CN101407820A

CN101407820A - 一种编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶的基因及其应用

Info

Publication number: CN101407820A
Application number: CNA2008100738138A
Authority: CN
Inventors: 杜丽琴; 黄日波; 韦宇拓; 黄志民; 王青艳; 朱绮霞; 罗兆飞
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2009-04-15
Anticipated expiration: 2028-09-26
Also published as: CN101407820B

Abstract

本发明涉及一种编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶的基因及其应用，其特征在于含有SEQID NO：1的核苷酸序列或其功能等同变异体。本发明含涉及该基因或其功能等同变异体编码的蔗糖酶(SEQ ID NO：2)及该酶在降解蔗糖中的应用。

Description

一种编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种新的编码蔗糖酶的基因，特别是涉及克隆自环境宏基因组的一种新的编码蔗糖酶的基因，该基因编码的蛋白质可用于蔗糖的降解。

背景技术

蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖通过1，2糖苷键组成的二糖。蔗糖作为植物中通过光合作用产生的糖类物质，是一种含量丰富的生物质。全球蔗糖的年产量超过了1亿吨。蔗糖分解而成的单糖长期以来作为发酵工业中的碳源而被利用。

蔗糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖。葡萄糖和果糖可作为重要的工业原料生产有机醇、氨基酸及生物聚合物等高附加值的化工产品。同时蔗糖分解成的葡萄糖也是生产乙醇的重要原材料。微生物蔗糖发酵的代谢过程是首先由蔗糖酶将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，然后葡萄糖和果糖才能进入糖酵解发酵途径得到有机醇、氨基酸及生物聚合物等化工产品。蔗糖酶是微生物蔗糖代谢途径中的关键酶之一，也是降解蔗糖的第一个酶，也是决定蔗糖发酵时间的最主要的因素之一。因此寻找新的蔗糖酶基因用于构建新的更适合工业化生产各种化工产品的基因工程菌，提高微生物水解蔗糖的转化效率和水解速度，从而缩短发酵生产时间，对于降低直接发酵甘蔗汁生产各种化工产品的生产成本具有十分重要的意义。

蔗糖酶属于糖基水解酶类(glycosyl hydrolases)，许多糖基水解酶由一个催化功能域和一个或更多个其它的功能域组成，根据催化功能域的氨基酸序列相似性，糖基水解酶类被划分成不同的家族(families)(Davies G.，Henrissat B.1995.Structures and mechanismsof glycosyl hydrolases.Structure 3：853-859；Henrissat B.，Bairoch A.1996.Updatingthe sequence-based classification of glycosyl hydrolases.Biochem.J.316：695-696)。根据碳水化合物活性酶数据库(http://www.cazy.org/fam/acc_GH.html)上所列糖基水解酶类的最新清单，目前糖基水解酶类有112个家族，蔗糖酶属于糖基水解酶类家族32。

目前国内外对蔗糖酶基因研究主要集中于已知的几种蔗糖酶含量高的肠道细菌(克雷伯氏菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌)上，对这些菌的蔗糖酶基因进行遗传学的研究(Sharon J.Reid，Valerie R.Abratt，2005.Sucrose utolosation in bacteria：genetic organisationand regulation.Appl Microbiol Biotechnol.67：312-321)。上海医药工业研究院的张洪斌构建了右旋糖酐蔗糖酶工程菌株同时对其培养条件进行了研究(微生物学报.2008，48(4).492-497)；广西大学的苏龙和农万庭分别克隆了来自嗜热菌XZ2K2和肠膜明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因，并在大肠杆菌中进行表达(化学与生物工程.2006，23(7).42-44，47。工业微生物.2007，37(3).29-32)；华中农业大学食品科技学院的邵彦春筛选到一株肠膜明串珠菌菌株，同时克隆了其中的右旋糖苷蔗糖酶基因并对其进行了序列分析(微生物学通报.2005，32(3).20-23)。

