CN113667656B - 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 - Google Patents
岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113667656B CN113667656B CN202110970236.8A CN202110970236A CN113667656B CN 113667656 B CN113667656 B CN 113667656B CN 202110970236 A CN202110970236 A CN 202110970236A CN 113667656 B CN113667656 B CN 113667656B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- futc
- fucosyltransferase
- mutant
- escherichia coli
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01069—Galactoside 2-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.69)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2'‑岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法，通过对α‑1,2‑岩藻糖基转移酶FutC定点突变，引入新的二硫键构建FutC半胱氨酸突变体；构建的表达载体pMA09‑MCys‑futC可以不同程度地提高重组大肠杆菌中合成2'‑FL的产量。其中，采用突变体S123C/I126C合成2'‑FL的产量最高，达到2.64g/L；而在对照组中，未突变的野生型FutC合成2'‑FL的产量仅为1.67g/L，突变体S123C/I126C合成2'‑FL的产量是野生型FutC的1.6倍。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法。
背景技术
人乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是一类母乳中含量仅次于脂肪和乳糖的新型功能性糖源，可以促进新生儿中有益肠道细菌的生长，增强肠道的屏障功能，对新生儿免疫系统的发育起着重要作用。HMOs 具有多种核心单糖结构单元，如D-葡萄糖(D-glucose,Glc)、D-半乳糖 (D-galactose,Gal)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)、 L-岩藻糖(L-fucose,Fuc)和唾液酸(Sialic acid,Sia)等，根据构成HMOs 单糖结构单元的不同空间构型、糖基序列、链长等，在糖链的不同位点上进一步岩藻糖化或唾液酸化，从而形成各种结构的HMOs，目前已鉴定出大约 200种HMOs分子，其中，以中性岩藻糖基化HMOs为主。2′-岩藻糖基乳糖 (2′-FL)已被证明是人乳中含量最丰富的一类岩藻糖基低聚糖，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为GRAS级别的HMOs，可作为高档婴配奶粉的营养补充剂，是目前最具商业价值的一种岩藻糖基乳糖。
岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferase,FucTs,EC 2.4.1.69)广泛地分布于植物、脊椎动物和细菌中，通常是将岩藻糖从供体底物岩藻糖鸟苷二磷酸 (GDP-L-岩藻糖)转移至寡糖、糖蛋白和糖脂等糖受体底物上，催化糖缀合物的岩藻糖基化。根据反应过程中形成的不同糖苷键，FucTs可以分成α-1,2-FucT、α-1,3/4-FucT、α-1,6-FucT和O-FucTs四个亚家族。α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FucT)属于CAZY家族11，可以催化岩藻糖从供体底物GDP-L-岩藻糖转移到受体底物，如Galβ1,4Glc NAc或Galβ1,3Glc NAc的半乳糖基上，形成α-1,2-糖苷键。其中，岩藻糖基化的2′-FL是通过α-1,2-岩藻糖基转移酶催化岩藻糖从GDP-L-岩藻糖转移到底物乳糖的半乳糖基上形成的。迄今为止，微生物来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶已被克隆和特征化，包括大肠杆菌O126(WbgL)、大肠杆菌O128(WbgJ)、大肠杆菌O86(WbwK)、脆弱拟杆菌(WcfB)、雪貂螺杆菌(HmFucT)和幽门螺杆菌(FutC)等。尽管目前缺少α-1,2-岩藻糖基转移酶三维结构的解析，但借助分子模拟软件可以构建α-1,2-FucT的模型结构，进一步结合分子对接或稳定性设计等方法，有望利用α-1,2-FucT突变体进一步提高2′-FL在重组大肠杆菌中的合成。
近年来，利用微生物代谢途径合成2′-FL的研究集中于合成途径的构建、代谢竞争途径的基因敲除、辅因子的强化等方面，而关于α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FucT)的催化机理方面鲜有报道。在2′-FL合成途径中，α-1,2-FucT 催化供体GDP-L-岩藻糖转移至底物乳糖的半乳糖基上合成2′-FL，其表达能力和催化活性是高效合成2′-FL的一个关键限速步骤。尽管Huang等人考察了不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶催化合成2′-FL的效率，发现来源于 Helicobacterpylori的α-1,2-岩藻糖基转移酶(FutC)合成2′-FL的效率最高，但并未对FutC的催化活性方面进一步研究。
尽管蛋白质晶体结构可以从真实的分子构象中反映出酶的催化活性口袋，为更好地改造蛋白质提供了一定的指导意义。然而在具体的实验操作中，蛋白质的结晶、解析等步骤繁琐，需要耗费大量时间。近年来，借助计算机模拟蛋白质的三维结构，预测蛋白质与底物之间的构效关系，以对蛋白质进行理性或半理性设计的方法，已应用于酶的改造、药物设计、癌症靶标等方面的研究。目前有多种蛋白结构模型预测的方法用于构建目标蛋白的三维结构。同源建模是一种根据蛋白序列比对，寻找与目标蛋白一级序列相似的已知蛋白质结构来构建目标蛋白结构，遵寻序列相似即结构相似的原则，因此同源建模的理论前提是模板和目的蛋白的序列相似度要高于30％，如网站 SWISS-MODLE(https://swissmodel.expasy.org/)。而对于没有高度序列相似的蛋白，通常是通过从头建模的方法实现目标蛋白结构的预测，如网站I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)，Robetta (https://robetta.bakerlab.org/)。α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-FucT)与α-1,2-FucT同属于一类岩藻糖基转移酶，催化底物乳糖的半乳糖基转移至供体GDP-L-岩藻糖上，生成3-fucosyllactose(3-FL)。目前已解析出α-1,3-岩藻糖基转移酶(Helicobacterpylori NCTC11639)与供体GDP-Fucose的复合晶体结构(PDB:2NZY)。尽管尚未解析出α-1,2-FucT的晶体结构，这为α-1,2-FucT的理性改造带来一定困难。但是，分析α-1,3-FucT与GDP-Fucose 的相互作用可以为预测α-1,2-FucT的三维结构以及筛选优良的α-1,2-FucT突变体提供良好的技术参考。
