JP5654078B2 - 新規2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素 - Google Patents
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Description
[1] 下記(1)、(2)、(4)、(6)及び(7)の特性を有し、かつ下記(3)及び/又は(5)の特性を有する2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素。
(1)作用:本酵素は、グルコース−6−リン酸を2−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
(2)至適pH範囲:7.0〜 7.7
(3)安定pH範囲:6.0〜 8.0
(4)至適温度範囲:55 〜 70℃
(5)安定温度範囲:20〜46℃
(6)補酵素:NAD+を利用
(7)分子量:39000〜42000
(8)比活性:1.0μmol/min/mg以上(反応温度65℃)
(9)補因子:Co2+イオンの添加により活性向上
(a)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有するアミノ酸配列;又は
(c)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び/又は置換を含み、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有するアミノ酸配列
(a)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有するアミノ酸配列;又は
(c)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び/又は置換を含み、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有するアミノ酸配列
(a)配列番号1、3、5、7、9又は11の何れかに記載の塩基配列;
(b)配列番号1、3、5、7、9又は11の何れかに記載の塩基配列に対して80%以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有する2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素をコードする塩基配列;又は
(c)配列番号1、3、5、7、9又は11の何れかに記載の塩基配列に対して1個又は複数個の塩基の欠失、付加、及び/又は置換を含み、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有する2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素をコードする塩基配列:
[DOI合成酵素]
本発明を実施するための形態(以下、本実施の形態という)のDOI合成酵素は、下記の特性を有し、
(1)作用:本酵素は、グルコース−6−リン酸をDOIへと変換する機能を有する。
(2)安定性:高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を示す。
(1)作用:本酵素は、グルコース−6−リン酸を2−デオキシ−シロ−イノソースへと変換する機能を有する。
(2)至適pH範囲:7.0〜 7.7
(3)安定pH範囲:6.0〜 8.0
(4)至適温度範囲:55 〜 70 ℃
(5)安定温度範囲:20〜46℃(好ましくは、20〜60℃)
(6)補酵素:NAD+を利用
(7)分子量:39000〜42000
(8)比活性:1.0μmol/min/mg以上(反応温度65℃)
(9)補因子:Co2+イオンの添加により活性向上
本実施の形態のDOI合成酵素遺伝子は、メタゲノムや微生物から単離・抽出した天然のものでも良く、また、その塩基配列に従ってPCR法、人工合成法等の公知の方法によって合成したものでも良い。また、新規DOI酵素キメラ遺伝子の作製には、既知DOI合成酵素遺伝子を組み合わせてもよく、例えば、Paenibacillus sp.NBRC13157株、Streptoalloteichus hindustanus JCM3268、Streptomyces fradiae NBRC12773株などに由来するDOI合成酵素遺伝子が挙げられる。
(a)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列に対して80%以上の相同性を有し、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有するアミノ酸配列;又は
(c)配列番号2、4、6、8、10又は12の何れかに記載のアミノ酸配列に対して1個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加、及び/又は置換を含み、かつ高温安定性及び/又は広範囲pH安定性を有するアミノ酸配列
本実施の形態の組換えベクターは、プラスミド等の公知のベクターに本実施の形態の遺伝子を連結(挿入)して得ることができる。前記ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられる。
本実施の形態の酵素は、本実施の形態の形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から該酵素活性を有するタンパク質を採取することによって得ることができる。本実施の形態の形質転換体を培養する方法は、宿主に応じて決定すればよい。例えば、大腸菌や酵母等の微生物を宿主とする形質転換体の場合は、微生物が資化しうる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体を効率的に培養しうる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いても良い。
本実施の形態のDOI合成酵素活性は、基質となり得る適当なグルコース−6−リン酸を含む反応液に該酵素を添加し、生成するDOIを検出する方法によって確認することができる。生成するDOIの確認は、非特許文献(Journal of Biotechnology 129, 502-509 (2007))に記載の方法などを用いることができる。