人类所克隆的蔗糖酶基因都是从人类所培养的微生物中来的，但并不是自然界中所有微生物都是可以被分离、培养的，一般认为可培养的微生物种类只占自然界中微生物种类的1％(RappéMS，Giovannoni SJ. 2003.The uncultured microbial majority.Annu RevMicrobiol.57：369 94.)，而其余的99％的微生物是用目前的实验条件所无法培养的。这些不可培养的微生物中蕴藏着大量的基因资源。从这些无法培养的微生物中获取基因资源成为微生物研究的热点(Cowan D.et al，2005.Metagenomic gene discovery：past，presentand future.Trends Biotechnol.23：321-9)。近年来从环境样品未培养微生物提取基因组DNA然后构建混合基因组DNA文库以分离各种新基因已是成熟技术(Lorenz P，Schleper C.2002.Metagenome-a challenging source of enzyme discovery.Journal of MolecularCatalysis B：Enzymatic 19-20：13-19)。糖厂废水中含有丰富的蔗糖，被糖厂废水污染浸润的土壤中有大量的微生物在进行蔗糖的分解，而这个土壤环境中的未培养微生物中含有大量的基因资源如蔗糖酶基因资源，其中很可能有些就是优于目前所发现的最好的蔗糖酶的高效酶的基因。通过构建糖厂废水污染土壤微生物的混合基因组DNA文库，极有可能从中筛选得到新的蔗糖酶基因。

发明内容

本发明的目的是通过构建自然界环境中不可培养的微生物的宏基因组DNA文库，从中筛选得到新的蔗糖酶基因，用于蔗糖的降解。

本发明人从广西壮族自治区武鸣县糖厂废水污染土壤环境中取样，提取土壤中所有微生物的DNA，构建宏基因组DNA文库，通过蔗糖酶活性平板检测筛选法，分离得到了新的编码蔗糖酶的基因，它属于编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶基因，可在宿主细胞中大量表达该蔗糖酶，用于蔗糖的降解，命名为：invGX(SEQ ID NO：1)，是由1458个碱基组成，含有完整的蔗糖酶基因invGX的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，invGX基因的起始密码为GTG，终止密码子为GTA。

SEQ ID NO：2的蛋白质是基因invGX编码的蔗糖酶产物InvGX，由486个氨基酸组成，和InvGX催化功能域同源性最高的为热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter sp.X514)的sucrose-6-phosphate hydrolase的催化功能域(e-值为e-97)，两者的相似性为38％、相同性为56％。

这种新的蔗糖酶基因：invGX在大肠杆菌中表达的重组产物InvGX能降解蔗糖。所述的蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中也具有广泛的应用。

以下是本发明人对上述SEQ ID NO.1的基因进行核苷酸测序，该编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶基因序列表如下：(SEQUENCE LISTING)

1.SEQ ID NO.1

(1)序列特征：

a.长度：1458碱基对

b.类型：DNA/RNA

c.链型：双链

d.几何结构：线形

(2)分子类型：核苷酸

(3)序列描述：

gtgccgtctgcaccttccgtatccatcaacactgagtttcagggtcagttccacctctgcgctccggtgggctggctgaacgaccccaacgggct

ttcctggttcgccgggaggcttcatctgttctatcagtaccatccgtattccagcgtctggggtcccatgcactggggccacgcggtcaccgagg

acttggtgcgctggacccatctccctatcgcgctgattcccggagagccctacgacgccgacgggtgtttctcgggcggcgccgtggccgacg

gggagcgtcacgctctgctctacaccggacacgtggaccccgatcccctggacccgtcgcgccgcgtcgagacccagtgtctggcctgggg

cgacgggacggtctaccacaaggctccccagaacccggtgatcggtcccgagctgctgccggagggggcttctcggggcgatttccgcgatc

cgaaggtgtggaaggagggcctccactggtactgtctggttgccagccgccacgctgacgggcacggccagatcctcctgttcaccgccgag

accccgactcagtggcgcctggtggggccggtgcttcaaagccgtggtcggctgggcggcatgtgggagtgcccggacctgttcgtgctcga

tggtcgggaggtgctgctttggtcggtgatgggacagccccagcaggacggcggcttccagaatcccagcgcggtggtgtggtccgtcggca

ccctcgaccgcactaccggcgccttcctccccgacgcgattcaggaggtcgatcagggacccgacttctacgcggcccagaccacgacgttg

cccgatggccgcgtggtgctcgtcggttggatgcagatgtgggagaggagcatccccaccgatgagcttgggcacggctgggccggtcggat