二硫键是维持蛋白质结构稳定的重要共价键之一，它不同于氢键、静电作用和范德华力，在蛋白质的结构中，空间上相近的2个半胱氨酸(Cys) 残基的巯基基团之间可发生氧化反应生成二硫键，形成的二硫键对于蛋白质的折叠和稳定性具有至关重要的作用。天然二硫键可稳定蛋白质分子的构象，而去除天然二硫键通常会降低目标蛋白的稳定性。研究表明，适当引入二硫键可以稳定目标蛋白质的柔性区域，并通过将蛋白质锁定为单个所需的构象来降低其构象熵，从而达到增强蛋白稳定性的目的。目前通过在蛋白质中定点突变构建半胱氨酸突变体，引入新的非天然二硫键，已被广泛用于改善蛋白质稳定性。例如在FAD依赖性葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)中引入二硫键(V149C-G190C)，突变体的热稳定性有明显改善，在45℃的半衰期为110min，是野生型的13倍，而没有改变FAD-GDH的催化活性和动力学参数并没有改变。朱方剑等人通过对Thermobifida fusca来源的角质酶进行二硫键理性设计，构建了半胱氨酸突变体D204C/E253C。相比野生型角质酶， D204C/E253C突变体的可溶性表达有所增加，此外，D204C/E253C突变体的热稳定性和pH稳定性均有提高。
由于外源蛋白在大肠杆菌翻译过程中通常因不正确折叠而形成无活性的包涵体，或是形成了非正确配对的二硫键造成蛋白质的不稳定表达。而在 2′-FL合成途径中，α-1,2-岩藻糖基转移酶催化供体GDP-L-岩藻糖转移至底物乳糖的半乳糖基上合成2′-FL，其稳定性是影响高效合成2′-FL的关键限速步骤。在申请专利号为202011240682.5中，硫氧还蛋白A(TrxA)与FutC 进行融合表达后，利用融合蛋白TrxA-futC可以提高重组大肠杆菌中2′-FL 的合成。硫氧还蛋白作为蛋白质二硫键的还原酶，可防止细胞质蛋白聚集沉淀，挽救因错误折叠的多二硫键肽链。二硫键是维持蛋白质结构稳定的重要共价键之一，适当引入二硫键可以稳定目标蛋白质的柔性区域，值得注意的是，在设计二硫键的同时，需要考虑到二硫键的能量值、Cys中β碳原子的距离、扭转角、引入区域范围内的温度因子等方面的信息。
因此，为进一步促进FutC在大肠杆菌中的稳定性，在FutC中设计新的非天然二硫键，通过构建半胱氨酸突变体有望提高2′-FL在重组大肠杆菌中的合成。
尽管目前没有α-1,2-岩藻糖基转移酶的晶体结构信息，但可以首先利用结构模拟网站预测出α-1,2-FucT的三维结构，再根据二硫键预测软件 Disulfide by Design，Yosshi网站(https://biokinet.belozersky.msu.ru/yosshi)可以获得α-1,2-FucT的半胱氨酸候选突变体。最后，通过实验验证获得正向半胱氨酸突变体，并将突变体运用在重组大肠杆菌的2′-FL合成中。
发明内容
为解决α-1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌催化合成2′-FL效率低的问题，本发明的目的旨在幽门螺旋杆菌Helicobacterpylori来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC中引入新的二硫键，通过定点突变构建多个半胱氨酸突变体用于重组大肠杆菌中2′-FL的合成，考察在FutC引入的二硫键是否能提高重组大肠杆菌MG-26中催化合成2′-FL的效率。由于目前没有α-1,2-岩藻糖基转移酶的晶体结构信息，首先借助结构模拟网站I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)预测出FutC的三维结构，并根据模型评估网站SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)对预测模型进行评估与优化；随后根据二硫键预测网站Yosshi(https://biokinet.belozersky.msu.ru/yosshi)获得FutC的半胱氨酸候选突变体。最后，通过采用组成型启动子Ptac表达FutC的半胱氨酸突变体，并将突变体运用在重组大肠杆菌的2′-FL合成中。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。
本发明提供了一种岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体，所述岩藻糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶，通过对α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC定点突变，引入新的二硫键构建FutC半胱氨酸突变体；优选的，所述FutC半胱氨酸突变体包括S123C/I126C、K185C/L188C、S240C/C241C、I246C/S252C的一种或多种突变体；所述FutC半胱氨酸突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5所示。
优选的，所述FutC半胱氨酸突变体是通过二硫键预测网站Yosshi设计获得。
优选的，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来源于幽门螺旋杆菌Helicobacterpylori，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种含岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体的重组表达载体，将α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC半胱氨酸突变体构建到pMA09质粒上获得重组质粒。
优选的，所述重组质粒采用组成型启动子Ptac进行表达。
本发明还提供了一种表达岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，所述大肠杆菌为大肠杆菌E.coliMG-26。
本发明还提供了一种表达岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
(1)α-1,2-岩藻糖基转移酶表达载体的构建
全基因合成获得α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC的基因，随后将FutC的 PCR扩增纯化产物与线性化载体pMA09进行重组反应，以构建FutC表达载体pMA09-futC；
(2)FutC半胱氨酸突变体载体的构建
将步骤(1)获得的pMA09-futC表达载体进行定点突变，构建FutC突变体S123C/I126C、K185C/L188C、S240C/C241C、I246C/S252C，随后将突变体的PCR扩增纯化片段转入大肠杆菌JM109感受态中培养，通过测序以确认FutC半胱氨酸突变体的表达载体pMA09-MCys-futC是否构建成功；
