MX2013008423A - Fucosiltransferasas novedosas y sus aplicaciones. - Google Patents

Abstract

Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de Escherichia coli del serogrupo O126 que codifican alfa-1,2-fucosiltransferasas novedosas o que las representan. Usos de dichas alfa-1,2-fucosiltransferasas en la generación de productos fucosilados, que por ejemplo, pueden ser oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lípidos, particularmente oligosacáridos propios de la leche humana, como es el caso de la 2'-fucosil-lactosa. Métodos relacionados.

Description

FUCOSILTRANSFERASAS NOVEDOSAS Y SUS APLICACIONES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada con fucosiltransferasas novedosas y con sus aplicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Para que una variedad de (gluco)protefnas, (gluco)lfpidos y oligosacáridos presenten actividad biológica, es necesario que haya estructuras fucosiladas específicas presentes. Por ejemplo, para la acción de diversos mecanismos de reconocimiento intercelulares, es imprescindible que haya un oligosacárido fucosilado presente. Más precisamente, para que pueda tener lugar la unión a las moléculas de adhesión en las células, tales como la L-selectina, es imprescindible que determinadas estructuras en las células comprendan hidratos de carbono fucosilados. En otro ejemplo, determinadas estructuras fucosiladas constituyen el sistema que está asociado al grupo sanguíneo ABO. Por otro lado, las (gluco)proteínas terapéuticas, cuyas propiedades farmacocinéticas y estabilidad son atribuidas a los glucanos que comprenden, son los reactivos farmacéuticos que se han desarrollado de manera más veloz.

Debido a que los glucoconjugados se caracterizan una naturaleza compleja y presentan propiedades químicas inherentes, su síntesis química es compleja y está asociada a numerosas dificultades. A diferencia de las proteínas o los ácidos nucleicos, para cuya elaboración puede recurrirse al uso de sintetizadores automatizados comerciales, los glucanos, y particularmente los glucoconjugados, (todavía) no pueden ser sintetizados con sistemas comerciales generalizados. Además de la necesidad de controlar la estereoquímica, subsisten las dificultades que están asociadas a la formación de los enlaces espié ficos.

Debido al carácter complejo que caracteriza a la síntesis de los glucoconjugados · por medios enzimáticos o químicos, en abordajes recientes se ha recurrido al uso de glucosiltransferasas para efectuar la síntesis enzimática de aquellas (gluco)proteínas y aquellos (gluco)lípidos que comprenden residuos de oligosacáridos.

Las fucosiltransferasas son enzimas que pertenecen a la familia de las glucosiltransferasas, que se caracterizan por una expresión amplia entre los vertebrados, los invertebrados, las plantas y las bacterias y que catalizan la transferencia de un residuo de fucosa desde un donante, que generalmente es la fucosa con difosfato de guanosina (GDP-fucosa), hasta un aceptor, que suele ser un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido. Se ha comprobado la presencia de estos sustratos aceptores fucosilados en diversos procesos biológicos y patológicos.

En función del sitio en el que se agrega la fucosa, las fucosiltransferasas se clasifican como alfa-1 ,2-fucosiltransferasas, alfa-1 ,3/4-fucosiltransferasas u O-fucosiltransferasas. Se han identificado numerosas alfa-1 ,2-fucosiltransferasas, por ejemplo, en las bacterias Helicobacter pylori y Escherichia coli, en los mamíferos, en Caenorhabditis elegans y en Schistosoma mansoni, asi como en las plantas. La mayoría de estas enzimas no pueden expresarse en formas activas en los sistemas basados en bacterias o no pueden utilizar la lactosa como aceptor.

La GDP-fucosa se sintetiza en el citoplasma de los mamíferos, a través de una combinación de un proceso de síntesis de novo y una vía de captura. En el contexto de la síntesis de novo, la GDP-manosa es convertida en GDP-fucosa merced a la acción de dos enzimas. Por otro lado, como sustrato en la vía de captura, se utiliza la fucosa que se encuentra libre en el citosol. En el interior de las células, la GDP-fucosa se concentra en las vesículas, donde es reconocida por las fucosiltransferasas como sustrato donante. Sin embargo, la expresión de las glucosiltransferasas heterólogas funcionales provenientes de los eucariotas, y particularmente de las fucosiltransferasas, ha resultado complicada en los sistemas basados en procariotas. Los oligosacáridos de los mamíferos, y particularmente los oligosacáridos de los seres humanos, tales como los HMO, no pueden obtenerse a partir de fuentes procariotas, lo cual complica en gran medida el descubrimiento de glucosiltransferasas apropiadas para su elaboración.

