KR101157116B1

KR101157116B1 - 토마토로부터 유래한 3’-ｏ-메틸전이효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 이들을 이용하여 만든 미생물로부터 크리소에리올, 아이소람네틴을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101157116B1
Application number: KR1020100043449A
Authority: KR
Inventors: 김대환; 박용배; 김기철; 정홍래; 김중범; 강석호
Original assignee: 경기도
Priority date: 2010-05-10
Filing date: 2010-05-10
Publication date: 2012-06-22
Also published as: KR20110123949A

Abstract

본 발명은 토마토(Lycopersicon esculentum Mill) 로부터 분리한 3’-O-메틸전이효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 상기 3’-O-메틸전이효소를 발현하는 미생물을 이용한 크리소에리올 및 아이소람네틴의 생산 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 루테올린, 퀘르세틴으로부터 크리소에리올, 아이소람네틴을 생산하는 3’-O-메틸전이효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법, 상기 3’-O-메틸전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환된 대장균, 그리고 상기 형질전환 대장균을 이용하여 크리소에리올, 아이소람네틴을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 3’-O-메틸전이효소 등을 이용한 크리소에리올, 아이소람네틴 생산밥법은 기질로부터 부가가치가 높은 대사산물을 대량 얻을 수 있는 매우 경제적이고 효과적인 방법으로 산업적으로 널리 사용될 수 있다.

Description

토마토로부터 유래한 3’-Ｏ-메틸전이효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 이들을 이용하여 만든 미생물로부터 크리소에리올, 아이소람네틴을 생산하는 방법{3'Ｏ-Methyltransferse, Gene thereof and Production method of chrisoeriol and isorhamnetin by using the same}

본 발명은 토마토(Lycopersicon esculentum Mill)에서 분리한 3’-O-메틸전이효소 및 그 재조합 유전자를 이용한 크리소에리올 및 아이소람네틴 생산방법에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 식물체에서 얻은 루테올린(Luteolin), 퀘르세틴(Quercetin)으로부터 지질 농도 저하 활성(lipidemic activity)을 갖는 크리소에리올(Chrysoeriol), 진해,항이뇨 효과가 있는 아이소람네틴(Isorhamnetin)을 생산하는데 관여하는 3’-O-메틸전이효소 및 그 재조합 유전자를 이용한 크리소에리올, 아이소람네틴 생산방법에 관한 발명이다.

국내 뿐 아니라 해외에서도 오랫동안 동물 및 사람에게 있어서 지질대사 개선, 지방간형성 억제, 심장병 예방, 당뇨병 예방 등에 효능이 있는 식물체 분말 및 추출물에 관해 연구해 왔다.

이들은 주로 식물체에 포함된 바이오후라보노이드 물질 및 폴리페놀계 물질 등에 의한 것이다. 바이오후라보노이드 물질들과 폴리페놀 물질은 일반적으로 강한 항산화제로 작용하여 동물이나 사람의 몸속에서 대사 과정 중에 발생하는 유해한 활성산소를 중화시키는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 이들의 섭취가 이에 따라 항균작용, 항암작용, 항바이러스작용,항염증작용, 심장병예방, 혈액순환개선, 간기능개선, 당뇨병예방에 도움이 된다고 알려져 있다(①Pier-Giorgio pietta. "Flavonoids as Antioxidants." J. Nat. Prod. 2000, 63, 1035~1042; ②Hertog, M. G. L.; Katan, M. B. " In Flavonoids in health and Disease.": Rice-Evans, C.A., Packer, L., Eds.; Marcel dekker: New Yourk, 1998, 447~467; ③Koo Hui Miean, Suhaila Mohamed. "Flavonoid (myricetin, quercetin, Kaempferol, Luteolin, and Apigenin) Content of Edible Tropical Plants." J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 3106~3112; ④Yoshida, M.; Sakai, T.; Hosokawa, N.;Marui, N.; Matsumoto, K.; Akihiro, F.; Nishino H.; Aoije, A. "The effect of quercetin on cell cycle progression and growth of human gastric cancer cells." FEBS Lett. 1990, 10~13; ⑤Hollman, P. C. H.; Van Trijp, J. M. P.;Buysman, M. N. C. P.; Gaag, M. S. v.d.; Mengelers, M. J. B.; De vries, J. H. M.; Katan, M. B. "Relative bioavailability of the antioxidant flavonoid quercetin from various foods in man." FEBS Lett. 1997,418,152~156;⑥Larson, R. L. "The antioxidants of higher plants." phytochemistry 1988, 4, 969~978).

