MX2013004055A - Nuevas fucosiltransferasas y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos de Akkermansia muciniphíla y de Bacteroides fragilis que codifican nuevas alfa-1,3-fucosiltransferasas o que corresponden a ellas. Usos y métodos para utilizar estas alfa-1,3-fucosiltransferasas en la generación de productos fucosilados, que pueden ser oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lípidos, y que en particular pueden ser la 3-fucosil-lactosa.

Description

NUEVAS FUC0S1LTRANSFERASAS Y SUS APLICACIONES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con nuevas fucosiltransferasas y con sus aplicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para que una variedad de (gluco)proteínas, de (gluco)lípidos y de oligosacáridos presenten actividad biológica, es imprescindible que haya presentes estructuras fucosiladas particulares. Por ejemplo, para la acción de numerosos mecanismos de reconocimiento intercelulares, es necesario que haya un oligosacárido fucosilado presente que pueda unirse a las moléculas de adhesión en las células, tales como la L-selectina. Como consecuencia, determinadas estructuras en las células deben comprender hidratos de carbono fucosilados. En otro ejemplo, hay estructuras fucosiladas que constituyen el sistema que está asociado al grupo sanguíneo ABO. Más aun, las (gluco)prote(nas terapéuticas son los reactivos farmacéuticos que se han desarrollado con mayor velocidad, y sus propiedades farmacocinéticas y su estabilidad se atribuyen a los glucanos que comprenden.

Debido a la naturaleza compleja de los glucoconjugados y a sus propiedades químicas inherentes, su síntesis química resulta complicada y presenta numerosas dificultades. A diferencia de las proteínas y los ácidos nucleicos, para cuya elaboración hay sintetizadores automatizados disponibles comercialmente, los glucanos, y particularmente los glucoconjugados, (todavía) no pueden ser sintetizados con sistemas comerciales generalizados. Aparte de la necesidad de controlar la estereoquímica, subsiste la dificultad asociada a la formación de enlaces específicos.

A causa del carácter complejo que caracteriza a la síntesis enzimática/química de los glucoconjugados, en abordajes recientes se ha recurrido al uso de glucosiltransferasas para efectuar la síntesis enzimática de (gluco)proteínas y (gluco)lípidos que comprenden residuos de oligosacáridos.

Las fucosiltransferasas son enzimas que pertenecen a la familia de las glucosiltransferasas y que presentan una expresión amplia entre los vertebrados, los invertebrados, las plantas y las bacterias. Catalizan la transferencia de un residuo de fucosa desde un donante, que generalmente es la fucosa con difosfato de guanoslna (GDP-fucosa), hasta un aceptor, que puede ser un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido. Los sustratos aceptores fucosilados participan en diversos procesos biológicos y patológicos.

Se han identificado numerosas fucosiltransferasas, por ejemplo, en las bacterias Helicobacter pylori, Escherichia coli y Salmonella entérica, en los mamíferos, en Caenorhab itis elegans, en Schistosoma mansoni y en las plantas. Sobre la base del sitio en el que se agrega la fucosa, las fucosiltransferasas se clasifican como alfa-1 ,2-fucosiltransferasas, alfa-1 ,3/4-fucos¡ltransferasas u O-fucosiltransferasas.

En los mamíferos, la GDP-fucosa es sintetizada en el citoplasma, tanto mediante un proceso de síntesis de novo como a través de una vía de captura. En la síntesis de novo, la GDP-manosa es convertida en GDP-fucosa merced a la acción de dos enzimas, mientras que en la vía de captura se utiliza la fucosa que se encuentra libre en el citosol como sustrato. En el interior de las células, la GDPrfucosa se concentra en vesículas y es reconocida por las fucosiltransferasas como sustrato donante.

Debido a que la actividad biológica de diversos oligosacáridos, (gluco)proteínas y (gluco)lípidos que son importantes desde el punto de vista comercial depende de la presencia de residuos de fucosa particulares, puede concluirse que en este ámbito existe la necesidad de métodos con los que puedan sintetizarse o producirse de manera eficiente glucoconjugados que comprendan los residuos de oligosacáridos deseados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Como consecuencia, un objetivo de la presente invención fue proveer herramientas y métodos con los que pudieran producirse sustratos fucosilados de manera eficiente, rápida y económica, con un rendimiento elevado de los sustratos deseados.

De acuerdo con la invención, el objetivo mencionado se cumple al proveerse, entre otros elementos, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiitransferasa y que comprende una secuencia que se selecciona del siguiente grupo, o que consiste en ella: (a) SEQ ID N° 1 , 3 ó 5 del listado de secuencias adjunto; (b) una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de SEQ ID N° 1 , 3 ó 5; y (c) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que se definen en a) y en b) o con sus cadenas complementarias.

Los polinucleótidos de acuerdo con la invención corresponden a fucosiltransferasas de las especies Akkermansia muciniphila y Bacteroides fragilis. Más precisamente, en SEQ ID N° 1 se representa la secuencia polinucleotídica de una fucosiitransferasa de Akkermansia muciniphila que fue identificada recientemente, y en SEQ ID N° 3 y 5 se representan las secuencias polinucleotídicas de dos fucosiltransferasas de Bacteroides fragilis que fueron identificadas recientemente.

Las fucosiltransferasas que se han identificado recientemente presentan efectos sorprendentes, ya que con ellas pueden ponerse en práctica reacciones que no serían posibles en la naturaleza. En el contexto de la presente invención, se ha determinado que las alfa-1 ,3-fucosiltransfe-rasas que se han identificado pueden emplear la lactosa como sustrato, de manera tal de producir oligosacáridos fucosilados, particularmente 3-fucosil-lactosa. Hasta la fecha, no se habla demostrado que ninguna de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas conocidas que se habían aislado a partir de bacterias pudiera emplear la lactosa como sustrato natural para la producción de fucosil-lactosa. De esta manera, la utilidad de las fucosiltransferasas que se han identificado recientemente en la producción de oligosacáridos fucosilados es sorprendente, por lo que representan una herramienta excelente, por ejemplo, para producir aquellos oligosacáridos que son propios- de la leche humana (HMO), tales como la fucosil-lactosa, de una manera sencilla, eficiente y económica. En la actualidad, el grupo de los HMO abarca más de 80 compuestos cuyas estructuras han sido caracterizadas. Estos compuestos representan una clase de oligosacáridos complejos que operan como prebióticos. Adicionalmente, la homología estructural que presentan los HMO con diversos epitopes epiteliales les confiere utilidad como agentes para proveer protección contra diversos patógenos bacterianos. En el tracto gastrointestinal de los lactantes, los HMÓ pueden servir como nutrientes selectivos para determinadas cepas de bacterias, por lo que pueden ser útiles para favorecer del desarrollo de una microbiota intestinal única.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS A partir de las formas de realización y los dibujos adjuntos, han de poder inferirse otras ventajas propias de la presente invención.

