优选为85%以上、进一步优选为90%以上、进一步优选为95%以上、进一步优选为99%以上的同源性的蛋白质。

另外，本实施方式中，DOI合成酶可以在选自由序列号2、4、6、8、10或12记载的氨基酸序列组成的组中的至少一种氨基酸序列中含有1个或2个以上的氨基酸的缺失、置换和/或添加。缺失、置换和/或添加的氨基酸的个数优选为1～50个，进一步优选为1～30个，进一步优选为1～20个，进一步优选为1～10个，进一步优选为1～5个，进一步优选为1～3个。

含有与选自由序列号2、4、6、8、10、12记载的氨基酸序列组成的组中的至少一种氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列；具有优异的高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的特性；且具有DOI合成酶活性的酶包含在本发明中。

含有在选自由序列号2、4、6、8、10、12记载的氨基酸序列组成的组中的至少一种氨基酸序列中包含1个或2个以上的氨基酸的缺失、置换和/或添加的氨基酸序列；具有优异的高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的特性；且具有DOI合成酶活性的酶包含在本发明中。

作为使DOI合成酶中的氨基酸产生缺失、置换、添加等变异的方法，可以利用PCR法、易错PCR法、DNA改组法或制作嵌合酶的方法等公知的方法。

关于DOI合成酶中的氨基酸序列的同源性，例如，可以使用UWGCG Package提供的BESTFIT程序(Devereux et al(1984)Nucleic Acids Research12,p387-395)、PILEUP和BLAST算法(Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36：290-300；Altschul S.F.(1990)J Mol Biol215：403-10)等序列分析用工具计算。

另外，通过在热处理后对由上述方法得到的DOI合成酶进行活性测定，能够选择出保持高温稳定性的酶。

[DOI合成酶基因]

本实施方式的DOI合成酶基因可以是由宏基因组或微生物分离、提取的天然的基因，另外，也可以是根据其碱基序列利用PCR法、人工合成法等公知的方法合成的基因。另外，制作新型DOI酶嵌合基因时，可以组合已知DOI合成酶基因，例如，可以举出来自类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)NBRC13157株、印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)JCM3268、弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)NBRC12773株等的DOI合成酶基因。

本实施方式中的DOI合成酶基因的碱基序列的具体例示于序列号1、3、5、7、9或11。

由含有DOI合成酶基因(该DOI合成酶基因具有选自由序列号1、3、5、7、9或11记载的碱基序列组成的组中的至少一种基因序列)的重组载体和宿主得到转化体，对所得到的转化体进行培养，可以得到DOI合成酶。

由具有序列号1、3、5、7、9或11记载的碱基序列的DOI合成酶基因得到的DOI合成酶优选具有高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的特性。

本实施方式中，DOI合成酶基因可以含有以下碱基序列，该碱基序列与具有序列号1、3、5、7、9或11记载的碱基序列的DOI合成酶基因具有优选为80%以上、进一步优选为85%以上、进一步优选为90%以上、进一步优选为95%以上、进一步优选为99%以上的同源性。含有与选自由序列号1、3、5、7、9或11记载的碱基序列组成的组中的至少一种碱基序列具有80%以上的同源性的碱基序列；编码具有优异的高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的特性、且具有DOI合成酶活性的酶的DOI合成酶基因包含在本发明中。

本实施方式中，DOI合成酶基因可以在序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列中包含1个或2个以上的碱基的缺失、添加、和/或置换。具有以下碱基序列的DOI合成酶基因包含在本发明中，该碱基序列在序列号1、3、5、7、9或11的任一项记载的碱基序列中包含1个或2个以上的碱基的缺失、添加、和/或置换，且编码具有高温稳定性和/或宽范围pH稳定性的DOI合成酶。缺失、添加和/或置换的碱基的个数优选为1～50个，进一步优选为1～30个，进一步优选为1～20个，进一步优选为1～10个，进一步优选为1～5个，进一步优选为1～3个。

本实施方式中，可以使用具有编码下述(a)、(b)或(c)的任一种氨基酸序列的碱基序列的DOI合成酶基因。

(a)序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列；

[重组载体和转化体]

本实施方式的重组载体可以通过在质粒等公知的载体中连接(插入)本实施方式的基因而获得。上述载体只要能够在宿主中复制则没有特别限定，可以举出例如质粒DNA、噬菌体DNA等。