(3)构建重组大肠杆菌
将步骤(2)中测序正确的FutC半胱氨酸突变体的表达载体 pMA09-MCys-futC化转到大肠杆菌MG-26感受态细胞中，得到重组大肠杆菌。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌发酵生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：
(1)将重组大肠杆菌单菌落接种到终浓度为0.1mM氨苄霉素的LB培养基中中培养8-10h，制备成种子液；
(2)将重组大肠杆菌种子液以1-2％的接种量接种至发酵培养基中，于30-37℃、220r/min条件下培养7-9h后，添加终浓度为1-2g/L的L-岩藻糖、 3-4g/L的乳糖，继续摇瓶发酵至72-80h，分离发酵液得到2′-岩藻糖。
优选的，步骤(1)中，所述LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L；步骤(2)中，所述发酵培养基配方为：甘油5-6g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L。
与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：
本发明采用定点突变构建不同的α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC半胱氨酸突变体，构建的表达载体pMA09-MCys-futC可以不同程度地提高重组大肠杆菌中合成2′-FL的产量。其中，采用突变体S123C/I126C合成2′-FL的产量最高，达到2.64g/L；而在对照组中，未突变的野生型FutC合成2′-FL的产量仅为1.67g/L，突变体S123C/I126C合成2′-FL的产量是野生型FutC的 1.6倍(图3)。由此可见，通过在FutC中引入新的二硫键，构建FutC半胱氨酸突变体，可以提高α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC催化合成2′-FL的效率，从而有效促进2′-FL的合成。本发明重组大肠杆菌的构建方法简单，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为不同来源α-1,2-岩藻糖基转移酶的序列比对图；
图2为根据Yosshi网站设计的二硫键氨基酸突变位点图；
图3为利用FutC半胱氨酸突变体合成2′-FL的结果图；
图4为利用FutC组合突变体S123C/I126C-I246C/S252C合成2′-FL的结果图。
具体实施方式
一种岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体，本发明在α-1,2-岩藻糖基转移酶中引入新的二硫键，以构建合成2’-FL的重组大肠杆菌。首先借助模型构建网站I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)对FutC 的三维结构进行预测，并根据模型评估网站SAVES v6.0
(https://saves.mbi.ucla.edu/)对预测模型进行评估与优化；随后将α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC通过一步克隆构建到pMA09质粒上，获得重组质粒 pMA09-futC，将其作为半胱氨酸突变体的对照组；最后通过定点突变将半胱氨酸突变体构建到pMA09-futC质粒上，获得FutC半胱氨酸突变体的表达载体pMA09-MCys-futC。两种重组质粒均采用组成型启动子Ptac进行表达。
本发明中，在FutC中引入新的二硫键是通过预测网站Yosshi (https://biokinet.belozersky.msu.ru/yosshi)设计获得的FutC半胱氨酸候选突变体，包括S123C/I126C、K185C/L188C、S240C/C241C、I246C/S252C的一种或多种突变体；所述FutC半胱氨酸突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.5所示。
本发明中，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来源于幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，ATCC No.26695)的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC 序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明提供的重组大肠杆菌是在基因工程菌E.coli MG-26的基础上，将α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC半胱氨酸突变体构建到pMA09质粒上获得的。
本发明还提供了一种表达岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)α-1,2-岩藻糖基转移酶表达载体的构建
首先对pMA09质粒进行反向PCR，随后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，使用DpnI酶对模板质粒pMA09进行消化；最后对PCR产物进行纯化回收，获得线性化pMA09载体片段；全基因合成获得α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC的基因；随后将FutC的PCR扩增纯化产物与线性化载体 pMA09通过无缝克隆试剂盒进行重组反应，以构建FutC表达载体 pMA09-futC；
(2)FutC半胱氨酸突变体载体的构建
将步骤(1)获得的pMA09-futC表达载体进行定点突变，构建FutC突变体S123C/I126C(SEQ ID NO.2)、K185C/L188C(SEQ ID NO.3)、 S240C/C241C(SEQ ID NO.4)、I246C/S252C(SEQ ID NO.5)，随后将突变体的PCR扩增纯化片段转入大肠杆菌JM109感受态中培养，通过测序以确认FutC半胱氨酸突变体的表达载体pMA09-MCys-futC是否构建成功；
(3)构建重组大肠杆菌
将步骤(2)中测序正确的FutC半胱氨酸突变体的表达载体 pMA09-MCys-futC化转到大肠杆菌MG-26感受态细胞中，得到重组大肠杆菌。
本发明还提供了一种重组大肠杆菌发酵生产2′-岩藻糖基乳糖的方法，包括以下步骤：
(1)将重组大肠杆菌单菌落接种到终浓度为0.1mM氨苄霉素的LB培养基中(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)培养8-10h，优选为 9h，制备成种子液；
(2)将重组大肠杆菌种子液以1-2％的接种量接种至发酵培养基中，优选为1％接种量，于30-37℃、220r/min条件下培养7-9h后，优选为30℃、 220r/min条件下培养8h，添加终浓度为1-2g/L的L-岩藻糖、3-4g/L的乳糖，优选为L-岩藻糖2g/L，乳糖4g/L，继续摇瓶发酵至72-80h，优选为76-78h，更优选为77h。分离发酵液得到2′-岩藻糖；所述发酵培养基配方优选为：甘油5-6g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