Es evidente que las características que se mencionaron con anterioridad y las características que se detallen más adelante podrán estar presentes no solamente en las combinaciones que se indiquen, sino que también podrán estar presentes en otras combinaciones o por sí solas, sin que esto constituya una desviación fuera del alcance de la presente invención.

Diversas formas de realización de la invención se explican con mayor detalle en la descripción más adelante y se ilustran en las figuras, que se describen a continuación.

En la figura 1 se ilustra la expresión de Amuc0760co a partir de pDEST14-amuc0760co en Escherichia coli JM109(DE3). Para analizarla, se separaron 15 pg de la proteína soluble del extracto en bruto por medio de una PAGE en SDS al 15% y se aplicó una coloración con azul brillante de Coomassie.

En la figura 2 se ilustra la detección de Amuc0760co con una marca de His por medio de una transferencia Western.

En la figura 3A se provee un mapa del vector pDEST14-amuc0760co, que comprendió el gen amuc0760co, que codificaba la nueva alfa-1 ,3-fucosiltransferasa Amuc0760co y que había sido sometido a una optimización a nivel de los codones. La clonación se basó en una reacción Gateway en la que se empleó el vector pDEST14 (de Invitrogen).

En la figura 3B se representa un mapa del vector pDEST14-fucT6, que comprendió el gen fucT6 de Bacteroides fragilis, que codificaba la nueva alfa-1 ,3-fucosiltransferasa FucT6. Esta clonación también se basó en una reacción Gateway en la que se empleó el vector pDEST14 (de Invitrogen, Alemania).

En la figura 3C se provee un mapa del vector pDEST14-fucT7, que comprendió el gen fucT7 de Bacteroides fragilis, que codificaba la nueva alfa-1 ,3-fucosiltransferasa FucT7. Una vez más, la clonación se basó en una reacción Gateway en la que se empleó el vector pDEST14 (de Invitrogen, Alemania).

En la figura 4A se provee un mapa del vector pACIC-amuc0760co, que comprendió el gen amuc0760co, que codificaba la nueva alfa-1 ,3-fucosiltransferasa Amuc0760co y que había sido sometido a una optimización a nivel de los codones. La clonación se basó en una reacción Gateway en la que se empleó el vector pACICDuet-1 (de Novagen) y una restricción con Ncol/Pstl.

En la figura 4B se representa un mapa del vector pACIC-fucT6, que comprendió el gen fucT6 de Bacteroides fragilis, que codificaba la nueva alfa-1 , 3-fucosiltransferasa FucT6 y que había sido sometido a una optimización a nivel de los codones. En este caso, la clonación se basó en una reacción Gateway en la que se empleó el vector pACICDuet-1 1 (de Novagen, Reino Unido) y una restricción con Ncol/BamHI.

En la figura 4C se provee un mapa del vector pACIC-fucT7, que comprendió el gen fucT7 de Bacteroides fragilis, que codificaba la nueva alfa-1 ,3-fucosiltransferasa FucT7 y que había sido sometido a una optimización a nivel de los codones. La clonación de este gen se basó en una reacción Gateway en la que se empleó el vector pACICDuet-1 (de Novagen, Reino Unido) y una restricción con Ncol/EcoRI.

En la figura 5 se ilustra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del gen amuc0760co y de la proteína Amuc0760co, respectivamente.

En la figura 6 se ilustra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del gen fucT6 y de la proteína FucT6, respectivamente.

En la figura 7 se ilustra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos del gen fucT7 y de la proteína FucT7, respectivamente.

En la figura 8 se ilustra el análisis de la 3-fucosil-lactosa que se purificó por medio de una cromatografía de permeación en gel BioGel P-2, que comprendió una cromatografía en una capa delgada con una fase móvil que consistió en una mezcla butanol, acetona, ácido acético y agua (35/35/7/23), a lo que siguió una coloración con una solución a base de difenilamina y anilina (que comprendió 2% de difenilamina, 2% de anilina y 10% de ácido fosfórico en metanol).

En la figura 9A se ilustra un cromatograma que se obtuvo al realizar una separación basada en una HPLC, en una columna Fenomenex Rezex RCM con Ca2+, con agua como eluyente (con una velocidad de 0,6 ml/minuto, durante 30 minutos y a una temperatura de 80°C), donde la detección se realizó con un dispositivo para analizar el índice de refracción (de Shimadzu, Alemania).

En la figura 9B se ilustra un cromatograma que se obtuvo al realizar una separación basada en una HPLC, en una columna Dionex CarboPac PA1 , con NaOH 50 mM como eluyente (con una velocidad de 1 ml/minuto, durante 35 minutos y a una temperatura de 30°C), donde la detección se realizó con un detector electroquímico DECADE II (de Antee Leyden, Países bajos).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Hasta el momento, la complejidad estructural de estos oligosacáridos había impedido su producción basada en métodos de síntesis, por lo que la fuente principal de los HMO era la leche humana. De esta manera, existía la necesidad de H O que pudieran obtenerse de una manera rápida y sencilla, que fue satisfecha con las fucosiltransferasas que se describen en la presente, las cuales resul-taron sorprendentemente apropiadas para este fin.