作为上述质粒DNA，可以举出来自大肠杆菌的质粒(例如pBR322、pBR325、pUC18、pUC119、pTrcHis、pBlueBacHis等)、来自枯草杆菌的质粒(例如pUB110、pTP5等)、来自酵母的质粒(例如YEp13、YEp24、YCp50、pYE52等)等，作为噬菌体DNA，可以举出λ噬菌体等。

向上述载体中插入本实施方式的基因时可以采用以下方法：首先，利用适当的限制酶将纯化后的DNA切断，在载体DNA的适当的限制酶位点或多克隆位点将其插入，连接到载体上。

为了在宿主内表达外来基因，需要在结构基因前设置适当的启动子。上述启动子没有特别限定，可以使用已知在宿主内发挥功能的任意的启动子。需要说明的是，关于启动子，在后述的转化体中与宿主一起进行详细说明。另外，根据需要还可以设置增强子等顺式作用元件、剪接信号、聚A附加信号、核糖体结合序列(SD序列)、终止子序列等。

将本实施方式的重组载体导入宿主中，以能够表达目标基因，从而能够得到本实施方式的转化体。在此作为宿主，只要能够表达本实施方式的DNA，则没有特别限定，例如，可以举出属于大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)等芽胞杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等假单胞菌属、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)等根瘤菌属的细菌；以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等酵母；其他COS细胞、CHO细胞等动物细胞；或者Sf19、Sf21等昆虫细胞。

另外，用作本实施方式的转化体的宿主优选具有由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖等单糖类合成葡萄糖-6-磷酸的功能。另外，根据需要，还优选具有分解两种以上单糖连接而成的多糖类的功能。

将大肠杆菌等细菌作为宿主时，从有效表达DOI合成酶的方面考虑，本实施方式的重组载体优选能够在各细菌中自主复制，同时优选由启动子、核糖体结合序列、本实施方式的基因、转录终止序列构成。另外，还可以含有调节启动子的基因。作为大肠杆菌，可以举出大肠杆菌(E.coli)K12、DH1、DH10B(Invitrogen公司)、BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Stratagene公司)、TOP10F等，作为枯草杆菌，可以举出枯草芽胞杆菌(B.subtilis)MI114、207-21等。

作为启动子，只要能够在大肠杆菌等宿主中发挥功能，则没有特别限定，可以使用例如gapA启动子、gadA启动子、trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌的启动子；T7启动子等来自噬菌体的启动子。

对向细菌导入重组载体的方法没有特别限定，只要是能够向细菌中导入DNA的方法即可，可以举出例如使用钙离子的方法(Cohen,SN et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972))、电穿孔法等。

将酵母作为宿主时，使用例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(PichiaPastoris)等。这种情况下，作为启动子，可以举出能够在酵母中表达的启动子，例如gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、PHO5启动子、AOX启动子等。

作为向酵母中导入重组载体的方法，可以举出例如电穿孔法(Becker,D.M.et al.：Methods.Enzymol.,194:180(1990))、原生质球法(Hinnen,A.et al.:Proc Natl.Acad.Sci.USA,75:1929(1978))、乙酸锂法(Itoh,H.:J.Bacteriol.,153:163(1983))等。

[DOI合成酶的生产]

本实施方式的酶可以通过如下方式获得：在适当的培养基中培养本实施方式的转化体，由该培养物采集具有该酶活性的蛋白质，从而获得本实施方式的酶。培养本实施方式的转化体的方法根据宿主决定即可。例如，在以大肠杆菌、酵母等微生物为宿主的转化体的情况下，只要是含有微生物可同化的碳源、氮源、无机盐类等；且能够有效培养转化体的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基的任一种。

培养中可以根据需要向培养基中添加氨苄青霉素、四环素等抗生素。在以使用了诱导性物质作为启动子的表达载体进行转化并对所得的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导物。例如，在以使用了lac启动子的表达载体进行转化并对所得到的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)等，在以使用了trp启动子的表达载体进行转化并对所得到的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸(IAA)等。

培养后，本实施方式的酶蛋白产生在菌体内或细胞内的情况下，将细胞破碎。另一方面，本实施方式的蛋白质分泌到菌体外或细胞外的情况下，直接使用培养液，或者通过离心分离等回收培养液。

蛋白质的分离-纯化中可以单独或者适当组合使用例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱法、亲和色谱法等。