gacgcttgtgcgcgaggtgtactggcaccgagggcgactggcccagaggccggtgcgagagctagaggcctaccggcgggaggaggtca

cgggcgcggcgaccttcgaagggcgtcacgagttctcaggcgtggaggggcaggcactggacctcgaggtcgaattccgaagctggaaag

ggcagtccgtcgggctcagcgtgtttgcctcggagacggaagagacccgcctcacctgggagccgcagtcgggatggttgaccctcgaccg

ctctcggagtggcgtccccatcgccagccgatcggcgacgcaccccgactgccaggtctatcgtgctcgcgtcgaggctcccgagggtgtgct

ttcccttcgtttggtcttggaccgctcggcggtcgaggtcttcgcgcagaacggcaccacgacgctgagcgccacggtctatccgcggccgac

gagcgcgcgcgtggcgtttctgtccgagggcggcaccaccgaagtggtctgccgagcctggccgctggccctcgta

本发明人对具有SEQ ID NO：1的核苷酸进行表达的蛋白质，列表如下：

2、SEQ ID NO.2

(2)序列特征：

a.长度：486氨基酸

b.类型：多肽

c.链型：单链

d.几何结构：立体

(2)分子类型：蛋白质

(3)序列描述：

Vpsapsvsintefqgqfhlcapvgwlndpnglswfagrlhlfyqyhpyssvwgpmhwghavtedlvrwthlpialipgepydadgcfs

ggavadgerhallytghvdpdpldpsrrvetqclawgdgtvyhkapqnpvigpellpegasrgdfrdpkvwkeglhwyclvasrhadgh

gqillftaetptqwrlvgpvlqsrgrlggmwecpdlfvldgrevllwsvmgqpqqdggfqnpsavvwsvgtldrttgaflpdaiqevdqg

pdfyaaqtttlpdgrvvlvgwmqmwersiptdelghgwagrmtlvrevywhrgrlaqrpvreleayrreevtgaatfegrhefsgvegqa

ldlevefrswkgqsvglsvfaseteetrltwepqsgwltldrsrsgvpiasrsathpdcqvyrarveapegvlslrlvldrsavevfaqngtttls

atvyprptsarvaflseggttevvcrawplalv

本发明所述的编码蔗糖酶的基因，其功能等同变异体的核苷酸序列的有突变形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。

含有本发明所述的蔗糖酶基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主，含有基因所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。

含有本发明所述的编码蔗糖酶基因的表达载体及用于转化本发明基因的宿主，含有基因所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞

本发明所述的蔗糖酶基因采集以及测定的方法包括以下几个步骤：

(1)微生物总DNA的提取；(2)构建微生物宏基因组文库；(3)蔗糖酶基因invGX序列的测定；(4)蔗糖酶基因invGX的核苷酸序列分析；(5)蔗糖酶基因编码的产物氨基酸序列分析；(6)蔗糖酶基因invGX的克隆和表达；(7)蔗糖酶InvGX酶活的测定。

以下是详细方法：

1)微生物总DNA的提取

取200克糖厂废水污染的土壤，悬浮在100ml的0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)中，然后在600g离心力下离心10分钟收集上清液。上清中加入40ml PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮，polyvinylpolypyrrolidone(购自Sigma公司，目录号P-6755))溶液(PVPP溶液：每100mgPVPP与1ml 0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)混匀)，振荡30秒，再加入200μl 3M CaCl₂溶液，振荡30秒后，在600g离心力离心5分钟，收集上清液于另一个离心管中并用8000g离心力离心15分钟收集上清液中的细菌细胞。收集到的菌体沉淀块悬浮在1mlTF(10mM Tris/HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)溶液中，并在37℃下加入100μl溶菌酶(20mg/ml，溶于TE溶液)作用30分钟，然后以10000g离心1分钟再次沉淀细胞，细胞沉淀块悬浮在600μl PUREGENE公司的基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNA Purification Kit，)的细胞裂解缓冲液(CellLysis Solution)中，置80℃水浴锅5分钟以裂解细胞，待样品冷却到室温后，加入200μl上述试剂盒中的蛋白质沉淀溶液(Protein Precipitation Solution)，充分混匀后13000g离心3分钟，将上清液转移到一个新的1.5ml微量离心管中，加入600μl 100％异丙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70％乙醇洗2次DNA，干燥后将DNA溶于500μlTE溶液即得DNA粗提物。