De acuerdo con la presente invención, el término "polinucleótido" hace referencia en general a cualquier polirribonucleótido o a cualquier polidesoxirribonucleótido, que puede comprender ARN o ARN no modificado o ARN o ARN modificado. El término "polinucleótido" abarca, sin limitaciones, el ADN de cadena simple, el ADN de cadena doble, el ADN que comprende combinaciones de regiones de cadena simple y de cadena doble, el ADN que comprende combinaciones de regiones de cadena simple, de cadena doble y de cadena triple, el ARN de cadena simple, el ARN de cadena doble, el ARN que comprende combinaciones de regiones de cadena simple y de cadena doble y las moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN, que pueden ser de cadena simple, pero que más típicamente comprenden regiones de cadena doble o de cadena triple. Por otra parte, el término "polinucleótido", tal como se lo emplea en la presente, puede hacer referencia a una región de cadena triple que puede comprender ARN y/o ADN. Las cadenas en estas regiones pueden provenir de una misma molécula o de moléculas diferentes, y las regiones pueden abarcar la totalidad de una o más de las moléculas, pero más típicamente abarcan tan solo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas que constituyen una región de una hélice triple frecuentemente es un oligonucleótido. En este contexto, el término "polinucleótido", tal como se lo emplea en la presente, podrá hacer referencia a moléculas de ADN o de ADN que sean como las que se describieron con anterioridad pero que también comprendan una o más bases modificadas. De esta manera, el término "polinucleótido", tal como se lo emplea en la presente, abarcará aquellas moléculas de ADN o de ADN que comprendan esqueletos que hayan sido modificados para incrementar su estabilidad o por otras razones. Más aun, dentro del alcance del término "polinucleótido", tal como se lo emplea en la presente, también se incluyen aquellas moléculas de ADN o de ARN que, a modo de ejemplo, comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiadas. Ha de apreciarse que es posible efectuar diversas modificaciones sobre el ADN y el ARN para cumplir con numerosos objetivos útiles que han de resultar conocidos para aquellos versados en la técnica. Como consecuencia, el término "poliuncleótido", tal como se lo emplea en la presente, abarcará todos los polinucleótidos que hayan sido sometidos a modificaciones químicas, enzimáticas o metabólicas, así como las formas químicas del ADN y del ARN que sean características de diversos virus o de diversas células, como es el caso de las células simples o complejas, y también abarcará aquellos polinucleótidos que frecuentemente se conocen como oligonucleótidos.

El término "polipéptido" hace referencia a cualquier péptido o cualquier proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos, los cuales pueden estar modificados o no. El término "polipéptido" hace referencia a los polímeros de aminoácidos que comprenden cadenas cortas, que comúnmente se conocen como péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y también hace referencia a los que comprenden cadenas largas, que generalmente se conocen como proteínas. Los polipéptidos pueden comprender aminoácidos diferentes de los 20 que están codificados por los genes. Más aun, el término "polipéptido" abarca aquellos péptidos que han sido modificados a través de procesos naturales, que incluyen el procesamiento y otras modificaciones posteriores a la traducción, así como aquellos péptidos que han sido modificados a través de procedimientos químicos artificiales. Estas modificaciones se describen apropiadamente en los textos básicos, se describen con mayor detalle en las monografías y en la abundante literatura dedicada a la investigación y han de resultar conocidas para aquellos versados en la técnica. Ha de apreciarse que será posible que una modificación de un tipo determinado se encuentre presente en un grado idéntico o diferente en diversos sitios de un mismo polipéptido. Por otro lado, un polipéptido podrá comprender modificaciones de diversos tipos. Las modificaciones . pueden efectuarse en cualquier parte de los polipéptidos, lo que abarca el esqueleto, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino y carboxilo. Las modificaciones abarcan, por ejemplo, la acetilación, la acilación, la ribosilación con ADP, la amidación, la unión covalente de una flavina, la unión covalente de una unidad hemo, la unión covalente de un nucleótido o de un derivado de un nucleótido, la unión covalente de un lípido o de un derivado de un lípido, la unión de un fosfotidilinositol, el entrecruzamiento, la formación de enlaces disulfuro, la desmetilación, la formación de entrecruzamientos covalentes, la formación de piroglutamatos, la formilación, la gamma-carboxilación, la glucosilación, la formación de anclajes GPI, la hidroxilación, la iodación, la metilación, la miristilación, la oxidación, el procesamiento proteolítico, la fosforilación, la prenilación, la racemiza-ción,.la unión de lípidos, la sulfación, la carboxilación de los residuos de ácido glutámico en la posición gamma, la selenización y la adición de aminoácidos a las proteínas que está mediada por el ARN de transferencia, lo que incluye la arginilación y la ubiquitinación. Los polipéptidos pueden ser ramificados o cíclicos, y en este último caso pueden comprender o no ramas. Los polipéptidos cíclicos, los polipéptidos y los polipéptidos circulares con ramas podrán ser el resultado de procesos naturales que tengan lugar después de la traducción. Como alternativa, podrán ser elaborados con métodos completamente sintéticos.

El término "aislado" hace referencia al resultado de una alteración con relación al estado natural, que es el fruto de la acción del hombre. Vale decir, si el elemento aislado estaba presente en la naturaleza, ha sido modificado y/o removido de su ambiente original. A modo de ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido que está presente de manera natural en un organismo vivo no se encuentra "aislado". Por el contrario, un polinucleótido o un polipéptido similar que ha sido separado de los materiales que lo acompañan en su estado natural se encuentra "aislado", en función de la definición que se provee en la presente. De manera similar, el término "sintética", aplicado a una secuencia, denota que la secuencia ha sido generada por medio de un procedimiento de síntesis, lo que implica que no ha sido aislada directamente a partir de una fuente natural. El término "recombinante" hace referencia al resultado de un procedimiento de ingeniería genética a nivel del ADN, que puede estar basado en la escisión de genes y/o en su transplante desde las células de una especie hasta las células de otra, que puede ser el organismo huésped. En este contexto, el ADN puede integrarse en el genoma del huésped, donde puede adquirir la capacidad de replicarse.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a aquellos polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican polipéptidos de acuerdo con la invención, particularmente alfa-1 ,3-fucosiltransferasas que presentan secuencias de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6. El término también abarca aquellos polinucleótidos que comprenden una única región continua o discontinua que codifica un polipéptido como el que se ha mencionado (que por ejemplo, puede estar interrumpida por un fago integrado o por una secuencia insertada o de edición), combinada con otras regiones que pueden comprender secuencias codificantes y/o secuencias no codificantes.

El término "variante", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a un polinucleótido o un polipéptido que difiere de un polinucleótido o un polipéptido de referencia, respectivamente, pero que conserva sus propiedades esenciales. En particular, una variante típica de un polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos que difiere de la del polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden dar como resultado una alteración en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, con relación al que es codificado por el polinucleótido de referencia, aunque esto no es imprescindible. Más precisamente, los cambios a nivel de los nucleótidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones o escisiones a nivel de los aminoácidos del polipéptido resultante, en comparación con el polipéptido que es codificado por la secuencia de referencia. Por otra parte, una variante típica de un polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la del polipéptido de referencia. En general, las diferencias son limitadas, por lo que las secuencias del polipéptido de referencia y de la variante son sustancialmente similares, e incluso son idénticas en diversas regiones. Las secuencias de aminoácidos de la variante y del polipéptido de referencia pueden variar a causa de una o más sustituciones, adiciones o supresiones, en cualquier combinación. Cualquier residuo de aminoácido sustituido o insertado podrá estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o de un polipéptido podrá ser una variante de origen natural, como es el caso de una variante alélica, o podrá ser una variante de la que se sepa que no se origina en la naturaleza. Las variantes de los polinucleótidos y de los polipéptidos que no se originan en la naturaleza pueden elaborarse por medio de procedimientos de mutagénesis, sobre la base de una síntesis directa o con otros métodos de recombinación conocidos por aquellos versados en la técnica.