따라서, 이들 바이오후라보노이드나 폴리페놀계 물질을 섭취하면 가축에게 있어서 병원균의 생육 억제, 질병 유발 바이러스 억제, 항염증작용(면역성증가), 혈액순환개선, 심장 및 간기능 개선에 효과가 있을 것이다.

루테올린과 퀘르세틴은 많은 종류의 식물이 만드는 물질로 이것에 3’ 위치에 메틸기를 첨가함으로써 고부가가치가 있는 크리소에리올과 아이소람네틴을 각각 만들게 된다. 현재까지 크리소에리올과 아이소람네틴은 은행나무 등의 식물에서 소량 존재하는 것으로 알려져 있고, 이를 생산하기 위하여 추출하거나 화학적으로 합성하여 상품화하였다. 그러나 개발한 방법을 이용하여 많은 식물에 다량 존재하는 루테올린과 퀘르세틴으로부터 유전자재조합법에 의해 발현된 효소를 이용하여 대량으로 만들어 낼 수 있게 되었다.

본 발명은 상기한 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 크리소에리올, 아이소람네틴 이라는 물질을 생산하는데 관여하는 단백질 및 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 이용하여 크리소에리올 및 아이소람네틴을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 3’-O-메틸전이효소 단백질을 제공한다.

본 발명의 전이효소 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 및 이들 아미노산 서열을 가진 단백질이 표시하는 3’-O-메틸전이효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1 이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 3’-O-메틸전이효소를 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 3’-O-메틸전이효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 유전자 서열로서는 서열번호 2으로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 2의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 3’-O-메틸전이효소를 코딩하는 변이 3’-O-메틸전이효소 유전자도 본 발명에 관한 3’-O-메틸전이효소 유전자에 포함된다.

또한 본 발명은 루테올린과 퀘르세틴에 본 발명의 효소를 처리하여 크리소에리올 과 아이소람네틴을 생산하는 방법을 제공한다.

또, 본 발명에는, 상기 3’-O-메틸전이효소 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게되는 배양물로부터 3’-O-메틸전이효소를 분리하는 것을 특징으로 하는 3’-O-메틸전이효소의 제조방법이 포함된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 3’-O-메틸전이효소 유전자는 토마토로부터 분리된 것이다. 먼저, 3’-O-메틸전이효소 유전자를 가진 토마토부터 염색체 DNA를 취득한다. 다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 토마토의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 행하여, 3’-O-메틸전이효소 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR 증폭 단편은 토마토의 3’-O-메틸전이효소 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시 (stringency)제어를 용이하게 한다. 상기의 PCR 증폭 단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 3’-O-메틸전이효소 유전자를 선발한다 (Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 3’-O-메틸전이효소 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법에 의해 염기서열을 결정한 후에는, 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써 본 발명의 전체 유전자를 얻는 것이 가능하다.

서열번호 2에는 본 발명의 3’-O-메틸전이효소 유전자의 염기서열을 서열번호 1에는 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열을 표시한다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주 속에 도입함으로써 얻게 된다. 예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주 속에서 자율복제 가능한 동시에, 프로모터, 3’-O-메틸전이효소 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pGEX 5X-2를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

본 발명에 관한 3’-O-메틸전이효소의 제조는, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 3’-O-메틸전이효소를 생성 축적시켜, 배양물로부터 효소를 취득함으로써 행하여진다.

3’-O-메틸전이효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피 등을 단독으로 또는 조합함으로써 행할 수 있다.

본 발명은 산업적으로 유용한 3’-O-메틸전이효소를 제조하기 위하여 토마토의 유전자로부터 3’-O-메틸전이효소를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 전기 유전자의 염기서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한다.

본 발명의 3’-O-메틸전이효소는 루테올린을 크리소에리올으로, 퀘르세틴을 아이소람네틴으로 전환시킬 수 있는 능력을 갖는 3’-O-메틸전이효소를 의미한다.