Debido a que la actividad biológica de una amplia variedad de oligosacáridos, (gluco)protefnas y (gluco)lípidos que son importantes desde el punto de vista comercial depende de la presencia de diversos residuos de fucosa específicos, puede concluirse que en la técnica existe la necesidad de métodos que sean útiles para sintetizar o producir de manera eficiente glucoconjugados que comprendan los residuos de oligosacáridos deseados.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En este contexto, un objetivo de la presente invención fue proveer herramientas y métodos que fueran útiles para producir los sustratos fucosilados deseados de una manera eficiente, rápida y económica, así como con un rendimiento elevado.

De acuerdo con la invención, el objetivo mencionado se cumple al proveerse, entre otros elementos, un polinucleótido, que por ejemplo, puede ser un polinucleótido aislado, recombinante o sintético, que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa y que comprende una secuencia que se selecciona del siguiente grupo, o que consiste en ella: (a) SEQ ID N° 1 del listado de secuencias adjunto; (b) una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de SEQ ID N° 1 ; y (c) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que se definen en a) y en b) o con sus cadenas complementarias.

El polinucleótido de acuerdo con la invención (véase SEQ ID N° 1 ) representa una fucosiltransferasa del serogrupo 0125 de la especie Escherichia coli.

Las fucosiltransferasas que se han identificado presentan efectos sorprendentes, ya que con ellas pueden llevarse a cabo diversas reacciones que no serian posibles bajo condiciones naturales. En el contexto de la presente invención, se determinó que las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas que identificaron pueden emplear la lactosa como sustrato, por lo que son útiles para producir oligosacáridos fucosilados, como es el caso de la 2'-fucosil-lactosa. Hasta la fecha, no se habla demostrado que ninguna de las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas conocidas que se habían aislado a partir de diversas bacterias pudiera emplear la lactosa como sustrato natural en la elaboración de la fucosil-lactosa. Por lo tanto, la utilidad de las fucosiltransferasas que se han identificado en la producción de los oligosacáridos fucosilados resulta sorprendente. En particular, estas fucosiltransferasas constituyen una herramienta excelente, por ejemplo, para producir oligosacáridos propios de la leche humana (HMO), tales como la fucosÍl-lactósá, de una manera sencilla, eficiente y económica. Actualmente, el grupo de los HMO abarca más de 80 compuestos cuyas estructuras han sido caracterizadas. Estos compuestos representan una clase de oligosacáridos complejos que cumplen la función de prebióticos. Por otra parte, la homología estructural que presentan los HMO con diversos epitopes epiteliales les confiere utilidad como agentes para proveer protección contra una variedad de patógenos bacterianos. En el tracto gastrointestinal de los lactantes, los HMO pueden ser útiles como nutrientes selectivos para determinadas cepas de bacterias, por lo que pueden favorecer del desarrollo de una microbiota intestinal única.

Hasta el momento, la producción de los oligosacáridos basada en métodos de síntesis se había visto impedida a causa de la complejidad estructural que los caracteriza, por lo que la fuente principal de los HMO era la leche humana. En este contexto, existía la necesidad de HMO que pudieran obtenerse de una manera rápida y sencilla, la cual fue satisfecha con las fucosiltransferasas que se describen en la presente, que resultaron sorprendentemente apropiadas para tal fin.