DOI合成において、従来菌の活性の観点から37℃以下に温度制御する厳密な温度管理が必要であった。高温安定性を持つDOI合成酵素を用いると、高温の範囲においても高活性を保つことが可能であるため、厳密な温度管理を行うことなく、DOIの製造が可能である。
本実施の形態のDOIは、本実施の形態の形質転換体を培養して得られる培養物からDOIを採取する発酵生産法により得ることができる。
添加コバルト値=[培養液中への塩化コバルト6水和物総添加量(mg)]/培養液量(L)/菌液OD
塩化コバルト6水和物以外のコバルト塩を用いた場合は、塩化コバルト6水和物換算で添加コバルト値を算出し、コバルトイオンの量が適切な値となるようにコバルト塩を添加してもよい。
得られたDOIの分析は、例えば、高速液体クロマトグラフィーや核磁気共鳴法などにより行う。
反応pHは広範囲で調整可能であり、酵素の安定性の点から、好ましくはpH2.0〜10.0、より好ましくはpH4.0〜8.0、さらに好ましくは6.0〜8.0である。
しかしながら、本実施の形態は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。
(1)染色体DNAの調製
常法に従ってPaenibacillus sp.NBRC13157株の染色体DNAを調製した。
Paenibacillus sp.NBRC13157株をNR寒天プレート(1% Bacto Tryptone、0.2% Yeast Extract、1% エルリッヒカツオエキス、1.5% Bacto Agar、pH7.0)で、30℃、1日間培養してコロニーを形成させた。その1白金耳を、NR培地(1% Bacto Tryptone、0.2% Yeast Extract、1% エルリッヒカツオエキス、pH7.0)30mLを150mL三角フラスコに分注したものに接種して、30℃、180rpmで1日間培養した。この培養液を、4℃で、12,000g、1分間遠心分離して上清を除去し、菌体を回収した。
上記(1)において調製した染色体DNAからDOI合成酵素遺伝子を増幅するためのPCRプライマーとして、センスプライマーは配列番号15の配列を有するオリゴDNAを、アンチセンスプライマーは配列番号16の配列を有するオリゴDNAをそれぞれ合成した。
ここで得られたPCRプライマーを用い、上記(1)において調製した染色体DNAを鋳型としてPCR法によるDOI合成酵素遺伝子の増幅を行い、1107塩基対からなるPCR産物を取得した。
ここで得られたPCR産物の遺伝子配列をDNAシークエンサーで解析することで確認し、配列番号13の塩基配列を有する既知DOI合成酵素(BtrC)遺伝子を得た。本遺伝子に対応するアミノ酸配列を配列番号14(BtrC)に示した。
上記(2)で取得したPCR産物の平滑末端化、リン酸化を行い、pUC19に大腸菌由来のgapAプロモーター、SD配列、ターミネーターを連結したプラスミドにライゲーションした。このプラスミドベクターには大腸菌中で外来遺伝子として連結された遺伝子を効率的に転写できるgapAプロモーターが導入されており、グルコースを含む培地で組換え微生物を培養した場合においてもDOI合成酵素遺伝子を効率的に発現・製造させることができる。
ここで得られたプラスミドベクターを、塩化カルシウム法で調製した大腸菌JM109株のコンピテントセルにヒートショック法で形質転換し、組換え微生物を作製した。
上記(3)で取得したプラスミドベクターに対し、常法による変異導入を行うことで、配列番号1(DOIS−1)、配列番号3(DOIS−2)、配列番号5(DOIS−3)、配列番号7(DOIS−4)、配列番号9(DOIS−5)および配列番号11(DOIS−6)に記載の塩基配列を有する耐熱性DOI合成酵素遺伝子を得ることができる。ここで取得したDOI合成酵素遺伝子についても(3)と同様に形質転換体の取得を行った。また、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9および配列番号11の塩基配列に対応するアミノ酸配列を、配列番号2(DOIS−1)、配列番号4(DOIS−2)、配列番号6(DOIS−3)、配列番号8(DOIS−4)、配列番号10(DOIS−5)および配列番号12(DOIS−6)に示した。
[精製酵素の取得]
実施例1で作製したDOI合成酵素(DOIS−1)の形質転換体を100mg/Lのアンピシリンを含むLBプレートで、37℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで100mg/Lのアンピシリンを含むLB培地30mLを150mL容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、37℃で、3〜8時間、OD(600nm)が0.5程度になるまで180rpmで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
次いでこの培養液を、4℃で、10,000g×30分間遠心分離して上清を除去し、0.2mg/L塩化コバルト六水和物を含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.7)で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、−80℃で凍結保存した。
菌体破砕後の溶液を、4℃で、10,000g×30分間遠心分離して菌体残渣を除去し、上清を回収した。
この上清にさらに硫酸アンモニウムを加えて40.0%飽和とし、4℃でしばらく攪拌した後に、生じた沈殿を、4℃で、10,000g×30分間遠心分離して上清を除去し、沈殿を回収した。次いでこの沈殿を0.2mg/L塩化コバルト六水和物を含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.7)に溶解させた。