将DNA粗提物加到含有Sephadex G200和2％PVPP的层析柱(200mm×10mm)上，用TE缓冲液洗脱，按每组分1ml分部收集洗脱液，每一组分加入100μl的3M醋酸钠溶液(pH4.8)及1ml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0.7％琼脂糖凝胶电泳后切下含20kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA。

2)构建微生物宏基因组文库

为了用这些纯化的DNA制做基因文库，首先对这些DNA进行末端修补以产生平头末端而和文库制备试剂盒中已处理好的同样具平头末端的CopyControl^TM pCC1FOS^TM载体相连，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：8μl 10X末端修补缓冲液(330mM Tris-醋酸[pH7.8]，660mM醋酸钾，100mM醋酸镁，5mM DTT)，8μl 2.5mM dNTP混合物(每种2.5mM)，8μl 10mM ATP，20μg DNA(0.5μg/μl)，4μl末端修补酶混合物(T4 DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)。室温下放置45分钟，再转移到70℃水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1.0％低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含25kb-45kb的DNA的凝胶进行DNA回收，为了使回收片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的载体在T4 DNA连接酶的作用下连接起来，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：2μl无菌水，1μl 10倍快速连接缓冲液(10X Fast-Link Ligation Buffer)，1μl 10mM ATP，1μl CopyControl^TM pCC1FOS^TM载体(0.5μg)，5μl低熔点琼脂糖凝胶回收的25kb-45kb的DNA(0.1μg/μl)，1μl快速连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase，2单位/μl)，混匀后在室温下放置2个小时，再在70℃放置10分钟以终止酶反应。为了将连接反应产物用λ包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl^TM Fosmid Library Production Kit的一个组分)包装，将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物25μl立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10μl连接反应产物，充分混匀后置于30℃90分钟后，再往其中加入25μl溶化的λ包装提取物，充分混匀后置于30℃90分钟，向其中加入935μl噬菌体稀释缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 8.3]，100mM NaCl，10mM MgCl₂)，再将该1mL包装反应产物加入到10mL的OD₆₀₀＝1.0的宿主大肠杆菌EPI300培养液(培养基为LB[每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；pH7.0]+10 mM MgSO₄)中，37℃下放置20分钟让上述得到的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞E.coli EPI300，在含氯霉素(12.5μg/mL)的LA平板上筛选转化子。结果共获得约11万个转化子。

3)蔗糖酶基因序列的测定

用平板影印法将含有氨卞青霉素的LA平板上得到的转化子(每平板约300个菌落)分别影印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基(M9基本培养基[每升含Na₂HPO₄·7H₂O，12.8g；KH₂PO₄，3g；NaCl，0.5g；NH₄Cl，1g])的平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养3天。结果筛选到两个能在以蔗糖为唯一碳源的基本培养基上生长的克隆，本发明只涉及其中一个克隆，进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pINV，用限制性内切酶BamHI酶切pINV后，将获得的DNA片段与去磷酸化的经BamIII酶切的pUC19质粒进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌JM109中，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选转化子。结果共获得约200个转化子，用平板影印法将得到的转化子影印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基的平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养3天。结果筛选到一个能在以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基上生长的亚克隆。进一步提取该亚克隆的质粒DNA并将其命名为pINV2，用限制性内切酶BamHI完全酶切pINV2后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果pINV2除有一个2.7kb的载体片段外，还给出另外一条DNA片段，大小为6.4kb。于是，对pINV2进行测序。pINV2送交大连宝生物生物工程公司测定DNA核苷酸序列。

4)蔗糖酶基因的核苷酸序列分析

用软件对DNA序列进行分析。本发明基因invGX的开放阅读框由1458个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO：1。其中，invGX基因的起始密码子为GTG，终止密码子为GTA。

5)蔗糖酶基因invGX编码的产物InvGX的氨基酸序列分析

蔗糖酶基因invGX编码一个含486个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为53460道尔顿。

用简单组件结构研究工具分析糖厂废水污染土壤微生物中的蔗糖酶InvGX的组件结构，结果是自N端的第18-448位氨基酸为家族32糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。

