KR20140032983A - 신규 푸코실트랜스페라제 및 그 적용 - Google Patents

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젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
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Abstract

본 발명은 신규 알파-1,2-푸코실트랜스페라제를 표현하도록 코딩하는, 대장균 혈청군 O126으로부터의 핵산 및 아미노산 서열들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 2'-푸코실락토스와 같은, 인간 모유에서 발견되는, 올리고당들, (당)단백질, 또는 (당)지질들, 특히 올리고당들과 같은, 푸코실화 산물들을 발생시키기 위하여 알파-1,2-푸코실트랜스페라제의 사용 및 이를 사용하기 위한 방법을 제공한다.

Description

신규 푸코실트랜스페라제 및 그 적용{NOVEL FUCOSYLTRANSFERASES AND THEIR APPLICATIONS}
본 발명은 신규 푸코실트랜스페라제(fucosyltransferase) 및 그 적용에 관한 것이다.
특정 생물 활성을 나타내기 위하여 많은 (당)단백질, (당)지질 또는 올리고당은 특정 푸코실화 구조체들의 존재를 필요로 한다. 예를 들면 세포간 인식 메커니즘들은 푸코실화 올리고당(fucosylated oligosaccharide)을 필요로 한다. 예를 들면, L-셀렉틴과 같은 세포 점착(cell adhesion) 분자들에 결속되기 위하여, 특정 세포 구조체들은 푸코실화 탄수화물들을 포함해야만 한다. 생물학적 기능을 갖는 푸코실화 구조체의 또 다른 예는 ABO 혈액형 시스템을 형성하는 구조체들이다. 게다가, 치료상의 (당)단백질들은 제약 시약의 빠른 성장 분야를 나타내는데, 그것들의 약학 특성 및 안정성은 그것들의 글리칸(glycan)들 때문으로 여겨진다.
그것들의 복잡한 본질 및 고유 화학 특성들 때문에, 당접합체(glycoconjugate)들의 화학 합성은 주요한 도전이고 상당한 문제들과 관련된다. 자동 합성장치들로 상업적으로 이용가능한, 단백질 및 아미노산들과 달리, 글리칸들(및 당접합체는 말할 것도 없이)은 일반적인 상업용 시스템을 사용하여 합성할 수 없다. 입체 화학(stereochemistry)을 제어하기 위한 필요성과 별도로, 특정 결합(linkage)들의 형성은 여전히 어렵다.
당접합체들의 화학 또는 복합 효소/화학 합성과 관련된 복합성에 대하여, 최근 접근법들은 올리고당 잔기(residue)를 사용하여 (당)단백질들 및 (당)지질을 효소적으로 합성하도록 글리코실트랜스페라제(glycosyltransferase)들을 사용하여 왔다.
글리코실트랜스페라제의 효소 군에 속하는 푸코실트랜스페라제들은 척추동물, 무척추동물, 식물, 및 박테리아에서 광범위하게 발현된다. 그것들은 일반적으로 구아노신-2인산(guanosine-diphosphate, GDP) 푸코스인 공여체(donor)로부터 올리고당, (당)단백질 및 (당)지질들을 포함하는 수용체로의 푸코스 잔기의 전달을 촉매한다. 따라서 푸코실화 수용체 기질들은 다양한 생물학적, 병리학적 과정에 관여한다.
푸코스 첨가의 위치를 기초로 하여, 푸코실트랜스페라제들은 알파(alpha)-1,2-, 알파-1,3/4- 및 오(O)-푸코실트랜스페라제로 분류된다. 예를 들면 박테리아 헬리코박터 파일로리(Helocobacter pylori) 및 대장균(E. coli)에서, 포유동물들 캐노햅디티스 엘레강스(Caenohabditis elegans) 및 시스토소마 만소니(Schistosoma mansoni) 뿐만 아니라, 식물들에서 일부 알파-1,2-푸코실트랜스페라제가 확인되었다. 이러한 효소들 대부분은 박테리아 시스템들 내에서 활성 형태로 발현되지 않거나, 또는 수용체로서 락토스를 사용할 수 없다.
포유동물들에서, 구아노신-2인산(이하 GDP로 표기)-푸코스는 데 노보(de novo) 합성 및 샐비지 경로(salvage pathway)를 통하여 세포질 내에서 합성된다. 데 노보 합성과 함께, 샐비지 경로가 기질로서 자유 세포질(cytosolic) 푸코스를 사용하는 동안에, GDP-만노오스(mannose)는 두 개의 효소를 통하여 GDP-푸코스로 전환된다. 세포 내에서, GDP-푸코스는 소포(vesicle) 내에서 농축되고 공여체 기질로서 푸코실트랜스페라제들에 의해 인식된다. 그러나, 진핵생물의 푸코실트랜스페라제들, 특히 푸코실트랜스페라제들의 이형(heterologous) 기능적 발현은 원핵생물 발현 시스템에서 어려운 것으로 증명되었다. 포유동물 및 특히, 인간 올리고당들(HMOs)과 같은 인간 올리고당은 원핵 생물원으로부터 알려져 있지 않은데, 따라서 이러한 올리고당을 만드는 글리코실트랜스페라제의 발견은 매우 어렵다.
상업적으로 중요한 많은 올리고당, (당)단백질 및 (당)지질의 생물 활성은 특정 푸코스 잔기들의 존재에 의존하기 때문에, 원하는 올리고당 잔기(들)를 갖는 당접합체들을 효율적으로 합성하고 생산하기 위한 최신 기술의 필요성이 존재한다.
따라서, 본 발명의 목적은 푸코실화 기질들이 많은 양의 원하는 기질을 생산하는, 효율적으로, 시간과 경비를 절약하는 방법으로 생산될 수 있는 수단과 방법들을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 본 발명의 목적은 그 중에서도, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고 다음의 그룹:
a) 첨부된 서열 목록의 서열 번호 1;
b) 서열 목록의 서열 번호 1에 상보적인 핵산의 서열;
c) a) 및 b) 또는 다른 상보적인 가닥(strand)들 내에 정의되는 핵산 서열들에 대하여 엄격한 조건 하에서 혼성화하는(hybridize) 핵산 서열들;을 포함하는 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 또는 구성하는, 예를 들면, 분리되거나, 재조합되거나 또는 합성될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 제공에 의해 해결된다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드(서열 목록의 서열 번호 1 참조)는 대장균 혈청군 O126의 푸코실트랜스페라제를 나타낸다.
새로 확인된 푸코실트랜스페라제는 놀라운 효과를 갖는데 그 이유는 그것들을 사용함으로써 근원(source) 생물에서 자연적으로 발생하지 않는 반응들이 실행될 수 있기 때문이다. 본 발명의 범위 내에서 위에서 확인된 알파-1,2-푸코실트랜스페라제는 기질로서 락토스를 사용할 수 있으며 푸코실화 올리고당, 특히 2'-푸코실락토스(fucosyllactose)를 생산할 수 있다. 현재까지, 푸코실락토스의 생산을 위한 자연 기질로서의 락토스의 사용을 위하여 박테리아로부터 분리된 알려진 어떠한 알파-1,2-푸코실트랜스페라제도 나타나지 않았다. 따라서, 푸코실화 올리고당들을 생산하기 위하여 사용되려는 새로 확인된 푸코실트랜스페라제의 적합성은 매우 놀라우며, 따라서 그것의 사용은 푸코실락토스와 같은, 예를 들면, 인간 모유 올리고당들을 쉽고, 효율적으로 그리고 비용을 절감하여 생산하는 뛰어난 도구를 나타낸다. 오늘날, 인간 모유 올리고당들에 속하는 80개 이상의 화합물이 구조적으로 특징을 갖는다. 그것들은 프리바이오틱스(prebiotics)로서 기능을 하는 복합 올리고당들을 나타낸다. 부가적으로, 상피 에피토프에 대한 인간 모유 올리고당들의 구조적 상동성(homology)은 박테리아 병원균에 대한 보호 특성을 설명한다. 유아의 위장관(gastointestinal tract) 내에, 인간 모유 올리고당들은 선택된 박테리아 스트레인들의 성장에 선택적으로 영양을 공급하며, 따라서 모유가 공급된 유아들 내의 독특한 장 박테리아의 발생을 나타낸다.