Los términos "alfa-1 ,3-fucosiltransferasa", "fucosiltransferasa", "ácido nucleico/polinucleótido que codifica una alfa-1 ,3-fucosiltransferasa" y "ácido nucleico/polinucleótido que codifica una fucosiltransferasa" hacen referencia a glucosiltransferasas que pueden catalizar la transferencia de un residuo de fucosa desde un sustrato donante, tal como la GDP-fucosa, hasta una molécula aceptora con un enlace alfa-1 , 3. La molécula aceptora puede ser un hidrato de carbono, un oligosacárido, una proteína, una (gluco)proteína, un lípido o un (gluco)lípido, y en particular, puede ser la N-acetilglucosamina, la N-acetil-lactosamina, la galactosa, la fucosa, el ácido siálico, la glucosa, la lactosa o cualquier combinación de éstos. Dentro del alcance de la presente invención también se contemplan las variantes polimórficas, alélicas, mutantes e interespecíficas de los ácidos un-cleicos/polinucleótidos que se describen, es decir, aquellos ácidos nucleicos/polinucleótidos que presentan secuencias de aminoácidos que se caracterizan por una identidad de aproximadamente 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% o 90%, y preferiblemente de aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más con una región de una secuencia que comprende al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más aminoácidos de un polipéptido codificado por un ácido nucleico como los que se detallan en SEQ ID N° 1 , 3 o 5, o bien con una secuencia de aminoácidos que se selecciona entre SEQ ID N° 2, 4 ó 6.

Adicionalmente, el polipéptido de la alfa-1, 3-fucosiltransferasa puede alterarse por medio de adiciones o supresiones en su secuencia, con el propósito de modificar su actividad. A modo de ejemplo, pueden fusionarse otras secuencias polipeptídicas al polipéptido de la alfa-1 ,3-fucosiltransferasa para agregarle una actividad enzimática diferente. Como alternativa, pueden suprimirse determinados aminoácidos para eliminar o modificar la actividad de la proteína. De esta manera, la proteína podrá ser modificada de modo tal que se elimine su actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa pero que se conserve su estructura tridimensional. Una modificación de este tipo podrá ser útil para desarrollar anticuerpos contra el polipéptido de la alfa-1 ,3-fucosiltransferasa.

Por otra parte, los productos de los genes de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas podrán ser proteínas o polipéptidos que representen variantes que sean equivalentes desde el punto de vista funcional de las alfa-1 , 3-fucosiltransferasas que se describen en la presente, donde dichas variantes podrán comprender supresiones, adiciones o sustituciones a nivel de los residuos de aminoácidos, con relación a las secuencias de los genes de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas que se describieron con anterioridad. En cualquier caso, estos cambios serán silenciosos, es decir, darán como resultado alfa-1 ,3-fucosiltransferasas que serán equivalentes desde el punto de vista funcional, según se ha indicado. Las sustituciones a nivel de los aminoácidos podrán realizarse sobre la base de las similitudes en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos que se desee modificar. A modo de ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina, la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptofano y la metionina, los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la asparragina y la glutamina, los aminoácidos con cargas positivas (básicos) incluyen la arginina, la lisina y la histidina, y los aminoácidos con cargas negativas (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. En el contexto de esta invención, el término "equivalente desde el punto de vista funcional" hace referencia a un polipéptido que presenta una actividad in vivo que es sustancialmente similar a la de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas que son codificadas por los genes endógenos, cuyas secuencias son como las que se describieron con anterioridad. Esto puede determinarse sobre la base de numerosos criterios, tales como, sin limitaciones, la antigenicidad, es decir, la capacidad del polipéptido de unirse a un anticuerpo anti-alfa-1 ,3-fucosiltransferasa, la inmunogenicidad, es decir, la capacidad del polipéptido de generar un anticuerpo que puede unirse a una proteína o un polipéptido de una alfa-1 ,3-fucosiltransferasa, y la actividad enzimática.

Dentro del alcance de la invención se incluirán las proteínas, los polipéptidos y los derivados de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas (que incluyen los fragmentos de éstas) que hayan sido sometidos a una modificación diferencial durante la traducción o después de ella. Además, ha de ser posible introducir diversos aminoácidos no clásicos o análogos químicos de diversos aminoácidos por medio de sustituciones o adiciones en las secuencias de los polipéptidos de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas.

Los polipéptidos de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas pueden elaborarse mediante el uso de tecnología de ADN recombinante, de acuerdo con procedimientos que han de resultar conocidos para aquellos versados en la técnica. Ha de ser posible usar métodos bien conocidos en la técnica para elaborar vectores de expresión que comprendan secuencias que codifiquen alfa-1 ,3-fucosiltransferasas y señales apropiadas para controlar la transcripción o la traducción. Estos métodos incluyen, por ejemplo, los procedimientos de recombinación de ADN ¡n vitro, los procedimientos de síntesis y la recombinación de genes in vivo. A modo de por ejemplo, puede consultarse la descripción que se provee en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2? edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

El término "oligosacárido", tal como se lo emplea en la presente y como suele interpretárselo en la técnica, hace referencia a un polímero que es un sacárido que comprende una cantidad pequeña de azúcares simples, es decir, monosacáridos, que típicamente varía entre tres y diez.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se provee un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que es como la que se describió con anterioridad, que codifica un poli-péptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa, donde la secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a secuencias de control que pueden ser reconocidas por la célula huésped que es transformada con el vector. En una forma de realización particularmente preferida, el vector es un vector de expresión, y de acuerdo con otro aspecto de la invención, el vector puede tomar la forma de un plásmido, de un cósmido, de un fago, de un liposoma o de un virus.

En el contexto de la producción recombinante, las células huésped pueden ser sometidas a modificaciones genéticas con el fin de introducir sistemas de expresión, porciones de éstos o polinucleótidos de acuerdo con la invención. La introducción de los polinucleótidos en las células huésped puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos como los que se describen en los manuales de referencia para los laboratorios, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), y Sambrook et al., 1989, supra.

En este contexto, por ejemplo, un polinucleótido de acuerdo con la invención puede estar incluido un vector que puede introducirse de manera estable en una célula huésped, por medio de un procedimiento de transfección o transformación. En el vector, el polinucleótido de acuerdo con la invención podrá hallarse bajo el control de un promotor, que por ejemplo, podrá ser un promotor inducible, de manera tal que la expresión del gen/polinucleótido pueda ser guiada de manera específica. Con este procedimiento, si se lo desea, también será posible sobreexpresar el gen en cuestión.