为检测本发明所述的重组大肠杆菌合成2′-FL的产量，采用高效液相色谱(HPLC)系统(AgilentTechnologies 1260系列)检测重组大肠杆菌发酵液中2′-FL的合成量。具体是通过Rezex ROA有机酸柱(Phenomenex,Torrance, CA,USA)测定发酵上清液中2′-FL的浓度。其中，HPLC的流动相采用0.01N 稀H2SO4，检测器为示差检测器，色谱柱的检测温度设置为55℃，检测流速设置为0.6mL/min。
实施例1
(1)异源表达幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶
全基因合成NCBI上公布的幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，ATCC No.26695)的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC序列，通过PCR对futC基因和表达载体pMA09进行扩增，使用DpnI酶消化模板质粒，并对futC 基因片段和线性化载体pMA09片段进行纯化回收。然后使用无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)将futC基因和线性化载体pMA09进行重组连接。重组反应体系在50℃反应30min后，冰浴35min，随后将重组体系化转到大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃复苏1h涂布于终浓度为0.1 mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12h。最后挑选氨苄霉素抗性平板上的单菌落进行菌落PCR验证，并通过测序确认α-1,2-岩藻糖基转移酶 FutC是否构建成功。
(2)设计FutC半胱氨酸突变体
根据不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列比对结果(图 1)，α-1,2-岩藻糖基转移酶同源性较低，因此选用I-TASSER对FutC的结构模型进行从头构建。首先在网站 (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)上提交FutC的一级氨基酸序列，获得FutC的预测结构模型，随后通过SAVES v6.0网站(https://saves.mbi.ucla.edu/)对预测的结构进行模型评估。然后在 Mustguseal网站(https://mustguseal.belozersky.msu.ru/)上提交FutC相似蛋白的氨基酸序列比对文件，获得的关于FutC蛋白质家族的多重比对文件futC.fasta_aln。最后在Yosshi网站 (https://biokinet.belozersky.msu.ru/yosshiserver/)上提交futC.fasta_aln，同时上传FutC的结构预测模型，获得多个FutC半胱氨酸突变体 S123C/I126C、K185C/L188C、S240C/C241C、I246C/S252C(图2)。
(3)构建FutC突变体表达载体
以上述步骤(1)中测序正确的重组质粒pMA09-futC为模板，按照上述步骤(2)中设计的FutC半胱氨酸突变体，通过反向PCR线性化扩增表达质粒pMA09-futC，随后使用DpnI酶消化模板质粒，纯化回收 pMA09-futC线性化载体片段后，化转到大肠杆菌JM109感受态细胞， 37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养 10-12h。通过测序确认FutC突变体pMA09-MCys-S123C/I126C、pMA09-MCys-K185C/L188C、pMA09-MCys-S240C/C241C、 pMA09-MCys-I246C/S252C是否构建成功。
实施例2
构建FutC半胱氨酸组合突变体S123C/I126C-I246C/S252C
以上述实施例1步骤(3)中测序正确的FutC半胱氨酸突变载体 pMA09-MCys-S123C/I126C为模板，通过反向PCR线性化扩增突变载体，随后使用DpnI酶消化模板质粒，纯化回收线性化载体片段后，化转到大肠杆菌JM109感受态细胞，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，培养12h。通过测序确认组合突变体S123C/I126C-I246C/S252C(SEQ ID NO.6)是否构建成功。
实施例3
摇瓶发酵突变载体pMA09-MCys-S123C/I126C合成2′-FL
将上述测序正确的大肠杆菌突变质粒pMA09-MCys-S123C/I126C化转到2′-FL合成大肠杆菌MG-26感受态细胞，得到重组大肠杆菌，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养11h。挑选单菌落到终浓度为0.1mM氨苄霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中培养9h，作为摇瓶发酵的种子液。然后将种子液按1％的接种量接入到装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为0.1mM的氨苄霉素，发酵培养基的配方是：甘油5-6 g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L。随后将三角瓶置于30℃、220r/min条件下培养8h后，添加终浓度为1.5g/L的L-岩藻糖、3.5g/L的乳糖至摇瓶中，继续摇瓶发酵至 77h。
发酵结束时，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定发酵上清液的2′-FL 产量。首先取2mL发酵液在12000rpm下离心15min后，收集上清液，通过HPLC检测细胞外2′-FL的浓度。
实施例4
摇瓶发酵突变载体pMA09-MCys-K185C/L188C合成2′-FL
同实施例3，区别在于将大肠杆菌突变质粒pMA09-MCys-K185C/L188C替换实施例2中大肠杆菌突变质粒 pMA09-MCys-S123C/I126C。
实施例5
摇瓶发酵突变载体pMA09-MCys-S240C/C241C合成2′-FL
同实施例3，区别在于将大肠杆菌突变质粒 pMA09-MCys-S240C/C241C替换实施例2中大肠杆菌突变质粒pMA09-MCys-S123C/I126C。
实施例6
摇瓶发酵突变载体pMA09-MCys-I246C/S252C合成2′-FL
同实施例3，区别在于将大肠杆菌突变质粒 pMA09-MCys-I246C/S252C替换实施例2中大肠杆菌突变质粒pMA09-MCys-S123C/I126C。
实施例3-6中的发酵液中2′-FL的HPLC检测结果如图3所示，采用突变体S123C/I126C合成2′-FL的产量最高，达到2.64g/L，是野生型FutC 的1.6倍；其他三个突变体合成2′-FL的产量也均有提高，分别为1.97g/L (K185C/L188C)、2.23g/L(S240C/C241C)和2.08g/L(I246C/S252C)。而在对照组中，未突变的野生型FutC合成2′-FL产量仅为1.67g/L(图3)。