上記で得られた酵素溶液を、50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.7)で平衡化した「DEAE Sepharose FF」(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)に吸着させた後、0〜0.4Mの塩化ナトリウムを含有する50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.7)の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃縮し、50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.7)で平衡化した「MonoQ 5/50 GL」(GEヘルスケア バイオサイエンス株式会社)に吸着させた後、0〜0.2Mの塩化ナトリウムを含有する50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.7)の濃度勾配法によって酵素を溶出させた。
上記で溶出した活性画分を集め、平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃縮し、精製DOI合成酵素(DOIS−1)を得た。
[新規DOI合成酵素の評価]
実施例2で得られた精製DOI合成酵素を用いて、その作用に関する実験を行った。
各pHにおける活性測定では、反応液に精製DOI合成酵素(DOIS−1)を適量添加し、グルコース−6−リン酸二ナトリウム塩(オリエンタル酵母製)が20mM、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mM、各種緩衝液が100mMとなるようにして反応液を調整した。緩衝液としては、Bis−Tris緩衝液(pH6.0〜7.7)およびTris緩衝液(pH7.4〜8.0) を使用した。反応温度は30℃とし、生成するDOIを定量することで活性を測定した。最も高活性を示した活性値を100とした相対活性を求め、この結果を図1に示す。本発明酵素における至適pH範囲は、pH7.0〜 7.7であった。
pH5.5〜8.0の範囲の100mMの緩衝液を用いて、精製DOI合成酵素(DOIS−1)を各pHで30℃、60分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Bis−Tris緩衝液(pH5.5〜8.0)およびTris緩衝液(pH7.4〜8.0)を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−6−リン酸二ナトリウム塩(オリエンタル酵母製)が20mM、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mMとなる100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)中で、反応温度30℃で実施した。最も高活性を示した活性値を100とした相対活性を求め、この結果を図2に示した。本酵素の安定pH範囲は、pH6.0〜 8.0であり、精製DOI合成酵素(DOIS−2)および精製DOI合成酵素(DOIS−3)も同様の結果を示した。これらの広範囲pH安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。
反応温度10〜70℃の各反応温度条件において、グルコース−6−リン酸二ナトリウム塩(オリエンタル酵母製)が20mM、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mMとなる100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)中で、精製DOI合成酵素(DOIS−1)の酵素活性測定を実施した。最も高活性を示した活性値を100とした相対活性を求め、この結果を図3に示す。至適温度範囲は55〜70℃であり、反応温度65℃における比活性は1.8μmol(DOI)/min/mg(酵素)と非常に高い値を示した。
精製DOI合成酵素(DOIS−1)を添加して且つ、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mMとなるように調整した100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)を、温度範囲25〜60℃の各温度で1時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
残存酵素活性測定は、グルコース−6−リン酸二ナトリウム塩(オリエンタル酵母製)が20mM、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mMとなる100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)中で、反応温度30℃で実施した。最も高活性を示した活性値を100とした相対活性を求め、この結果を図4に示した。精製DOI合成酵素(DOIS−1)の安定温度範囲は50℃以下であり、精製DOI合成酵素(DOIS−2)および精製DOI合成酵素(DOIS−3)も同様の結果を示した。これらの高温安定性は、既知酵素にはない新規特性であった。
分離ゲル濃度が10%の「レディーゲルJ」(日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社)を用いるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量を求めたところ、精製DOI合成酵素(DOIS−1)の分子量は約40,000であり、アミノ酸配列から推定される分子量40,656とほぼ一致した。
[新規DOI合成酵素の評価]
実施例2で得られた精製DOI合成酵素(DOIS−4)を用いて、その作用に関する実験を行った。
精製DOI合成酵素(DOIS−4)を添加して且つ、塩化コバルト六水和物が5mMとなるように調整した100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)を、25℃および42℃の各温度で1時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
また、反応温度60℃における比活性は1.2μmol(DOI)/min/mg(酵素)と非常に高い値を示した。
[実施例5]
[新規DOI合成酵素の評価]
実施例2で得られた精製DOI合成酵素(DOIS−5)を用いて、その作用に関する実験を行った。