Pueden emplearse diversos sistemas de expresión para producir los polipéptidos de acuerdo con la invención. Los vectores que pueden usarse incluyen, sin limitaciones, los vectores que derivan de cromosomas, de episomas o de virus, que abarcan los vectores que derivan de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas provenientes de levaduras, de elementos insertados, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus o de combinaciones de éstos, donde las combinaciones pueden comprender elementos genéticos derivados de plásmidos y de bacteriófagos, como es el caso de los cósmidos o los fagémidos. Las construcciones que se emplean en los sistemas de expresión pueden comprender regiones apropiadas para iniciar y controlar la expresión. En general, en este contexto podrá usarse un sistema o un vector que sea apropiado para mantener o propagar un polinucleótido y/o para expresar un polipéptido en un huésped. La secuencia de ADN apropiada podrá insertarse en el sistema de expresión a través de diversos procedimientos convencionales conocidos, tales como los que se describen en Sambrook et al., supra.

En este contexto, la presente invención también se relaciona con un polipéptido aislado que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa y que consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6; (b) una secuencia de aminoácidos que corresponde a una variante alélica de una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de una molécula de ácido nucleico como las que se detallan en SEQ ID N° 1 , 3 ó 5; (c) una secuencia de aminoácidos que corresponde a un ortólogo de una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de una molécula de ácido nucleico como las que se detallan en SEQ ID N° 1 , 3 ó 5; y (d) un fragmento de una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6, donde dicho fragmento comprende al menos 10 aminoácidos contiguos y presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa.

El término "condiciones estrictas" hace referencia a condiciones bajo las cuales una sonda puede hibridar con la subsecuencia que se emplea como blanco, pero no con otras secuencias. Las condiciones estrictas dependen de las secuencias y resultan diferentes bajo distintas circunstancias. Las secuencias más largas pueden hibridar de manera específica a temperaturas más altas. En general, las condiciones estrictas abarcan temperaturas que son aproximadamente 15°C inferiores al punto de fusión térmica (Tm) de la secuencia que se desea analizar, con una fuerza iónica específica y a un pH determinado. El Tm es la temperatura (en presencia de una fuerza iónica, un pH y una concentración de los ácidos nucleicos definidos) a la cual 50% de las sondas que son complementarias de la secuencia que se emplea como blanco pueden hibridar con ella en el equilibrio. A modo de ejemplo, las condiciones de hibridación estrictas pueden comprender el uso de 50% de formamida, SSC 5x y 1 % de SDS y una incubación a 42°C, o bien el uso de SSC 5x y 1 % de SDS, una incubación a 65°C y un lavado con SSC 0,2x y 0,1 % de SDS a 65°C.

La invención también está relacionada con una célula huésped que contiene un vector que es como se lo definió con anterioridad, donde dicha célula huésped se selecciona en particular del grupo que consiste en una célula fúngica, que puede provenir de una levadura, una célula bacteriana, una célula de un insecto, una célula animal y una célula vegetal. Resulta particularmente preferible que la célula huésped sea una célula de Escherichia coli.

Tal como se lo emplea en la presente, el término "célula huésped" hace referencia a una célula que ha sido transformada o transfectada con una secuencia polinucleotídica exógena, o bien a una célula que puede ser transformada o transfectada según se ha indicado.

Pueden utilizarse diversas combinaciones de huéspedes y vectores de expresión para expresar las secuencias de los genes de alfa-1 ,3-fucosiltransferasas de acuerdo con la invención. Con estas combinaciones de huéspedes y vectores de expresión, es posible producir y luego purificar las secuencias codificantes de interés. Más aun, los huéspedes pueden ser células que, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes apropiadas, pueden producir los polipéptidos de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas de acuerdo con la invención in.situ.

A modo de ejemplo, en WO 98/55630, que se incorpora explícitamente en la presente a modo de referencia, donde se describen fucosiltransferasas que se aislan a partir de Helicobacter pylori, pueden hallarse numerosos sistemas y huéspedes apropiados para llevar a cabo la expresión.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, el ácido nucleico que codifica el polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa ha sido adaptado al uso de codones de la célula donde se lo introduce.

La invención se relaciona con un método para producir oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lípidos fucosilados, que comprende los siguientes pasos: (a) proveer un polipéptido que presente actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa de acuerdo con la invención; y (b) poner en contacto el polipéptido que presenta actividad de alfa- ,3-fucosiltransferasa del paso (a) con una mezcla que comprenda un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptar que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)prote(na o un (gluco)lípido, bajo condiciones apropiadas para que el polipéptido catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido fucosilado.

De acuerdo con la invención, el método para producir oligosacáridos fucosilados puede ponerse en práctica en un sistema libre de células o en un sistema que contiene células. Los sustratos han de reaccionar con los polipéptidos de las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas durante un período de tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para posibilitar la formación del producto deseado como resultado de la reacción enzimática. Ha de comprenderse que las condiciones apropiadas podrán variar en función de la cantidad y la pureza del sustrato y del carácter libre de células o basado en células del sistema que se emplee. Estas variables podrán ser ajustadas fácilmente por aquellos versados en la técnica.

( En los sistemas libres de células, el polipéptido de acuerdo con la invención, los uno o más sustratos aceptores, los uno o más sustratos donantes y los otros ingredientes eventuales de la mezcla de reacción, que pueden ser otras glucosiltransferasas u otras enzimas accesorias, se combinan en un medio de reacción acuoso. Las enzimas pueden emplearse en una forma libre, en una solución, o bien pueden inmovilizarse en un soporte, que puede ser un polímero, por ejemplo, envasado en una columna, sobre el cual pueden aplicarse los sustratos.

Las células que comprendan los sistemas con los que puedan sintetizarse los oligosacáridos fucosilados podrán ser células huésped que hayan sido modificadas por medios recombinantes.

En este contexto, la invención también se relaciona con un método para producir oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lípidos fucosilados, que comprende los siguientes pasos: (a) cultivar una célula huésped como la que se describió con anterioridad bajo condiciones nutritivas apropiadas para que se produzca un oligosacárido, una (gluco)proteína y/o un (gluco)lípido fucosilado y para que se exprese un polipéptido que presente actividad de alfa-1 ,3- fucosiltransferasa; (b) de manera simultánea con el paso (a), o después de él, proveer un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido, de modo tal que el polipéptido de la alfa- 1 ,3-fucosiltransferasa catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido fucosilado; y (c) aislar el oligosacárido, la (gluco)proteína y/o el (gluco)lípido fucosilado a partir de la célula huésped o a partir del medio de cultivo.