实施例7
摇瓶发酵组合突变载体pMA09-MCys-S123C/I126C-I246C/S252C合成2′-FL
将实施例2中测序正确的大肠杆菌突变质粒 pMA09-MCys-S123C/I126C-I246C/S252C化转到2′-FL合成大肠杆菌 MG-26感受态细胞，得到重组大肠杆菌，37℃复苏1h涂布终浓度为0.1 mM的氨苄霉素抗性LB平板，37℃培养12h。挑选单菌落到终浓度为 0.1mM氨苄霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L)中培养10h，作为摇瓶发酵的种子液。然后将种子液按1％的接种量接入到装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，同时添加终浓度为 0.1mM的氨苄霉素，发酵培养基的配方是：甘油4-6g/L、胰蛋白胨12g/L、酵母粉24g/L、磷酸氢二钾12.54g/L、磷酸二氢钾2.31g/L。随后将三角瓶置于30℃、220r/min条件下培养8h后，添加终浓度为3g/L的L-岩藻糖、3g/L的乳糖至摇瓶，继续摇瓶发酵至72h。
发酵结束时，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定发酵上清液的2′-FL 产量。首先取2mL发酵液在12000rpm下离心20min后，收集上清液，通过HPLC检测细胞外2′-FL的浓度。发酵液中2′-FL的HPLC检测结果如图4所示，采用突变体S123C/I126C-I246C/S252C合成2′-FL的产量比突变体S123C/I126C略低，为2.38g/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 光明乳业股份有限公司
<120> 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 903
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atggccttta aagtcgtcca aatctgcggc ggacttggca accagatgtt ccagtatgcc 60
ttcgccaaga gccttcagaa gcacagcaat acgccggtcc ttctggacat cacgtccttt 120
gactggagcg atcgcaagat gcagctggaa cttttcccga tcgatcttcc atatgcctcc 180
gccaaagaaa tcgccatcgc caagatgcag caccttccga agctggtccg cgatgctctt 240
aagtgtatgg gcttcgaccg cgtcagccaa gaaatcgtct tcgagtacga accgaagctt 300
ctgaagccga gcagacttac gtacttcttc ggctatttcc aagatccgcg ctatttcgac 360
gccatttccc cgcttatcaa gcagacgttc acactgccgc caccgccgga aaacaacaag 420
aacaataata agaaagagga ggagtaccag tgcaagctga gccttattct tgccgccaag 480
aatagcgtct tcgtccacat cagacgcgga gactatgtcg gcatcggctg tcagctgggc 540
atcgactatc agaagaaggc tcttgagtac atggctaaac gcgtcccgaa catggagctg 600
ttcgtctttt gcgaggatct ggagttcacg cagaatcttg atcttggata cccgttcatg 660
gatatgacga cgcgcgataa ggaggaggag gcttactggg acatgcttct gatgcagagc 720
tgccagcacg gcattatcgc caatagcacg tacagctggt gggccgccta tcttatcgag 780
aacccagaga aaatcatcat cggcccgaag cactggctgt tcggccacga gaacatcctt 840
tgcaaggagt gggtcaagat cgagtcccac ttcgaggtca agagccagaa gtacaacgcc 900
taa 903
<210> 2
<211> 903
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
atggcattta aggttgttca gatttgcggg gggttaggga atcagatgtt tcaatatgcg 60
tttgcgaaaa gcctgcaaaa acactcaaat acgccggttc tgctggatat tacgtcgttt 120
gattggtcag atagaaaaat gcaactggaa ctgtttccga tcgatctgcc atatgcaagc 180
gaaaaagaaa ttgcaatcgc aaaaatgcaa catctgccta aactggtgag agatgcgctg 240
aaatgcatgg gattcgaccg cgtttcaaaa gaaattgttt ttgaatacga gccggaactg 300
ctgaaaccgt caagactgac atacttctat ggttacttcc aagatccgag atattttgat 360
gcgatctgtc ctctgtgtaa acaaacattt acactgccgc cgccgccgcc tgaaaatggc 420
aacaataaaa agaaagaaga ggaatatcac cgcaaattag cactgattct ggcagcaaaa 480
aattcagttt ttgttcatat tagaagaggc gattatgttg gcattggctg ccaactgggc 540
attgattatc aaaaaaaagc actggaatat atggcaaaaa gagttccgaa tatggaactg 600
tttgtttttt gcgaagatct gacatttaca caaaatctgg atctgggcta tccgtttatg 660
gatatgacaa caagagataa agaagaagaa gcatattggg atatgctgct gatgcaatca 720
tgccaacatg gcattattgc aaattcaaca tattcatggt gggcagcata tctgattaat 780
aatccggaaa aaattattat tggcccgaaa cattggctgt ttggccatga aaatattctg 840
tgcaaagaat gggttaaaat tgaatcacat tttgaagtta aatcacaaaa atataatgca 900
taa 903
<210> 3
<211> 903
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atggcattta aggttgttca gatttgcggg gggttaggga atcagatgtt tcaatatgcg 60