另外，活性表示将葡萄糖-6-磷酸转换为DOI。活性值的测定方法如下所示。

本实施方式的DOI合成酶活性可以通过以下方法确认：向能够作为底物的含有适当的葡萄糖-6-磷酸的反应液中添加该酶，检测所生成的DOI，从而进行确认。所生成的DOI的确认可以使用非专利文献(Journal of Biotechnology129,502-509(2007))中记载的方法等。

作为测定DOI合成酶活性的方法，可以使用以下方法：向含有1000mM葡萄糖-6-磷酸溶液20μL、100mM NAD⁺溶液50μL、100mM氯化钴六水合物溶液50μL的pH7.0的150mM Bis-Tris缓冲液900μL中混合适当浓度的DOI合成酶液100μL，反应约5～60分钟后，使酶失活，对DOI进行定量。

纯化后的DOI合成酶的纯化度的确认和分子量的测定可以通过电泳、凝胶过滤色谱法等来进行。另外，关于酶的最适温度范围或者最适pH范围，可以改变反应温度或者反应pH来测定酶活性。进而，通过在将DOI合成酶暴露于各种pH条件下或温度条件下一定时间后再测定酶活性，能够考察稳定pH范围和稳定温度范围。例如，在各pH条件下评价DOI合成酶时，可以使用Bis-Tris缓冲液(pH5.5～8.0)和Tris缓冲液(pH7.4～8.0)。

最适pH范围是指，在改变pH而进行测定时将显示最高活性的活性值设为100的情况下活性值为70以上的pH范围。

稳定pH范围是指，在改变pH而进行测定时将显示最高活性的活性值设为100的情况下活性值在70以上的pH范围。

最适温度范围是指，在改变温度而进行测定时将显示最高活性的活性值设为100的情况下活性值为50以上的温度范围。

稳定温度范围是指，在改变温度而进行测定时将显示最高活性的活性值设为100的情况下活性值在50以上的温度范围。

本实施方式中的DOI合成酶的高温稳定性是指，稳定温度范围的上限为46℃，更优选为50℃，进一步优选为60℃，进一步优选为70℃，进一步优选为80℃，进一步优选为90℃，特别优选为95℃。下限没有特别限定，在通常的操作下稳定的温度范围的下限例如可以为20℃，优选为10℃，优选为5℃，进一步优选为1℃。

作为本实施方式的具有高温稳定性的2-脱氧青蟹肌糖合成酶，例如，可以挑选在50℃温育1小时后的残存酶活性为50以上的酶。残存酶活性表示将显示最高活性的活性值设为100时的相对活性。

通常，在工业上的酶反应中，需要调节在酶具有高活性的温度范围内，因此温度的调节是非常重要的因素。

DOI合成中，以往从菌的活性的方面出发，需要将温度调节至37℃以下的严格的温度管理。若使用具有高温稳定性的DOI合成酶，则在高温范围内也能够保持高活性，因此能够进行DOI的制造而不需要进行严格的温度管理。

本实施方式中的具有宽范围pH稳定性的DOI合成酶具有以下特性：稳定pH范围优选为pH6.0～7.0，更优选为pH6.0～7.4，更优选为pH6.0～7.7，更优选为pH6.0～8.0，特别更优选为pH4.0～9.0。

DOI合成中，以往从菌的高活性的方面出发，需要将pH调节为pH6.0～7.0的严格的pH管理。若使用具有宽范围pH稳定性的DOI合成酶，则在宽范围的pH范围内也能够保持高活性，因此能够进行DOI的制造而不需要进行严格的pH管理。

关于本实施方式的酶，只要其作用不受到抑制则不需要为高纯度。因此，纯化不是必须的，也可以含有其他酶等。

[DOI的生产]

本实施方式的DOI可以通过以下发酵生产法获得：培养本实施方式的转化体，由所得到的培养物采集DOI。

作为上述培养的营养源，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类、其他有机营养源的培养基。培养温度只要为该菌能够生长的温度即可。培养时间没有特别限定，可以为1天至7天左右。其后，由所得到的培养菌体或培养上清液回收DOI即可。

作为用于培养的碳源，只要是转化体能够同化的碳源，则可以直接使用以葡萄糖为构成成分的多糖类，更优选举出来自含有单糖类或者淀粉、米糠、废糖蜜等多糖类的原料的单糖类，具体地说可以举出D-葡萄糖等。另外，启动子的表达为诱导型时，适时添加诱导物质即可。

