KR20080020832A - 벼에서 분리한 당전이효소 유전자를 포함하는 대장균을이용한 플라보놀 3-ｏ-배당체 생산 방법 - Google Patents

벼에서 분리한 당전이효소 유전자를 포함하는 대장균을이용한 플라보놀 3-ｏ-배당체 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 벼 (Oryza sativa)에서 분리한 당전이효소 (glycosyltransferase), 그의 유전자 및 그들의 제조방법, 상기 당전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물과 상기 형질전환 미생물을 이용한 플라보놀 (flavonol)의 3번 탄소의 수산기 대신에 한 분자의 글루코스 (glucose, 포도당)가 결합된 형태인 플라보놀 3-O-배당체 (flavonol 3-O-glucoside)의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 당전이효소의 제조방법은 대사산물의 원하는 위치에 당을 부착하는데 이용될 수 있고, 또한 이로부터 생산된 플라보놀 배당체 등은 세포 독성은 감소하고, 용해도와 화학적 안정성은 증가하여 생체 내 섭취 및 흡수가 용이할 뿐만 아니라 저장성도 우수하여 산업적으로 널리 적용될 수 있다.
플라보놀, 당전이효소, 대장균, 배당체, 생산 방법

Description

벼에서 분리한 당전이효소 유전자를 포함하는 대장균을 이용한 플라보놀 3-Ｏ-배당체 생산 방법 {Production method of Flavonol 3-O-glucoside by using E. Coli containing glycosyltransferase gene from Oryza sativa}
도 1 은 본 발명에 따른 당전이효소 유전자로 형질전환 된 대장균에서 자체적으로 생산된 플라보놀 배당체를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 벼 (Oryza sativa)에서 분리한 당전이효소 (glycosyltransferase), 그의 유전자 및 그들의 제조방법, 상기 당전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물과 상기 형질전환 미생물을 이용한 플라보놀 3-O-배당체 (flavonol 3-O-glucoside)의 생산 방법에 관한 것이다.
플라보노이드 (flavonoid)는 대표적인 식물의 2차 대사산물로 알려져 있으며, 항산화, 항균 및 항암 효과 등의 생리적 기능을 수행한다고 보고되고 있다. 플라보노이드의 3번 탄소에 수산기가 붙은 것을 플라보놀 (flavonol) 이라 하는데, 특히 플라보놀의 항산화제로서의 역할은 혈전을 제거하고, 혈압을 낮추어 혈액순환 이나 심장병 등의 예방에 효과가 있는 것으로 추정되고 있다.
당전이효소 (glycosyltransferase)는 주로 식물체의 2차 대사산물에 당을 결합시키는 단백질로, 해당 2차 대사산물의 독성을 감소시키고, 수용성 및 화학적 안정성을 크게 증가시켜 생체 내에서 저장이 용이한 상태로 만들어주는 역할을 한다.
플라보놀 배당체를 얻는 방법으로는 생물체에서 직접 추출하는 방법 외에, 화학적으로 합성하는 방법과 재조합 유전자로 생체전환 반응을 이용하는 방법 등이 있는데, 생물체에서 직접 추출하는 방법은 추출 수율의 문제 및 추출 후 폐기물 등의 처리에 난점이 있으며, 화학적으로 합성하는 방법은 대량 생산의 이점은 있으나 화학적 반응에 필요한 여러 가지 화학물질들의 환경오염 문제 및 임의로 당이 부착되는 위치가 결정된다는 결점이 있다.
그러나, 재조합 유전자로 대장균을 생체전환반응에 이용할 경우, 대량 생산이 가능 할뿐만 아니라, 유전자의 성질에 따라 특정위치에 당을 부착시킬 수 있으며, 대장균이 생산하는 당을 이용하여 배당체를 만들 수 있기 때문에 당의 확보에 필요한 부가적인 금전적 소비가 필요 없고, 환경오염 등의 문제로부터 자유로울 수 있다는 이점이 있다.