지금까지, 이러한 올리고당들의 구조적 복잡성이 그것들의 합성 생산을 저해하였기 때문에, 인간 모유 올리고당들을 위한 주요 근원은 여전히 인간 모유이다. 따라서, 여기서 설명되는 푸코실트랜스페라제를 사용하여 제공될 수 있는, 손쉽게 획득가능한 인간 모유 올리고당들에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명에 따라, 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 혹은 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는, 어떠한 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 언급한다. "폴리뉴클레오티드(들)"는 제한 없이, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역들 또는 이중- 및 삼중-가닥 영역들의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 그리고 단일- 및 이중-가닥 또는 더 일반적으로 이중-가닥, 또는 삼중-가닥 영역들, 또는 단일- 및 이중-가닥 영역들의 혼합물일 수 있는 RNA를 포함한다. 게다가, 여기서 사용되는 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역들을 언급한다. 그러한 영역들 내의 가닥들은 동일한 분자 또는 서로 다른 분자들로부터 존재할 수 있다. 영역들은 하나 또는 그 이상의 분자들 모두를 포함할 수 있으나, 더 일반적으로는 분자들 중 일부의 영역을 포함한다. 삼중-나선 영역의 분자들 중 하나는 때때로 올리고뉴클레오티드이다. 여기서 사용되는 것과 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"는 또한 하나 또는 그 이상의 변형된 염기를 포함하는 위에서 설명된 것과 같은 DNA들 또는 RNA들을 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유들을 위하여 변형된 백본(backbone)들을 갖는 DNA들 또는 RNA들은 그러한 용어가 여기서 의도되는 것과 같은 "폴리뉴클레오티드(들)"이다. 게다가, 이노신(inosine)과 같은 특이한 염기들, 또는 삼중(tritylated) 염기들과 같은 변형된 염기들을 포함하는 DNA들 또는 RNA들은 용어가 여기서 사용되는 것과 같은 폴리뉴클레오티드이다. 매우 다양한 변형들이 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA로 만들어져 왔다는 것을 이해할 것이다. 여기서 사용되는 것과 같은 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"는 폴리뉴클레오티드들의 화학적, 효소학적 또는 대사작용으로 변형된 형태들뿐만 아니라, 예를 들면, 간단하고 복잡한 세포들을 포함하는 바이러스들과 세포들의 DNA와 RNA 특징들의 화학적 형태들을 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오티드(들)"은 때때로 올리고뉴클레오티드(들)로서 언급되는 짧은 폴리뉴클레오티드들을 포함한다.
"폴리펩티드(들)"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결되는 두 개 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 모든 펩티드 또는 단백질을 언급한다. "폴리펩티드(들)"는 주로 펩티드들, 올리고펩티드들 및 올리고머들로서 언급되는 짧은 사슬들, 및 일반적으로 단백질들로서 언급되는 긴 사슬들 모두를 언급한다. 폴리펩티드들은 20종의 유전자가 인코딩된 아미노산 이외의 아미노산들을 포함할 수 있다. "폴리펩티드(들)"는 가공(processing) 및 다른 후-번역 변형들과 같은 자연적 가공, 또는 화학적 변형 기술들에 의해 변형된 것들을 포함한다. 그러한 변형들은 기본 문서 및 더 상세한 논문들뿐만 아니라 방대한 연구 문헌들에 존재하며, 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려져 있다. 동일한 형태의 변형은 주어진 폴리펩티드 내의 일부 위치에서 동일하거나 다양한 정도로 존재한다는 것이 이해될 것이다. 또한 주어진 폴리펩티드는 많은 형태의 변형들을 포함할 수 있다. 변형들은 펩티드 백본, 아미노산 측쇄(side-chain)들, 및 아미노 또는 카르복실 말단(terminal)들을 포함하는 폴리펩티드 내의 어느 곳에서도 발생할 수 있다. 변형들은 예를 들면, 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation), ADP-라이보실화(ribosylation), 아미드화(amidation), 플라빈의 공유 결합, 헴 모이어티(heme moiety)의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)의 공유 결합, 교차-결합(cross-linking), 고리화(cyclization), 이황화물(disulfide) 결합 형성, 탈메틸화(dimethylation), 공유 교차-결합들의 형성, 피로글루타메이트(pyroglutamate)의 형성, 포르밀화(formylation), 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI(Glucose Phosphate Isomerase) 앵커 형성, 히드록실화(hydroxylation), 요오드화(iodination), 메틸화, 미리스토일화(myristoylation), 산화, 단백질 가수분해 과정, 인산화, 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 지질 결합, 황산화, 글루타민산(glutamic acid) 잔기들의 감마-카르복실화, 히드록실화 및 ADP-리보실화, 셀레닐화(selenylation), 아르기닐화(arginylation)와 같은, 아미노산들의 단백질로의 운반 RNA 매개된 첨가, 및 유비퀴틴화(ubiquitination)을 포함한다. 폴리펩티드들은 분기될 수 있거나 또는 분기를 갖거나 분기를 갖지 않는 원형일 수 있다. 원형의 분기된, 그리고 분기된 원형의 폴리펩티드들은 후-번역 자연 가공들에 기인할 수 있으며, 또한 완전히 합성 방법들로 만들어질 수 있다.
"분리된(isolated)"은 자연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경된 것을 의미하는데, 즉, 만일 자연적으로 발생하면, 그것의 원래 환경으로부터 변하거나 또는 제거되었거나, 혹은 둘 모두 발생된다. 예를 들면, 생명체 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "분리되지" 않으나, 그것의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 용어가 여기서 사용되는 것과 같이, "분리된다". 유사하게, 여기서 사용되는 것과 같은, "합성" 서열은 합성으로 발생되었고 자연원으로부터 직접 분리되지 않은 모든 서열을 의미한다. "재조합(recombinant)"은 하나의 종으로부터 서로 다른 종의 숙주 생물의 세포들 내로 유전자들을 이식하거나 접합하여(splicing) 제작된 유전적으로 조작된 DNA를 의미한다. 그러한 DNA는 숙주(host)의 유전적 구성의 일부가 되고 복제된다.
여기서 사용되는 것과 같은 용어 "폴리펩티드를 인코딩한 폴리뉴클레오티드"는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 서열 목록의 서열 번호 2에 설명된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 알파-1,2,-푸코실트랜스페라제을 인코딩한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한다. 용어는 또한 코딩 및/또는 비-코딩 서열들을 포함할 수 있는 부가적인 영역들과 함께 폴리펩티드(예를 들면, 삽입된 파지(integrate phage) 또는 삽입 서열 또는 편집(editing)에 의해 중단된)를 인코딩하는 단일의 연속 영역 또는 불연속 영역들을 포함하는 폴리뉴클레오티드들을 포함한다.
여기서 사용되는 것과 같은 "이형(들)(variant(s))"은 각각 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와는 다르나 본질적인 특성들을 유지하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드이다. 폴리뉴클레오티드의 일반적인 이형은 또 다른 참조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 서열에서 서로 다르다. 이형의 뉴클레오티드 서열의 변화는 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경할 수 있거나 또는 변경할 수 없다. 뉴클레오티드 변화들은 아미노산 대체, 첨가, 삭제, 아래에 설명되는 것과 같은, 참조 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 내의 융합과 절단(truncation)들에 기인할 수 있다. 폴리펩티드의 일반적인 이형은 다른 참조 폴리펩티드와 아미노산 서열이 서로 다르다. 일반적으로, 차이들은 참조 폴리펩티드와 이형의 서열들이 전반적으로 매우 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 제한된다. 이형 및 참조 폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 대체, 첨가, 삭제의 조합에 의해 아미노산 서열이 다를 수 있다. 대체되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 코드에 의해 인코딩된 것일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다. 폴리뉴클레오티드들과 폴리펩티드들의 이형들은 대립 이형과 같은 자연적으로 발생하는 것일 수 있거나, 또는 자연적으로 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 이형일 수 있다. 비자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드들과 폴리펩티드들의 이형들은 돌연변이 유발, 기술, 직접적인 합성, 및 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 다른 재조합 방법들에 의해 만들어질 수 있다.
용어들 "알파-1,2-푸코실트랜스페라제" 또는 "푸코실트랜스페라제" 또는 "알파-1,2-푸코실트랜스페라제" 또는 "푸코실트랜스페라제"를 인코딩한 핵산/폴리뉴클레오티드는 공여체 기질, 예를 들면, GDP-푸코스로부터 알파-1,2-결합 내의 수용체 분자로 푸코스의 전달을 촉매하는 글리코실트랜스페라제를 언급한다. 수용체 분자는 탄수화물, 올리고당, 단백질 또는 당단백질, 혹은 지질 또는 당지질일 수 있으며, 예를 들면, N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine), N-아세틸락토사민(acetyllactosamine), 갈락토스, 푸코스, 시알산(cialic acid), 글루코오스, 락토스, 또는 그것들의 조합일 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, 또한 서열 목록의 서열 번호 1로부터의 핵산, 또는 서열 목록의 서열 번호 2로부터의 아미노산 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 대하여, 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 또는 그 이상의 아미노산들의 영역에 걸쳐, 약 60% 이상의 아미노산 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 805, 85%, 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 핵산/폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드 다형성 이형들, 대립유전자들, 및 종간 상동체들이 그러한 용어들에 의해 포함된다.