En el método de acuerdo con la invención, el sustrato donante puede ser la GDP-fucosa. Más aun, resulta particularmente preferible que el sustrato donante sea la GDP-fucosa.

De acuerdo con un aspecto de la invención, el sustrato aceptor se selecciona entre la N-acetilglucosamina, la N acetil-lactosamina, la galactosa, la fucosa, el ácido siálico, la glucosa, la lactosa o cualquier combinación de éstos. En particular, se prefiere el uso de la lactosa como sustrato aceptor.

El término "sustrato", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a cualquier material o cualquier combinación de diversos materiales que pueden ser modificados por los polipéptidos de acuerdo con la invención para obtener oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lípidos fucosilados.

Se permite que los sustratos reaccionen con el polipéptido de la alfa-1 ,3-fucosiltransferasa durante un período de tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para que se forme el producto deseado como resultado de la reacción enzimática. Estas condiciones variarán en función de la i cantidad y la pureza del sustrato y de la enzima y del carácter libre de células o basado en células del sistema que se emplee. Estas variables podrán ser ajustadas fácilmente por aquellos versados en la técnica.

En un aspecto del método de acuerdo con la invención, el sustrato donante se provee en el paso (b) al ser producido por la propia célula huésped. Para ello, en la célula huésped podrá expresarse simultáneamente una enzima que sea apropiada, por ejemplo, para convertir la fucosa en GDP-fucosa. Esta enzima podrá ser, por ejemplo, una enzima bifuncional, que pueda operar como una quinasa de fucosa y como una guanililtransferasa de fucosa-1 -fosfato, como es el caso de la enzima Fkp de Bacteroides fragilis. Como alternativa, podrá expresarse una combinación de una quinasa de fucosa y una guanililtransferasa de fucosa-1 -fosfato, las cuales podrán provenir de diversas especies, tales como Homo sapiens, Sus scrofa o Rattus norvegicus.

Como alternativa, en el paso (b), el sustrato donante podrá agregarse al medio de cultivo, podrá introducirse en las células huésped o podrá producirse como resultado del metabolismo de las propias células.

En aun otra forma de realización, la invención se relaciona con un método que comprende los siguientes pasos: (a) cultivar células huésped que hayan sido transformadas o transfectadas para que comprendan una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre (i) SEQ ID N° 1 , 3 ó 5 del listado de secuencias adjunto, (ii) una secuencia de ácido nucleico que sea complementaria de SEQ ID N° 1 , 3 ó 5 y (iii) una secuencia de ácido nucleico que pueda hibridar bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que se definen en (i) y en (ii) o con sus cadenas complementarias, bajo condiciones nutritivas apropiadas para que la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con (i), (ii) o (iii) se exprese en forma de un péptido que presente actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa; de manera simultánea con el paso (a), o después de él, proveer un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido, de modo tal que el polipéptido de la alfa- 1 ,3-fucosiltransferasa que se exprese a partir de la célula huésped que se ha mencionado catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido fucosilado; y aislar el oligosacárido, la (gluco)proteína y/o el (gluco)lípido fucosilado a partir de la célula huésped o a partir del medio de cultivo.

En los métodos de acuerdo con la invención, el péptido que se expresa en la célula huésped presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa, es decir, puede transferir un residuo de fucosa desde un donante, tal como la fucosa con difosfato de guanosina (GDP-fucosa), hasta un aceptor, que puede ser un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lipido. Como consecuencia, el sustrato aceptor fucosilado puede usarse como aditivo para alimentos, como suplemento para alimentos para bebés o como un compuesto con actividad terapéutica o farmacéutica. Con los métodos novedosos que se describen, es posible obtener productos fucosilados de una manera sencilla y eficaz, sin que sea necesario recurrir a procedimientos de síntesis complejos, laboriosos y costosos.

Tal como se lo emplea en la presente, el término "aislamiento" hace referencia a la cosecha, la recolección o la separación del producto que se genera con la alfa-1 , 3-fucosiltransferasa de acuerdo con la invención, a partir del sistema que se emplea para expresar los genes.

En este contexto, la invención también se relaciona con oligosacáridos, (gluco)proteínas y/o (gluco)lípidos fucosilados que pueden obtenerse con los métodos de acuerdo con la invención, así como con el uso de un polinucleótido, un vector o un polipéptido como los que se describieron con anterioridad en la producción de oligosacáridos, (gluco)proteínas y/o (gluco)lípidos fucosilados.

De acuerdo con aun otra forma de realización, la producción del oligosacárido, la (gluco)proteína y/o el (gluco)lípido fucosilado se basa en la (sobre)expresión heteróloga u homóloga de un polinucleótido que codifica una alfa-1 ,3-fucosiltransferasa.

A menos que se los defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se emplean en la presente generalmente tienen el significado que les dan aquellos versados en la técnica a los que concierne esta invención. En general, la nomenclatura que se emplea en la presente, los procedimientos de laboratorio que pueden usarse para llevar a. cabo el cultivo de las células, los protocolos de genética molecular, los procesos de química orgánica, los métodos relacionados con la química de los ácidos nucleicos y los procedimientos para poner en práctica las hibridaciones que se describieron con anterioridad y que puedan describirse más adelante han de ser procedimientos de uso habitual, por lo que han de resultar conocidos para aquellos versados en la técnica. Para sintetizar los ácidos nucleicos y los péptidos, podrán emplearse procedimientos convencionales. En general, las reacciones enzimáticas y los procedimientos de purificación se pondrán en práctica de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Dentro del alcance de la invención también se incluyen los fragmentos de las secuencias polinucleotídicas que se describen en la presente.

EJEMPLO Clonación de los genes El gen que codificaba la fucosiltransferasa Amuc0760 fue sometido a una optimización a nivel de los codones y fue sintetizado por GenScript, Piscataway, Nueva Jersey (EEUU). Con dos secuencias circundantes que comprendían sitios para attB apropiados para realizar una clonación con el sistema Gateway (la secuencia 5' fue GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAG-ATAGAACC (SEQ ID N° 7) y la secuencia 3" fue TAGGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCC (SEQ ID N° 8)), se lo clonó en el vector pUC57 con el conjunto de elementos GenScript. La transferencia al vector pDEST14 (de Invitrogen GmbH, Alemania; véase la figura 3A) con el protocolo Gateway se llevó a cabo de acuerdo con el manual provisto por el fabricante (Invitrogen GmbH, Alemania). El polinucleótido que codificaba Amuc0760co con una marca de His en el extremo N se amplificó a partir de pUC57-amuc0760co con los cebadores GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAG-GCTTCGAAGGAGATACAACCATGGGCCATCACCATCATCACCACAAAACGCTGAAAATTAGCTTTC (SEQ ID N° 9) y GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC (SEQ ID N° 10). El polinucleótido que codificaba Amuc0760co con una marca de His en el extremo C se amplificó a partir de pUC57-amuc0760co con los cebadores G G GG AC AAGTTTGTAC AAAAAAGC AGG CTTC (SEQ ID N° 1 1 ) y G-GGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC (SEQ ID N° 12).