tttgcgaaaa gcctgcaaaa acactcaaat acgccggttc tgctggatat tacgtcgttt 120
gattggtcag atagaaaaat gcaactggaa ctgtttccga tcgatctgcc atatgcaagc 180
gaaaaagaaa ttgcaatcgc aaaaatgcaa catctgccta aactggtgag agatgcgctg 240
aaatgcatgg gattcgaccg cgtttcaaaa gaaattgttt ttgaatacga gccggaactg 300
ctgaaaccgt caagactgac atacttctat ggttacttcc aagatccgag atattttgat 360
gcgatcagtc ctctgattaa acaaacattt acactgccgc cgccgccgcc tgaaaatggc 420
aacaataaaa agaaagaaga ggaatatcac cgcaaattag cactgattct ggcagcaaaa 480
aattcagttt ttgttcatat tagaagaggc gattatgttg gcattggctg ccaactgggc 540
attgattatc aatgtaaagc atgtgaatat atggcaaaaa gagttccgaa tatggaactg 600
tttgtttttt gcgaagatct gacatttaca caaaatctgg atctgggcta tccgtttatg 660
gatatgacaa caagagataa agaagaagaa gcatattggg atatgctgct gatgcaatca 720
tgccaacatg gcattattgc aaattcaaca tattcatggt gggcagcata tctgattaat 780
aatccggaaa aaattattat tggcccgaaa cattggctgt ttggccatga aaatattctg 840
tgcaaagaat gggttaaaat tgaatcacat tttgaagtta aatcacaaaa atataatgca 900
taa 903
<210> 4
<211> 903
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
atggcattta aggttgttca gatttgcggg gggttaggga atcagatgtt tcaatatgcg 60
tttgcgaaaa gcctgcaaaa acactcaaat acgccggttc tgctggatat tacgtcgttt 120
gattggtcag atagaaaaat gcaactggaa ctgtttccga tcgatctgcc atatgcaagc 180
gaaaaagaaa ttgcaatcgc aaaaatgcaa catctgccta aactggtgag agatgcgctg 240
aaatgcatgg gattcgaccg cgtttcaaaa gaaattgttt ttgaatacga gccggaactg 300
ctgaaaccgt caagactgac atacttctat ggttacttcc aagatccgag atattttgat 360
gcgatcagtc ctctgattaa acaaacattt acactgccgc cgccgccgcc tgaaaatggc 420
aacaataaaa agaaagaaga ggaatatcac cgcaaattag cactgattct ggcagcaaaa 480
aattcagttt ttgttcatat tagaagaggc gattatgttg gcattggctg ccaactgggc 540
attgattatc aaaaaaaagc actggaatat atggcaaaaa gagttccgaa tatggaactg 600
tttgtttttt gcgaagatct gacatttaca caaaatctgg atctgggcta tccgtttatg 660
gatatgacaa caagagataa agaagaagaa gcatattggg atatgctgct gatgcaatgt 720
tgccaacatg gcattattgc aaattcaaca tattcatggt gggcagcata tctgattaat 780
aatccggaaa aaattattat tggcccgaaa cattggctgt ttggccatga aaatattctg 840
tgcaaagaat gggttaaaat tgaatcacat tttgaagtta aatcacaaaa atataatgca 900
taa 903
<210> 5
<211> 903
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
atggcattta aggttgttca gatttgcggg gggttaggga atcagatgtt tcaatatgcg 60
tttgcgaaaa gcctgcaaaa acactcaaat acgccggttc tgctggatat tacgtcgttt 120
gattggtcag atagaaaaat gcaactggaa ctgtttccga tcgatctgcc atatgcaagc 180
gaaaaagaaa ttgcaatcgc aaaaatgcaa catctgccta aactggtgag agatgcgctg 240
aaatgcatgg gattcgaccg cgtttcaaaa gaaattgttt ttgaatacga gccggaactg 300
ctgaaaccgt caagactgac atacttctat ggttacttcc aagatccgag atattttgat 360
gcgatcagtc ctctgattaa acaaacattt acactgccgc cgccgccgcc tgaaaatggc 420
aacaataaaa agaaagaaga ggaatatcac cgcaaattag cactgattct ggcagcaaaa 480
aattcagttt ttgttcatat tagaagaggc gattatgttg gcattggctg ccaactgggc 540
attgattatc aaaaaaaagc actggaatat atggcaaaaa gagttccgaa tatggaactg 600
tttgtttttt gcgaagatct gacatttaca caaaatctgg atctgggcta tccgtttatg 660
gatatgacaa caagagataa agaagaagaa gcatattggg atatgctgct gatgcaatca 720
tgccaacatg gcatttgtgc aaattcaaca tattgttggt gggcagcata tctgattaat 780
aatccggaaa aaattattat tggcccgaaa cattggctgt ttggccatga aaatattctg 840