이에 본 발명자들은 생체전환반응으로 플라보놀의 배당체를 생산하는 기술을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 벼에서 당전이효소 유전자를 분리하고, 이를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 대장균을 제작한 다음, 이를 이용하여 발현된 재조합 단백질이 유리딘 이인산 글루코스 (Uridine diphophaste-glucose; UDP-glucose, UDP-포도당)를 당원으로 하고 플라보놀을 기질로 사용하여 글루코스 (포도당) 한 분자를 플라보놀에 결합시킨 형태의 플라보놀 3-O-배당체를 생산하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 (Oryza sativa)에서 분리한 당전이효소 (glycosyltransferase), 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 이들을 이용한 플라보놀 3-O-배당체 (flavonol 3-O-glucoside)의 생산 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 당전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물과 상기 형질전환 미생물을 이용한 플라보놀 3-O-배당체의 생산 방법을 제공하는데 있다.
상기의 목적을 이루기 위해 본 발명은 벼 (Oryza sativa)에서 분리하고, 서열번호 3의 염기 서열을 일부 또는 전부 포함하는 당전이효소 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 상기 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;
(2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도하고; 및
(3) 상기 효소 단백질을 분리 정제하는; 과정으로 이루어진 당전이효소의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 (2) 과정에 더하여 상기 당전이효소의 기질을 배지에 첨가하여 당을 부착하는 과정을 포함하는 당전이효소의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
(1) 상기 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;
(2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도하고; 및
(3) 효소의 기질을 배지에 첨가하여 당을 부착하는; 과정으로 이루어진 플라보놀 3-O-배당체의 생산 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 벼 (Oriza sativa)에서 분리한 당전이효소 유전자를 제공한다.
본 발명의 당전이효소 유전자는 서열번호 3의 염기 서열을 일부 또는 전부 포함하는 것을 특징으로 한다 (서열목록 참조).
또한, 본 발명은 상기 당전이효소 유전자를 얻는 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 벼에서 분리한 DNA를 주형으로 사용하고, 벼 유전체의 게놈 정보로 얻은 염기 서열을 기초로 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2 의 프라이머 중합효소 연쇄반응을 수행하는 과정으로 상기 당전이효소 유전자를 얻는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 클로닝 벡터를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 기존 클리닝 벡터인 pGEM-T easy 에 상기 당전이효소 유전자를 삽입한 재조합 클로닝 벡터인 pGEM-T easy (glycosyltransferase)를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼에서 분리한 당전이효소를 제공한다.
본 발명의 당전이효소는 서열번호 4의 아미노산 서열을 일부 또는 전부 포함하는 것을 특징으로 한다 (서열목록 참조).
또한, 본 발명은 상기 당전이효소 유전자를 포함하고 이를 미생물에서 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 기존 발현 벡터인 pGEX 에 상기 당전이효소 유전자를 삽입한 재조합 발현 벡터 pGEX (glycosyltransferase)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터 pGEX (glycosyltransferase)를 대장균 BL21 균주에 형질전환 시킨 대장균 형질전환체 Escherichia coli UGT6 를 제공한다 (기탁번호: KACC 95053P).
또한, 본 발명은 상기 당전이효소를 생산하는 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (1) 상기 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고; (2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도하고; 및 (3) 상기 효소 단백질을 분리 정제하는; 과정으로 이루어진 당전이효소의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 (2) 과정에 더하여 상기 당전이효소의 지질을 배지에 첨가하여 당을 부착하는 과정을 추가하는 당전이효소의 제조방법을 제공한다.
상기 (1) 과정에서 상기 재조합 발현 벡터로는 pGEX (glycosyltransferase)를 사용하는 것이 바람직하여, 상기 미생물로 상기 형질전환 대장균 BL21 pGEX (glycosyltransferase) 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 당전이효소의 제조방법을 통하여 형질전환 미생물에 원료 물질을 유용한 대사산물로 전환시키는 생산 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 (1) 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 미생물을 배양하고; (2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도하고; 및 (3) 상기 당전이효소의 기질을 배지에 첨가하여 당을 부착하는; 과정으로 이루어진 미생물로부터 직접 플라보놀 3-O-배당체의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 (3) 과정에서 기질로 플라보놀을 사용하고, 상기 배지에 추가되는 당원을, 바람직하게는 유리딘 이인산 글루코스 (UDP-글루코스)를 첨가하여 배당체를 얻는 플라보놀 3-O-배당체 생산 방법을 제공한다.