Los genes que codificaban las fucosiltransferasas FucT6 y FucT7 se amplificaron a partir de ADN genómico de Bacteroides fragilis NCTC 9343, mediante el uso de los cebadores GGGGACAAG-TTTGTAC AAAAA AG C AG G CTTCG AAG G AG ATAC AACC ATGTGTG ATTG CTTGTCTATC ATATTG (SEQ ID N° 13)/GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTATTTTCTATCAAACAATTGAGAA-TAATATTC (SEQ ID N° 14) y GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATACAAC-CATGGATATATTGATTC l i l i l í ATAATACGATG (SEQ ID N° 15)/GGGGACCACTTTGTACAAGAAA-GCTGGGTCCATATCCCTCCCAATTTTAGTTCG (SEQ ID N° 16), respectivamente, y también se los clonó en pDEST14 con el método Gateway (de Invitrogen GmbH, Alemania; véanse las figuras 3B y 3C).

Expresión de las fucosiltransferasas Los genes amuc0760co, fucT6 y ruc7~7 también se clonaron en el vector de expresión pACICDuet-1 (de Novagen, Reino Unido). Para clonar amuc0760co, se efectuó una restricción con Ncol/Pstl y se realizó la unión con los cebadores AGCTAGCCATGGGCAAAACGCTGAAAATTAGCT-TTCTG (SEQ ID N° 17) y AGCTAGCTGCAGTTAGCGACGCAGGCGA I I I I I C (SEQ ID N° 18; los sitios de restricción están subrayados). El producto resultante se denominó pACIC-amuc0760co (véase la figura 4A). fucT6 se clonó con Ncol/BamHI, mediante el uso de los cebadores GATCACCAT- GGGCTGTG ATTG CTTGTCTATC ATATTG (SEQ ID N° 19) y GATCAGGATCCTTATTTTCTATCAAA-CAATTGAGAATAATATTC (SEQ ID N° 20; los sitios de restricción están subrayados). Como resultado, se obtuvo pACIC-fucT6 (véase la figura 4B). Finalmente, fucT7 se clonó con Ncol/EcoRI, mediante el uso de los cebadores GATCACCATGGATATATTGATTC 1 1 I 1 1 1 ATAATACGATGTGG (SEQ ID N° 21 ) y GATCAGAATTCTCATATCCCTCCCAATTTTAGTTCGTG (SEQ ID N° 22; los sitios de restricción están subrayados). De esta manera, se obtuvo pACIC- uc77 (véase la figura 4C).

Se transformaron las cepas de E. coli JM109(DE3) y BL21 (DE3) OlacZ con los plásmidos apropiados, que se describieron con anterioridad. Se aplicaron 5 mi de un medio 2YT con una espátula de inoculación y se realizó un cultivo durante una noche a 37°C, con agitación a 180 rpm. Se combinaron 400 mi de un medio 2YT con 4 mi del cultivo precedente y se cultivó la mezcla a 37°C, con agitación a 180 rpm, hasta obtener una OD660 de 0,5. Se indujo la expresión agregando IPTG 0,1 mM y se continuó con el cultivo durante la noche, a 28°C y con agitación a 180 rpm. Las células se cosecharon y se suspendieron en 4% v/p de un medio que comprendió Tris-HCI 50 mM y MgCI2 5 mM y que tuvo un pH de 7,5. Como alternativa, cuando se realizó la purificación en la columna de Ni sefarosa FF (HisPrep FF 16/10, de GE Healthcare, Suecia), la suspensión se realizó en 4 v/p de un medio que comprendió Tris-HCI 20 mM, NaCI 500 mM e imidazol 30 mM y que tuvo un pH de 7,5. Se agregaron esferas de vidrio en una cantidad equivalente al séxtuple del peso del precipitado celular y se agitó la suspensión que comprendió las células en dos ocasiones, cada una durante 5 minutos. Entre las agitaciones, la suspensión se colocó en Hielo durante 5 minutos. Una vez destruidas las células, se removieron los residuos por medio de una centrifugación a 15000 x G durante 10 minutos. El sobrenadante resultante se sometió a un análisis de SDS-PAGE o se purificó en una columna de Ni sefarosa FF.

Detección por medio de una transferencia Western El producto del gen Amuc0760co marcado con His se expresó como se describió con anterioridad. Se separaron 10 mg de las proteínas del extracto celular en bruto en un gel de SDS al 10%. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF usando un tanque Mini Trans-Blot (de Bio-Rad, Alemania), de acuerdo con el manual provisto por el fabricante. El producto del gen Amuc0760co marcado con His en la transferencia se detectó con un conjunto de elementos que comprendió un anticuerpo marcado con His y conjugado con HRP (de Novagen, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante (véase la figura 2).

Producción de los compuestos fucosilados Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) ?/acZ pDEST14-fkp pCOLA-lacY-fucP con un vector pACIC que comprendía un gen apropiado que codificaba una fucosiltransferasa. Las colonias se desarrollaron en placas que comprendieron un medio 2YT con los antibióticos apropiados. Se cultivaron 5 mi de cada cepa durante la noche (en un medio 2YT con antibióticos). Se tomaron 30 mi de cada uno de estos cultivos, se los combinó con un medio mineral hasta obtener una concentración de 1% y se los inoculó en las células, las cuales se cultivaron con glicerol como fuente de carbono. Cuando se alcanzó una OD600 de 0,2, se agregó IPTG 0,1 mM, lactosa 20 mM y fucosa 20 mM. La producción de la 3-fucosil-lactosa se monitoreó con análisis de TLC y de HPLC. Se comparó la cantidad de 3-fucosíl-lactosa (3-FL) que se produjo con la enzima FutA, de Helicobacter pylori, con la que se obtuvo con Amuc0760co, de Akkermansia muciniphila, y con la que se obtuvo con FucT6 y FucT7, de Bacteroides fragilis. Los resultados se detallan en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1. Comparación de la cantidad y el rendimiento de la 3-fucosil-lactosa que se obtuvieron cuando se usaron las alfa-1 ,3-fucosiltransferasas FutA de Helicobacter pylori, Amuc0760co de Akkermansia muciniphila y FucT6 y FucT7 de Bacteroides fragilis En la tabla 1 puede observarse que la cantidad que se obtuvo del producto fucosilado, la 3-fucosil-lactosa, fue significativamente mayor cuando se usaron las alfa-1 ,3-fucos¡ltransferasas de acuerdo con la invención, es decir, Amuc0760co de Akkermansia muciniphila y FucT6 y FucT7 de Bacteroides fragilis, que cuando se usó la alfa-1 ,3-fucosiltransferasa FutA de Helicobacter pylori, que es la enzima que se emplea en la actualidad.