본 발명자들은 토마토(Lycopersicon esculentum Mill) 유전체의 게놈을 검색하여 3’-O-메틸전이효소와 유사성이 높은 유전자를 분리하였다. 분리된 유전자를 유전자 재조합법에 의해 GST(Glutathione S-transferase) fusion시스템을 이용하여 단백질을 발현한 후에 그 발현된 효소를 이용하여 루테올린을 크리소에리올으로, 퀘르세틴을 아이소람네틴으로 전환함을 확인하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 토마토(Lycopersicon esculentum Mill) 에서 분리한 3’-O-메틸전이효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법, 상기 3’-O-메틸전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물과 상기 형질전환 미생물을 이용하여 크리소에리올 및 아이소람네틴을 대량 생산하는 것으로서, 본 발명의 대량생산과정은 기질로부터 부가가치가 높은 대사산물을 대량 얻을 수 있는 매우 경제적이고 효과적인 방법으로 산업적으로 널리 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 3’-O-메틸전이효소 유전자로 형질전환 된 대장균에서 루테올린과 퀘르세틴을 이용하여 자체적으로 생산한 크리소에리올과 아이소람네틴을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 pGEX 벡터의 벡터 맵을 나타낸다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

실시예1 : 메틸전이효소 유전자의 분리

60일을 키운 토마토를 자외선(UV)하에서 1시간 처리한 후 이것에서 분리한 total RNA를 이용하여 oligo dT를 시발물질(primer)로 하여 역전사를 실시하였다.

이역전사체를 주형으로 하여 콩유전체의 게놈에서 얻은 염기 서열을 바탕으로 만든 프라이머를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 실시하였다. 이 때 사용한 염기 서열은 다음과 같다.

프라이머 1(서열번호 3, forward primer); 5’-AACATTTTCTTGTTCATCTCTAAGTTC-3’

프라이머 2(서열번호 4, reverse primer); 5’-ATCTACTTGCAGAATTCCATGACC-3’

PCR은 텍 DNA폴리머라제(Taq DNA Polymerase, Qiagen)를 위의 역전사체와 프라이머들을 혼합하여 94℃ 60초, 55℃ 60초, 72℃ 90초의 사이클을 35회 반복하여 1,095bp에 해당하는 메틸전이효소 유전자의 구조유전자를 대량 증폭하였다. 증폭된 DNA는 클로닝 벡터인 pGEM-T easy(Promega)로 옮겨서 염기 서열을 결정하였다.

실시예 2: 3’-O- 메틸전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 대장균의 제작

본 발명에 따른 3’-O-메틸전이효소를 생산할 수 있는 재조합 발현 벡터를 재작하기 위하여, 상기 실시예1에서 클로닝한 3’-O-메틸전이효소 유전자를 기존의 발현 벡터 pGEX 5X-2(GE Health Care Life Science, 스웨덴)에 삽입하였다.

구체적으로, pGEM-T easy 에 삽입한 3’-O-메틸전이효소를 주형으로 하여, 상기 프라이머와 pfu 중합효소를 이용해 PCR을 실시한 후 제한효소 Not I 부위를 삽입하여 제작한 당전이효소의 프라이머와 pfu 중합효소를 참가하여 PCR을 실시하여 상기 3’-O-메틸전이효소 유전자를 증폭시켰다. 여기에서 얻은 PCR산물을 제한효소 Sma I 과 Not I 으로 미리 절단해 둔 기존 발현 벡터 pGEX 5X-2(도 2)에 라이게이션하여 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 태그 벡터 시스템(Glutathion S-transferase tagging vector system)을 이용하는 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

상기 3’-O-메틸전이효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터는 대장균 DH5a 균주에 형질전환시키고, 이로부터 형질전환 대장균을 엠피실린을 포함하는 LB배지를 사용하여 선별하였다. 상기에서 선별된 형질전환 대장균을 이용하여 플라스미드를 분리하고, 제한효소와 PCR 을 통하여 상기 재조합 발현 벡터에서 3’-O-메틸전이효소 유전자의 유무를 확인하였다.

상기의 메틸전이효소 유전자가 삽입된 것으로 확인된 재조합 발현 벡터 PGEX 5X-2 는 다시 대장균 BL21 균주로 형질전환을 실시하여 3’-O-메틸전이효소유전자의 발현에 적합한 대장균 균주를 제작하였다.