作为碳源，可以使用D-葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖等糖类；油脂类；脂肪酸类以及正链烷烃等。作为油脂，例如，可以举出菜籽油、椰子油、棕榈油、棕榈仁油等。作为脂肪酸，可以举出己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、十四酸等饱和/不饱和脂肪酸、或者这些脂肪酸的酯或盐等脂肪酸衍生物等。

作为有机营养源，可以举出氨基酸类，例如，腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、色氨酸等。

作为氮源，例如，除了氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐之外，可以举出蛋白胨、肉浸膏、酵母浸膏等。作为无机盐类，例如，可以举出磷酸氢钠、磷酸二氢钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠等。

本发明中，通过在含有钴离子的培养基中培养能够表达DOI合成酶的微生物，能够由葡萄糖-6-磷酸制造DOI。

本实施方式中的DOI生产法中，钴离子优选以二价钴离子的盐的形式使用。具体地说，可以举出氯化钴、硫酸钴、乙酸钴等。

若向培养液中添加钴离子，则DOI生产率高于不添加钴离子的培养。在培养液中过量添加钴离子时，可能会引起微生物的生长抑制。因此，培养中的钴浓度以以下范围为宜：对于该酶具有活性而言是充分的，且不抑制微生物的生长。刚开始培养后的钴浓度根据宿主而异，例如在使用大肠杆菌的情况下，刚开始培养后的钴浓度以氯化钴六水合物换算优选维持在0.1～200mg/L、更优选0.1～100mg/L、进一步更优选0.1～50mg/L的范围内。刚开始培养后表示从主培养开始至菌液OD达到5的范围。菌液OD是指培养液的光密度，本实施方式中，表示培养液对于600nm的光的吸收强度。

应用高密度培养时，随着培养液中的菌体浓度的上升，作为微生物菌体中的蛋白质、核酸、脂质、维生素等构成成分的原料；且对于微生物的生长为必须的能量源的葡萄糖等碳源会变得不足。这种情况下，连续地或者间歇地向培养基中供给碳源。本实施方式中，优选进一步添加钴离子，连续地或者间歇地适量供给该酶的活性表达所必需的钴离子。

本实施方式的DOI生产法中，优选将添加钴值调节为0.0003～70，更优选为0.001～15，进一步优选为0.01～5。添加钴值通过下式计算。

添加钴值=[培养液中氯化钴六水合物的总添加量(mg)]/培养液量(L)/菌液OD

使用除氯化钴六水合物以外的钴盐时，可以通过氯化钴六水合物换算计算出添加钴值，并添加钴盐以使钴离子的量为适当的值。

作为由培养液回收DOI的方法，可以举出以下方法。

培养终止后，利用离心分离器或过滤装置等从培养液中除去菌体，得到培养上清液。对该培养上清液进一步进行过滤处理，除去菌体等固体物质，向其滤液中添加离子交换树脂，用蒸馏水进行洗脱。一边测定ICP发射光谱、pH等，一边分离不含杂质的级分，除去该水溶液的溶剂，从而可以回收DOI。

所得到的DOI的分析例如可以通过高效液相色谱法或核磁共振法等进行。

另外，作为上述发酵生产法以外的方法，可以举出利用通过葡萄糖激酶等由葡萄糖转换而得到的葡萄糖-6-磷酸的方法，可以通过本实施方式的DOI合成酶或者转化体由葡萄糖-6-磷酸得到DOI。

从反应速度、酶的稳定性的方面考虑，使用本实施方式的DOI合成酶和/或转化体制造DOI时的反应温度优选为10～95℃，更优选为20～70℃，进一步优选为30～60℃。

反应pH可以在宽范围调整，从酶的稳定性的方面考虑，优选为pH2.0～10.0，更优选为pH4.0～8.0，进一步优选为6.0～8.0。

反应时间还根据酶的用量而异，考虑工业利用时，通常优选为20分钟～200小时，更优选为6～80小时。利用转化体作为DOI合成催化剂时，可以事先进行冷冻处理、各种破碎处理。

但是，本实施方式不限于以上的反应条件和反应形态，可以适当选择。

以下，通过实施例进行具体说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。

实施例

[实施例1]

(1)染色体DNA的制备

根据常规方法制备类芽孢杆菌NBRC13157株的染色体DNA。

将类芽孢杆菌NBRC13157株在NR琼脂培养皿(1%细菌用胰化胨、0.2%酵母浸膏、1%Ehrlich松鱼浸膏(エルリッヒカツオエキス)、1.5%细菌用琼脂、pH7.0)中，于30℃培养1天，形成菌落。将30mL NR培养基(1%细菌用胰化胨、0.2%酵母浸膏、1%Ehrlich松鱼浸膏、pH7.0)分注到150mL锥形瓶中，向其中接种1接种环的该菌落，在30℃、180rpm的条件下培养1天。在4℃、12,000g的条件下将该培养液离心分离1分钟，除去上清，回收菌体。