Purificación del producto de la fucosilación La 3-fucosil-lactosa que se produjo como se describió con anterioridad se purificó en varios pasos. El primer paso comprendió una purificación basada en una adsorción en carbón activado. En este contexto, el sobrenadante del cultivo que se había obtenido en la etapa de producción se aplicó sobre un lecho de carbón activado. Se recolectó la fracción que atravesó el lecho y se la analizó: fue imposible detectar 3-fucosil-lactosa. Para remover los compuestos que pudieran haberse unido al medio de manera no específica, como es el caso de las sales o los aminoácidos, el lecho se lavó con agua destilada (una vez más, no se detectó 3-FL en la fracción que atravesó el lecho). Posteriormente, se eluyó la 3-FL y la lactosa y la fucosa remanentes con etanol al 96%. Se evaporó el etanol en un evaporador rotativo y se filtró el residuo en un módulo de flujo transversal con un umbral de 10 kDa (de Microdyn Nadir, Alemania). Las sales remanentes se eliminaron por medio de una electrodiálisis. Después, las endotoxinas se removieron por medio de una filtración en un módulo de flujo transversal (de Pall, Alemania). La 3-FL se separó de la lactosa y de la fucosa en una escala de un gramo, mediante el uso de un material apropiado para poner en práctica una cromatografía de permeación en gel, Biogel P-2 (de BioRad, Alemania), en una columna de vidrio fritado de 520 mm x 428 mm. La purificación de la 3-FL se monitoreó a través de una cromatografía en una capa delgada (véase la figura 8). Se combinaron las fracciones que solamente comprendían 3-fucosil-lactosa y se las secó por congelación.

Confirmación de la identidad del producto La 3-fucosil-lactosa purificada que se produjo con las fucosiltransferasas que se describen en esta invención se sometió a análisis de RMN 1 H y de espectrometría de masa. Los espectros que se obtuvieron fueron consistentes con los que se había esperado obtener para la 3-FL. Adicionalmente, se pusieron en práctica dos métodos basados en sendas HPLC para verificar la identidad de la 3-FL obtenida. Un método estuvo basado en una separación en una columna Fenomenex Rezex RCM con Ca2+, con agua como eluyente (con una velocidad de 0,6 ml/minuto, durante 30 minutos y a una temperatura de 80°C), donde la detección se realizó con un dispositivo para analizar el índice de refracción (de Shimadzu, Alemania; véase la figura 9A). El otro método estuvo basado en una separación en una columna Dionex CarboPac PA1 , con NaOH 50 mM como eluyente (con una velocidad de 1 ml/minuto, durante 35 minutos y a una temperatura de 30°C), donde la detección se realizó con un detector electroquímico DECADE II (de Antee Leyden, Países bajos; véase la figura 9B).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1 . Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa y que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en (a) SEQ ID N° 1 , 3 ó 5 del listado de secuencias adjunto; (b) una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de SEQ ID N° 1 , 3 ó 5; y (c) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que se definen en a) y en b) o con sus cadenas complementarias.

2. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 , que consiste en SEQ ID N° 1 , 3 ó 5 y que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa.

3. Un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa y que está unida operativamente a secuencias de control que pueden ser reconocidas por la célula huésped que es transformada con el vector.

4. Un péptido aislado que presenta actividad de alfa-1 , 3-fucosiltransferasa y que consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (a) una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6; (b) una secuencia de aminoácidos que corresponde a una variante alélica de una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de una molécula de ácido nucleico como las que se detallan en SEQ ID N° 1 , 3 ó 5; (c) una secuencia de aminoácidos que corresponde a un ortólogo de una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6, donde dicho ortólogo está codificada por una molécula de ácido uncleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de una molécula de ácido uncleico como las que se detallan en SEQ ID N° 1 , 3 ó 5; y (d) un fragmento de una secuencia de aminoácidos como las que se detallan en SEQ ID N° 2, 4 ó 6, donde dicho fragmento comprende al menos 10 aminoácidos contiguos.

5. Una célula huésped que contiene un vector de acuerdo con la reivindicación 3.

6. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, que se selecciona del grupo que consiste en una célula fúngica, que puede provenir de una levadura, una célula bacteriana, una célula de un insecto, una célula animal y una célula vegetal.

7. Una célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 5 ó 6, que es una célula de Escherichia coli.

8. Una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa ha sido adaptado al uso de codones de dicha célula.

9. El uso de un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, de un vector de acuerdo con la reivindicación 3 o de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 en la producción de un oligosacárido fucosilado.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la producción de dicho oligosacárido fucosilado se basa en la expresión heteróloga u homóloga de un polinucleótido que codifica una alfa-1 ,3-fucosiltransferasa.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, donde el oligosacárido fucosilado es la 3-fucos¡l-lactosa.

12. Un método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los siguientes pasos: (a) proveer un polipéptido que presente actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa de acuerdo con la reivindicación 4; y (b) poner en contacto el polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa del paso (a) con una mezcla que comprenda un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido o un oligosacárido, bajo condiciones apropiadas para que el polipéptido catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido fucosilado.

13. Un método para producir oligosacáridos fucosilados, que comprende los siguientes pasos: (a) cultivar una célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 5 a 8 bajo condiciones nutritivas apropiadas para que se produzca un oligosacárido fucosilado y para que se exprese un polipéptido que presente actividad de alfa-1 ,3-fucosiltransferasa; (b) de manera simultánea con el paso (a), o después de él, proveer un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido o un oligosacárido, de modo tal que el polipéptido de la alfa-1 ,3-fucosiltransferasa catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido fucosilado; y (c) aislar el oligosacárido fucosilado a partir de la célula huésped o a partir del medio de cultivo.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, donde el sustrato donante es la GDP-fucosa.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde la GDP-fucosa es provista por una enzima que se expresa de manera simultánea en la célula huésped o se produce como resultado del metabolismo de la célula huésped.