상기 (1) 과정에서는 상기 재조합 발현 벡터로 상기 재조합 발현 벡터 pGEX (glycosyltransferase)를 사용하는 것이 바람직하여, 상기 미생물로 상기 형질전환 대장균 BL21 pGEX (glycosyltransferase) 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
이외에도, 본 발명의 재조합 발현 벡터, 형질전환 미생물 및 이들을 이용한 생산방법 등을 응용하여 다양한 생물전환 공정을 진행할 수 있다. 이때 사용되는 기질은 플라보놀류를 포함하여 상기 당전이효소의 작용으로 인해 유용한 대사산물로 전환되는 모든 종류의 원료 물질 등을 포함하며, 생성되는 대사산물은 당 부착 이 필요한 모든 종류의 대사산물을 포함할 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 당전이효소 유전자의 분리
본 발명에 따른 당전이효소 (glycosyltransferase)를 분리하기 위하여, 벼 (Oryza sativa)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, 벼의 유전체의 염기 서열을 기초로 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머로 중합효소 연쇄반응 (Polymerase chain reaction; PCR)을 다음과 같이 실시하였다.
먼저 상기 균주의 DNA 및 상기 프라이머들을 Taq DNA 중합효소 (Taq DNA polymerase)와 함께 혼합하고, 중항효소 연쇄반응을 94℃ 60초, 55℃ 60초, 72℃ 90초의 과정으로 40회 반복하여 1.5 kbp 크기에 해당하는 당전이효소의 구조 유전자를 대량 증폭하였다.
이때 증폭된 DNA 조각은 클로닝 벡터인 pGEM easy 로 삽입하여 재조합 클로닝 벡터 pGEM easy(glycosyltransferase)를 제작하고, 그의 염기 서열 및 이로부터 유추한 아미노산 서열을 결정하였다.
실시예 2. 당전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 대장 균의 제작
본 발명에 따른 당전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제적하기 위하여, 상기 실시예 1 에서 클로닝한 당전이효소 유전자를 기존의 발현 벡터 pGEX 에 삽입하였다.
구체적으로, pGEM easy 에 삽입한 당전이효소를 주형으로 하여, 상기 프라이머와 Pfu 중합효소를 이용해 PCR을 실시한 후 제한효소 NotI 부위를 삽입하여 제작한 당전이효소의 프라이머와 Pfu 중합효소를 첨가하여 PCR을 실시하여 상기 당전이효소 유전자를 증폭시켰다. 여기에서 얻은 PCR 산물을 제한효소 Sma I 와 Not I 으로 미리 절단해 둔 기존 발현 벡터 pGEM 에 라이게이션하여 글루타티온 S-트랜스퍼레이스 태그 벡터 시스템 (Glutathion s-transferase tagging vector system) 을 이용하는 재조합 발현 벡터를 제작하였다.
상기 당전이효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 대장균 DH5α 균주에 형질전환 시키고, 이로부터 형질전환 대장균을 엠피실린을 포함하는 LB 배지를 사용하여 선발하였다. 상기에서 선발된 형질전환 대장균을 이용하여 플라스미드를 분리하고, 제한효소와 PCR 을 통하여 상기 재조합 발현 벡터에서 당전이효소 유전자의 유무를 확인하였다.
상기의 당전이효소 유전자가 삽입된 것으로 확인된 재조합 발현 벡터 pGEX (glycosyltransferase)는 다시 대장균 BL21 균주로 형질전환을 실시하여 당전이효소 유전자의 발현에 적합한 대장균 균주를 제작하였다.
본 발명의 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 대장균 균주는 Escherichia coli UGT6 라고 명명하고, 한국농업미생물자원센터에 2006년 8월 28일자로 기탁하였다 (기탁번호: KACC 95053P).
실시예 3. 당전이효소의 발현 및 정제
(1) 당전이효소 유전자의 발현
본 발명에 따른 당전이효소를 발현시키기 위하여, 상기 실시예 2 에서 얻은 당전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균을 전날 오후에 2 ㎖의 엠피실린을 포함하는 LB 배지에 접종하여, 37℃, 200 rpm의 배양기에서 12시간 배양하였다. 상기에서 얻은 세포 배양액은 다시 200 ㎖의 LB 배지에 섞어준 후, 600 ㎚ 파장에서 흡광도가 0.9 정도의 밀도에 이르도록 배양한 다음 IPTG 를 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하고, 18℃, 200 rpm에서 배양기로 24시간 더 배양하여 효소 단백질의 발현을 유도하였다.