将所得到的菌体悬浮于裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、20mM EDTA、50mM葡萄糖)中，充分清洗。离心分离回收菌体后，重悬浮于裂解缓冲液中，向其中加入溶菌酶，在37℃温育45分钟。接下来添加SDS和RNase，在37℃温育45分钟。其后添加蛋白酶K，在50℃平稳地振荡60分钟。利用苯酚-三氯甲烷、三氯甲烷对此处得到的溶液进行处理，然后进行乙醇沉淀，使析出的核酸缠绕到玻璃移液管上，进行回收。用70%乙醇清洗该核酸后，进行干燥，再溶解于TE中。通过该操作，制备约100μg的染色体DNA。

(2)DOI合成酶基因的分离

作为用于由上述(1)中制备的染色体DNA扩增DOI合成酶基因的PCR引物，正义引物合成具有序列号15的序列的寡聚DNA，反义引物合成具有序列号16的序列的寡聚DNA。

使用此处得到的PCR引物，以上述(1)中制备的染色体DNA为模板，通过PCR法进行DOI合成酶基因的扩增，得到由1107个碱基对构成的PCR产物。

利用DNA测序仪对此处得到的PCR产物的基因序列进行分析并确认，得到具有序列号13的碱基序列的已知DOI合成酶(BtrC)基因。与该基因对应的氨基酸序列示于序列号14(BtrC)中。

(3)DOI合成酶基因的表达质粒载体的构筑和转化

对上述(2)中得到的PCR产物进行末端平滑化、磷酸化，连接到在pUC19中连接有来自大肠杆菌的gapA启动子、SD序列、终止子的质粒中。该质粒载体中导入了gapA启动子，该gapA启动子能够在大肠杆菌中有效地转录作为外来基因而连接的基因，因而即使在含有葡萄糖的培养基中培养重组微生物时，也能够有效地表达、制造DOI合成酶基因。

通过热激法将此处得到的质粒载体转化到利用氯化钙法制备的大肠杆菌JM109株的感应细胞中，制作重组微生物。

(4)新型DOI合成酶基因的获得

对于上述(3)中得到的质粒载体，利用常规方法进行变异导入，从而可以得到具有序列号1(DOIS-1)、序列号3(DOIS-2)、序列号5(DOIS-3)、序列号7(DOIS-4)、序列号9(DOIS-5)和序列号11(DOIS-6)记载的碱基序列的耐热性DOI合成酶基因。关于此处得到的DOI合成酶基因，也与(3)同样地获得转化体。另外，将与序列号1、序列号3、序列号5、序列号7、序列号9和序列号11的碱基序列对应的氨基酸序列示于序列号2(DOIS-1)、序列号4(DOIS-2)、序列号6(DOIS-3)、序列号8(DOIS-4)、序列号10(DOIS-5)和序列号12(DOIS-6)中。

新型DOI合成酶的挑选可以通过在对利用常规方法制作的各种DOI合成酶热处理或者各种pH处理后进行活性测定等来实施。

[实施例2]

[纯化酶的获得]

将实施例1中制作的DOI合成酶(DOIS-1)的转化体在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养皿中于37℃培养一天，形成菌落。

接下来，将30mL含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基加入容量为150mL的锥形瓶中，利用接种环从上述培养皿接种菌落，在37℃以180rpm旋转振荡培养3～8小时，直至OD(600nm)达到0.5左右，以此作为主培养的前培养液。

向36个容量为500mL的锥形瓶中分别加入含有2g/L葡萄糖和100mg/L氨苄青霉素的LB培养基100mL，在各锥形瓶中添加0.5mL前培养液，在37℃以180rpm旋转振荡培养16小时。

接下来，将该培养液在4℃以10,000g离心分离30分钟，除去上清，用含有0.2mg/L氯化钴六水合物的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)清洗多次，同时回收菌体。回收后的菌体在-80℃冷冻保存。

将该冷冻保存菌体悬浮于含有0.2mg/L氯化钴六水合物的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)中，添加180mg溶菌酶(Sigma公司制造，来自蛋清)和60μL脱氧核糖核酸酶I(WaKo公司制造，来自牛，重组体溶液)，在37℃以120rpm振荡5小时，进行菌体破碎。