6)蔗糖酶基因的克隆和表达

使用上游引物5’-ACCCATGGCACCACCACCACCACCACC

GTCTGCACCTTCCGTATCC-3’和下游引物5’-CACAAGCTTT

CGGTCGGCGACAGGCTGAGCG-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增蔗糖酶基因invGX，用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切蔗糖酶基因invGX后，与经NcoI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue中(转化方法为CaCl₂法)，涂布到含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选克隆。进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pSE-INV，用限制性内切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE-INV后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-INV除有一个4.1kb的载体片段外，还有一条大小为1458bp的目的DNA片段。

将含有质粒pSE-INV的重组大肠杆菌XL1-Blue菌株接种到20mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃振荡培养，待OD₆₀₀为0.4时，加入IPTG使其终浓度为1.0mM，37℃诱导10hr。11000rpm离心3min，收集菌体，用4mL pH7.0 100mM的磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9min。12000rpm离心10min，上清即为含有蔗糖酶InvGX的粗酶液。

7)蔗糖酶酶活的测定

取20μl蔗糖酶InvGX粗酶液，加入500μl pH7.0值100mM的磷酸缓冲液，与480μl 1％蔗糖(溶于水中)溶液混合，在37℃作用2小时后，加入800μl DNS溶液[DNS试剂配制：称取1克NaOH用约40ml ddH2O溶解，再称取1克二硝基水杨酸、0.2克苯酚、0.05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30ml ddH2O中，两种溶液混合，定容到100ml。]，放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD530。吸光度测定值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。

本发明的编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶InvGX的所述的蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中的应用基因可以应用于水解成葡萄糖和果糖。用分光光度计测吸光度OD530测量本发明的酶活，每毫升蔗糖酶粗酶液的酶活力为316个国际单位。

具体实施方式

下述实施方法是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明的目的。

实施例1：

在本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌(Escherichia coli)株系EPI300(属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl^TM Fosmid Library Production Kit(目录号CCFOS110)的一个组分)；载体为购自Epicentre公司的柯斯质粒载体CopyControl^TMpCC1FOS^TM；购自Epicentre公司的文库制备试剂盒(CopyControl^TM Fosmid Library ProductionKit，目录号CCFOS110)，购自TaKaRA、MBI的限制性内切酶、修饰酶等试剂。

下面将通过实施例对本发明作详细描述：

5)广西武鸣县糖厂废水污染土壤微生物总DNA的提取

取200克糖厂废水污染的土壤，悬浮在100ml的0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)中，然后在600g离心力下离心10分钟收集上清液。上清中加入40ml PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮，polyvinylpolypyrrolidone(购自Sigma公司，目录号P 6755))溶液(PVPP溶液：每100mgPVPP与1ml 0.18M磷酸钾缓冲液(pH7.2)混匀)，振荡30秒，再加入200μl 3M CaCl₂溶液，振荡30秒后，在600g离心力离心5分钟，收集上清液于另一个离心管中并用8000g离心力离心15分钟收集上清液中的细菌细胞。收集到的菌体沉淀块悬浮在1ml TF(10mM Tris/HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)溶液中，并在37℃下加入100μl溶菌酶(20mg/ml，溶于TF溶液)作用30分钟，然后以10000g离心1分钟再次沉淀细胞，细胞沉淀块悬浮在600μl PUREGENE公司的基因组DNA纯化试剂盒(Genomic DNA Purification Kit，目录号R-5500A)的细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Solution)中，置80℃水浴锅5分钟以裂解细胞，待样品冷却到室温后，加入200μl上述试剂盒中的蛋白质沉淀溶液(Protein Precipitation Solution)，充分混匀后13000g离心3分钟，将上清液转移到一个新的1.5ml微量离心管中，加入600μl 100％异丙醇，充分混匀后即见DNA絮状沉淀析出，挑出DNA絮状沉淀，用70％乙醇洗2次DNA，干燥后将DNA溶于500μlTE溶液即得DNA粗提物。