pH5.5〜8.0の範囲の100mMの緩衝液を用いて、精製DOI合成酵素(DOIS−5)を各pHで30℃、60分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Bis−Tris緩衝液(pH5.5〜8.0)およびTris緩衝液(pH7.4〜8.0) を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−6−リン酸二ナトリウム塩(オリエンタル酵母製)が20mM、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mMとなる100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)中で、反応温度30℃で実施した。最大活性を100とする相対活性を求め、この結果を図5に示した。図5に示すとおり、本酵素は非常に幅広いpH領域で高い安定性を示した。この高い安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。
[新規DOI合成酵素の評価]
実施例2で得られた精製DOI合成酵素(DOIS−6)を用いて、その作用に関する実験を行った。
pH5.5〜8.0の範囲の100mMの緩衝液を用いて、精製DOI合成酵素(DOIS−6)を各pHで30℃、60分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Bis−Tris緩衝液(pH5.5〜8.0)を使用した。
残存酵素活性測定は、グルコース−6−リン酸二ナトリウム塩(オリエンタル酵母製)が20mM、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mMとなる100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)中で、反応温度30℃で実施した。最大活性を示したpH8.0の残存活性を100とすると、pH6.5〜8.0の範囲では活性値は70以上であり、pH6.0の残存活性は53という非常に高い値を示した。この高いpH安定性は、既存酵素にはない新規特性であった。
「DOIの生産方法」
実施例1で作製したDOI合成酵素(DOIS−1)の形質転換体を100mg/Lのアンピシリンを含むLBプレートで、37℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで100mg/Lのアンピシリンを含むLB培地30mLを150mL容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、37℃で、3〜8時間、OD(600nm)が0.5程度になるまで180rpmで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
次いでこの培養液を、4℃で、10,000g×30分間遠心分離して上清を除去し、0.2mg/L塩化コバルト六水和物を含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.7)で数回洗浄しながら菌体を回収した。回収した菌体は、−80℃で凍結保存した。
実施例1で作製したDOI合成酵素(DOIS−1)の形質転換体を100mg/Lのアンピシリンを含むLBプレートで、37℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。
次いで100mg/Lのアンピシリンを含むLB培地30mLを150mL容の三角フラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、37℃で、3〜8時間、ODが0.5程度になるまで180rpmで回転振盪培養を行い、これを本培養の前培養液とした。
[既知DOI合成酵素の評価]
配列番号14に記載のアミノ酸配列を有する精製既知DOI合成酵素(BtrC)に関して、実施例3−(4)安定温度範囲と同様にして以下実験を行った。
精製既知DOI合成酵素(BtrC)を添加して且つ、NAD+(オリエンタル酵母製)が5mM、塩化コバルト六水和物が5mMとなるように調整した100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)を、温度範囲25〜60℃の各温度で1時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
精製既知DOI合成酵素(BtrC)を各pHで30℃、60分間インキュベートし、その残存酵素活性を測定した。インキュベートに用いた緩衝液としては、Bis−Tris緩衝液(pH5.5〜7.0)およびTris緩衝液(pH7.4〜8.0) を使用した。
[既知DOI合成酵素の評価]
配列番号14に記載のアミノ酸配列を有する精製既知DOI合成酵素(BtrC)に関して、実施例3と同様にして以下実験を行った。
精製既知DOI合成酵素(BtrC)を添加して且つ、塩化コバルト六水和物が5mMとなるように調整した100mMBis−Tris緩衝液(pH7.0)を、25℃および42℃の各温度で1時間インキュベートした後、それぞれの残存酵素活性を測定した。
Claims (2)
- 塩化コバルト6水和物換算で0.1〜50mg/Lの範囲で、コバルトイオンを含有する培地において2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素を発現可能な微生物を培養することを特徴とする、グルコース−6−リン酸から2−デオキシ−シロ−イノソースを製造する製造方法であって、2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素が、下記の何れかのアミノ酸配列を有する2−デオキシ−シロ−イノソース合成酵素である、上記の方法。
(a)配列番号2、4、6又は8の何れかに記載のアミノ酸配列;
(b)配列番号2に記載のアミノ酸配列に対して95%以上の相同性を有し、かつ安定温度範囲が20℃以上50℃以下である高温安定性及び/又は安定pH範囲が6.0〜8.0である広範囲pH安定性を有するアミノ酸配列; - グルコースを構成成分とする多糖類あるいはグルコースを含有する原料を用いることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
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