tgcaaagaat gggttaaaat tgaatcacat tttgaagtta aatcacaaaa atataatgca 900
taa 903
<210> 6
<211> 903
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
atggcattta aggttgttca gatttgcggg gggttaggga atcagatgtt tcaatatgcg 60
tttgcgaaaa gcctgcaaaa acactcaaat acgccggttc tgctggatat tacgtcgttt 120
gattggtcag atagaaaaat gcaactggaa ctgtttccga tcgatctgcc atatgcaagc 180
gaaaaagaaa ttgcaatcgc aaaaatgcaa catctgccta aactggtgag agatgcgctg 240
aaatgcatgg gattcgaccg cgtttcaaaa gaaattgttt ttgaatacga gccggaactg 300
ctgaaaccgt caagactgac atacttctat ggttacttcc aagatccgag atattttgat 360
gcgatctgtc ctctgtgtaa acaaacattt acactgccgc cgccgccgcc tgaaaatggc 420
aacaataaaa agaaagaaga ggaatatcac cgcaaattag cactgattct ggcagcaaaa 480
aattcagttt ttgttcatat tagaagaggc gattatgttg gcattggctg ccaactgggc 540
attgattatc aaaaaaaagc actggaatat atggcaaaaa gagttccgaa tatggaactg 600
tttgtttttt gcgaagatct gacatttaca caaaatctgg atctgggcta tccgtttatg 660
gatatgacaa caagagataa agaagaagaa gcatattggg atatgctgct gatgcaatca 720
tgccaacatg gcatttgtgc aaattcaaca tattgttggt gggcagcata tctgattaat 780
aatccggaaa aaattattat tggcccgaaa cattggctgt ttggccatga aaatattctg 840
tgcaaagaat gggttaaaat tgaatcacat tttgaagtta aatcacaaaa atataatgca 900
taa 903
Claims (9)
1.一种岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶，通过对α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC定点突变，引入新的二硫键构建FutC半胱氨酸突变体；所述FutC半胱氨酸突变体核苷酸序列如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶借助结构模拟网站I-TASSER预测出FutC的三维结构；所述FutC半胱氨酸突变体是通过二硫键预测网站Yosshi设计获得。
3.根据权利要求1所述的岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶基因来源于幽门螺旋杆菌Helicobacter pylori，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
4.一种含权利要求1所述的岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体的重组表达载体，其特征在于，将α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC半胱氨酸突变体构建到pMA09质粒上获得重组质粒。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组质粒采用组成型启动子Ptac进行表达。
6.一种表达权利要求1所述岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌E. coli MG-26。
7.一种如权利要求6所述的表达岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体合成2 '-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
（1）α-1,2-岩藻糖基转移酶表达载体的构建
全基因合成获得α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC的基因，随后将FutC的PCR扩增纯化产物与线性化载体pMA09进行重组反应，以构建FutC表达载体pMA09-futC；
（2）FutC半胱氨酸突变体载体的构建
将步骤（1）获得的pMA09-futC表达载体进行定点突变，构建FutC突变体S123C/I126C、K185C/L188C、S240C/C241C或I246C/S252C，随后将突变体的PCR扩增纯化片段转入大肠杆菌JM109感受态中培养，通过测序以确认FutC半胱氨酸突变体的表达载体pMA09-MCys-futC是否构建成功；
（3）构建重组大肠杆菌
将步骤（2）中测序正确的FutC半胱氨酸突变体的表达载体pMA09-MCys-futC化转到大肠杆菌MG-26感受态细胞中，得到重组大肠杆菌。
8.一种权利要求6所述的重组大肠杆菌发酵生产2 '-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将重组大肠杆菌单菌落接种到终浓度为0.1mM氨苄霉素的LB培养基中培养8-10h，制备成种子液；
（2）将重组大肠杆菌种子液以1-2％的接种量接种至发酵培养基中，于30-37℃、220r/min条件下培养7-9h后，添加终浓度为1-2g/L的L-岩藻糖、3-4g/L的乳糖，继续摇瓶发酵至72-80h，分离发酵液得到2 '-岩藻糖基乳糖。
9.根据权利要求8所述的重组大肠杆菌发酵生产2 '-岩藻糖基乳糖的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述LB培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L；步骤（2）中，所述发酵培养基配方为：甘油5-6 g/L、胰蛋白胨12 g/L、酵母粉24 g/L、磷酸氢二钾12.54 g/L、磷酸二氢钾2.31 g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110970236.8A CN113667656B (zh) | 2021-08-23 | 2021-08-23 | 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110970236.8A CN113667656B (zh) | 2021-08-23 | 2021-08-23 | 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113667656A CN113667656A (zh) | 2021-11-19 |