(2) 재조합 당전이효소 단백질의 분리, 정제
상기 실시예 3 의 (1)에서 발현시킨 당전이효소를 분리, 정제하기 위하여, 대장균 배양액을 초음파 발생기로 약 10분 정도 처리하여 세포를 파쇄한 다음 원심분리기로 세포 찌거기와 세포 내용물을 분리하고, 상기에서 얻은 단백질 조추출액은 글루타티온 S-트랜스퍼레이스 태그 칼럼을 이용하여 재조합 단백질을 정제하였다.
실시예 4. 당전이효소 유전자의 발현 및 효소 특성 확인
(1) 당전이효소 유전자의 발현 확인
본 발명에 따른 당전이효소 유전자의 발현 정도를 확인하기 위하여, 상기 당전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균과 상기 유전자를 포함하지 아니하는 대장균을 각각 사용하여 상기 실시예 3 의 방법에 따라 재조합 효소 단백질을 획득한 다음 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 을 실시하고 이로부터 당전이효소 유전자가 발현되는지 여부를 확인하였다.
(2) 당전이효소의 지질과의 반응 확인
상기에서 얻은 재조합 효소의 특성을 조사하기 위하여, 재조합 당전이효소를 상기 실시예 3 의 방법으로 분리 정제하고 UDP-글루코스, MgCl2 및 플라보놀의 최종 농도가 각각 500 μM, 50 μM 및 100 μM 이 되도록 100 mM의 KH2PO4 완충용액을 첨가하여 총 500 ㎕가 맞추어 혼합한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기와 같이 얻은 반응물은 에틸아세테이트를 사용하여 두 번 추출하고, 상기 추출액은 진공 건조시킨 다음 메탄올에 용해하여 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 분석하였다.
실시예 5. 유전자 재조합 방법을 이용한 대장균으로부터 플라보노이드 배당체의 생산
본 발명에 따른 재조합 당전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균을 이용하여 플라보노이드 배당체 (flavonoid glycoside)를 생산하기 위하여, 상기 실시예 3-(1)의 방법에 따라 상기 당전이효소의 발현을 유도하고, 이때 플라보놀의 최종 농도가 100 μM이 되도록 첨가한 다음 28℃에서 배양기로 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양액은 에틸아세테이트를 이용하여 추출하고, 이 추출액은 건조시킨 후 메탄올에 녹여 TLC 및 HPLC를 통해 반응물을 분석하였다.
도 1 은 본 발명의 당전이효소 유전자로 형질전환 된 대장균에서 자체적으로 생산된 플라보놀 배당체를 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것으로, UDP-글루코스를 당원으로 하여 생산한 플라보놀 배당체 중 하나인 캠페롤 배당체 (Kaempferol glucoside)와 쿼르세틴 배당체 (Quercetin glucosied)의 HPLC 분석 결과이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 벼 (Oryza sativa)에서 분리한 당전이효소 (glycosyltransferase), 그의 유전자 및 그들의 제조방법, 상기 당전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물과 상기 형질전환 미생물을 이용한 플라보놀 배당체의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 당전이효소의 제조방법은 대사산물의 원하는 위치에 당을 부착하는데 이용될 수 있고, 또한 이로부터 생산된 플라보놀 배당체 등은 세포 독성은 감소하고, 용해도와 화학적 안정성은 증가하여 생체 내 섭취 및 흡수가 용이할 뿐만 아니라 저장성도 우수하여 산업적으로 널리 적용될 수 있다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Production method of Flavonol 3-O-glucoside by using E. Coli containing glycosyltransferase gene from Oryza sativa <130> P06-E263 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 atggccatgg tggagaag 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 tcagtcatgc acgggtgt 18 <210> 3 <211> 1425 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 atggccatgg tggagaagac ggtgctgctc tacccttgcc ctgcggtggg ccatctcaac 60 cccatggtgc agctcgccga ggccctcgtc cgccgcggtg tctccgtcac cctcgccgtc 120 gccgacccgc ctgacaaggg cgctgtgctg gccggcgcga tcgcccgcat cgccgccgtg 180 tgcccctcca tcggtgtccg cctccttccc atcccgtcct gcgagggcaa gacgtactcc 240 caccccgtca tgtggatcgt cgacgcgctc cgcctcgcca accccgtgct