将DNA粗提物加到含有Sephadex G200(购自Pharmacia公司，目录号17-0080-01)和2％PVPP的层析柱(200mm×10mm)上，用TF缓冲液洗脱，按每组分1ml分部收集洗脱液，每一组分加入100μl的3M醋酸钠溶液(pH4.8)及1ml异丙醇沉淀DNA，把沉淀物溶于TE中，合并所得DNA溶液，0.7％琼脂糖凝胶电泳后切下含20kb以上的DNA的凝胶，用电洗脱法回收纯化DNA。

6)构建糖厂废水污染土壤微生物宏基因组文库

为了用这些纯化的DNA制做基因文库，首先对这些DNA进行末端修补以产生平头末端而和文库制备试剂盒中已处理好的同样具平头末端的CopyControl^TM pCC1FOS^TM载体相连，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：8μl 10X末端修补缓冲液(330mM Tris-醋酸[pH7.8]，660mM醋酸钾，100mM醋酸镁，5mM DTT)，8μl 2.5mM dNTP混合物(每种2.5mM)，8μl 10mM ATP，20μg DNA(0. μg/μl)，4μl末端修补酶混合物(T4 DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)。室温下放置45分钟，再转移到70℃水浴锅放置10分钟以终止酶反应，1.0％低熔点琼脂糖凝胶电泳后切下含25kb-45kb的DNA的凝胶进行DNA回收，为了使回收片段与文库制备试剂盒中已处理好的具平头末端的载体在T4 DNA连接酶的作用下连接起来，依次在冰上向一个新的灭过菌的微量离心管中加入：2μl无菌水，1μl 10倍快速连接缓冲液(10X Fast-Link Ligation Buffer)，1μl 10 mM ATP，1μl CopyControl^TM pCC1FOS^TM载体(0.5μg)，5μl低熔点琼脂糖凝胶回收的25kb-45kb的DNA(0.1μg/μl)，1μl快速连接DNA连接酶(Fast-Link DNA Ligase，2单位/μl)，混匀后在室温下放置2个小时，再在70℃放置10分钟以终止酶反应。为了将连接反应产物用λ包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl^TM Fosmid Library Production Kit(目录号CCFOS110)的一个组分)包装，将在冰上刚刚溶化的λ包装提取物(属购自Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControl^TM Fosmid Library Production Kit(目录号CCFOS110)的一个组分)25μl立即转移到一个新的灭过菌的微量离心管中并快速置于冰上，再往其中加入10μl连接反应产物，充分混匀后置于30℃90分钟后，再往其中加入25μl溶化的λ包装提取物，充分混匀后置于30℃90分钟，向其中加入935μl噬菌体稀释缓冲液(10mM Tris-HCl[pH 8.3]，100mM NaCl，10mM MgCl₂)，再将该1mL包装反应产物加入到10mL的OD₆₀₀＝1.0的宿主大肠杆菌EPI300培养液(培养基为LB[每升含胰蛋白胨(Oxoid)，10g；酵母浸出粉(Difco)，5g；NaCl，5g；pH7.0]+10mM MgSO₄)中，37℃下放置20分钟让上述得到的包装的λ噬菌体吸附和侵染宿主细胞E.coli EPI300，在含氯霉素(12.5μg/mL)的LA平板上筛选转化子。结果共获得约11万个转化子。

7)蔗糖酶基因invGX序列的测定

用平板影印法将含有氨卞青霉素的LA平板上得到的转化子(每平板约300个菌落)分别影印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基(M9基本培养基[每升含Na₂HPO₄·7H₂O，12.8g；KH₂PO₄，3g；NaCl，0.5g；NH₄Cl，1g])的平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养3天。结果筛选到两个能在以蔗糖为唯一碳源的基本培养基上生长的克隆，本发明只涉及其中一个克隆，进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pINV，用限制性内切酶BamHI酶切pINV后，将获得的DNA片段与去磷酸化的经BamHI酶切的pUC19质粒进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌JM109中(转化方法为CaCl₂法)，在含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选转化子。结果共获得约200个转化子，用平板影印法将得到的转化子影印到含有氨卞青霉素的以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基的平板上，将平板倒置于37℃培养箱培养3天。结果筛选到一个能在以蔗糖为唯一碳源的M9基本培养基上生长的亚克隆。进一步提取该亚克隆的质粒DNA并将其命名为pINV2，用限制性内切酶BamHI完全酶切pINV2后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果pINV2除有一个2.7kb的载体片段外，还给出另外一条DNA片段，大小为6.4kb。于是，对pINV2进行测序。pINV2送交大连宝生物生物工程公司测定DNA核苷酸序列。