将菌体破碎后的溶液在4℃以10,000g离心分离30分钟，除去菌体残渣，回收上清。

向该上清中加入硫酸铵，形成30%饱和，在4℃搅拌一段时间后，在4℃以10,000g离心分离30分钟，除去所生成的沉淀，回收上清。

向该上清中进一步加入硫酸铵，形成40.0%饱和，在4℃搅拌一段时间后，对于所生成的沉淀，在4℃以10,000g离心分离30分钟，除去上清，回收沉淀。接下来，将该沉淀溶解于含有0.2mg/L氯化钴六水合物的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)中。

在4℃使用平均分级分子量为10,000的超滤膜浓缩该溶解液，加入含有0.2mg/L氯化钴六水合物的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)，再次浓缩，重复该脱盐操作2～3次。

使上述得到的酶溶液吸附到用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)平衡化后的“DEAESepharose FF”(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES公司)上，然后通过含有0～0.4M氯化钠的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)的浓度梯度法将酶洗脱出来。

收集上述洗脱后的酶的DOI合成酶的活性级分，使用平均分级分子量为10,000的超滤膜进行浓缩，用含有10重量%硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)悬浮，使其吸附到用含有10重量%硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)平衡化后的“HiTrap Phenyl FF(high sub)”(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES公司)上，然后通过含有10～0重量%硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)的浓度梯度法将酶洗脱出来。

收集上述洗脱后的活性级分，使用平均分级分子量为10,000的超滤膜进行浓缩，使其吸附到用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)平衡化后的“MonoQ5/50GL”(GEHEALTHCARE BIO-SCIENCES公司)上，然后通过含有0～0.2M氯化钠的50mMTris-HCl缓冲液(pH7.7)的浓度梯度法将酶洗脱出来。

收集上述洗脱后的活性级分，使用平均分级分子量为10,000的超滤膜进行浓缩，填充到用含有0.2mg/L氯化钴六水合物和0.1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)平衡化后的“HiLoad16/60Superdex200”(GE HEALTHCARE BIO-SCIENCES公司)中，然后利用同样的缓冲液进行洗脱。

收集上述洗脱后的活性级分，使用平均分级分子量为10,000的超滤膜进行浓缩，得到纯化DOI合成酶(DOIS-1)。

与上述一系列的纯化酶获得实验同样地获得纯化DOI合成酶(DOIS-2)、纯化DOI合成酶(DOIS-3)、纯化DOI合成酶(DOIS-4)、纯化DOI合成酶(DOIS-5)、纯化DOI合成酶(DOIS-6)和纯化已知DOI合成酶(BtrC)。

[实施例3]

[新型DOI合成酶的评价]

使用实施例2中得到的纯化DOI合成酶，进行与其作用相关的实验。

(1)最适pH范围

在各pH下的活性测定中，向反应液中添加适量纯化DOI合成酶(DOIS-1)，制备反应液，使得葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM、各种缓冲液为100mM。作为缓冲液，使用Bis-Tris缓冲液(pH6.0～7.7)和Tris缓冲液(pH7.4～8.0)。反应温度设为30℃，对所生成的DOI进行定量，从而测定活性。求出以显示最高活性的活性值为100时的相对活性，其结果示于图1。本发明的酶的最适pH范围为pH7.0～7.7。

(2)稳定pH范围

使用pH5.5～8.0的范围的100mM缓冲液，将纯化DOI合成酶(DOIS-1)在各pH下于30℃温育60分钟，测定其残存酶活性。作为温育中使用的缓冲液，使用Bis-Tris缓冲液(pH5.5～8.0)和Tris缓冲液(pH7.4～8.0)。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。求出以显示最高活性的活性值为100时的相对活性，其结果示于图2。该酶的稳定pH范围为pH6.0～8.0，纯化DOI合成酶(DOIS-2)和纯化DOI合成酶(DOIS-3)也显示出同样的结果。这些宽范围pH稳定性是现有酶所没有的新特性。

(3)最适温度范围

在反应温度为10～70℃的各反应温度条件下，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(OrientalYeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)中实施纯化DOI合成酶(DOIS-1)的酶活性测定。求出以显示最高活性的活性值为100时的相对活性，其结果示于图3。最适温度范围为55～70℃，反应温度为65℃时的比活性为1.8μmol(DOI)/min/mg(酶)，显示出非常高的值。