ccgggagctc 300 ctgcgctcgt tccctgctgc cgtcgacgct ctcgtggtcg acatgttctg catcgacgcg 360 ctcgacgtcg ccgccgagct cgccgtcccg gcctacatgt tctacccgtc tgcggccagc 420 gacctagcga tctacctcca ggttccgcat gtcgcccgct cggctccatc ctctttcaag 480 gacatggccg acacggtgct gagcttctcc ggcgtgccga cgattcgcgc gctggacatg 540 ccggacacca tgcaagacag ggagagcgac gtgggcacga cccggattca ccactgctcc 600 cggatggctg aagcgagagg cattctggtg aacagcttcg attggttgga gacgagggcc 660 ctgaaagcga tccgcggcgg cctctgcctg ccgtccggcc gctcggtgcc cgcgatctac 720 tgcgttgggc cgctggtcga tgggggcaag ctcaaggaga acgacgcgcg gcacgagtgc 780 ctcgagtggc tggaccgcca accgaagcag agcgtggtgt tcctctgctt cgggagcagg 840 ggcactttct cggtgtcgca gctgagcgag atggctcggg ggatagagaa ctccggacac 900 agattcctgt gggctgtgcg tagcaacctc ggcgaggtgg acttggaggc gttgtttccg 960 gaagggttct tggagaggac ccaaggcagg ggattcgtcg tgaagaactg ggcgccgcag 1020 tcggcggtgc tgcagcacgg cgccgtcggc gcgttcgtga cgcactgcgg gtggaactcg 1080 tcgctggagg cgatcatgtc cggcgtgccg atgatctgct ggccgctgta cgcggagcag 1140 aggctgaaca aagcgcacct ggtggaggag atgaagcttg gggtgttggt ggagggctac 1200 gacggcgagc ttgttaaggc cgacgagctg gagaccaagg ttcggctggt gatggagtcg 1260 gaggaaggga agaggcttag ggagaggtcg gcgatggcca aggagatggc tgctgatgcc 1320 gtcaaagatg ggggttcgtc tgacatggcg ttcgccgaat tcctgaacaa tttggggacg 1380 aacaacgtga aaagcggccc gagagataca cccgtgcatg actga 1425 <210> 4 <211> 474 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 4 Met Ala Met Val Glu Lys Thr Val Leu Leu Tyr Pro Cys Pro Ala Val 1 5 10 15 Gly His Leu Asn Pro Met Val Gln Leu Ala Glu Ala Leu Val Arg Arg 20 25 30 Gly Val Ser Val Thr Leu Ala Val Ala Asp Pro Pro Asp Lys Gly Ala 35 40 45 Val Leu Ala Gly Ala Ile Ala Arg Ile Ala Ala Val Cys Pro Ser Ile 50 55 60 Gly Val Arg Leu Leu Pro Ile Pro Ser Cys Glu Gly Lys Thr Tyr Ser 65 70 75 80 His Pro Val Met Trp Ile Val Asp Ala Leu Arg Leu Ala Asn Pro Val 85 90 95 Leu Arg Glu Leu Leu Arg Ser Phe Pro Ala Ala Val Asp Ala Leu Val 100 105 110 Val Asp Met Phe Cys Ile Asp Ala Leu Asp Val Ala Ala Glu Leu Ala 115 120 125 Val Pro Ala Tyr Met Phe Tyr Pro Ser Ala Ala Ser Asp Leu Ala Ile 130 135 140 Tyr Leu Gln Val Pro His Val Ala Arg Ser Ala Pro Ser Ser Phe Lys 145 150 155 160 Asp Met Ala Asp Thr Val Leu Ser Phe Ser Gly Val Pro Thr Ile Arg 165 170 175 Ala Leu Asp Met Pro Asp Thr Met Gln Asp Arg Glu Ser Asp Val Gly 180 185 190 Thr Thr Arg Ile His His Cys Ser Arg Met Ala Glu Ala Arg Gly Ile 195 200 205 Leu Val Asn Ser Phe Asp Trp Leu Glu Thr Arg Ala Leu Lys Ala Ile 210 215 220 Arg Gly Gly Leu Cys Leu Pro Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Ile Tyr 225 230 235 240 Cys Val Gly Pro Leu Val Asp Gly Gly Lys Leu Lys Glu Asn Asp Ala 245 250 255 Arg His Glu