8)蔗糖酶基因invGX的核苷酸序列分析

用NCBI(National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的软件如ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对DNA序列进行分析。基因invGX的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)由1458个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO：1。其中，invGX基因的起始密码子为GTG，终止密码子为GTA。

5)蔗糖酶基因invGX编码的产物InvGX的氨基酸序列分析

用简单组件结构研究工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析糖厂废水污染土壤微生物中的蔗糖酶InvGX的组件结构，结果是自N端的第18-448位氨基酸为家族32糖基水解酶(glycosyl hydrolase)功能域。

6)蔗糖酶基因invGX的克隆和表达

使用上游引物5’-ACCCATGGCACCACCACCACCACCACCGTCTGCACCTTCCGTATCC-3’和下游引物5’-CACAAGCTTTCGGTCGGCGACAGGCTGAGCG-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增蔗糖酶基因invGX，用限制性内切酶NcoI和HindIII酶切蔗糖酶基因invGX后，与经NcoI和HindIII酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue中(转化方法为CaCl₂法)，涂布到含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上筛选克隆。进一步提取该克隆的质粒DNA并将其命名为pSE-INV，用限制性内切酶NcoI和HindIII完全酶切pSE-INV后，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析，结果pSE-INV除有一个4.1kb的载体片段外，还有一条大小为1458bp的目的DNA片段。

7)蔗糖酶InvGX酶活的测定

取20μl蔗糖酶InvGX粗酶液，加入500μl pH7.0值100mM的磷酸缓冲液)，与480μl 1％蔗糖(溶于水中)溶液混合，在37℃作用2小时后，加入800μl DNS溶液[DNS试剂配制：称取1克NaOH用约40ml ddH2O溶解，再称取1克二硝基水杨酸、0.2克苯酚、0.05克无水亚硫酸钠、20克四水酒石酸钾钠，将其溶解于约30ml ddH2O中，两种溶液混合，定容到100ml。]，放置沸水中反应5分钟，室温冷却，用分光光度计测吸光度OD530。吸光度测定值与不同含量的葡萄糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。

蔗糖酶酶活定义按国际酶活定义为每分钟产生葡萄糖的量。每毫升蔗糖酶粗酶液的酶活力为316个国际单位，说明本发明的编码糖基水解酶家族32的蔗糖酶能够降解蔗糖，可以应用于水解蔗糖生成葡萄糖和果糖。

Claims

1.一种编码蔗糖酶的基因，其特征在于：其核苷酸和蛋白质序列如下：

(1)核苷酸序列：

gagcgcgcgcgtggcgtttctgtccgagggcggcaccaccgaagtggtctgccgagcctggccgctggccctcgta

(2)蛋白质序列：

atvyprptsarvaflseggttevvcrawplalv

2.根据权利要求1所述的编码蔗糖酶的基因，其特征在于：所述的编码蔗糖酶的基因是将糖厂废水污染的土壤中提取微生物分离后，通过构建DNA文库和文库克隆的酶活性平板检测筛选法，得到新的编码蔗糖酶的基因。

3.根据权利要求1所述的编码蔗糖酶的基因，其特征在于：其功能等同变异体的核苷酸序列的有突变形式，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。

4.如权利要求1所述的编码蔗糖酶基因的表达载体及宿主细胞，其特征在于：所述的蔗糖酶基因的表达载体，及用于转化本发明基因的宿主，含有基因所述表达载体转化的原核细胞或真核细胞。

5.如权利要求1所述的编码蔗糖酶基因的采集以及测定的方法，包括以下步骤：(1)微生物总DNA的提取；(2)构建微生物宏基因组文库；(3)蔗糖酶基因序列的测定；(4)蔗糖酶基因的核苷酸序列分析；(5)蔗糖酶基因编码的产物氨基酸序列分析；(6)蔗糖酶基因invGX的克隆和表达；(7)蔗糖酶酶活的测定。

6.权利要求1所述的蛋白质在蔗糖降解和对含蔗糖材料的处理中的应用。