(4)稳定温度范围

对于添加了纯化DOI合成酶(DOIS-1)、且制备成NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)，在温度范围为25～60℃的各温度下温育1小时后，测定各残存酶活性。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。求出以显示最高活性的活性值为100时的相对活性，其结果示于图4。纯化DOI合成酶(DOIS-1)的稳定温度范围为50℃以下，纯化DOI合成酶(DOIS-2)和纯化DOI合成酶(DOIS-3)也显示出同样的结果。这些高温稳定性是现有酶所没有的新特性。

另外，在不存在已知具有稳定剂的作用的NAD+和钴离子的条件下进行温育，实施稳定温度范围试验，结果纯化DOI合成酶(DOIS-1)在46℃温育温度下的相对活性为38，在42℃温育温度下的相对活性为89，在37℃温育温度下的相对活性为100。

(5)分子量

通过使用了分离凝胶浓度为10%的“Ready-Gel J”(日本Bio-Rad Laboratories,Inc.)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求出分子量，结果纯化DOI合成酶(DOIS-1)的分子量为约40,000，与由氨基酸序列推测的分子量40,656基本一致。

[实施例4]

[新型DOI合成酶的评价]

使用实施例2中得到的纯化DOI合成酶(DOIS-4)，进行与其作用相关的实验。

(温度稳定性的评价)

对于添加了纯化DOI合成酶(DOIS-4)、且制备成氯化钴六水合物为5mM的100mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)，在25℃和42℃的各温度下温育1小时后，测定各残存酶活性。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。将在25℃温育时的残存活性设为100，则42℃温育的活性值为74，显示出非常高的值。

(比活性的测定)

另外，反应温度为60℃时的比活性为1.2μmol(DOI)/min/mg(酶)，显示出非常高的值。

[实施例5]

[新型DOI合成酶的评价]

使用实施例2中得到的纯化DOI合成酶(DOIS-5)，进行与其作用相关的实验。

(pH稳定性的评价)

使用pH5.5～8.0的范围的100mM缓冲液，将纯化DOI合成酶(DOIS-5)在各pH于30℃温育60分钟，测定其残存酶活性。作为温育中使用的缓冲液，使用Bis-Tris缓冲液(pH5.5～8.0)和Tris缓冲液(pH7.4～8.0)。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。求出以最大活性为100时的相对活性，其结果示于图5。如图5所示，该酶在非常宽的pH区域中显示出高稳定性。该高稳定性是现有酶所没有的新特性。

[实施例6]

[新型DOI合成酶的评价]

使用实施例2中得到的纯化DOI合成酶(DOIS-6)，进行与其作用相关的实验。

(pH稳定性的评价)

使用pH5.5～8.0的范围的100mM缓冲液，将纯化DOI合成酶(DOIS-6)在各pH于30℃温育60分钟，测定其残存酶活性。作为温育中使用的缓冲液，使用Bis-Tris缓冲液(pH5.5～8.0)。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。将显示最大活性的pH8.0的残存活性设为100时，在pH6.5～8.0的范围内活性值为70以上，pH6.0的残存活性为53，显示出非常高的值。该高pH稳定性是现有酶所没有的新特性。

[实施例7]

“DOI的生产方法”

DOI的合成中，作为DOI合成催化剂，使用将上述冷冻菌体悬浮在含有0.2mg/L氯化钴六水合物的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.7)中而得到的溶液。DOI合成反应的反应液组成为：葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为85mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为0.1mM、氯化钴六水合物为1mM，菌体OD为30，开始DOI的合成反应。反应开始时的pH调整为7.7，在46℃的反应温度进行2.5小时合成反应，由此生成1重量%的DOI。反应终止后，添加盐酸，使pH降低至6以下。接下来，将该反应溶液在4℃以10,000g离心分离30分钟，回收上清，用过滤器过滤，除去菌体残渣。

对于上述合成的DOI溶液，使用将Amberlite IR120BNa(Organo Corporation制造)再生为H⁺型的阳离子交换树脂和将Amberlite IRA96SB(Organo Corporation制造)再生为OH^-型的阴离子交换树脂进行纯化处理。该纯化处理中，合用柱处理和间歇处理，将未通过ICP发射光谱法检测出P、Co、Na且含有DOI溶液的级分回收。