부가적으로, 알파-1,2,-푸코실트랜스페라제 폴리펩티드는 그것의 활성을 변형하기 위하여 펩티드 서열들의 첨가 또는 삭제들에 의해 변경될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드 서열들은 부가적인 효소 활성을 유발하기 위하여 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 폴리펩티드로 융합될 수 있다. 대안으로서, 단백질의 활성을 제거하거나 변형하도록 아미노산들이 삭제될 수 있다. 단백질은 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 효소 활성이 결핍되도록 변형될 것이나 여전히 그것의 구조적 3차원 구조를 유지할 것이다. 그러한 변형은 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 폴리펩티드에 대한 항체들의 개발에 유용할 것이다.
게다가, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자 산물들은 기능적으로 동등한 유전자 산물들을 나타내는 단백질들 또는 폴리펩티드들을 포함할 수 있다. 그러한 동등한 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자 산물은 위에서 설명된 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열 내의 아미노산 잔기들의 삭제, 첨가 또는 대체들을 포함할 수 있으나, 이는 조용한 변화를 야기하는데, 따라서 기능적으로 동등한 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자 산물을 생산한다. 아미노산 대체들은 극성의 유사성, 전하, 용해도, 소수성(hydrophobicity), 친수성, 및/또는 관련된 잔기들의 양친매성(amphiphatic) 본질을 기초로 하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산들은 알라닌(alanine), 류신(leucine), 이소류신, 발린(valine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 및 메티오닌(methionine)을 포함하고, planar 중성 아미노산들은 글리신(glycine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 티로신(tyrosine), 아스파라긴(asparagine), 및 글루타민(glutamine)을 포함하며, 양성의(염기성) 아미노산들은 아르기닌(arginine), 라이신(lysine), 및 히스티딘(histidine)을 포함하며, 음성의(산성) 아미노산들은 아스파르트 산(aspartic acid) 및 글루타민 산을 포함한다. 본 발명의 맥락 내에서, 여기서 사용되는 것과 같은 "기능적으로 동등한"은 항원성(antigenicity), 즉, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 항체를 결합하는 능력, 면역원성, 즉, 효소 활성뿐만 아니라, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 단백질 또는 폴리펩티드를 결합할 수 있는 항체를 발생시키기 위한 능력을 포함하나 이에 한정하지 않는, 다수의 기준 중 어느 것에 의해 판단되는, 위에 설명된 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자 서열에 의해 인코딩되는 내인성(endogenous) 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자 산물과 같은, 실질적으로 유사한 체내(in vivo) 활성을 나타낼 수 있는 폴리펩티드를 언급한다.
번역(translation) 동안에 또는 번역 후에 다르게 변형되는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 단백질들, 폴리펩티드들, 및 유도체들(단편(fragment)들을 포함하여)이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 게다가, 비고전적 아미노산들 또는 화학적 아미노산 유사체들이 대체 또는 첨가로서 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 폴리펩티드 서열 내로 도입될 수 있다.
알파-1,2-푸코실트랜스페라제 폴리펩티드는 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 기법들을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 코딩 서열들 및 적절한 전사 번역 제어 신호들을 포함하는 발현 벡터들을 구성하기 위하여 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려진 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 예를 들면, 체외(in vitro) 재조합 DNA 기술들, 합성 기술들, 및 체내 유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, Sambrook 등의 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)"가 참조된다.
여기서 사용되고 일반적으로 통상의 지식을 가진 자들에게 이해되는 것과 같은 "올리고당"은 적은 수의, 일반적으로 3개 내지 10개의 단당류를 포함하는 당 중합체를 언급한다.
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 위에서 주어진 것과 같은 핵산 서열을 포함하는 벡터가 제공되는데, 핵산 서열은 벡터로 전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 서열들을 제어하도록 작동가능하게 결합된다. 특히 바람직한 실시 예에서, 벡터는 발현 벡터이며, 본 발명의 또 다른 양상에 따라, 벡터는 플라스미드, 코스미드(cosmid), 파지, 리포솜(liposome), 또는 바이러스 형태로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 구성하는 서열을 포함하는 숙주 세포들에 관한 것이며, 위에서 설명된 것과 같이, 서열은 숙주 세포에 대한 외래 서열이며 서열은 숙주 세포의 게놈(genome) 내에 통합된다. 그렇게 함으로써, "숙주 세포에 대한 외래의"는 서열이 상기 숙주 세포 내에 자연적으로 발생하지 않는 것을 의미하는데, 즉, 서열은 숙주 세포에 대하여 이형(heterologous)이다. 외래 서열은 예를 들면, 감염(transfection), 형질전환, 또는 형질도입(transduction)에 의해 숙주 세포의 게놈 내로 안정적으로 도입될 수 있다. 서열이 도입되려는 숙주 세포에 의존할 기술들이 적용될 수 있다. 다양한 기술들이 통상의 지식을 가진 자들에게 알려져 있으며 예를 들면, 위의 Sambrook 등의 저서에 설명된다. 따라서, 안에 외래 서열이 도입된 숙주 세포는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 코딩되는 외래 단백질을 생산할 것이다.
재조합 생산을 위하여, 숙주 세포들은 본 발명의 발현 시스템 또는 그것들의 일부 또는 폴리뉴클레오티드들을 통합하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 1986년 Davis 등의 "Basic Methods in Molecular Biology" 및 위의 Sambrook 등에 의한 것과 같은, 많은 표준 실습 안내서들에서 설명된 방법들에 의해 영향을 받을 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 숙주 세포들 내로 안정적으로 형질전환/감염되는 벡터 내에 포함된다. 벡터 내에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 유도 프로모터(inducible promoter)에 제어되는데, 따라서 유전자/폴리뉴클레오티드의 발현이 명확하게 표적화될 수 있으며, 만일 원하면, 유전자는 그러한 방법으로 과발현될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드들을 사용하기 위하여 매우 다양한 발현 시스템이 사용될 수 있다. 그러한 벡터들은 그 중에서도 염색체의, 에피솜(episome)의, 그리고 바이러스 유래 벡터들, 예를 들면, 코스미드들 및 파지플라스미드(phagemid)들과 같은, 플라스미드 및 박테리오파지 유전적 구조요소들로부터 유래되는 것과 같은, 박테리아 플라스미드들, 박테리오파지, 트랜스포손(transposon), 이스트(yeast) 에피솜, 삽입 구성요소들, 이스트 염색체 구성요소들, 바이러스들, 그것들의 조합으로부터 유래되는 벡터들을 포함한다. 발현 시스템 구성들은 발현을 조절할 뿐만 아니라 일으키는 제어 영역들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드들을 유지하거나, 번식시키거나 또는 발현하는데 적합하거나 및/또는 숙주 내의 폴리펩티드를 발현하는데 적합한 어떠한 시스템 또는 벡터도 이와 관련하여 발현을 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, Sambrook 등의 저서에서 설명된 것과 같은, 잘 알려진 일반적인 다양한 기법들 중 어떠한 것에 의해 적절한 DNA 서열이 발현 시스템 내로 삽입될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 구성하는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다:
(a) 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열;
(b) 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열의 대립 이형, 상기 대립 이형은 서열 목록의 서열 번호 1에 도시된 핵산 분자의 반대편 가닥에 대한 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩되며;
(c) 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 분자의 오솔로그(ortholog)의 아미노산 서열, 상기 오솔로그는 서열 목록의 서열 번호 1에 도시된 아미노산 분자의 반대편 가닥에 대한 엄격한 조건 하에서 교잡하는 핵산 분자에 의해 인코딩되며; 및
(d) 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열의 단편, 상기 단편은 적어도 10개의 연속적인 아미노산을 포함하고 상기 단편은 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는다.
용어 "엄격한 조건들"은 프로브(probe)가 그것의 표적 서브시퀀스(subsequence)를 혼성화하나, 다른 서열들은 혼성화하지 않는 조건들을 언급한다. 엄격한 조건들은 서열 의존적이며 서로 다른 상황에서 다를 것이다. 긴 서열들은 특히 높은 온도에서 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 조건들은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열을 위한 열 용융점보다 약 15 C 낮도록 선택된다. 용융점은 표적 서열에 상보적인 프로브들의 50%가 평형 상태에서 표적 서열로 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에서)이다. 바람직한 엄격한 혼성화 조건들은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드(formamide), 5x SSC(saline-sodium citrate), 및 1% SDS, 42C에서 배양, 또는, 65C에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS에서 세척과 함께, 5x SSC, 1% SDS, 63C에서 배양.
또한, 본 발명은 위에서 정의된 것과 같은 벡터를 포함하거나, 또는 숙주 세포의 게놈 내에 도입된 이종 서열로서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포, 특히, 이스트를 포함하는 균류, 박테리아, 곤충, 동물 및 식물 세포들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 숙주 세포에 관한 것이다. 만일 숙주 세포가 대장균 세포이면 이는 특히 바람직하다.
여기서 사용되는 것과 같이, 용어 "숙주 세포"는 여기서 전환되거나 감염되거나, 혹은 외생(exogenous) 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환 또는 감염될 수 있는 세포로서 정의된다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템들이 본 발명의 서열을 코딩하는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자를 발현하도록 사용될 수 있다. 그러한 숙주-발현 시스템들은 흥미 있는 코딩 서열이 생산되고 그 뒤에 정제될 수 있는 수단들을 나타내나, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 감염될 때, 본 발명의 인 사이투(in situ) 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 유전자 산물을 나타내는, 세포들을 나타낸다.
예를 들면, 국제특허 WO/0026383 및 유럽특허 EP 1 243 647에서 다수의 적합한 발현 시스템들 및 숙주들이 알려질 수 있는데, 이들은 헬리코박터 파일로리로부터의 알파-1,2-푸코실트랜스페라제를 다루며, 여기서 참조로써 언급된다.
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산이 각각의 세포의 코돈 사용에 적용된다.
본 발명은 또한 각각 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질의 생산을 위한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 폴리펩티드의 사용에 관한 것이다.
그렇게 함으로써, 사용의 일 양상에 따라, 상기 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질의 생산은 알파-1,2-푸코실트랜스페라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 이종 또는 상동 발현에 의해 실행된다.
사용의 또 다른 양상에 따라, 푸코실화 올리고당은 2'-푸코실락토스와 같은, 인간 모유로부터 알려진 올리고당이다.
본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다:
a. 본 발명에 따른 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계,
b. 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로의 푸코스 잔기의 전달을 촉진하는 조건들 하에서 단계 a의 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 푸코스 잔기를 포함하는 공여체 기질, 및 모노- 또는 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 포함하는 수용체 기질을 포함하는 혼합물과 접촉하는 단계, 그렇게 함으로써 푸코실화 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 생산하는 단계.
본 발명에 따라, 푸코실화 올리고당들을 생산하기 위한 방법은 무세포(cell-free) 시스템 또는 세포들을 포함하는 시스템들에서 실행될 수 있다. 기질들은 효소적 산물의 형성을 허용하기 위하여 충분한 시간 동안 그리고 충분한 조건들 하에서 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 폴리펩티드와 반응하도록 허용된다. 이러한 조건들은 시스템이 무세포 또는 세포 기반 시스템이든지 간에, 기질 및 효소의 양과 순도에 따라 다양할 것이라는 것을 이해하여야 한다. 이러한 변수들은 통상의 지식을 가진 자들에 의해 쉽게 조정될 수 있다.
무세포 시스템들에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 수용체 기질(들), 공여체 기질(들) 및, 경우에 따라, 다른 글리코트랜스페라제들과 보조 효소(accessory enzyme)들을 포함하는 다른 반응 혼합 성분들은 수성(aqueous) 반응 배지에서의 혼합에 의해 결합된다. 효소들은 용액 내에서 사용될 수 있거나 또는 중합체와 같은 서포트(support)에 결합되거나 고정될 수 있으며 기질들이 서포트에 첨가될 수 있다. 서포트는 예를 들면, 칼럼(column) 내에 패킹될 수 있다.
푸코실화 올리고당들의 합성을 위한 세포를 포함하는 시스템들은 재조합형으로 변형된 숙주 세포들을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 다음의 단계들을 포함하는 푸코실화 올리고당들, (당)단백질들 및 (당)지질들을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다:
a. 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질의 생산을 허용하고, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적절한 영양 조건들 하에서, 위에서 설명된 것과 같은 숙주 세포를 성장시키는 단계;
b. 단계 a와 동시에 또는 그 뒤에, 숙주 세포 내에 발현되는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코스 잔기의 전달을 촉매하기 위하여, 푸코스 잔기를 포함하는 공여체 기질 및 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 포함하는 수용체 기질을 제공하는 단계, 그렇게 함으로써 푸코실화 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 생산하는 단계; 및
c. 상기 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질을 숙주 세포 또는 그것의 성장 배지로부터 분리하는 단계.
본 발명에 따른 방법에서, 공여체 기질은 GDP-푸코스일 수 있다. 만일 공여체 기질이 GDP-푸코스이면 이는 특히 바람직하다.
본 발명의 일 양상에 따라, 수용체 기질은 N-아세틸글루코사민, N-아세틸락토사민, 갈락토스, 푸코스, 시알산, 글루코오스, 락토스 또는 그것들의 조합으로부터 선택된다. 특히, 수용체 기질로서 락토스가 바람직하다.
여기서 사용되는 것과 같은, 용어 "기질"은 푸코실화 올리고당들, (당)단백질들 또는 (당)지질들을 생산하기 위하여 본 발명의 폴리펩티드에 의해 반응될 수 있는 어떠한 물질 또는 서로 다른 물질들의 조합을 의미한다.
기질들은 효소적 산물의 형성을 허용하기 위한 충분한 시간 동안 그리고 충분한 조건들 하에서 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 폴리펩티드에 반응하도록 허용된다. 이러한 조건들은 시스템이 무세포 또는 세포 기반 시스템이든지 간에, 기질 및 효소의 양과 순도에 따라 다양할 것이라는 것을 이해하여야 한다. 이러한 변수들은 통상의 지식을 가진 자들에 의해 쉽게 조정될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 일 양상에 따라, 그것이 숙주 세포 내에 생산되도록 하게 함으로써 공여체 기질이 단계 b에서 제공된다. 그렇게 함에 있어서, 예를 들면, 숙주 세포에 첨가되는 푸코스의 GDP-푸코스로의 효소 전환이 숙주 세포 내에 동시에 발현된다. 이러한 효소는 예를 들면, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)로부터의 Fkp(fucose pyrophosphorylase)와 같은, 이작용기(bifunctional) 푸코스 키나제(fucose kinase)/푸코스-1-포스페이트 구아니릴트랜스페라제(fucose1-phosphate guanylyltransferase), 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens), 수스 스크로파(Sus scrofa) 및 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus)를 포함하는 일부 종들로부터 알려진 것과 같은 하나의 분리된 푸코스-1-포스페이트 구아니릴트랜스페라제와 함계 하나의 분리된 푸코스 키나제의 조합일 수 있다.
대안으로서, 단계 b에서, 공여체 기질은 배양 배지/숙주 세포들에 첨가될 수 있거나 또는 세포 고유의 대사에 의해 생산될 수 있다.
또 다른 실시 예에서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
a) ⅰ) 첨부된 서열 목록으로부터의 서열 번호 1, ⅱ) 서열 번호 1에 상보적인 핵산 서열, 및 ⅲ) ⅰ)과 ⅱ)에서 정의되는 핵산 서열들에 대한 엄격한 조건들 하에서 혼성화하는 핵산 서열들 또는 그것들의 상보적인 가닥들로부터 선택되는 핵산 서열이 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 펩티드로서 발현되도록 하기 위한 적절한 영양 조건들 하에서, ⅰ), ⅱ), 및 ⅲ)으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하도록 변환되거나 또는 감염된 숙주 세포들을 성장시키는 단계;
b) 단계 a와 동시에 또는 그 뒤에, 숙주 세포 내에 발현되는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코스 잔기의 전달을 촉매하기 위하여, 푸코스 잔기를 포함하는 공여체 기질 및 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 포함하는 수용체 기질을 제공하는 단계, 그렇게 함으로써 푸코실화 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 생산하는 단계; 및
c) 상기 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질을 숙주 세포 또는 그것의 성장 배지로부터 분리하는 단계.
본 발명에 따른 방법들에서, 숙주 세포 내에 발현되는 펩티드는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 나타내며, 따라서 공여체, 예를 들면, 구아노신-디포스페이트 푸코스(guanosine-diphophate fucose)로부터 올리고당들, (당)단백질들 및 (당)지질들을 포함하는 수용체로 푸코스 잔기를 전달한다. 이러한 방법으로, 푸코실화 수용체 기질은 유아식의 보완을 위한 식품 첨가제로서, 또는 치료 혹은 약학적으로 활성의 화합물로서 사용될 수 있다. 신규의 방법들로, 푸코실화 산물들은 복잡하고 시간과 경비가 많이 드는 합성 과정들의 필요 없이, 쉽고 효율적으로 제공될 수 있다.
여기서 사용되는 것과 같은, 용어 "분리하는"은 본 발명에 따른 알파-1,2-푸코실트랜스페라제에 의해 생산되는 산물을 유전자 발현 시스템으로부터 수확하거나, 수집하거나 또는 분리하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 획득되는 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질뿐만 아니라, 푸코실화 올리고당들, (당)단백질들 및/또는 (당)지질들의 생산을 위하여 위에서 설명된 것과 같은 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 폴리펩티드의 사용에 관한 것이다.
또 다른 실시 예에 따라, 상기 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질의 생산은 알파-1,2-푸코실트랜스페라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 이형 또는 상동 (과)발현에 의해 실행된다.
달리 표현되지 않는 한, 여기서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명에 속하는 통상의 지식을 가진 자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 여기서 사용되는 명명법 및 위에서 설명되고 아래에 설명될 세포 배양, 분자 유전학, 유기 화학과 핵산 화학 및 혼성화에서의 실험 절차는 잘 알려져 있으며 종래에 통상적으로 사용되는 것들이다. 핵산과 펩티드 합성을 위하여 표준 기법들이 사용된다. 일반적으로 효소 반응들 및 정제 단계들은 제조사의 사양에 따라 실행된다.
본 발명은 또한 여기에 개시되는 폴리뉴클레오티드 서열들의 단편들을 포함한다.
또 다른 장점들이 실시 예들의 설명 및 첨부된 도면들에서 설명된다.
위에서 언급된 특징들 및 아래에 설명될 특징들은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고, 각각의 명시된 조합들뿐만 아니라, 다른 조합들 또는 독자적으로 사용될 수 있다는 것은 말할 것도 없다.
본 발명의 일부 예들이 도면들 내에 도시되고 다음의 설명에서 상세히 설명된다.
도 1a는 대장균 O126으로부터 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 WbgL을 위한 유전자 코딩의 DNA 및 아미노산 서열을 도시한다.
도 1b는 pET22bHIS6PropwbgL의 벡터 맵, 즉, N-터미널 His-Tag 을 코딩하기 위한 18 bp 및 스타필로코쿠스 하이쿠스(Staphylococcus Hyicus)의 프로펩티드로부터의 621 bp가 이전에 Ndel/BamHI를 통하여 첨가된 pET22b(+)(Novagen사, 다름슈타트, 독일) 내로 클로닝된 신규 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 WbgL을 인코딩하는 대장균 O126으로부터 코돈 최적화된 유전자 wbgL을 도시한다.
도 1c는 pACYC-wbgL의 벡터 맵, 즉, pACYCDuet-1(Novagen, Ncol/BamHI를 통하여) 내로 클로닝된 신규 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 WbgL을 인코딩하는 대장균 O126으로부터 코돈 최적화된 유전자 wbgL을 도시한다.
도 2는 IMAC Ni2+-NTA 세파로오스(Sepharose) 칼럼(청색: 280 ㎚에서 흡수, 적색: 전도도; 칼럼으로부터 분리하는 His6-프로펩티드-WbgL을 포함하는 단편들을 IMAC 도구로 명칭)에 의한 WbgL 정제의 크로마토그램을 도시한다.
도 3은 대장균 JM109(DE3) pET22bHIS6PropwbgL의 조추출액(crude extraction) 및 불용성 단편들에서뿐만 아니라 His6-프로펩티드WbgL의 정제 및 정제된 His6-프로펩티드WbgL의 세척 단편들에서의 His6-프로펩티드-WbgL 발현의 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 4는 DAB 기질(Roche Diagnostics, 만하임, 독일)로의 배양 후에 겨자무과산화효소(horse radish peroxidase, HRP, 이하 HRP로 표기) (Roche Diagnostics, 만하임, 독일)에 접합된 단일클론 항-His6-항체를 사용하여 면역블롯 상의 His6-프로펩티드-WbgL의 검출을 도시한다.
도 5는 활성도가 NADH의 산화에 의해 340 ㎚에서 흡수의 감소에 의해 검출될 수 있는, 0.4 mM GDP-베타-L-푸코스 및 5mM 락토스로 정제된 His6-프로펩티드-WbgL의 연속 광도 분석을 도시한다.
도 6은 2'-푸코실락토스가 존재하지 않는 반응의 시작(A); 및 2 mM GDP-베타-L-푸코스 및 5mM 락토스로의 WbgL 반응의 1시간 후에 생산된 2'-푸코실락토스(B);에서 HPAEC-PAD에 의한 WbgL 반응으로부터 2'-푸코실락토스 생산의 검출을 도시한다.
도 7은 GDP-베타-L-푸코스만이 검출될 수 있는 반응의 초반(A); 및 WbgL 활성에 의해 방출되는 GDP의 열화로서 구아노신만이 검출될 수 있는 반응의 16시간 후(B);에서 모세관 전기영동에 의한 2 mM GDP-푸코스와 5 mM 락토스 및 WbgL로 시작된 반응 혼합물의 분석을 도시한다.
도 8은 50 mM Tris-HCl 버퍼 내의 서로 다른 pH 값들(pH 6.8 내지 8.4)에서 WbgL의 상대 활성도를 도시한다.
도 9는 16시간의 반응 과정 동안에 서로 다른 시점들에 2 mM GDP-베타-L-푸코스 및 5 mM 락토스로 시작된 WbgL 반응에서 측정된 것과 같이 2'-푸코실락토스 농도의 증가를 도시한다.
도 10은 고성능액체크래마토그래피(HPLC, 이하 HPLC로 표기) 크래마토그램; 용리제로서 물을 갖는 Phenomenex Rezex RCM Ca2+ 칼럼에 의한 분리(80℃에서 30분간 0.6 ㎖/분) 및 굴절률 검출기(Shimadzu, 독일)에 의한 검출(A); 및 HPLC 크래마토그램; 용리제로서 아세토니트릴/물(68:32)을 갖는 Reprosil Carbohydrate 칼럼(5 ㎛, 250x4.6 ㎜)에 의한 분리(35℃에서 20분간 1.4 ㎖/분) 및 굴절률 검출기(Shimadzu, 독일)에 의한 검출(B);을 도시한다.
도 11은 WbgL에 의해 생산된 2'-푸코실락토스의 NMR 스펙트럼을 도시한다.
실시 예
유전자의 클로닝
추정되는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 WbgL의 세포질 발현을 위하여, 발현 벡터 pET22b(+) (Novagen사, 다름슈타트, 독일)가 변형되었다. 따라서, 대장균 내의 주변세포질(periplasmatic) 발현에 이르게 하는 pelB 선도 서열(leader sequence)이 제한 효소들 NdeI 및 BamHI를 사용하여 절단되었다. 스타필로코쿠스 하이쿠스의 리파아제(Sauerzapse, B., D. J. Namdijou 등 (2008): "Characterization of recombinant fusion constructs of human beta-1,4-galactosyltransferase 1 and the lipase pre-propeptide from Staphylococcus hyicus." Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 50(2-4): 128-140)의 프로펩티드 유전자 서열(서열 목록의 서열 번호 3)이 프라이머들 5'-C-A-T-A-T-G-C-A-C-C-A-C-C-A-C-C-A-C-C-A-C-C-A-C-A-A-T-G-A-T-T-C-G-A-C-A-A-C-A-C-A-A-A-C-A-A-C-G-A-C-3'(서열 목록의 서열 번호 5) 및 3'-G-G-A-T-C-C-G-T-A-T-G-G-T-T-T-T-T-T-G-T-C-G-C-T-C-G-C-T-T-G-5'(서열 목록의 서열 번호 6)을 사용하여 플라스미드 pLGalT 38로부터 증폭되었으며, 벡터 pET22bHIS6Prop를 야기하는 변형된 벡터 pET22b로 융합되었다. 결과로서 생긴 벡터는 BAMHI 및 Xhol에 의해 소화되었다. 대장균 O126으로부터 추정되는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 WbgL을 위한 유전자 코딩이 제한 위치들 BAMHI 및 Xhol을 포함하는 Geneart(레겐스버그, 독일)에 의해 합성되었다. 벡터 pET22bHIS6Prop 내로의 결찰(ligation)은 발현 벡터 pETHIS6PropwbgL을 주었는데(도 1a 참조), 이는 이소프로필 티오갈락토시드(isopropyl thiogalactoside, IPTG)로의 유도 후에 대장균의 세포질 내에 His6-프로펩티드-WbgL(613 아미노산)을 생산한다. 대안으로서, 유전자 wbgL은 벡터 pACYC-wbgL을 생산하기 위하여, 프라이머들 5'-G-A-T-C-A-C-C-A-T-G-G-G-C-A-G-C-A-T-T-A-T-T-C-G-T-C-T-G-C-A-G-G-G-T-G-G-T-C-3'(서열 목록의 서열 번호 7) 및 5'-G-A-T-C-A-G-G-A-T-C-C-T-T-A-G-C-A-G-C-T-G-C-T-A-T-G-T-T-T-A-T-C-A-A-C-G-T-T-G-A-T-C-C-3'(서열 목록의 서열 번호 8)을 사용하는 증폭 후에 Ncol/BamHI을 통하여 벡터 pACYCDuet-1(Novagen사, 다름슈타트, 독일) 내로 클로닝되었다(도 1b참조). 플라스미드들의 번식을 위하여 대장균 Nova Blue(Norvagen사, 다름슈타트, 독일) 또는 대장균 TOP10(Invitrogen사, 다름슈타트, 독일)가 사용되었으며 His6-프로펩티드-WbgL의 발현을 위하여 대장균 JM109(DE3)(Promega
Figure pct00001
, 매디슨, 미국)가 사용되었다.
푸코실트랜스페라제들의 배양 및 발현
형질전환체(tranformant)들은 100 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)을 갖는 20 ㎖ LB(Luna-Bentani) 배지를 포함하는 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 성장되었으며 37℃ 및 130 rpm에서 하룻밤 동안 배양되었다. 단백질 생산을 위하여 세포들은 세포들은 37℃ 및 80 rpm에서 1000 ㎖ TB(Terrific Broth) 배지를 갖는 5L 에를렌마이어 플라스크에서 성장되었다. lacZ의 유도는 이소프로필 티오갈락토시드를 0.1 mM의 최종 농도로 배양액들(OD600 = 0.6∼0.8)에 첨가함으로써 수행되었다. 배양은 25℃에서 20시간 동안 계속되었으며 원심분리에 의해 세포들이 최종적으로 수확되었다.
효소 정제
50mM Tris-HCl 버퍼 pH 7.6 내의 대장균 세포들의 40%(w/w) 세포 현탁액이 초음파처리(sonication, 4x15 s)에 의해 분열되었다. 원심분리(15000 rpm, 30분) 이후에 펠릿들은 SDS-PAGE에 의해 내용물들 생산의 분석을 위하여 보존되었다. 이전에 100 ㎖ 50 mM Tris-HCl pH 7.6(버퍼 A)으로 평형이 유지된, Ni2+-NTA 세파로오스 (Qiagen
Figure pct00002
, 힐덴, 독일)를 사용하여 IMAC 칼럼(0.8 ㎠ x 10 ㎝, 1.5 ㎖/분) 상에 조추출액(15 ㎖)이 로딩되었다. 0.3 M NaCl 및 20 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 버퍼 B로의 세척 단계 이후에 단백질들이 버퍼 C(50 mM Tris-HCl pH 7.6, 0.3 M NaCl 및 300 mM 이미다졸) 내의 300 mM 이미다졸의 농도에 의해 용리되었다. 모든 단편이 단백질 농도 및 효소 활성도를 위하여 분석되었다. 버퍼 C를 갖는 용리제로부터 활성 용해성 WbgL을 포함하는 모든 단편이 수집되었으며 결과로서 생긴 용액은 IMAC 풀(pool)로 불린다(도 2 참조).
SDS - PAGE ( sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ) 및 웨스턴 블롯(Western Blot)을 통한 검출
His6-프로펩티드-WbgL의 발현은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 모니터링되었다. 따라서 SDS-PAGE 분석은 Invitrogen
Figure pct00003
(Invitrogen
Figure pct00004
, 페이즐리, 영국)의 겔 캐스팅 사양에 따라 캐스팅된 10% 아크릴아미드(acrylamide) 겔들과 함께 실행되었다. 단백질 샘플들(40 ㎍)이 겔의 각각의 슬롯 상에 로딩되었다. 분자 질량의 결정을 위하여 Prestained Protein Ladder PageRulerTM(Fermentas
Figure pct00005
, 빌뉴스, 리투아니아)이 사용되었다. 단백질 겔들은 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색되었다(도 3 참조).
His6-프로펩티드-WbgL을 검출하기 위하여 특정 항-His6-항체를 사용하여 면역블롯(immunoblot)이 실행되었다. 따라서 대장균 JM109(DE3)의 세포 잔여물(cell debris)의 샘플들, 조추출액 및 IMAC 단편들 내의 His6-프로펩티드-WbgL이 SDS-PAGE 겔들 상에서 분리되었고 NuPAGE Western 전달 프로코콜(BioRad사, 뮌헨, 독일)에 의해 PVDF 막들 상으로 전달되었다. 막들은 TBS 버퍼(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.2)에서 3% BSA로 차단되었다. 특정 결합을 위하여 HRP(Roche Diagnostics사, 만하임, 독일)에 접합된 단일클론 항-His6-항체가 사용되었다. 0.1% Tween 20을 포함하는 TBS 버퍼로의 세척 후에 블롯들은 DAB 기질(Roche Diagnostics사, 만하임, 독일)과 함께 배양되었고 용액의 제거와 증류수의 첨가에 의해 HRP 반응이 중단되었다.(도 4 참조).
활성도 분석
2'-푸코실락토스의 측광 분석 및 HPAGE-PAD 분석에 의해 조추출액 및 IMAC 단편들 내의 His6-프로펩티드-WbgL의 효소 활성도가 결정되었다.
측광 분석은 방출된 GDP의 검출을 위하여 피루브산 키나아제/젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase) 시스템을 사용하여 실행되었다(Barratt, D. H., L. Barber 등. (2001). "Multiple, distinct isoforms of sucrose synthesis in pea". Plant Physiology 127(2): 655-664.). 마이크로티터 플레이트(microtiter plate) 분석을 위한 반응 혼합물에 250 ㎕의 전체 볼륨에서 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 2 mM GDP-베타-L-푸코스, 5 mM 락토스, 1 mM 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate), 1 mM DTT, 0.25 mM NADH, 2 mM MnCl2, 5 U 피루브산 키나아제, 및 5 U 젖산 탈수소효소가 포함되었다. 반응은 100 ㎕ 효소 용액의 첨가 및 그 후에 30℃에서 340 ㎚에서 시작되었다. 부반응들의 검출을 위한 대조 실험들이 수용체 기질 락토스 없이 수행되었다(도 5 참조).
2'-푸코실락토스의 검출을 위하여 HPAEC-PAD 분석에 의해 효소 활성이 또한 결정되었다. 분석 용액에 175 ㎕의 전체 볼륨에서 2 mM GDP-베타-L-락토스, 5 mM 락토스, 2 mM MnCl2 내의 50 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM DTT, 1 U 알칼리 인산염(alkaline phosphate)이 포함되었고 175 ㎕ 조추출액 및 정제된 효소 용액의 첨가 후에 30℃에서 배양되었다. 반응은 전환율이 선형인 서로 다른 시점들에서 95℃에서 5분간 가열에 의해 중단되었다. 원심분리된 샘플들은 ChromeleonTM 6.40 소프트웨어를 사용하여 CarboPac PA1 칼럼 상에서 Dionex HPAEC-PAD(Dionex Corporation, 서니베일, 캘리포니아, 미국)에 의해 분석되었다. 용출은 30℃에서 50 mM NaOH로 수행되었다(유동 비율 1 ㎖/분, 50 ㎕ 주입 볼륨). 발생된 삼당류 2'-푸코실락토스가 상업적으로 이용가능한 2'-푸코실락토스와 함께 표준 교정 곡선에 의해 결정되었고 그 뒤의 효소 활성도의 계산을 위하여 사용되었다(도 6 참조).
HPAGE-PAD 및 측광 분석 모두를 위하여, 1 U의 His6-프로펩티드-WbgL가 표준 분석 조건 하에서 분 당 1 μ몰 산물(GDP 또는 2'-푸코실락토스)을 생산하는 효소의 양이다.
UV 검출기가 장착된, Beckman Coulter(크레펠트, 독일)로부터의 P/ACE MDQ 장치상의 모세관 전기영동에 의해 GDP-베타-L-푸코스 및 그 소비가 분석되었다. 활성화된 공여체 기질 GDP-베타-L-푸코스의 결정을 위한 샘플들이 5분 동안의 가열(95℃)에 의해 중단되었고 15000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었다(Rotina 35R, Hettich, 터틀링겐, 독일). 50 mM NA2B4O7 x 10 H2O/64 mM 붕산(boric acid) 버퍼, pH 8.9를 갖는 미처리 용융 실리카 모세관(I.D. 75 ㎜, 57 ㎝ 전체 모세관 길이, 검출기에 대하여 50 ㎝) 상에서 검출이 달성되었다. 이동 및 검출을 위한 조건은 각각 25.8℃에서 25 kV(23 mA) 및 254 ㎚에서의 UV 검출이었다. 샘플들이 압력(순 반향으로 0.5 psi에서 5.0초)에 의해 주입되었다(도 7 참조). GDP-베타-L-푸코스 및 발생된 구아노신의 정체성은 상업적으로 이용가능한 기질들로 확인되었다.
최적 pH 및 금속 이온 의존도
재조합 His6-프로펩티드-WbgL의 활성도를 위한 최적 pH 값을 연구하기 위하여, pH 6.8 내지 8.4 범위의 50 mM Tris-HCL 버퍼의 서로 다른 pH 값들에서 분석이 실행되었다. 최적 pH 값은 7.6이었다(도 8 참조). 금속 이온들 Mn2 +의 표준 분석으로의 첨가는 금속 이온 의존도를 관찰하는 것을 허용하였다. 효소는 Mn2 + 이온들에 의존하지 않는 것으로 나타났다.
동역학적( kinetic ) 분석
수용체 기질 락토스 및 공여체 기질 GDP-베타-L-푸코스에 대한 His6-프로펩티드-WbgL의 동역학 상수들은 위에서 설명된 광도측정 분석을 사용하여 가변 기질 농도들에서 초기 비율 분석으로부터 유래되었다. GDP-베타-L-푸코스는 10 mM 락토스의 일정한 농도에서 0.02 mM부터 4 mM까지 변경되었으며 락토스는 2 mM GDP-베타-L-푸코스의 농도에서 0.05부터 40 mM까지 변경되었다. 모든 데이터는 Sigma Plot 10 소프트웨어(SPSS Science Software GmbH, 에어크라트, 독일)을 사용하여 미카엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 방정식에 따른 비선형-회귀 분석에 의해 결정되었다.
테이블 1. 재조합 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 His6-프로펩티드-WbgL의 동역학 상수.
Figure pct00006

수용체 기질 스펙트럼 연구들
재조합 His6-프로펩티드-WbgL의 기질 스펙트럼이 위에서 설명된 활성 분석에 따른 HPAEC-PAD를 사용하여 분석되었다. 5 mM 락토스 대신에 락토스와 비교하여 상대적인 활성도를 결정하기 위하여 서로 다른 수용체 기질들이 테스트되었다.
테이블 2. 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 His6-프로펩티드-WbgL의 수용체 스펙트럼.
Figure pct00007

푸코실화 화합물들의 생산
대장균 BL21(DE3) lacZ pDEST14-fkp pCOLA-lacY-fucP 세포들이 적합한 푸코실트랜스페라제 유전자를 지니는 pACYCDuet-1으로 변환되었다. 콜로니들은 적절한 항생제들을 갖는 2YT 플레이트 상에서 성장되었다. 5 ㎖ 오버나이트(overnight) 배지들(항생제들을 갖는 2YT)에 각각의 균주들이 성장되었으며 이러한 배양액들로부터 15 ㎖ 무기물 배지가 각각 1%로 접종되었다. 세포들은 탄소원으로 글리세롤을 사용하여 성장되었으며 OD600=0.5에서 0.1 mM 이소프로필 티오갈락토시드 및 40 mM 락토스로 유도되며 30 mM 푸코스가 첨가되었다. 배양액들은 30℃에서 120 rpm으로 배양되었다. 2'-푸코실락토스의 생산은 HPLC 분석으로 모니터링되었다. 대장균 O126으로부터의 WbgL의 발현과 비교하여 헬리코박터 파일로리로부터의 FucT2의 발현에 의해 생산되는 2'-푸코실락토스(2'-FL)의 양의 비교가 테이블 3에 도시된다.
테이블 3. 헬리코박터 파일로리로부터의 FucT2 및 대장균 O126으로부터의 WbgL 알파-1,2-푸코실트랜스페라제를 사용하는 2'-푸코실락토스 생산의 양의 비교.
Figure pct00008

테이블 3에서 알 수 있는 것과 같이, 푸코실화 산물 2'-푸코실락토스의 양은 종래 기술인, 헬리코박터 파일로리로부터의 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 FucT2와 비교하여, 본 발명에 따른 알파-1,2-푸코실트랜스페라제, 즉 대장균 O126으로부터의 WbgL을 사용할 때 상당히 높았다.
푸코실화 산물의 정제
위에서 설명된 것과 같이 생산되는 2'-푸코실락토스가 몇몇 단계들에서 정제되었다. 첫 번째 단계는 활성탄(activated charcoal) 상의 흡착에 의한 정제이었다. 생산 단계로부터의 배양 상청액이 활성탄의 베드(bed)에 적용되었다. 통과액이 수집되고 분석되었으나, 나머지 2'-푸코실락토스는 검출되지 않았다. 예를 들면, 염(salt)들과 아미노산들과 같은 불특정하게 묶인 배지 화합물들의 제거를 위하여, 베드는 증류수로 세척되었다(통과액 내에 2'-푸코실락토스 없음). 2'-푸코실락토스 및 나머지 락토스와 푸코스는 그리고 나서 96% 에탄올로 용출되었다. 에탄올은 그 뒤에 회전 증발기에서 증발되고 나머지는 10 kDa 크로스플로 모듈(crossflow module, Microdyn Nadin, 독일)을 통하여 여과되었다. 나머지 염들은 전기투석에 의해 제거되었으며 그 후에 내독소(endotoxin)들이 크로스플로 모듈(Pall, 독일)을 사용하여 여과에 의해 제거되었다. 2'-푸코실락토스는 그리고 나서 프릿(frit)을 갖는 520 ㎜ x 420 ㎜ 유리 칼럼 내로 패킹된 겔 투과 크로마토그래피 물질 Biogel P-2(Biorad사, 독일)를 사용하여 그램 스케일로 락토스와 푸코스로부터 분리되었다. 2'-푸코실락토스의 정제는 얇은 층 크로마토그래피(thin layer chromatography)에 의해 모니터링되었다. 2'-푸코실락토스만을 포함하는 단편들이 수집되었고 동결 건조되었다.
산물의 정체성의 확인
본 발명에 존재하는 푸코실트랜스페라제를 사용하여 생산된 정제된 2'-푸코실락토스가 1H-NMR에 의해 분석되었다(도 11 참조). 결과로서 생긴 스펙트럼은 2'-푸코실락토스 표준(Dextra사, 레딩, 영국)을 위하여 받은 스펙트럼과 일치하였다. 이에 더하여, 결과로서 생긴 2'-푸코실락토스의 정체성을 입증하기 위하여 서로 다른 HPLC 방법들이 적용되었다. 위에서 설명된 것과 같이 HPAEC-PAD가 적용되었다. 다른 방법들은 용리제로서 물을 갖는 Phenomenex사 Rezex RCM Ca2+ 칼럼(80℃에서 30분 동안 0.6 ㎖/분; 굴절률 검출기(Shimadzu사, 독일)에 의한 검출)을 사용하는 분리(도 10b 참조) 및 용리제로서 아세토니트릴/물(68:32)를 갖는, Reprosil사 Carbohydrate, 5㎛, 250 x 4.6 ㎜(35℃에서 20분 동안 1.4㎖/분; 굴절률 검출기(Shimadzu사, 독일)에 의한 검출)를 사용하는 분리(도 10b 참조)이다.
SEQUENCE LISTING <110> Jennewein Biotechnoloie GmbH <120> Novel fucosyltransferases and their applications <130> 2827P104WO <160> 8 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 894 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgagcatta ttcgtctgca gggtggtctg ggtaatcagc tgtttcagtt tagctttggt 60 tatgccctga gcaaaattaa tggtacaccg ctgtatttcg acattagcca ttatgccgaa 120 aacgatgatc atggtggtta tcgtctgaat aatctgcaga ttccggaaga atatctgcag 180 tattataccc cgaaaattaa taatatttat aaactgctgg tgcgtggcag ccgtctgtat 240 ccggatattt ttctgtttct gggcttttgc aacgaatttc atgcctatgg ctacgatttt 300 gaatatattg cccagaaatg gaaaagcaaa aaatacattg gctactggca gagcgaacac 360 ttttttcata aacatattct ggacctgaaa gaatttttta ttccgaaaaa tgtgagcgaa 420 caggcaaatc tgctggcagc aaaaattctg gaaagccaga gcagcctgag cattcatatt 480 cgtcgtggcg attatattaa aaacaaaacc gcaaccctga cacatggtgt ttgtagcctg 540 gaatattata aaaaagccct gaacaaaatc cgcgatctgg caatgattcg tgatgtgttt 600 atctttagcg acgatatctt ctggtgcaaa gaaaatattg aaaccctgct gagcaaaaaa 660 tataatattt 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Ala Lys Ile Leu Glu Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ile His Ile 145 150 155 160 Arg Arg Gly Asp Tyr Ile Lys Asn Lys Thr Ala Thr Leu Thr His Gly 165 170 175 Val Cys Ser Leu Glu Tyr Tyr Lys Lys Ala Leu Asn Lys Ile Arg Asp 180 185 190 Leu Ala Met Ile Arg Asp Val Phe Ile Phe Ser Asp Asp Ile Phe Trp 195 200 205 Cys Lys Glu Asn Ile Glu Thr Leu Leu Ser Lys Lys Tyr Asn Ile Tyr 210 215 220 Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Gln Glu Glu Asp Leu Trp Leu Met Ser Leu 225 230 235 240 Ala Asn His His Ile Ile Ala Asn Ser Ser Phe Ser Trp Trp Gly Ala 245 250 255 Tyr Leu Gly Ser Ser Ala Ser Gln Ile Val Ile Tyr Pro Thr Pro Trp 260 265 270 Tyr Asp Ile Thr Pro Lys Asn Thr Tyr Ile Pro Ile Val Asn His Trp 275 280 285 Ile Asn Val Asp Lys His Ser Ser Cys 290 295 <210> 3 <211> 642 <212> DNA <213> Staphylococcus hyicus <400> 3 atgcaccacc accaccacca caatgattcg acaacacaaa caacgacacc actggaagtc 60 gctcaaacgt cgcagcaaga aacacataca catcaaacac ctgttacatc attacatact 120 gcaacacctg aacatgttga tgactctaaa gaagcaacac ctttacctga aaaagcagag 180 tcaccaaaaa ccgaagtgac agttcaacct tcatcgcata cacaggaagt acctgcgtta 240 cataaaaaaa cacagcaaca accggcgtat aaggataaaa cggtaccaga gtcaacgata 300 gcatcaaagt cggttgaatc aaataaagca acagaaaatg agatgtcacc tgttgaacat 360 catgcttcaa atgtggaaaa acgtgaagat agattggaga ctaatgagac aacaccgcca 420 tcagtggacc gtgaatttag ccataaaatc atcaataatg cgcacgtaaa tccaaaaacg 480 gatggacaaa caaacgttaa tgttgatacg aaaacgatag acaccgtttc accgaaagat 540 gacagaatag atacggcgca accgaaacaa gtcgacgctc ctaaagaaaa tacaacggca 600 caaaataaat ttacatcaca agcgagcgac aaaaaaccat ac 642 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Staphylococcus hyicus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(7) <223> His-Tag <400> 4 Met His His His His His His Asn Asp Ser Thr Thr Gln Thr Thr Thr 1 5 10 15 Pro Leu Glu Val Ala Gln Thr Ser Gln Gln Glu Thr His Thr His Gln 20 25 30 Thr Pro Val Thr Ser Leu His Thr Ala Thr Pro Glu His Val Asp Asp 35 40 45 Ser Lys Glu Ala Thr Pro Leu Pro Glu Lys Ala Glu Ser Pro Lys Thr 50 55 60 Glu Val Thr Val Gln Pro Ser Ser His Thr Gln Glu Val Pro Ala Leu 65 70 75 80 His Lys Lys Thr Gln Gln Gln Pro Ala Tyr Lys Asp Lys Thr Val Pro 85 90 95 Glu Ser Thr Ile Ala Ser Lys Ser Val Glu Ser Asn Lys Ala Thr Glu 100 105 110 Asn Glu Met Ser Pro Val Glu His His Ala Ser Asn Val Glu Lys Arg 115 120 125 Glu Asp Arg Leu Glu Thr Asn Glu Thr Thr Pro Pro Ser Val Asp Arg 130 135 140 Glu Phe Ser His Lys Ile Ile Asn Asn Ala His Val Asn Pro Lys Thr 145 150 155 160 Asp Gly Gln Thr Asn Val Asn Val Asp Thr Lys Thr Ile Asp Thr Val 165 170 175 Ser Pro Lys Asp Asp Arg Ile Asp Thr Ala Gln Pro Lys Gln Val Asp 180 185 190 Ala Pro Lys Glu Asn Thr Thr Ala Gln Asn Lys Phe Thr Ser Gln Ala 195 200 205 Ser Asp Lys Lys Pro Tyr 210 <210> 5 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer for 207 amino acid His-tagged propeptide from Staphylococcus hyicus <400> 5 catatgcacc accaccacca ccacaatgat tcgacaacac aaacaacgac 50 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer for 207 amino acid His-tagged propeptide from Staphylococcus hyicus <400> 6 ggatccgtat ggttttttgt cgctcgcttg 30 <210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Forward primer for cloning of codon-optimized gene wbgL via NcoI into pACYCDuet-1 <400> 7 gatcaccatg ggcagcatta ttcgtctgca gggtggtc 38 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse primer for cloning of codon-optimized gene wbgL via BamHI into pACYCDuet-1 <400> 8 gatcaggatc cttagcagct gctatgttta tcaacgttga tcc 43

Claims (18)

  1. 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하고,
    a) 첨부된 서열 목록의 서열 번호 1;
    b) 상기 서열 목록의 서열 번호 1에 상보적인 핵산 서열;
    c) 상기 a) 및 상기 b) 또는 그것들의 상보적인 가닥들 내에 정의되는 핵산 서열들에 대하여 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 서열들;을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 상기 서열 목록의 서열 번호 1로 구성되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 상기 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 제 1항 또는 제 2항에 따른 핵산 서열을 포함하되, 상기 핵산 서열은 벡터로 형질전환되는 숙주 세포에 의해 인식되는 서열들을 제어하도록 작동가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. (a) 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열;
    (b) 상기 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열의 대립 이형의 아미노산 서열을 포함하되, 상기 대립 이형은 상기 서열 목록의 서열 번호 1에 도시된 핵산 분자의 반대편 가닥에 대한 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩되며;
    (c) 상기 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 분자의 올소로그의 아미노산 서열을 포함하되, 상기 올소로그는 상기 서열 목록의 서열 번호 1에 도시된 아미노산 분자의 반대편 가닥에 대한 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 핵산 분자에 의해 인코딩되며; 및
    (d) 적어도 10개의 연속적인 아미노산을 포함하는, 상기 서열 목록의 서열 번호 2에 도시된 아미노산 서열의 단편;으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드.
  5. 제 3항에 따른 벡터를 포함하거나 혹은 제 1항 또는 2항에 따른 폴리뉴클레오티드로 구성되는 서열을 포함하되, 상기 서열은 숙주 세포에 외래의 서열이고 상기 서열은 상기 숙주 세포의 게놈 내에 통합되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 숙주 세포는 이스트를 포함하는 균류, 박테리아, 곤충, 동물 및 식물 세포들로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  7. 제 5항 또는 6항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  8. 제 5항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산은 각각의 세포의 코돈 사용에 적용되는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  9. 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질의 생산을 위하여, 제 1항 또는 2항 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드, 혹은 제 3항에 따른 벡터, 혹은 제 4항에 따른 폴리펩티드의 사용.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질의 생산은 상기 알파-1,2-푸코실트랜스페라제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 이형 또는 상동 발현에 의해 실행되는 것을 특징으로 하는 사용.
  11. 제 9항 또는 10항에 있어서, 상기 푸코실화 올리고당은 인간 모유로부터 알려진 올리고당인 것을 특징으로 하는 사용.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 푸코실화 올리고당은 2'-푸코실락토스인 것을 특징으로 하는 사용.
  13. a. 제 4항에 따른 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 단계;
    b. 상기 폴리펩티드가 공여체 기질로부터 수용체 기질로의 푸코스 잔기의 전달을 촉진하는 조건들 하에서, 상기 단계 a의 상기 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드를, 푸코스 잔기를 포함하는 공여체 기질, 및 모노- 또는 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 포함하는 수용체 기질을 포함하는 혼합물과 접촉하는 단계, 그렇게 함으로써 상기 푸코실화 올리고당, 상기 (당)단백질 또는 상기 (당)지질을 생산하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 푸코실화 올리고당들, (당)단백질들 및 (당)지질들을 생산하기 위한 방법.
  14. a. 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질의 생산을 허용하고, 알파-1,2-푸코실트랜스페라제 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 허용하는 적절한 영양 조건들 하에서, 제 5항 내지 8항에 따른 숙주 세포를 성장시키는 단계;
    b. 상기 단계 a와 동시에 또는 그 뒤에, 상기 숙주 세포 내에 발현되는 알파-1,2-푸코실트랜스페라제가 공여체 기질로부터 수용체 기질로 푸코스 잔기의 전달을 촉매하도록 하기 위하여, 상기 푸코스 잔기를 포함하는 공여체 기질, 및 모노- 또는 올리고당, (당)단백질 혹은 (당)지질을 포함하는 수용체 기질을 제공하는 단계, 그렇게 함으로써 푸코실화 올리고당, (당)단백질 또는 (당)지질을 생산하는 단계; 및
    c. 상기 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질을 상기 숙주 세포 또는 그것의 성장 배지로부터 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 푸코실화 올리고당들, (당)단백질들 및 (당)지질들을 생산하기 위한 방법.
  15. 제 12항 또는 13항에 있어서, 상기 공여체 기질은 GDP-푸코스인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GDP-푸코스는 상기 숙주 세포 내에 동시에 발현되는 효소 또는 상기 숙주 세포의 대사에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 9항 내지 11항 중 어느 한 항의 사용 혹은 제 12항 내지 15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 획득되는 것을 특징으로 하는 푸코실화 올리고당, (당)단백질 및/또는 (당)지질.
  18. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 분리되거나, 재조합이거나 또는 합성인 것을 특징으로 하는 제 1항 또는 제 2항의 폴리펩티드 혹은 제 4항의 폴리펩티드.
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