실시예 3: 3’-O- 메틸전이효소의 발현 및 정제

1.메틸전이효소 유전자의 발현

본 발명에 따른 3’-O-메틸전이효소를 발현시키기 위하여, 상기 실시예 2에서 얻은 3’-O-메틸전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균을 전날 오후에 2ml의 엠피실린을 포함하는 LB배지에 접종하여, 37℃ , 200rpm의 배양기에서 12시간 배양하였다. 상기에서 얻은 세포 배양액은 다시 200ml 의 LB 배지에 섞어준 후, 600nm 파장에서 흡광도가 0.9 정도의 밀도에 이르도록 배양한 다음 IPTG 를 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하고, 18℃ , 200 rpm에서 배양기로 24시간 더 배양하여 효소 단백질의 발현을 유도하였다.

2.재조합 3’-O-메틸전이효소 단백질의 분리, 정제

상기 실시예 3의 1에서 발현시킨 3’-O-메틸전이효소를 분리, 정제하기 위하여, 대장균 배양액을 초음파발생기로 약 10분 정도 처리하여 세포를 파쇄한 다음 원심분리기로 세포 찌거기와 세포 내용물을 분리하고, 상기에서 얻은 단백질 조추출액은 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈 태그 컬럼을 이용하여 재조합 단백질을 정제하였다.

실시예4: 3’-O-메틸전이효소 유전자의 발현 및 효소 특성 확인

1.3’-O- 메틸전이효소 유전자의 발현 확인

본 발명에 따른 3’-O-메틸전이효소 유전자의 발현 정도를 확인하기 위하여, 상기 3’-O-메틸전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균과 상기 유전자를 포함하지 아니하는 대장균을 각각 사용하여 상기 실시예3의 방법에 따라 재조합효소 단백질을 획득한 다음 도데실 황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 을 실시하고 이로부터 메틸전이효소 유전자가 발현되는지 여부를 확인하였다.

2.3’-O-메틸전이효소의 기질과의 반응 확인

상기에서 얻은 재조합 효소의 특성을 조사하기 위햐여, 재조합 3’-O-메틸전이효소를 상기 실시예 3의 방법으로 분리정제하고 SAM, MgCl₂ 및 기질인 플라보노이드의 최종농도가 각각 250uM, 5mM, 50uM 이 되도록 KH₂PO₄를 최종 20mM로 맞추어 완충용액을 첨가하여 총 500ul로 맞추어 혼합한 다음, 37℃에서 1시간 반응 시켰다.

상기와 같이 얻은 반응물은 에틸아세테이트를 사용하여 두 번 추출하고, 상기 추출액은 진공 건조시킨 다음 메틸알코올에 용해하여 HPLC 를 통해 분석하였다.

실시예 5:유전자 재조합 방법을 이용한 대장균으로부터 크리소에리올, 아이소람네틴의 생산

본 발명에 따른 재조합 3’-O-메틸전이효소 유전자를 포함하는 형질전환 대장균을 이용하여 크리소에리올과 아이소람네틴을 생산하기 위하여, 상가 실시예 3-1 의 방법에 따라 상기 3’-O-메틸전이효소의 발현을 유도하고, 이때 기질인 루테올린과 퀘르세틴의 최종 농도가 100uM이 되도록 첨가한 다음 30℃에서 배양기로 24시간 동안 배양하였다.

상기 배양액은 에틸아세티이트를 이용하여 추출하고, 이 추출액은 건조시킨 후 메틸알코올에 녹여 TLC 및 HPLC 를 통해 반응물을 분석하였다.

도 1은 본 발명의 3’-O-메틸전이효소 유전자로 형질전환된 대장균에서 자체적으로 생산된 크리소에리올과 아이소람네틴을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것으로, 기질인 루테올린과 퀘르세틴을 이용하고 SAM을 메틸원으로 하여 생산한 크리소에리올과 아이소람네틴의 HPLC 분석 결과이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 3'O-메틸전이효소를 이용하여 루테올린 또는 퀘르세틴으로부터 크리소에리올 또는 아이소람네틴을 합성하는 방법.
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