接下来，在上述得到的DOI溶液中，相对于溶液中的1g DOI添加0.5g的活性炭CARBORAFFIN(Japan EnviroChemicals,Ltd.,制造)，在室温下搅拌1小时，使微量杂质吸附到活性炭上。1小时后，通过过滤操作除去活性炭，回收DOI溶液。通过将该DOI溶液减压浓缩，浓缩DOI，通过冷冻干燥得到DOI的粉末。

[实施例8]

接下来，将30mL含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基加入容量为150mL的锥形瓶中，利用接种环从上述培养皿接种菌落，在37℃以180rpm旋转振荡培养3～8小时，直至OD达到0.5左右，以此作为主培养的前培养液。

将100mL表1所示的含有不同浓度的氯化钴六水合物的培养基A分别加入容量为500mL的锥形瓶中，进一步加入0.5mL的前培养液，在37℃以180rpm旋转振荡培养18小时。培养18小时后各培养基条件下的菌液OD、添加钴值和以未添加钴离子的培养基的上清DOI浓度为100时的相对值(DOI生产率)示于表2。

[表1]

表1培养基A

磷酸二氢钾	2g/L
		磷酸氢二铵	3g/L
硫酸镁七水合物	0.2mg/L
		硫胺素盐酸盐	20mg/L
酵母浸膏	3g/L
		葡萄糖	10g/L
氯化钴六水合物	0～2Omg/L

(*)用蒸馏水溶解，调整为pH7.0。

[表2]

比较例1

[已知DOI合成酶的评价]

关于具有序列号14记载的氨基酸序列的纯化已知DOI合成酶(BtrC)，与实施例3-(4)稳定温度范围同样地进行以下实验。

对于添加了纯化已知DOI合成酶(BtrC)、且制备成NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)，在温度范围为25～60℃的各温度下温育1小时后，测定各残存酶活性。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。求出以最大活性为100时的相对活性，其结果示于图6。纯化已知DOI合成酶(BtrC)的稳定温度范围为42℃以下，于46℃的相对活性为23，于50℃的相对活性为0，显示出明显低的热稳定性。

另外，在不存在已知具有稳定剂的作用的NAD+和钴离子的条件下进行温育，实施稳定温度范围试验，结果纯化已知DOI合成酶(BtrC)在42℃和46℃温育温度下的相对活性为0，在37℃温育温度下的相对活性为14。本实验也表明，现有酶具有明显低的热稳定性。

关于具有序列号14记载的氨基酸序列的纯化已知DOI合成酶(BtrC)，与实施例3-(2)稳定pH范围同样地进行以下实验。

将纯化已知DOI合成酶(BtrC)在各pH下于30℃温育60分钟，测定其残存酶活性。作为温育中使用的缓冲液，使用Bis-Tris缓冲液(pH5.5～7.0)和Tris缓冲液(pH7.4～8.0)。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。求出以最大活性为100时的相对活性，其结果示于图7。如图7所示，pH6时的相对活性为27，是非常低的值，在pH5.5的条件下几乎完全失活。

[比较例2]

[已知DOI合成酶的评价]

关于具有序列号14记载的氨基酸序列的纯化已知DOI合成酶(BtrC)，与实施例3同样地进行以下实验。

对于添加了纯化已知DOI合成酶(BtrC)、且制备成氯化钴六水合物为5mM的100mM Bis-Tris缓冲液(pH7.0)，在25℃和42℃的各温度下温育1小时后，测定各残存酶活性。

关于残存酶活性的测定，在葡萄糖-6-磷酸二钠盐(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为20mM、NAD+(Oriental Yeast Co.,ltd.制造)为5mM、氯化钴六水合物为5mM的100mMBis-Tris缓冲液(pH7.0)中，在30℃的反应温度下实施。将在25℃温育时的残存活性设为100，则42℃温育的活性值为0，显示出明显低的热稳定性。

工业实用性

根据本发明，能够通过有效的制造工艺来生产DOI，所述DOI作为工业上有用的芳香族化合物(邻苯二酚等)的前体的利用价值高。

Claims

1.一种由葡萄糖-6-磷酸制造2-脱氧青蟹肌糖的制造方法，其特征在于，在含有钴离子的培养基中培养能够表达2-脱氧青蟹肌糖合成酶的微生物，所述培养基中钴离子的含量以氯化钴六水合物换算为0.1mg/L～50mg/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法中使用含有以葡萄糖为构成成分的多糖类或者葡萄糖的原料。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，2-脱氧青蟹肌糖合成酶由下述任一种氨基酸序列组成：

序列号2、4、6、8、10或12的任一项记载的氨基酸序列。