Cys Leu Glu Trp Leu Asp Arg Gln Pro Lys Gln Ser Val 260 265 270 Val Phe Leu Cys Phe Gly Ser Arg Gly Thr Phe Ser Val Ser Gln Leu 275 280 285 Ser Glu Met Ala Arg Gly Ile Glu Asn Ser Gly His Arg Phe Leu Trp 290 295 300 Ala Val Arg Ser Asn Leu Gly Glu Val Asp Leu Glu Ala Leu Phe Pro 305 310 315 320 Glu Gly Phe Leu Glu Arg Thr Gln Gly Arg Gly Phe Val Val Lys Asn 325 330 335 Trp Ala Pro Gln Ser Ala Val Leu Gln His Gly Ala Val Gly Ala Phe 340 345 350 Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Ser Leu Glu Ala Ile Met Ser Gly 355 360 365 Val Pro Met Ile Cys Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gln Arg Leu Asn Lys 370 375 380 Ala His Leu Val Glu Glu Met Lys Leu Gly Val Leu Val Glu Gly Tyr 385 390 395 400 Asp Gly Glu Leu Val Lys Ala Asp Glu Leu Glu Thr Lys Val Arg Leu 405 410 415 Val Met Glu Ser Glu Glu Gly Lys Arg Leu Arg Glu Arg Ser Ala Met 420 425 430 Ala Lys Glu Met Ala Ala Asp Ala Val Lys Asp Gly Gly Ser Ser Asp 435 440 445 Met Ala Phe Ala Glu Phe Leu Asn Asn Leu Gly Thr Asn Asn Val Lys 450 455 460 Ser Gly Pro Arg Asp Thr Pro Val His Asp 465 470

Claims (11)

  1. 벼 (Oryza sativa)에서 분리한 당전이효소 (glycosyltransferase) 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서, 서열번호 3의 염기 서열을 일부 또는 전부 포함하는 것을 특징으로 하는 당전이효소 유전자.
  3. 제 1 항의 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pGEX (Glycosyltransferase).
  4. 제 3 항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균 Escherichia coli UGT6 균주 (기탁번호: KACC 95053P).
  5. (1) 제 1 항의 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고;
    (2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도하고; 및
    (3) 상기 효소 단백질을 분리 정제하는; 과정으로 이루어진 당전이효소의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 (2) 과정에 더하여 상기 당전이효소의 기질을 배지에 첨가하여 당을 부착하는 과정을 추가하는 것을 특징으로 하는 당전이효소의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 기질로 플라보놀을 사용하고, 상기 당원으로는 글루코스 (glucose, 포도당)를 사용하여 플라보놀 3-O-배당체 (flavonol 3-O-glucoside)를 얻는 것을 특징으로 하는 당전이효소의 제조방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항에 있어서,
    상기 (1) 과정에서 상기 재조합 발현 벡터로는 제 3 항의 재조합 발현 벡터를 사용하고, 상기 미생물로는 제 4 항의 형질전환된 대장균을 사용하는 것을 특징으로 하는 당전이효소의 제조방법.
  9. (1) 당전이효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 혈질전환된 미생물을 배양하고;
    (2) 상기 효소 단백질의 발현을 유도하고; 및
    (3) 상기 효소의 기질을 배지에 첨가하여 당을 부착하는l 과정으로 이루어진 배당체의 생산방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 (3) 과정에서 기질로 플라보놀을 사용하고, 상기 당원으로 글루코스 (포도당)를 첨가하여 플라보놀 3-O-배당체 (flavonol 3-O-glucoside)를 얻는 것을 특징으로 하는 배당체의 생산방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    상기 (1) 과정에서 상기 재조합 발현 벡터는 제 3 항의 재조합 발현 벡터를 사용하고, 상기 미생물은 제 4 항의 형질전환 대장균을 사용하는 것을 특징으로 하는 배당체의 생산방법.
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