| CN113667656B true CN113667656B (zh) | 2023-07-25 |
Family
ID=78545202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110970236.8A Active CN113667656B (zh) | 2021-08-23 | 2021-08-23 | 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113667656B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116064453B (zh) * | 2022-10-27 | 2023-11-24 | 苏州一兮生物技术有限公司 | 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶突变体及其制备方法和用途 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2439507T3 (es) * | 2011-01-20 | 2014-01-23 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones |
| CN112322565B (zh) * | 2020-11-09 | 2023-11-10 | 光明乳业股份有限公司 | 提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法 |
-
2021
- 2021-08-23 CN CN202110970236.8A patent/CN113667656B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113667656A (zh) | 2021-11-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Prates et al. | The structure of the feruloyl esterase module of xylanase 10B from Clostridium thermocellum provides insights into substrate recognition | |
| CN111712570B (zh) | 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 | |
| CN112322565B (zh) | 提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法 | |
| Ramakrishnan et al. | Structural snapshots of β-1, 4-galactosyltransferase-I along the kinetic pathway | |
| Loris et al. | Structural basis of carbohydrate recognition by lectin II from Ulex europaeus, a protein with a promiscuous carbohydrate-binding site | |
| CN114480240A (zh) | 一种产岩藻糖基乳糖的基因工程菌及生产方法 | |
| CN113667656B (zh) | 岩藻糖基转移酶半胱氨酸突变体及其合成2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌及构建方法 | |
| CN113817763B (zh) | β-半乳糖苷酶家族基因定向进化方法、突变体及其应用 | |
| US10233439B2 (en) | Directed modification of glucosamine synthase mutant and application thereof | |
| CN113186142A (zh) | 一种高效生产2′-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株 | |
| Zhu et al. | Elimination of byproduct generation and enhancement of 2′-fucosyllactose synthesis by expressing a novel α1, 2-fucosyltransferase in engineered Escherichia coli | |
| Xu et al. | Improved production of 2′-fucosyllactose in engineered Saccharomyces cerevisiae expressing a putative α-1, 2-fucosyltransferase from Bacillus cereus | |
| CN114672448B (zh) | 一种合成2’-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN116254249A (zh) | 一种表达几丁质酶的重组菌的构建及高酶活突变体的制备 | |
| US11618902B2 (en) | Bacillus subtilis for producing N-acetylneuraminic acid and application thereof | |
| CN114806991A (zh) | 一种提高岩藻糖基乳糖产量的工程大肠杆菌及生产方法 | |
| JP4638447B2 (ja) | 糖転移酵素の酵素活性を向上させる方法 | |
| CN116042562B (zh) | 重组酵母菌及其应用 | |
| Meyer et al. | N-glycan core synthesis by Alg24 strengthens the hypothesis of an archaeal origin of eukaryal N-glycosylation | |
| CN117586938B (zh) | 一种合成乳酰-n-新四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用 | |
| CN113201512B (zh) | 一种产蔗果三糖的菊糖蔗糖酶突变体 | |
| CN116286712B (zh) | 鼠李糖基转移酶突变体、编码基因、制备方法及应用 | |
| US20240060056A1 (en) | Modified beta-1,3-n-acetylglucosaminyltransferase polypeptides | |
| CN117402804A (zh) | 一种α-1,2岩藻糖基转移酶突变体及产2'-岩藻糖基乳糖的大肠杆菌 | |
| CN116144636A (zh) | 一种几丁质脱乙酰基酶突变体及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |