WO2024005499A1 - 2'-푸코실락토오스 제조방법 - Google Patents

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WO2024005499A1
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hydrolase
fucosyllactose
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김진하
김민영
박부수
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주식회사 삼양사
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01047—GDP-mannose 4,6-dehydratase (4.2.1.47), i.e. GMD
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y504/00—Intramolecular transferases (5.4)
    • C12Y504/02—Phosphotransferases (phosphomutases) (5.4.2)
    • C12Y504/02008—Phosphomannomutase (5.4.2.8)

Definitions

  • This application relates to a method for producing 2'-Foucault room lactose.
  • HMOs Human Milk Oligosaccharides
  • fucosyl oligosaccharides Approximately 80% of Human Milk Oligosaccharides (HMOs) are fucosylated fucosyloligosaccharides, which are known to affect the formation of the intestinal microflora of newborns.
  • 2'-foucault lactose exists in the highest content and is known to exhibit various biological functions.
  • the production method of 2'-Foucault room lactose using microorganisms is highly productive because mass production is possible using cheap raw materials, but since the molecular weights of 2'-Foucault room lactose and lactose are similar, it is difficult to separate them, so high purity 2'- There is a problem in that it is difficult to produce fucosyllactose.
  • An example of the present application is to culture microorganisms with alpha-1,2-fucosyltransferase in a medium containing lactose and treat them with lactose hydrolase to produce high-purity 2'-
  • the purpose is to provide a method for producing fucosyllactose.
  • An example of the present application is to culture microorganisms with alpha-1,2-fucosyltransferase in a medium containing lactose and treat them with lactose hydrolase to produce high-purity 2'- It relates to a method of producing fucosyllactose.
  • the step of treating the lactose hydrolase may be performed in a culture medium containing the microorganisms, or may be performed in a culture medium from which the microbial cells have been removed.
  • the step of treating the lactose hydrolase may be treating the culture medium containing the microorganisms with the lactose hydrolase, or treating the culture medium from which the microbial cells have been removed.
  • the lactose hydrolase is treated with the culture medium containing the microorganism, and the culture may be continued by treating the culture medium with the lactose hydrolase.
  • the method for producing the 2'-Foucault room lactose may further include the step of removing the cells from the culture medium of the microorganism to obtain a supernatant. In addition, it may further include the step of purifying the supernatant to obtain 2'-foucault room lactose. In addition, it may further include the step of concentrating or spray drying the supernatant to obtain 2'-foucault room lactose powder.
  • the microorganism having the alpha-1,2-fucose transferase may be capable of using one or more types selected from the group consisting of glucose and galactose as a carbon source.
  • the microorganism having the alpha-1,2-fucose transferase may have one or more characteristics selected from the group consisting of the following (1) to (4):
  • LacZ gene is deleted
  • a carbon source one or more types selected from the group consisting of glucose and galactose can be used.
  • An example of the present application is the step of producing 2'-fucosyllactose from lactose by culturing a microorganism having alpha-1,2-fucosyltransferase in a medium containing lactose. ; and a method for producing 2'-fucosyllactose, including the step of treating it with lactose hydrolase.
  • the step of treating the lactose hydrolase may be performed in a culture medium containing the microorganisms, or may be performed in a culture medium from which the microbial cells have been removed.
  • the step of treating the lactose hydrolase may be treating the culture medium containing the microorganisms with the lactose hydrolase, or treating the culture medium from which the microbial cells have been removed.
  • the lactose hydrolase may be treated with the culture medium containing the microorganisms, and the culture of the microorganisms may be continued by treating the culture medium with the lactose hydrolase enzyme.
  • the lactose hydrolase decomposes lactose in the culture medium into glucose and galactose, and can reduce the content of 2'-fucosyllactose and lactose, which is difficult to separate and purify, in the final product.
  • the culture of the microorganism may be continued after the lactose hydrolase treatment.
  • the microorganism may be capable of using one or more types selected from the group consisting of glucose and galactose as a carbon source.
  • the culture medium is treated with lactose hydrolase and the culture of the microorganism is continued, the remaining sugar, lactose, is decomposed by the lactose hydrolase, and the glucose and/or galactose produced by the breakdown of lactose are used by the microorganism as a carbon source.
  • the remaining sugars, glucose and/or galactose are removed, the glucose and/or galactose content in the final product is lowered, and the purity of 2'-foucault room lactose can be increased.
  • the lactose hydrolase may be added after the maximum value of 2'-Foucault room lactose content or concentration in the culture medium is reached.
  • the time when the maximum value of 2'-Foucault room lactose content or concentration in the culture medium is reached is the time when 2'-Foucault room lactose is maximally produced, the time when there is no change in the content or concentration of 2'-Foucault room lactose, or This may mean the point at which the content or concentration of 2'-foucault room lactose begins to decrease.
  • the lactose hydrolase increases the 2'-fucosyllactose content of the culture medium by 10% or less, 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, It may be added when it is 3% or less, 2% or less, or 1% or less.
  • the rate of increase in the 2'-Foucault room lactose content is the rate of change of the 2'-Foucault room lactose content over time in the culture medium, for example, the rate of change over time of the 2'-Foucault room lactose concentration in the culture medium (mg/Ls). You can.
  • the lactose hydrolase may be added when the 2'-fucosyllactose conversion reaction is in a normal state in the culture medium.
  • the steady state is a state that does not change with time after passing the transient state of the 2'-Foucault room lactose conversion reaction, and may be a constant state after the 2'-Foucault room lactose content in the culture medium reaches the maximum value.
  • the lactose content in the culture medium may decrease and the contents of glucose and galactose may increase due to the lactose hydrolase.
  • the culture medium after the lactose hydrolase treatment has a lactose content of 5% by weight or less, 4% by weight or less, 3% by weight or less, 2% by weight or less, based on 100% by weight of the lactose content of the culture medium before treatment. It may be 1.5% by weight or less, 1% by weight or less, 0.5% by weight or less, 0.4% by weight or less, 0.3% by weight or less, 0.2% by weight or less, or 0.1% by weight or less.
  • the lower limit of the lactose content is not specified, a person skilled in the art will be able to clearly understand the lactose content after the decomposition of lactose occurs by treating the culture medium with lactose hydrolase.
  • the lactose content The lower limit may be more than 0% by weight, more than 0% by weight, more than 0.001% by weight, more than 0.005% by weight, more than 0.01% by weight, more than 0.05% by weight, more than 0.1% by weight, more than 0.5% by weight, or more than 1% by weight, It is not limited to this.
  • the method for producing 2'-Foucault room lactose may further include the step of removing cells from the culture medium of the microorganism to obtain a supernatant.
  • the bacteria can be removed, for example, through centrifugation.
  • cell debris may be removed through centrifugation.
  • the method for producing 2'-Foucault room lactose further includes the steps of removing cells from the culture medium of the microorganism to obtain a supernatant, and purifying the supernatant to obtain 2'-Foucault room lactose. It may be.
  • the purification may include one or more processes selected from the group consisting of activated carbon treatment, ultrafiltration, nanofiltration, electrodialysis, and ion exchange resin.
  • the activated carbon treatment process can remove large-sized proteins and make primary adjustments to chromaticity.
  • the activated carbon treatment process may be performed early in the purification process. If the activated carbon process is performed early, the fouling phenomenon, in which large-sized proteins get caught in the filtration membrane during subsequent filtration, can be delayed, and the membrane usage period and separation efficiency can be increased.
  • the ultrafiltration process may remove proteins of small size (for example, 1 kDa or less).
  • the ultrafiltration process may be performed before the nanofiltration process. If the ultrafiltration process is performed before the nanofiltration process, all remaining proteins are removed, thereby extending the service life of the NF filtration membrane and allowing removal of salts without increasing pressure.
  • the nanofiltration process uses concentrate rather than filtrate, so sufficient protein removal is necessary beforehand.
  • the nanofiltration process may remove salts such as sodium acetate and glycrol.
  • the nanofiltration process may be performed before the electrodialysis process. If the nanofiltration process is performed before the electrodialysis process, salts are removed once and the load of the electrodialysis process can be reduced. In addition, if the initial conductivity value is too high during the electrodialysis process, the conductivity value may increase after purification. If a sample concentrated using nanofiltration, etc. is used for electrodialysis and ion exchange resin purification, the process time and capacity may be shortened. .
  • the electrodialysis process may remove salts such as sodium citrate and glycrol and reduce conductivity (for example, to 1 mS or less). By performing the electrodialysis process, salts and ionic substances can be sufficiently removed before the ion exchange process, and the load of ion exchange resin, which is expensive to process, can be reduced.
  • the ion exchange resin process may reduce the final conductivity (for example, to 20uS or less) and secondaryly adjust the chromaticity. If the ion exchange process is performed at the end of the purification process, the last small amount of ionic substances can be sufficiently removed, and finally, color and impurities can be thoroughly removed.
  • the ion exchange resin may include a cation exchange resin and/or an anion exchange resin.
  • the cation exchange resin may be a strongly acidic cation exchange resin.
  • a cation exchange resin (SCRB or CMP18) or an anion exchange resin (AW30, WAS or AMP24) can be used.
  • the strongly acidic cation exchange resin is distinguished from the weakly acidic cation exchange resin by maintaining a substantially completely ionized form over a wide pH range, while the weakly acidic cation exchange resin maintains an ionized form over a narrow pH range.
  • the strongly acidic cation exchange resin may be one in which a sulfo, sulfoalkyl (for example, sulfomethyl, sulfoethyl or sulfopropyl), phospho or phosphoalkyl functional group is bonded to a polymer (for example, polysaccharide) matrix.
  • the strongly acidic cation exchange resin may have a sulfo or sulfoalkyl functional group.
  • SCRB Strong acid, Polystyrene+DVB matrix, Sulfonate exchanger, Na ion type
  • CMP18 Strong acid, Polystyrene+DVB matrix, Sulfonate exchanger, Na ion type
  • AW30 Weak base, Polystyrene+DVB matrix, Tertiary amine exchanger, free base ion type
  • AMP24 Strongly basic, Polystyrene+DVB matrix, Dimethylethanolammonium exchanger, Cl ion type
  • the method for producing 2'-Foucault room lactose may further include purifying the supernatant and/or concentrating the purified supernatant. Alternatively, it may further include the step of concentrating or spray drying the supernatant to obtain 2'-foucault room lactose powder.
  • the concentration process is to concentrate diluted purified products (for example, purified liquid), and may be concentrated for spray drying.
  • the purified solution may be concentrated to 30 to 80 Brix.
  • the spray drying process is a process for manufacturing 2'-Foucault room lactose powder, and 2'-Foucault room lactose powder can be obtained through spray drying.
  • the method for producing 2'-fucosyllactose according to an example of the present application is by culturing microorganisms having alpha-1,2-fucose transferase in a medium containing lactose and treating the culture medium with lactose hydrolase. , it is possible to obtain high purity 2'-foucault room lactose.
  • the method for producing 2'-foucault room lactose according to an example of the present application has a purity of 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, and 92% or more.
  • the 2'-foucault room lactose content is 45% by weight, 50% by weight, or 55% by weight based on 100% by weight of saccharide solids.
  • Microorganisms having alpha-1,2-fucose transferase according to an example of the present application express or secrete alpha-1,2-fucose transferase, and are examples of the ⁇ -1,2-fucose transferase.
  • the typical amino acid sequence is shown in Table 1.
  • the ⁇ -1,2-fucose transferase may be derived from a Biosafety level 1 strain.
  • the ⁇ -1,2-fucose transferase may include one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16.
  • the ⁇ -1,2-fucose transferase may include one or more amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5.
  • the ⁇ -1,2-fucose transferase may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5.
  • the ⁇ -1,2-fucose transferase may consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5.
  • the fucose transferase of SEQ ID NO: 1 is derived from Akkermansia muciniphila and was named Am2FT_2.
  • the fucose transferases of SEQ ID NOs: 2 to 4 are from Bacillus megaterium and were named Bm2FT, Bm2FT_2, and Bm2FT_3, respectively.
  • the fucose transferase of SEQ ID NO: 5 is from the genus Bacillus and was named Bs2FT.
  • Am2FT_2 was about 5 (mg/L)
  • Bm2FT was about 15 (mg/L)
  • Bm2FT_2 was about 3 (mg/L)
  • Bm2FT_3. was about 4 (mg/L)
  • Bs2FT produced about 1 (mg/L) 2'-fucosyllactose, having a 2FL production activity.
  • the 2FL production activity was analyzed by the following process: ⁇ -1,2-fucose transferase plasmids of SEQ ID NOs: 1 to 5 were each transformed into Bacillus megaterium and grown at 37°C. Two colonies were inoculated from each plate and overnight seed culture was performed. 200 uL of seed was added to 4mL medium containing 22mM lactose, and the reaction was performed at 30°C. After 20h, it was analyzed by HPLC.
  • the microorganism having the alpha-1,2-fucose transferase may have one or more characteristics selected from the group consisting of the following (1) to (4):
  • the fucose synthesis genes include GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, GDP-L-fucose synthase, and GDP-L-fucose synthase. ), phosphomannomurase, and GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase.
  • the lactose membrane transport protein may be one or more types selected from the group consisting of Lac12 and LacY.
  • Microorganisms having alpha-1,2-fucose transferase include Bacillus sp. microorganisms, Corynebacterium sp. microorganisms, and Escherichia sp. microorganisms. , and it may be one or more types selected from the group consisting of yeast.
  • the Bacillus sp. Microorganisms include Bacillus megaterium , Bacillus subtilis , Bacillus cereus , Bacillus coagulans , and Bacillus licheniphor. It may be one or more species selected from the group consisting of Bacillus licheniformis and Bacillus stearothermophilus .
  • the microorganism of the Escherichia sp. genus may be Escherichia coli .
  • This application treats lactose hydrolase in the process of producing 2'-Foucault room lactose, effectively removes lactose, increases 2'-Foucault room lactose production, and can remove more than 99% of proteins in the fermentation broth.
  • High purity 2'-foucault room lactose can be produced by removing internal culture by-products and salts.
  • Figure 1 is a diagram analyzing the purity of 2'-foucault room lactose obtained according to an example of the present application.
  • Bacillus megaterium 14581 (Korea Center for Microbial Conservation (KCCM) Accession No. 40441), a Biosafety level 1 strain, was used as an example at the Korea Microorganism Conservation Center. It was obtained from the center (KCCM) and used as a host. Exemplary amino acid sequences of ⁇ -1,2-fucose transferase are shown in SEQ ID NOs: 1 to 16, and representatively, ⁇ -1,2-fucose transferase (alpha-1, 2-fucosyltranferase) was used.
  • b-galactosidase (hereinafter LacZ) was removed from the Bacillus megaterium 14581 gene through homologous recombination, and deletion of the LacZ gene was verified through genome sequencing.
  • lactose membrane transport protein (hereinafter Lac12) from Kluyveromyces lactis or the lactose membrane transport protein (hereinafter LacY) from Bacillus megaterium is always maintained in plasmid form.
  • Lac12 lactose membrane transport protein
  • LacY lactose membrane transport protein
  • SMMP 5 mL SMMP was added to 15 mL Falcon containing 1.5 mL of PEG-P and mixed by carefully rolling the Falcon. After collecting the cells by centrifugation at 1300g for 10 minutes, the cells were released into SMMP and transformed into 1.5mL by shaking at 250rpm at 37C.
  • Example 1 100 uL of the Bacillus megaterium-derived strain prepared in Example 1, which was stored frozen at -70°C, was inoculated into a Test-tube of 3ml liquid medium, and cultured at 30°C at 240 rpm for 12-18 hours.
  • the 3 mL liquid culture solution upon completion of cultivation was inoculated into 50 mL liquid medium in a sterilized 250 mL Erlenmeyer flask and cultured at 30°C and 240 rpm for 12 to 16 hours.
  • the medium composition used for seed culture included yeast extract 5 g/L, Tryptone 10 g/L, and NaCl 10 g/L.
  • a method was used to set an appropriate sugar concentration at the beginning of the culture, and then gradually inject a high concentration of sugar according to the growth rate of the microorganism to maintain a low sugar concentration in the culture medium.
  • a variety of fed-batch culture methods can be used depending on the timing, method, and amount of sugar addition, and in this experiment, pH maintenance sugar feeding (pH stat feeding) was used.
  • pH stat feeding pH maintenance sugar feeding
  • 15 g/L of lactose was additionally supplied, and the composition of the additional feeding solution included 750 g/L of Glucose and 15 g/L of MgSO4 ⁇ 7H2O.
  • a basic solution such as carbon source, sodium hydroxide, or aqueous ammonia was supplied to maintain the pH of the culture medium in the range of 7.0 to 7.2.
  • the bacteria were removed from the culture medium using a centrifuge, the supernatant was recovered, and the fermentation broth was used for purification of human milk oligosaccharides.
  • the strain was cultured in the same manner as in Comparative Example 1, and after completion of cultivation, the supernatant was recovered, and the supernatant was treated with lactose hydrolase to remove residual lactose. Specifically, the recovered supernatant was treated with lactose hydrolase (Novozymes, Lactozym® 6500L) at 50°C for more than 16 hours, and the breakdown of all lactose to produce glucose and galactose was analyzed through HPLC analysis.
  • lactose hydrolase Novozymes, Lactozym® 6500L
  • the culture broth in which the lactose was decomposed was centrifuged at 8,000 rpm (11,000 g) for 15 minutes at 8°C using a centrifuge to remove the bacterial cells, and the supernatant was recovered and the fermentation broth was added to breast milk. Used for oligosaccharide purification.
  • the culture broth from which all residual sugars have been removed is centrifuged at 8,000 rpm (11,000 g) for 15 minutes at 8°C using a centrifuge to remove bacterial cells, recover the supernatant, and transform it into fermentation broth using milk oligosaccharides. Used for purification.
  • activated carbon (KB-EVN, 4% (10% of solid content) was added to the fermentation broth obtained in Comparative Example 1, Example 2, and Example 3, and then stirred at 70° C. for 30 minutes. Afterwards, it was centrifuged at 7,000 rpm for 20 minutes and then filtered (filter size: 1 ⁇ m, 0.45 ⁇ m) to remove activated carbon.
  • ultrafiltration was performed using an ultrafilter (MILLIPORE, ProFlux M12) under the conditions of 30k&10kDa filter and 135psi pressure.
  • nanofiltration was performed on the product that underwent the ultrafine filtration process under the conditions of 200-300Da and 145-150psi using a nanofilter (Puretech P&T).
  • electrodialysis was performed using an electrodialysis machine (INNOMEDITECH, PS520) (constant voltage method: 1V/cell, 20cells, total 20V). Ion exchange was performed by continuously flowing the electrodialysis-completed sample through a column each packed with cation resin (SCRB), anion resin (AW30), and mixed resin (SCRB, AMP24).
  • SCRB cation resin
  • AW30 anion resin
  • SCRB mixed resin
  • the sugar content was measured using an ATAGO Digital Refractometer and was measured to be 30 to 50 brix.
  • the purity of 2'-foucault room lactose was measured according to the method of Example 5.
  • the 2'-FL content of the culture medium after completion of the 2'-foucault room lactose conversion reaction was similar to Comparative Example 1 and Examples 1 and 2.
  • a difference in 2'-FL purity appeared during the separation and purification process, and after the nanofiltering process, the cultures of Examples 2 and 3 achieved 2'-FL purity of more than 45%.
  • the culture supernatant of Example 3 achieved more than 94% 2'-FL purity after electrodialysis and ion purification, respectively, showing more desirable results.
  • the culture medium of Example 3 decomposes lactose through lactase treatment when the maximum production of 2'-FL is reached, and 2'-FL is converted to 2' by 2'-fucosyllactose-converting microorganisms that consume glucose and galactose, which are lactose breakdown products. -Saccharides other than FL were removed, making it possible to produce 2'-fucosyllactose with high purity of 90% or more.
  • each saccharide is shown in Table 5 based on 100% by weight of saccharide solid content.
  • Example 5 As shown in Table 5, compared to Comparative Example 1, in Examples 2 and 3 treated with lactase, lactose, which was previously difficult to separate and purify from 2'-fucosyllactose, was efficiently removed. In addition, in Example 3, lactase was treated at the late stage of the culture and additional culture was performed, so that lactose, glucose, and galactose were consumed and removed from the culture medium, and after purification, the remaining sugar content other than 2'-FL was minimized, and the final The 2'-FL content of the product was very high, over 90% by weight.
  • the protein content is shown in Table 8. As shown in Table 7, as purification progressed, more than 99% of the protein was removed in the AC and UF processes.
  • Example 4 The separation and purification process of Example 4 was completed for the supernatant of Example 3, and the obtained product was spray-dried to prepare 2'-foucault room lactose powder.

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Abstract

본 출원은 2'-푸코실락토오스의 제조 방법에 관한 것으로, 락토오스를 포함하는 배지에서 알파-1,2-푸코오스 전이효소(alpha-1,2-fucosyltransferase)를 가지는 미생물을 배양하여, 락토오스로부터 2'-푸코실락토오스를 생산하는 단계; 및 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, 2'-푸코실락토오스의 제조 방법을 제공한다.

Description

2’-푸코실락토오스 제조방법
본 출원은 2’-푸코실락토오스 제조방법에 관한 것이다.
인간모유올리고당 (Human Milk Oligosaccharides, HMOs)의 약 80%는 푸코실화되어 있는 푸코실올리고당 (Fucosyloligosaccharide)으로, 신생아의 장내 미생물총의 형성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 푸코실올리고당 중 2’-푸코실락토오스는 가장 높은 함량으로 존재하고, 다양한 생물학적 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 미생물을 이용한 2’-푸코실락토오스의 생산방법은 값싼 원료를 이용하여 대량생산이 가능하기 때문에 생산성이 높으나, 2’-푸코실락토오스와 젖당의 분자량이 유사하여 분리가 어려워, 고순도의 2’-푸코실락토오스를 생산하기 어려운 문제점이 있다.
본 출원의 일 예는 락토오스를 포함하는 배지에서 알파-1,2-푸코오스 전이효소(alpha-1,2-fucosyltransferase)를 가지는 미생물을 배양하고, 락토오스 가수분해효소를 처리하여 고순도의 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 출원의 일 예는 락토오스를 포함하는 배지에서 알파-1,2-푸코오스 전이효소(alpha-1,2-fucosyltransferase)를 가지는 미생물을 배양하고, 락토오스 가수분해효소를 처리하여 고순도의 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계는, 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 수행되거나, 또는 상기 미생물 균체가 제거된 배양액에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계는, 락토오스 가수분해효소를 상기 미생물을 포함하는 배양액에 처리하거나, 또는 상기 미생물 균체가 제거된 배양액에 처리하는 것일 수 있다.
상기 락토오스 가수분해효소는 상기 미생물을 포함하는 배양액에 처리되며, 상기 배양액에 락토오스 가수분해효소를 처리하여 배양을 지속하는 것일 수 있다.
상기 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법은, 상기 미생물의 배양액에서 균체를 제거하여 상등액을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 상등액을 정제하여 2’-푸코실락토오스를 얻는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 상등액을 농축 또는 분무건조하여 2’-푸코실락토오스 분말을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물은 탄소원으로 포도당 및 갈락토오스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 사용 가능한 것일 수 있다.
상기 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물은 하기 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특징을 가지는 것일 수 있다:
(1) LacZ 유전자가 결실됨,
(2) 푸코오스 합성 유전자를 발현함,
(3) 락토오스 막 수송 단백질을 발현함, 및
(4) 탄소원으로 포도당 및 갈락토오스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 사용 가능함.
이하, 본 출원을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 출원의 일 예는 락토오스를 포함하는 배지에서 알파-1,2-푸코오스 전이효소(alpha-1,2-fucosyltransferase)를 가지는 미생물을 배양하여, 락토오스로부터 2’-푸코실락토오스를 생산하는 단계; 및 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, 2’-푸코실락토오스의 제조 방법에 관한 것이다.
상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계는, 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 수행되거나, 또는 상기 미생물 균체가 제거된 배양액에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계는, 락토오스 가수분해효소를 상기 미생물을 포함하는 배양액에 처리하거나, 또는 상기 미생물 균체가 제거된 배양액에 처리하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 락토오스 가수분해효소는 상기 미생물을 포함하는 배양액에 처리되며, 상기 배양액에 락토오스 가수분해효소를 처리하여 미생물의 배양을 지속하는 것일 수 있다.
상기 락토오스 가수분해효소는 배양액 내의 락토오스가 포도당 및 갈락토오스로 분해되며, 최종 산물에서 2’-푸코실락토오스와 분리 정제가 까다로운 락토오스 함량을 줄일 수 있다.
상기 락토오스 가수분해효소가 상기 미생물을 포함하는 배양액에 처리되는 경우, 락토오스 가수분해효소 처리 후 상기 미생물의 배양을 지속하는 것일 수 있다. 이 때, 상기 미생물은 탄소원으로 포도당 및 갈락토오스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 사용 가능한 것일 수 있다. 상기 배양액에 락토오스 가수분해효소를 처리 후 미생물의 배양을 지속할 경우, 잔존당인 락토오스는 상기 락토오스 가수분해효소에 의해 분해되고, 락토오스가 분해되어 생성된 포도당 및/또는 갈락토오스를 상기 미생물이 탄소원으로 사용하여, 잔존당인 포도당 및/또는 갈락토오스가 제거되고, 최종 산물에서 포도당 및/또는 갈락토오스 함량이 낮아져, 2’-푸코실락토오스의 순도가 높아질 수 있다.
상기 락토오스 가수분해효소는 상기 배양액 내 2’-푸코실락토오스 함량 또는 농도의 최댓값을 도달한 시점 이후에 첨가되는 것일 수 있다. 상기 배양액 내 2’-푸코실락토오스 함량 또는 농도의 최댓값을 도달한 시점은, 2’-푸코실락토오스가 최대로 생산되는 시점, 2’-푸코실락토오스의 함량 또는 농도의 변화가 없는 시점, 또는 2’-푸코실락토오스의 함량 또는 농도가 감소하기 시작하는 시점을 의미하는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 락토오스 가수분해효소는 상기 배양액의 2’-푸코실락토오스 함량의 증가율이 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하일 때 첨가되는 것일 수 있다. 상기 2’-푸코실락토오스 함량의 증가율은 배양액 내의 2’-푸코실락토오스 함량의 시간에 따른 함량 변화율, 예를 들어 배양액 내의 2’-푸코실락토오스 농도의 시간에 따른 변화율 (mg/Ls)일 수 있다.
일 예로, 상기 락토오스 가수분해효소는 상기 배양액에서, 2’-푸코실락토오스 전환반응이 정상상태일 때 첨가되는 것일 수 있다. 상기 정상상태는 2’-푸코실락토오스 전환반응의 과도적 상태를 경과하여 시간의 흐름에 따라 변화하지 않는 상태로, 배양액 내 2’-푸코실락토오스 함량이 최댓값에 도달 후 일정한 상태일 수 있다.
상기 배양액에 락토오스 가수분해효소를 처리할 경우, 락토오스 가수분해효소에 의해 배양액 내 락토오스 함량이 감소하고, 포도당 및 갈락토오스의 함량은 증가할 수 있다.
예를 들어, 상기 락토오스 가수분해효소 처리 후 배양액은, 처리 전 배양액의 락토오스 함량 100중량%을 기준으로, 락토오스 함량이 5중량% 이하, 4중량% 이하, 3중량% 이하, 2중량% 이하, 1.5중량 % 이하, 1중량% 이하, 0.5중량% 이하, 0.4중량% 이하, 0.3중량% 이하, 0.2중량% 이하, 또는 0.1중량% 이하인 것일 수 있다. 이 때, 상기 락토오스 함량의 하한값이 특정되지 않더라도, 통상의 기술자가 상기 배양액에 락토오스 가수분해효소를 처리하여 락토오스의 분해가 일어난 뒤의 락토오스 함량을 명확히 이해할 수 있을 것이나, 예를 들어 상기 락토오스 함량의 하한값은 0중량% 이상, 0중량% 초과, 0.001중량% 이상, 0.005중량% 이상, 0.01중량% 이상, 0.05중량% 이상, 0.1중량% 이상, 0.5중량% 이상, 또는 1중량% 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 일 예에 따른 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법은, 상기 미생물의 배양액에서 균체를 제거하여 상등액을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 균체 제거는 예를 들어 원심분리를 통해 제거될 수 있다. 일 예로, 원심분리를 통해 세포 잔해물 (cell debris)을 제거하는 것일 수 있다.
본 출원의 일 예에 따른 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법은, 상기 미생물의 배양액에서 균체를 제거하여 상등액을 얻고, 상기 상등액을 정제하여 2’-푸코실락토오스를 얻는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 정제는 활성탄 처리, 초미세여과 (Ultrafiltration), 나노여과 (Nanofiltration), 전기투석 (Electrodialysis), 및 이온교환수지 (Ion exchange)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정을 포함하는 것일 수 있다.
상기 활성탄 처리 공정은 큰 사이즈의 단백질을 제거하고, 색도를 1차 조정할 수 있다. 상기 활성탄 처리 공정은 정제과정 중 초기에 수행될 수 있다. 활성탄 공정을 초기에 진행할 경우 이후 여과 시 큰 사이즈 단백질이 여과막에 걸려 막히는 파울링 (fouling) 현상을 지연할 수 있으며, 막의 사용 기간과 분리 효율을 상승시킬 수 있다.
상기 초미세여과 (Ultrafiltration) 공정은 작은 사이즈 (예를 들어 1kDa 이하)의 단백질을 제거하는 것일 수 있다. 상기 초미세여과 공정은 나노여과 (Nanofiltration) 공정 이전에 수행되는 것일 수 있다. 초미세여과 공정을 나노여과 공정 이전에 수행할 경우, 남아있는 단백질을 모두 제거하여 NF 여과막의 사용 기간이 늘어나며 압력 증가 없이 염류의 제거가 가능하다. 특히, 나노여과 공정은 여과액이 아닌 농축물을 사용하게 되므로 이전에 충분한 단백질 제거가 필요하다.
상기 나노여과 (Nanofiltration) 공정은 Sodium acetate, glycrol 등의 염류를 제거하는 것일 수 있다. 상기 나노여과 공정은 전기투석 (Electrodialysis) 공정 이전에 수행되는 것일 수 있다. 나노여과 공정을 전기투석 공정 이전에 진행하면 1차례 염류가 제거되어 전기투석 공정의 부하 (load)가 줄어들 수 있다. 또한, 전기투석 공정 시 초기 전도도 값이 너무 높으면 정제 후 전도도 값이 높아질 수 있으며, 나노여과 등을 이용하여 농축한 샘플을 전기투석 및 이온교환수지 정제에 이용하면 공정 시간과 용량이 단축될 수 있다.
상기 전기투석 (Electrodialysis) 공정은 Sodium citrate, glycrol 등의 염류를 제거하고, 전도도를 감소 (예를 들어 1mS 이하)하는 것일 수 있다. 전기투석 공정을 수행하면 이온교환 공정 전 염류 및 이온물질을 충분히 제거할 수 있으며, 처리 비용이 비싼 이온교환수지의 부하 (load)를 줄일 수 있다.
상기 이온교환수지 공정은 최종 전도도를 감소 (예를 들어 20uS 이하)하고, 색도를 2차 조정하는 것일 수 있다. 이온교환공정을 정제공정 중 마지막에 수행하면 마지막 소량의 이온물질을 충분히 제거할 수 있고, 마지막으로 색깔과 불순물을 깔끔하게 제거할 수 있다. 상기 이온교환수지는 양이온교환수지 및/또는 음이온교환수지를 포함할 수 있다. 상기 양이온교환수지는 강산성 양이온교환수지인 것일 수 있다. 예를 들어 양이온교환수지 (SCRB 혹은 CMP18) 또는 음이온교환수지 (AW30, WAS 또는 AMP24)를 사용할 수 있다.
상기 강산성 양이온교환수지는 넓은 pH 범위에서 실질적으로 완전히 이온화된 형태를 유지하여 약산성 양이온교환수지와 구별되며, 약산성 양이온교환수지는 좁은 pH 범위에서 이온화된 형태를 유지한다. 상기 강산성 양이온교환수지는 중합체 (예를 들어 폴리사카라이드) 매트릭스에 설포, 설포알킬 (예를 들어 설포메틸, 설포에틸 또는 설포프로필), 포스포 또는 포스포알킬 작용기가 결합되어 있는 것일 수 있다. 일 예로, 상기 강산성 양이온교환수지는 설포 또는 설포알킬 작용기를 가지는 것일 수 있다.
SCRB : 강산성, Polystyrene+DVB 모체, Sulfonate 교환기, Na 이온형
CMP18 : 강산성, Polystyrene+DVB 모체, Sulfonate 교환기, Na 이온형
AW30 : 약염기성, Polystyrene+DVB 모체, Tertiary amine 교환기, free base 이온형
AMP24 : 강염기성, Polystyrene+DVB 모체, Dimethylethanolammonium 교환기, Cl 이온형
본 출원의 일 예에 따른 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법은, 상기 상등액을 정제하는 단계 및/또는 상기 정제된 상등액을 농축하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또는, 상기 상등액을 농축 또는 분무건조하여 2’-푸코실락토오스 분말을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 농축 공정은 희석된 정제물 (예를 들어 정제액)을 농축하는 것으로, 분무건조를 하기 위해 농축하는 것일 수 있다. 예를 들어, 정제액을 30 내지 80 Brix로 농축하는 것일 수 있다.
상기 분무건조 (Spray drying) 공정은 2’-푸코실락토오스 분말 (powder)을 제조하는 공정이며, 분무건조를 통해 2’-푸코실락토오스 분말 형태를 얻을 수 있다.
본 출원의 일 예에 따른 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법은 락토오스를 포함하는 배지에서 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물을 배양하고, 배양액에 락토오스 가수분해효소를 처리하여, 고순도의 2’-푸코실락토오스를 얻는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법은 순도 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 또는 95% 이상의 2’-푸코실락토오스를 얻는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 일 예에 따른 2’-푸코실락토오스를 제조하는 방법은 당류 고형분 100중량% 기준으로 2’-푸코실락토오스 함량이 45중량% 이상, 50중량% 이상, 55중량% 이상, 60중량% 이상, 65중량% 이상, 70중량% 이상, 75중량% 이상, 80중량% 이상, 85중량% 이상, 86중량% 이상, 87중량% 이상, 88중량% 이상, 89중량% 이상, 90중량% 이상, 91중량% 이상, 92중량% 이상, 93중량% 이상, 94중량% 이상, 또는 95중량% 이상인 정제물을 얻는 것일 수 있다.
본 출원의 일 예에 따른 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물은 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 발현 또는 분비하며, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소의 예시적인 아미노산 서열을 표 1에 나타내었다.
명명 서열 서열번호
Am2FT_2 MNMERKTGLMNKKYVSPCFLPGMRLGNIMFTLAAACAHARTVGVECRVPWAYNDASLMLRSRLGGWVLPSTPCGTNEPPSWQEPSFAYCPVPSRIRTGGLRGYFQSARYFEGQEAFIRALFAPLTAEKEPGAVGIHIRLGDYRRLRDKHRILDPGFLRRAAGHLSSGKNRLVLFSDEPDEAAEMLARVPAFGRFALEIDRGAPCESLRRMTAMEELVMSCSSFSWWGAWLGNTRKVIVPRDWFVGGVEDYRDIYLPHWVTL 1
Bm2FT MKIVQISSGLGNQLFQYALYKRLSMNNNDVFLDVETSYQLNKNQHNGYEIERIFSIQPSHATKGMIDELADVDNRLINRLRRKLFGPKNSMYTETKEFSYDCEVFTKDGIYIKGYWQNYNYFKEIEDDLKNELVFKKALDLKNSHLINQMNKEISVSIHVRRGDYYLNKEYENKFGNIADLDYYLKAINFIKKEVDDPKFYVFSDDIKWAKENLNLTDNVTYVEHNKGSDSYKDMRLMTCCKHNIIANSTFSWWGAFLNENKNKIVIAPGKWINVEGVGGINLFPEGWIVY 2
Bm2FT_2 MGCIKRLFLYEYGGRCFLVIVKIKGGFGNQLFTYASAYAISQELQQNLIMDKVIYDLDYFRKFELPSLSLKYDQMLISKFVPNTKVKTLIYKVLRRLKLKGFTEVHEKKEFSFDENIYNLSGDIYLDGYWQNYRYFHKYYKDLSEMFVPRETPRKEVTDYITSLRGVNSVAMHVRRGDYKTFNGGKCLSLDYYIKAMEYFNSNDVQFYVFTDDIDFCEKNLPNSENINYVSRSEKLTDIEEFFIMKECKNFIIANSSFSWWAAYLSEQKADSLIVAPVVDMWKRDFYPDEWVALNTHLE 3
Bm2FT_3 MIIVQIKGGLGNQLFSYASAYGIARENETELIIDRYIYDTSYSLRKYMLDFFPEIDEALLLKYIPKKNKISQIMYKLIRKSKLKYKYKAQLFLEEEEFKFTRISTQNENLYLNGYWQSYVYFDKYRNDIIKKFTPLVSFNQDGNQLLNEIKSYNSVAIHVRRGDYINFKGGKCLDSSYYIKAMKHLYNLKGKNLFFYIFTDDVEYCKRIFKNVANVKFIGEEAKLSDFEEFTLMTHCKNLIIGNSSFSWWAAYLASCKDKAVIAPVVDMWTEDFYLPEWIKIKADLQ 4
Bs2FT MKIVHISSGLGNQMFQYALYKKLSLIQDNVFLDTITSYQLYPNQHNGYELEKVFTIKPRHASKELTYNLSDLDNSVTSRIRRKLIGSKKSMYIEHKEFEYDPNLFYQENIYIKGYWQNYDYFKDIENELKNDFTFQRALDEKNNNLAIKINNENSISIHVRRGDYYLNRKNQEKFGDIANLEYYSKAISYIKERIDNPKFYIFSDNVEWVKQNLNSLEEAVYIDYNVGNDSYKDMQLMSLCKHNIIANSSFSWWGAFLNKNMEKIVIAPGKWINMKGVKKVNLFPKDWIIY 5
Bm2FT_4 MIIVRVIGGLGNQMFQYALYKSLENEGKEVKLDLTGFGDYDLHNGYELNKIFNINENVATKDEINKLIKLPDNKVLSMIKRKFFSSTINYYSQDQFKYLSEIFQLDNVYLDGYWQSEKYFQGIKEVIRKEFKFKGEPNPKNIEMVKLMRGSNSVSIHFRRGDYISNPDAYKVHGGITTIHYYENAVKEIKSKVKEPKFFIFSDDIKWVKENFKLEDAFFIDWNTGSESYRDIELMSNCKHNIIANSTFSWWGAWLNKNKNKIVIAPNQWFNTIDTEDVIPDTWQCINTF 6
Bt2FT MNEIHVLLTGRLGNQLFQYAFARSLQKQYGGRIVCNTFDLDHRSEKSKVADQKFSYAMGDFKLDENVALEDAALPWYADFSSPLIKPVKKLFPRRYFDFMARRGYLMWQRTDYMPIPKLECEDVFAWGWWQDIRYFQDVQTELSDEVVPVTDPLPENQYIYNAASGEESVCISIRCGNYFNPTVKKLLYVCTPEYFRNAVESITKRLTHPKFIVFTDDVDWVKENIRFESAYPQYEFLYERGSDTVEEKIRMMTLCKHFIISNSTFSWWAQFLSKSENKIVIAPDRWFVDGRRIGLYMHGWTLIPAGQ 7
Fp2FT MIYVEMHGRLGNQMFQYAAARALQEKNNQPIMLSFRKVIGANTEGTAGWENSLKYFNVKPCEYYMGKKSLVTEYPVEYRLLCYAYALSYKPLMNNMNRWYEYQVKCCRFLDRFGIRWIANGYYDFHYNGLKNYLLNGSFESPKYFDSIRDKLLEEFTPREEERKENKRLYEQIRKRNSVCLSVRHFQLTGKQADMYDVCSLEYYQTAIRKMCELIENPLFVVFSDDIEWVKNTIDLSRVEVVYETPGNPVWEKLRLMYSCKNFIIPNSTFAWWAQYLSRNPDKYVLCPAKWFNNNFESPLIASQWVRIDREGNIVNE 8
Gs2FT MKIVKVIGGLGNQMFQYAFYRNLKAKFQEVKLDITAFETYKLHNGYELERVFDIKPEYATKKEIYPLTTNRNSKISKIKRRIFGGKETEYIEKDLKFDPEVFKVTGDVYFEGYWQTEKYFKEIEDLIRKDFQFKNPLTNKNLELSNKIKNENSVSIHVRRGDYYTSKKAERKHGNIATIEYYQKAVRKITEFVDNPVFYIFSDDIPWVKENLKLENEVIYVDWNKGLDSYIDMQLMSICKHNIIANSTFSWWGAWLNQNKNKIVIAPSRWINNKRLDTSDVIPKEWIKI 9
Lg2FT MLYVEMDGRCGNQLFHYAVARYIQLAIGNKEKLCLNFNKIFEKKDENNGWVDYLKDFKTVPYSYYSKSGTILKNESNFIQKIAIGLKAIQIKSLTKKSRQEQADKAEVGQRTLNKLGVYWVREGVNQIYPYKNNKILVSGICESNFIYEIQEQLQKELIPVTPVSSLNKSLLEKIDNCNSVCISVRRGDFFNNKNAKKYGVCSPEYYIRAKKYFDKKRLENTVYFCFSDDIEWCKENLKFTDKNVIFVSQEMPVYETLRLMSHCKHFILSNSTFSWWGQFLSEYKDKIVVSPARWNNDGYDTNLIDKNWILIDA 10
Ll2FT MIYVEIRGNLGNQLFIYATAKKIQKLTGQKIQLNTTTLNKYFPNYKFGLSEFIMEDPDCFIESYKKLPWFTNEYLLPIKIFKKILNKTPKINKILSDFFFKAFEKKGYFIWRGETFKKFSLGNHKNYYLSGFWQSEDYFYDIRDELLEIITPINSIRECNFELLNLIRNSESICVSIRRGDYVDNPKISAIYNVCDINYFIESVNEIKKNVVNVKVICFSDDVEWVKKNIKFDCETHYETYGNSLSEKVQLMSSCKHFVLSNSSFSWWTEFLSIRGGITIAPKNWYADEREADIYRKNWIYLEDKTEEE 11
Ls2FT MEEIHTLLTGRLGNQLFQYAFARNLQKQYGGQIYCDVYELEHRMSKVADEKFSYAMSGFKLDAGVIREDQAFPWYADFSNPVIKPIKKAMPRKYFELMARRGYLMWQRSDYMPIPVLDTQRVFASGWWQDIRYLQNVQEELSDEIVPITNPLQENRYIYDAAHDRDSVCISIRCGNYFNPTVKKLLYVCNPQYFHDSVKRISQMLAHPKFIVFTDDVSWVKEHLKFEDTYPQFEFLYERGCDTAEEKIRMMAMCNNFIISNSTFSWWAQFLSKNKEKIVIAPDKWFVDGRKIGLYMDGWTLVPAGR 12
Ri2FT MIAVKIGDGMGNQLFNYACGYAQARRDGDSLVLDISECDNSTLRDFELDKFHLKYDKKESFPNRNLGQKIYKNLRRALKYHVIKEREVYHNRDHRYDVNDIDPRVYKKKGLRNKYLYGYWQHLAYFEDYLNEITAMMTPAYEQSETVKKLQEEFKKTPTCAVHVRGGDIMGPAGAYFKHAMERMEQEKPGVRYIVFTNDMERAEEALAPVLESQKKDAVGQAENRLEFVSEMGEFSDVDEFFLMAACQNQILSNSTFSTWAAYLNQNPDKTVIMPDDLLSERMRQKNWIILK 13
Te2FT(WP_011056838.1) MIIVHLCGGLGNQMFQYAAGLAAAHRIGSEVKFDTHWFDATCLHQGLELRRVFGLELPEPSSKDLRKVLGACVHPAVRRLLAGHFLHGLRPKSLVIQPHFHYWTGFEHLPDNVYLEGYWQSERYFSNIADIIRQQFRFVEPLDPHNAALMDEMQSGVSVSLHIRRGDYFNNPQMRRVHGVDLSEYYPAAVATMIEKTNAERFYVFSDDPQWVLEHLKLPVSYTVVDHNRGAASYRDMQLMSACRHHIIANSTFSWWGAWLNPRPDKVVIAPRHWFNVDVFDTRDLYCPGWIVL 14
Fut C(Hp2FT)
(WP_080473865.1)		 MAFKVVQICGGLGNQMFQYAFAKSLQKHSNTPVLLDITSFDWSDRKMQLELFPIDLPYASAKEIAIAKMQHLPKLVRDALKCMGFDRVSQEIVFEYEPKLLKPSRLTYFFGYFQDPRYFDAISPLIKQTFTLPPPPENNKNNNKKEEEYQCKLSLILAAKNSVFVHIRRGDYVGIGCQLGIDYQKKALEYMAKRVPNMELFVFCEDLEFTQNLDLGYPFMDMTTRDKEEEAYWDMLLMQSCQHGIIANSTYSWWAAYLIENPEKIIIGPKHWLFGHENILCKEWVKIESHFEVKSQKYNA 15
Am2FT_1(WP_081429121.1) MAGHSCGKYANSWRKYAGISRFNPFPCLNMAKGKIIVMRLFGGLGNQLFQYAFLFALSRQGGKARLETSSYEHDDKRVCELHHFRVSLPIEGGPPPWAFRKSRIPACLRSLFAAPKYPHFREEKRHGFDPGLAAPPRRHTYFKGYFQTEQYFLHCREQLCREFRLKTPLTPENARILEDIRSCCSISLHIRRTDYLSNPYLSPPPLEYYLRSMAEMEGRLRAAGAPQESLRYFIFSDDIEWARQNLRPALPHVHVDINDGGTGYFDLELMRNCRHHIIANSTFSWWAAWLNEHAEKIVIAPRIWFNREEGDRYHTDDALIPGSWLRI 16
상기 α-1,2-푸코오스 전이효소는 Biosafety level 1 균주에서 유래한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소는 서열번호 1 내지 서열번호 16으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소는 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 α-1,2-푸코오스 전이효소는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
표 1에서 서열번호 1의 푸코오스 전이효소는 아커만시아 무시니필라 유래이며, Am2FT_2로 명명하였다. 서열번호 2 내지 4의 푸코오스 전이효소는 바실러스 메가테리움 유래이며, 각각 Bm2FT, Bm2FT_2, 및 Bm2FT_3로 명명하였다. 서열번호 5의 푸코오스 전이효소는 바실러스 속 유래이며, Bs2FT로 명명하였다.
서열번호 1 내지 5의 2’-푸코실락토오스 생산 활성을 측정한 결과, Am2FT_2는 약 5 (mg/L), Bm2FT는 약 15 (mg/L), Bm2FT_2는 약 3 (mg/L), Bm2FT_3는 약 4 (mg/L), 및 Bs2FT는 약 1 (mg/L)의 2’-푸코실락토오스를 생성하여, 2FL 생산 활성을 가졌다. 상기 2FL 생산 활성은 다음과 같은 과정으로 분석하였다: 서열번호 1 내지 5의 α-1,2-푸코오스 전이효소 플라스미드를 각각 바실러스 메가테리움에 transformation 후 37℃에서 키웠다. 각각의 plate 에서 2개의 colony를 접종하여 overnight seed culture를 진행하였다. seed 200 uL를 22mM lactose가 첨가된 4mL 배지에 첨가하여 30℃에서 반응을 진행하였다. 20h 후 HPLC 로 분석하였다.
본 출원의 일 예에 따른 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물은 탄소원으로 포도당 및 갈락토오스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 사용 가능한 것일 수 있다. 이 때, 락토오스 가수분해효소를 배양액에 처리 후 상기 미생물의 배양을 지속할 경우, 상기 미생물이 락토오스의 분해산물인 포도당 및/또는 갈락토오스를 탄소원으로 사용하여, 락토오스, 포도당 및 갈락토오스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 잔존당을 배양액 내에서 효과적으로 제거하고, 2’-푸코실락토오스 생산량도 높일 수 있다.
상기 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물은 하기 (1) 내지 (4)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특징을 가지는 것일 수 있다:
(1) LacZ 유전자가 결실됨,
(2) 푸코오스 합성 유전자를 발현함,
(3) 락토오스 막 수송 단백질을 발현함, 및
(4) 포도당 및/또는 갈락토오스를 탄소원으로 사용함.
상기 푸코오스 합성 유전자는 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase), GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase), 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomurase), 및 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 락토오스 막 수송 단백질은 Lac12 및 LacY로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 출원의 일 예에 따른 알파-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물은 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물, 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물, 대장균 속 (Escherichia sp.) 미생물, 및 효모 (yeast)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물은 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 코아귤런스 (Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 및 바실러스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutatamicum) 일 수 있다.
상기 대장균 속 (Escherichia sp.) 미생물은 대장균 (Escherichia coli) 일 수 있다.
상기 효모 (yeast)는 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 및 캔디다 유틸리스 (Candida utilis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 출원은 2’-푸코실락토오스를 생산하는 과정에서 락토오스 가수분해효소를 처리하여, 락토오스를 효과적으로 제거하여 2’-푸코실락토오스 생산량을 높이고, 발효액 내 단백질도 99% 이상 제거할 수 있으며, 발효액 내 배양 부산물과 염류 등을 제거하여 고순도의 2’-푸코실락토오스를 제조할 수 있다.
도 1은 본 출원의 일 예에 따라 얻어진 2’-푸코실락토오스의 순도를 분석한 도면이다.
이하, 본 출원을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. α-1,2-푸코오스 전이효소를 가지는 미생물 제조
락토오스로부터 2’-푸코실락토오스 전환능을 가지는 미생물을 제조하기 위해 예시적으로 Biosafety level 1 균주인 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 14581 (한국 미생물 보존 센터 (KCCM) 기탁번호 40441)을 한국 미생물 보존 센터 (KCCM)에서 입수하여 host로 사용하였다. α-1,2-푸코오스 전이효소의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 16에 나타나 있으며, 대표적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 α-1,2-푸코오스 전이효소(alpha-1,2-fucosyltranferase)를 사용하였다. 바실러스 메가테리움 14581 유전자 내에 b-galactosidase (이하 LacZ)를 homologous recombination 방법을 통해 제거하였고, genome sequencing 을 통해 LacZ 유전자가 제거된 것을 검증하였다.
벡터 형태로 α-1,2-푸코오스 전이효소를 과발현하기 위해, 종래에 주로 사용되는 프로모터인 자일로스 유도 프로모터 (이하 pXyl)를 대체하는 p3610, p12455, 또는 p24930 항시 발현 프로모터를 사용하여 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 효소 (Bm2FT)를 발현하도록 플라스미드를 제작하였다. 이를 상기 제조한 LacZ 결실 균주에 형질전환하여 2’-푸코실락토오스 전환능을 가지는 균주를 제조하고, 이후 실험에 사용하였다.
젖당을 세포 내에 더 많이 도입하기 위하여, 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) 유래의 락토오스 막 수송 단백질 (이하 Lac12) 또는 바실러스 메가테리움 유래의 락토오스 막 수송 단백질 (이하 LacY)을 플라스미드 형태로 항시 발현 프로모터 p12455가 도입된 △LacZ 바실러스 메가테리움에 도입하였다.
바실러스 메가테리움 14581 균주의 GDP-fuc 합성 효소 4종인 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (이하 Gmd), GDP-L-푸코오스 신타아제 (이하 WcaG), 포스포만노뮤타아제 (이하 Hypo 또는 ManB) 및 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (이하 ManC) 4종 효소를 항시발현 프로모터를 사용하여 과발현 되도록 플라스미드 형태로 형질전환하여 생산성을 향상시키고자 하였다. 구체적으로, 50ul 플라스미드를 lysozme을 처리한 500ml b.megaterium protoplast와 섞었다. PEG-P 1.5mL이 들어있는 15mL 팔콘에 5mL SMMP 를 첨가하고 조심히 팔콘을 굴려 섞었다. 1300g에서 10분 원심 분리하여 세포 수거 후 SMMP에 세포를 풀어주어 1.5mL 37C에서 250rpm shaking 하여 형질전환을 완료하였다.
비교예 1. 모유올리고당 제조 (1)
(1) 종균배양
-70℃ 온도에서 냉동 보관된 상기 실시예 1에서 제조한 Bacillus megaterium 유래 균주를 3ml 액체배지의 Test-tube에 100uL 접종하여, 30℃에서 240rpm으로 12-18시간 배양하였다. 배양이 완료된 3mL 액체 배양액은 다시 멸균 상태인 250mL 삼각플라스크의 50ml 액체배지에 접종하여, 30℃에서 240rpm으로 12~16시간 배양하였다. 종균배양에 사용한 배지 조성은 yeast extract 5 g/L, Tryptone 10 g/L 및 NaCl 10 g/L를 포함하였다.
(2) 본배양
멸균된 5L 용량의 자발효기 (jar fermentor)에서 배양이 완료된 100mL 배양액을 본배양 배지 2L에 접종하여 30℃에서 500-800rpm, 1v/v/m 조건으로 배양을 진행하였다. 상기 본배양 배지의 조성을 표 2에 나타내었으며, 본배양 배지에 첨가된 100X TMS (Trace Metal Solution)의 조성을 표 3에 나타내었다.
배양 초기에 적절한 당 농도를 설정하여 배양하고, 미생물의 성장 속도에 따라 고농도의 당을 점진적으로 주입하여 배양액 내에 낮은 당 농도를 유지하는 방법을 사용하였다. 당의 첨가 시기, 방법 및 첨가량에 따라 다양한 유가식 배양방법을 사용할 수 있으며, 본 실험에서는 pH 유지 당 공급 (pH stat feeding)을 사용하였다. Feeding 시작 전에 15 g/L의 락토오스를 추가 공급하였으며, 추가 용액 (feeding solution)의 조성은 Glucose 750g/L 및 MgSO4·7H2O 15 g/L을 포함하였다. 배양 초기에 배양액의 pH가 7.0 내지 7.2 범위로 유지되도록 탄소원, 수산화나트륨 또는 암모니아수와 같은 염기성 용액을 공급하였다.
배양이 완료된 후 원심분리기를 이용하여 배양액에서 균체를 제거하고, 상등액을 회수하여 발효액 (fermentation broth)을 모유올리고당 정제에 사용하였다.
성분 농도 (g/L)
Glucose 10
Lactose 15
MgSO4-7H2O 0.3
Yeast extract 3
(NH4)2SO4 1
K2HPO4 12
KH2PO4 3
NaCl 0.1
CaCl2-2H2O 0.015
FeSO4-7H2O 0.015
Thaimine 0.010
100X TMS 10ml
성분 농도 (g/L)
Tri-sodium citrate 20
CaCl2.2H2O 11.5
FeSO4.7H2O 8.3
MnCl2.4H2O 3.2
Zn(CH3COO)2.2H2O 1.68
CuCl2.2H2O 0.302
CoCl2.6H2O 0.534
H3BO3 0.666
Na2MoO4.2H2O 0.534
Thiamine 0.534
1N HCl 원액 (ml) 100
dH2O up to 1L
실시예 2. 모유올리고당 제조 (2)
비교예 1과 같은 방법으로 균주를 배양하고, 배양 완료 후 상등액을 회수하고, 상등액에 락토오스 가수분해효소를 처리하여 잔존 락토오스를 제거하였다. 구체적으로, 상기 회수된 상등액에 락토오스 가수분해효소 (Novozymes, Lactozym® 6500L)를 50℃에서 16시간 이상 처리하였고, 락토오스가 모두 분해되어 포도당 및 갈락토오스가 생성되는 것을 HPLC 분석을 통해 분석하였다.
상기 락토오스가 분해된 배양액을, 원심분리기를 사용하여 8,000rpm (11,000g)으로 8℃ 온도에서 15분 간 수행하여 원심분리를 수행하여 균체를 제거하고, 상등액을 회수하여 발효액 (fermentation broth)을 모유올리고당 정제에 사용하였다.
실시예 3. 모유올리고당 제조 (3)
비교예 1과 같은 방법으로 균주를 배양하고, 2’-푸코실락토오스 생산량의 증가가 없는 배양 후기에 락토오스가수분해효소 (Novozymes, Lactozym® 6500L)를 처리하고 이후 12-24시간 동안 배양을 지속하여 추가 배양을 실시하였다. 추가 배양이 진행되는 동안 락토오스는 분해되고, 생성된 포도당 및 갈락토오스는 2’-FL 생산 균주에 의해 소모되는 것을 HPLC 분석을 통해 검증하였다.
잔존당이 모두 제거된 배양액은 원심분리기를 사용하여 8,000rpm (11,000g)으로 8℃ 온도에서 15분 간 수행하여 원심분리를 수행하여 균체를 제거하여 상등액을 회수하여 발효액 (fermentation broth)을 모유올리고당 정제에 사용하였다.
실시예 4. 2’-푸코실락토오스 분리 정제
비교예 1, 실시예 2 및 실시예 3에서 얻은 상등액을 활성탄 처리, 초미세여과(Ultrafiltration), 나노여과 (Nanofiltration), 전기투석 (Electrodialysis), 및 이온교환수지 (Ion exchange) 공정 순서로 2’-푸코실락토오스를 분리 정제하였다.
구체적으로, 비교예 1, 실시예 2 및 실시예 3에서 얻은 발효액에 활성탄 (KB-EVN, 4% (고형분의 10%))을 투입 후, 70℃ 온도에서 30분 교반하여 수행하였다. 그 후 7,000rpm에서 20분간 원심분리한 다음 여과 (필터 사이즈: 1μm, 0.45μm)하여 활성탄을 제거하였다.
이어서, 단백질을 농축하여 제거하기 위해, 초미세여과기 (MILLIPORE, ProFlux M12)를 사용하여 30k&10kDa 필터, 135psi 압력 조건 하에서 초미세여과를 수행하였다. 다음으로, 나노여과기 (퓨어테크피앤티)를 사용하여 200-300Da, 145-150psi 조건 하에서, 상기 초미세여과공정을 거친 산물에 대해 나노여과를 수행하였다. 다음으로, 전기투석기 (INNOMEDITECH, PS520)를 사용하여 전기투석을 수행하였다 (정전압 방식: 1V/cell, 20cells, 총 20V). 전기투석을 완료한 샘플을 양이온 수지(SCRB), 음이온 수지(AW30), 혼합 수지(SCRB, AMP24)를 각각 패킹한 컬럼에 연속해서 흘려 이온교환을 수행하였다.
이온교환수지 통액 후 굴절당도계 (ATAGO Digital Regractometer)를 사용하여 당도를 측정한 결과 30 내지 50 brix로 측정되었다. 또한, 상기 각 분리 정제 공정 단계를 수행한 뒤 실시예 5의 방법에 따라 2’-푸코실락토오스의 순도를 측정하였다.
실시예 5. 2’-푸코실락토오스 분리 정제에 따른 순도 분석
실시예 4의 각 분리 정제 공정 단계를 수행한 뒤 2’-푸코실락토오스의 순도 (중량%) 변화를 측정하여 표 4에 나타냈다. 각 분리 정제 공정 단계별 성분 조성을 HPLC-RI로 측정하였고, 분석 조건은 다음과 같았다:
장비 : HPLC-RI (Waters)
이동상 : 5mM H2SO4
유속 : 0.6mL/min
오븐온도 : 50℃
Column : Rezex ROA Organic Acid H+ 8% (Phenomenex)
정제단계 비교예 1 실시예 2 실시예 3
Fermentation broth 17.70 17.57 17.52
Active carbon 17.76 17.76 18.56
Ultrafiltration 17.56 18.13 18.08
Nanofiltration 40.09 72.30 67.02
Electrodialysis 42.51 74.43 94.03
Ion exchange 44.25 85.17 95.24
표 4에 나타난 바와 같이, 2’-푸코실락토오스 전환반응 완료 후 배양액의 2’-FL 함량은 비교예 1과 실시예 1 및 2가 유사하였다. 그러나, 분리정제 과정을 거치면서 2’-FL 순도 차이가 나타났으며, 나노필터링 공정이후 실시예 2 및 3의 배양액은 45% 이상의 2’-FL 순도를 달성하였다. 특히, 실시예 3의 배양 상등액은 전기투석과 이온정제 공정을 수행한 후에는 각각 94% 이상의 2’-FL 순도를 달성하여 더욱 바람직한 결과를 나타냈다. 구체적으로, 실시예 3의 배양액은 2’-FL 최대 생산량에 도달한 때에 락타아제 처리를 통해 락토오스를 분해하고, 락토오스 분해산물인 포도당 및 갈락토오스를 소모하는 2’-푸코실락토오스 전환 미생물에 의해 2’-FL 이외의 당류가 제거되어, 90% 이상의 고순도 2’- 푸코실락토오스를 제조할 수 있었다.
실시예 6. 분리 정제에 따른 당류 분석
실시예 4의 분리 정제 공정 단계를 수행한 뒤 당류 고형분 100중량%를 기준으로 각 당류의 함량을 표 5에 나타냈다.
당 비율 (%) 2’-FL 락토오스 포도당 갈락토오스
비교예 1 44.25 55.75 0 0
실시예 2 85.17 3.37 3.66 7.8
실시예 3 >95 0 0 0
표 5에 나타난 바와 같이, 비교예 1에 비해 락타아제를 처리한 실시예 2 및 3은 종래에 2’-푸코실락토오스와 분리 정제가 어려웠던 락토오스가 효율적으로 제거되었다. 또한, 실시예 3은 배양 후기에 락타아제를 처리하고 추가 배양을 수행하여 락토오스, 포도당 및 갈락토오스가 소모되어 배양액 내에서 모두 제거되고, 정제완료 후 2’-FL 이외의 잔여당 함량이 최소화되고, 최종 산물의 2’-FL 함량이 90중량% 이상으로 매우 높았다.
실시예 7. 분리 정제에 따른 단백질 함량 분석
실시예 3에서 얻은 상등액의 각 분리 정제 공정 단계를 수행한 뒤 단백질 함량을 표 8에 나타냈다. 표 7에 나타난 바와 같이, 정제를 진행함에 따라 단백질은 AC, UF 공정에서 99% 이상 제거되었다.
단계 단백질
농도(g/L) 수율(%)
Fermentation broth 3.46 100
Active carbon 0.35 9.82
Ultrafiltration 0.01 0.58
Nanofiltration 0.06 0.56
Electrodialysis 0.02 0.11
Ion exchange 0.01 0.04
실시예 8. 2’-푸코실락토오스 분무건조
실시예 3의 상등액에 대해 실시예 4의 분리 정제 공정을 완료하고, 얻어진 산물을 분무건조하여 2’-푸코실락토오스의 분말을 제조하였다.
구체적으로, 실시예 5에서 제조한 이온정제액을 분무건조에 적합한 40-70 brix까지 농축하고, 분무건조기 (Yamato Spray Dryer, ADL311)를 사용하여 건조 분말을 제조하였다. 분무건조는 inlet 온도 140-150℃, outlet 온도 70-75℃, automizing air는 0.15, 펌프 속도는 1 mL/min 조건에서 진행하였다.
상기 얻어진 건조 분말을 용해 후 HPLC 분석을 실시하였고, 도 1과 같이 2’-푸코실락토오스의 순도가 95% 이상인 것을 검증하였다.

Claims (24)

  1. 락토오스를 포함하는 배지에서 알파-1,2-푸코오스 전이효소(alpha-1,2-fucosyltransferase)를 가지는 미생물을 배양하여, 락토오스로부터 2’-푸코실락토오스를 생산하는 단계; 및
    락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는, 2’-푸코실락토오스의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계는, 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 수행되거나, 또는 상기 미생물 균체가 제거된 배양액에서 수행되는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 락토오스 가수분해효소는 상기 미생물을 포함하는 배양액에 처리되며, 상기 배양액에 락토오스 가수분해효소를 처리하여 배양을 지속하는 단계 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계를, 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 수행하는 경우, 2’-푸코실락토오스 함량의 증가율이 10% 이하일 때 첨가되는 것인, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계를, 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 수행하는 경우, 배양액 내 2’-푸코실락토오스 함량의 최댓값을 도달한 시점 이후에 첨가되는 것인, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 락토오스 가수분해효소를 처리하는 단계를, 상기 미생물을 포함하는 배양액에서 수행하는 경우, 2’-푸코실락토오스 전환반응이 정상상태일 때 첨가되는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 락토오스 가수분해효소 처리 후 배양액은, 처리 전 배양액의 락토오스 함량 100중량%을 기준으로, 락토오스 함량이 5중량% 이하인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물의 배양액에서 균체를 제거하여 상등액을 얻는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 상등액을 정제하여 2’-푸코실락토오스를 얻는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 정제는 활성탄 처리, 초미세여과 (Ultrafiltration), 나노여과 (Nanofiltration), 전기투석 (Electrodialysis), 및 이온교환수지 (Ion exchange)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 공정을 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 활성탄 처리는 정제공정 중 처음에 수행되거나, 상기 초미세여과는 상기 나노여과 이전에 수행되거나, 상기 나노여과는 상기 전기투석 이전에 수행되거나, 또는 상기 이온교환수지는 정제공정 중 마지막에 수행되는 것인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 정제는 활성탄 처리, 초미세여과, 나노여과, 전기투석, 및 이온교환수지 순서로 수행되는 것인, 방법.
  13. 제9에 있어서, 상기 방법은 순도 45중량% 이상의 2’-푸코실락토오스를 얻는 것인, 방법.
  14. 제9항에 있어서, 당류 고형분 100중량% 기준으로 2’-푸코실락토오스 함량이 45중량% 이상인 정제물을 얻는 것인, 방법.
  15. 제8항에 있어서, 상기 상등액을 농축 또는 분무건조하여 2’-푸코실락토오스 분말을 얻는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제8항에 있어서, 상기 상등액을 정제하는 단계;
    상기 정제된 상등액을 농축하는 단계; 및
    상기 농축된 상등액을 분무건조하여 2’-푸코실락토오스 분말을 얻는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 탄소원으로 포도당 및 갈락토오스로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 사용 가능한 것인, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 LacZ 유전자가 결실된 것인, 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 푸코오스 합성 유전자를 발현하는 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 푸코오스 합성 유전자는 GDP-D-만노오스-4,6-데하이드라타아제 (GDP-D-mannose-4,6-dehydratase), GDP-L-푸코오스 신타아제 (GDP-L-fucose synthase), 포스포만노뮤타아제 (phosphomannomurase), 및 GTP 만노오스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라아제 (GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 락토오스 막 수송 단백질을 발현하는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 락토오스 막 수송 단백질은 Lac12 및 LacY로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법
  23. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물, 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물, 대장균 속 (Escherichia sp.) 미생물, 및 효모 (yeast)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 바실러스 속 (Bacillus sp.) 미생물은 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 코아귤런스 (Bacillus coagulans), 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis), 및 바실러스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상,
    상기 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutatamicum),
    상기 대장균 속 (Escherichia sp.) 미생물은 대장균 (Escherichia coli), 또는
    상기 효모 (yeast)는 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 및 캔디다 유틸리스 (Candida utilis)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
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