En el contexto de la presente invención, el término "polinucleótido" hace referencia en general a cualquier polirribonucleótido o a cualquier polidesoxirribonucleótido, lo que incluye el ADN no modificado, el A N no modificado, el ADN modificado y el ARN modificado. El término "polinucleótido" abarca, sin limitaciones, el ADN de cadena simple, el ADN de cadena doble, el ADN que está compuesto por combinaciones de regiones de cadena simple y de cadena doble, el ADN que está compuesto por combinaciones de regiones de cadena simple, de cadena doble y de cadena triple, el ARN de cadena simple, el ARN de cadena doble, el ARN que está compuesto por combinaciones de regiones de cadena simple y de cadena doble y las moléculas híbridas que están compuestas por ADN y ARN, que pueden ser de cadena simple, pero que más típicamente están compuestas por regiones de cadena doble o de cadena triple o por mezclas de regiones de cadena doble y de cadena triple. Por otra parte, el término "polinucleótido", tal como se lo emplea en la presente, puede hacer referencia a una región de cadena triple, la cual puede comprender ARN, ADN o una combinación de éstos. Las cadenas que constituyen estas regiones pueden provenir de una misma molécula o de moléculas diferentes, y las regiones propiamente dichas pueden abarcar la totalidad de una o más de las moléculas, aunque más típicamente apenas abarcan una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas que constituyen una región de una hélice triple frecuentemente es un oligonucleótido. En este contexto, el término "polinucleótido", tal . como se lo emplea en la presente, también puede hacer referencia a moléculas de ADN o de ADN que son' como las que se describieron con anterioridad, pero que también comprenden una o más bases modificadas. De esta manera, el término "polinucleótido", tal como se lo emplea en la presente, abarca aquellas moléculas de ADN o de ADN que comprenden esqueletos que han sido modificados con el fin de incrementar su estabilidad o por otros motivos. Más aun, dentro del alcance del término "polinucleótido", ta! como se lo emplea en la presente, también se incluyen aquellas moléculas de ADN o de ARN que, por ejemplo, comprenden bases inusuales, como es el caso de la inosina, o bases modificadas, tales como las bases tritiadas. Ha de apreciarse la posibilidad de realizar diversas modificaciones en el ADN o en el ARN para cumplir con numerosos objetivos útiles, conocidos para aquellos versados en la técnica. Como consecuencia, el término "polinucleótido", tal como se lo emplea en la presente, ' abarca ! todos los polinucleótidos que han sido sometidos a modificaciones químicas, enzimáticas o metabólicas, asi como las formas químicas del ADN y del ARN que son características de una amplia variedad de virus o de células, como es el caso de las células simples o complejas, y también abarca aquellos polinucleótidos que suelen conocerse como oligonucleótidos.

El término "polipéptido" hace referencia a un péptido o una proteína que comprende dos o más aminoácidos que están unidos a través de enlaces peptídicos, los cuales pueden estar modificados o no. El término "polipéptido" hace referencia a los polímeros de aminoácidos que comprenden cadenas cortas, que suelen denominarse péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y también hace referencia a los polímeros de aminoácidos que comprenden cadenas largas, que suelen denominarse proteínas. Los polipéptidos pueden comprender aminoácidos diferentes de los 20 que están codificados por los genes. Dentro del alcance del término "polipéptido" también se incluyen aquellos péptidos que han sido modificados por medios naturales, que incluyen el procesamiento y otras modificaciones posteriores a la traducción, así como aquellos péptidos que han sido modificados a través de procedimientos químicos artificiales. Estas modificaciones se describen apropiadamente en los textos de referencia, se detallan en las monografías y en la abundante literatura dedicada a la investigación y han de resultar conocidas para aquellos versados en la técnica. Ha de apreciarse la posibilidad de que una modificación de un tipo determinado esté presente en un grado idéntico o diferente en diversos sitios de un mismo polipéptido, y de que un mismo polipéptido comprenda modificaciones de diversos tipos. Las modificaciones podrán efectuarse en cualquier parte de los polipéptidos, lo que abarca el esqueleto, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino y carboxilo. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, la acetilación, la acilación, la ribosiláción con ADP, la amidación, la unión covalente de una flavina, la unión covalente de una unidad hemo, la unión ¿oválente de un nucleótido o de un derivado de un nucleótido, la unión covalente de un lípido o de un derivado de un lípido, la unión de un fosfotidilinositol, el entrecruzamiento, la formación de enlaces disulfuro, la desmetilación, la formación de entrecruzamientos covalentes, la formación de piroglutamatos, la formilación, la gamma-carboxilación, la glucosilación, la formación de anclajes GPI, la hidroxilación, la iodación, la metilación, la miristilación, la oxidación, el procesamiento proteolítico, la fosforilación, la pferiilación, la racemización, la unión de lípidos, la sulfación, la carboxilación de los residuos de ácido glutámico en la posición gamma, la selenización y la adición de aminoácidos a las proteínas mediante el uso de ARN de transferencia, lo que incluye la arginilación y la ubiquitinación. Los polipéptidos pueden ¡ser ramificados o cíclicos, en cuyo caso pueden comprender o no ramas. Los polipéptidos cíclicos, los polipéptidos ramificados y los polipéptidos circulares con ramas pueden obtenerse como resultado de diversos procesos naturales que tienen lugar después de la traducción, aunque también pueden ser elaborados con métodos completamente sintéticos.

El término "aislado" hace referencia al resultado de una alteración producida por el hombre, con relación al estado natural. En este contexto, si un elemento puede hallarse en la naturaleza, debe haber sido modificado y/o removido de su ambiente original para que se lo denomine aislado. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido que están presentes de manera natural en un organismo vivo no se encuentran "aislados". En contraste, un polinucleótido o un polipéptido que son similares pero que han sido separados de los materiales que los acompañan en su estado natural se encuentran "aislados", en función de la definición que se provee en la presente. Asimismo, el término "sintética", aplicado a una secuencia, denota que ésta ha sido generada por medio de un procedimiento de síntesis, lo que implica que no ha sido aislada directamente a partir de una fuente natural. El término "recombinante" hace referencia al resultado de un procedimiento de ingeniería genética a nivel del ADN, que puede estar basado en la escisión de genes o en su transplante desde las células de una especie hasta las células del organismo huésped de otra especie. En este contexto, el ADN puede integrarse en el genoma del huésped, en el cual puede adquirir la capacidad de replicarse.

El término "polinucleótido que codifica un polipéptido", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención, que particular puede ser una alfa-1 ,2-fucosiltransferasa que presenta una secuencia de aminoácidos como la que se detalla en SEQ ID N° 2. El término también abarca aquellos poiinucleótidos que comprenden una única región continua o discontinua que codifica un polipéptido como el ; que se ha mencionado (que puede estar interrumpida, por ejemplo, por un fago integrado, por una secuencia insertada o por una secuencia de edición), en combinación con otras regiones que también pueden comprender secuencias codificantes y/o secuencias no codificantes.

El término "variante", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a un polinucleótido o un polipéptido que es diferente de un polinucleótido o un polipéptido de referencia, respectivamente,, pero que todavía presenta sus propiedades esenciales. En particular, una variante de un polinucleótido suele comprender una secuencia de nucleótidos que difiere de la del polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden manifestarse como una alteración en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, con relación a la que codifica el polinucleótido de referencia, aunque esto no es imprescindible. Más precisamente, tal como se describirá más adelante, los cambios a nivel de los nucleótidos pueden dar como resultado diversas sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones o escisiones a nivel de los aminoácidos del polipéptido resultante, en comparación con el polipéptido que es codificado por la secuencia de referencia. En este contexto, una variante típica de un polipéptido suele comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la del polipéptido de referencia, aunque estas diferencias suelen ser limitadas, por lo que la secuencia del polipéptido de referencia y la secuencia de la variante suelen ser sustancialmente similares, e incluso pueden ser idénticas en diversas regiones. Las diferencias entre la secuencia de aminoácidos de la variante y la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia pueden deberse a una o más sustituciones, adiciones o supresiones, en cualquier combinación. Cualquier residuo de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polinucleótido o de un polipéptido puede ser una variante de origen natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante con un origen no natural conocido. Las vanantes de los polinucleótidos y de los polipéptidos que no se originan en la naturaleza pueden elaborarse por medio de una mutagénesis, a través de una síntesis directa o con otros métodos de recombinación conocidos por aquellos versados en la técnica.

Los términos "alfa-1 ,2-fucosiltranferasa", "fucosiltransferasa", "ácido nucleico/polinucleótido que codifica una alfa-1,2-fucosiltranferasa" y "ácido nucleico/polinucleótido que codifica una fucosiltransferasa" hacen referencia a glucosiltransferasas que pueden catalizar la transferencia de un residuo de fucosa desde un sustrato donante, tal como la GDP-fucosa, hasta una molécula aceptora con un enjace ialfa-1 ,2. La molécula aceptora puede ser un hidrato de carbono, un oligosacárido, una proteína, una glucoproteína, un lípido o un glucolípido, y en particular, puede ser la N-acetilglucosamina, la N-acetil-lactosamina, la galactosa, la fucosa, el ácido siálico, la glucosa, la lactosa o cualquier combinación de éstos. Dentro del alcance de la presente invención también se contemplan las variantes polimórficas, alélicas, mutadas o interespecíficas de los ácidos nucleicos/polinucleótidos que se describen, es decir, aquellos ácidos nucleicos/polinucleótidos que presentan secuencias de aminoácidos que se caracterizan por una identidad superior a aproximadamente 60%, preferiblemente de aproximadamente 65%, 70%, 75%, 80%, '85%, 90%, y más preferiblemente de 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, con una región de una secuencia que comprende al menos aproximadamente 25, 50, 100, 200, 500, 1000 o más aminoácidos de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID N° 1 , o bien con la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID N° 2.

Adicionalmente, para modificar la actividad de un polipéptido de una alfa-1 ,2-fucosiltransferasa, pueden llevarse a cabo diversas adiciones o supresiones en su secuencia. Por ejemplo, pueden fusionarse otras secuencias polipeptídicas a un polipéptido de una alfa-1 ,2-fucosiltransferasa para agregar otra actividad enzimática. Como alternativa, pueden suprimirse aminoácidos específicos para eliminar o modificar la actividad de una proteína. En este contexto, una proteína puede modificarse para eliminar su actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa y conservar su estructura tridimensional al mismo tiempo. Una modificación de este tipo puede resultar útil para desarrollar un anticuerpo contra un polipéptido de una alfa-1 ,2-fucosiltransferasa.

Por otro lado, los productos de los genes de las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas pueden ser proteínas o polipéptidos que corresponden a variantes equivalentes desde el punto de vista funcional de las alfa-1 , 2-fucosíltransferasas que se describen en la presente, donde dichas variantes pueden presentar supresiones, adiciones o sustituciones a nivel de los residuos de aminoácidos, con relación a las secuencias de los genes de las alfa-1 , 2-fucosiltransferasas que se describieron con anterioridad. En cualquier caso, estos cambios pueden ser silenciosos, es decir, pueden dar como resultado alfa-1 , 2-fucosiltransferasas que son equivalentes desde el punto de vista funcional, según se ha indicado. Las sustituciones a nivel de los aminoácidos pueden efectuarse en función de las similitudes en la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos que se desea modificar. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen la alanina, la leucina, la isoleucina. la valina, la prolina, la fenilalanina, el triptofano y la metionina, los aminoácidos polares neutros incluyen la glicina, la serina, la treonina, la cisteína, la tirosina, la asparragina y la glutamina, los aminoácidos con cargas positivas (básicos) incluyen la arginina, la lisina y la histidina, y los aminoácidos con cargas negativas (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico. Tal como se lo emplea en la presente, el término "equivalente desde el punto de vista funcional" hace referencia a un polipéptido que presenta una actividad in vivo que es sustancialmente similar a la de las alfa-1 , 2-fucosiltransferasas que son codificadas por los genes endógenos y que comprenden secuencias como las que se describieron con anterioridad. Esto puede determinarse en función de diversos criterios, tales como la antigenicidad, es decir, la capacidad del polipéptido de unirse a un anticuerpo anti-alfa-1 ,2-fucosiltransferasa, la inmunogenicidad, es decir, la capacidad del polipéptido de generar un anticuerpo que puede unirse a una proteína o un polipéptido de una alfa-1 ,2-fucosiltransferasa, o la actividad enzimática, entre otras posibilidades.

Las proteínas, los polipéptidos y los derivados de las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas (que incluyen los fragmentos de éstas) que han sido sometidos a una modificación diferencial durante la traducción o después de ella también se encuentran dentro del alcance de la invención. Por otra parte, ha de ser posible introducir una variedad de aminoácidos no clásicos o análogos químicos de diversos aminoácidos a través de sustituciones o adiciones en las secuencias de los polipéptidos de las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas.

La elaboración de los polipéptidos de las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas puede basarse en el uso de tecnología de ADN recombinante, de acuerdo con procedimientos conocidos para aquellos versados en la técnica. Pueden emplearse métodos bien conocidos en la técnica para preparar los vectores de expresión que comprenden las secuencias que codifican las alfa-1 , 2-fucosiltransferasas y las señales apropiadas para controlar la transcripción o la traducción. A modo de ejemplo, estos métodos incluyen los procedimientos de recombinación de ADN in vitro, los procedimientos de síntesis y la recombinación de genes in vivo. Como referencia, puede consultarse la descripción que se provee en Sambrook et al., Molecular Cioning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Tal como se lo emplea en la présente y como suele interpretárselo en la técnica, el término "oligosacárido" hace referencia a un polímero que es un sacárido que comprende una cantidad pequeña de azúcares simples, es decir, monosacáridos, que típicamente varía entre tres y diez. . .

En otro aspecto de la invención, se provee un vector que comprende una secuencia1 de ácido nucleico que es como la que se describió con anterioridad, que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 , 2-fucosiltransferasa, donde la secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a secuencias de control que pueden ser reconocidas por la célula huésped que es transformada con el vector. En una forma de realización particularmente preferida, el vector es un vector de expresión, y en otro aspecto de la invención, el vector puede tomar la forma de un plásmido, un cósmido, un fago, un liposoma o un virus.

La invención también se relaciona con células huésped que comprenden una secuencia que consiste en un polinucleótido de acuerdo con la invención, que puede ser como :se describió con anterioridad, donde la secuencia puede ser una secuencia exógena con relación a la célula huésped y puede estar integrada en su genoma. En este contexto, el término "exógena con relación a la célülá huésped" denota que la secuencia no puede hallarse en la célula huésped bajo condiciones naturales, por lo que se trata de una secuencia heteróloga. Esta secuencia heteróloga puede introducirse de manera estable en el genoma de la célula huésped, por ejemplo, por medio de una transfección, una transformación o una transducción, aunque el procedimiento que se seleccione finalmente dependerá de las características propias de la célula huésped en la que se desee introducir la secuencia. Aquellos versados en la técnica han de conocer una variedad de procedimientos útiles para el propósito que se ha descripto. A modo de ejemplo, puede consultarse Sambrook et al., 1989, supra. Una célula huésped en la que se ha introducido un polinucleótido heterólogo de acuerdo con la invención puede ser útil para producir la proteína heteróloga que éste codifica.

En los procedimientos de elaboración recombinantes, las células huésped pueden ser sometidas a diversas modificaciones genéticas para introducir sistemas de expresión, porciones de éstos o. polinucleótidos de acuerdo con la invención. Los poliuncleótidos pueden introducirse en las células huésped de acuerdo con métodos como los que se describen en los manuales de referencia para los laboratorios, tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, (1986), y Sambrook et al., 1989, supra.

A modo de ejemplo, un polinucleótido de acuerdo con la invención puede estar incluido un vector que puede introducirse de manera estable en una célula huésped, por medio de una transfección o una transformación. En el vector, el polinucleótido de acuerdo con la invención puede estar bajo el control de un promotor, que por ejemplo, puede ser un promotor inducible, con el fin de guiar la expresión del gen o del polinucleótido de manera específica. Si se lo desea, con un procedimiento de este tipo también puede sobreexpresarse el gen en cuestión.

Para producir los polipéptidos de acuerdo con la invención, puede recurrirse al uso 'de diversos sistemas de expresión. Los vectores que pueden usarse abarcan, sin limitaciones, los vectores que derivan de cromosomas, de episomas o de virus, que incluyen los vectores que derivan de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levaduras, de elementos insertados, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus o de combinaciones de éstos, donde las combinacitínes pueden comprender elementos genéticos derivados de plásmidos y de bacteriófagos, como es el caso de los cósmidos o los fagémidos. Las construcciones que se empleen en los sistemas de expresión podrán comprender regiones que sean apropiadas para iniciar y controlar la expresión. En este| contexto, generalmente podrá usarse un sistema o un vector que resulte apropiado para mantener ?· propagar un polinucleótido y/o para expresar un polipéptido en un huésped. La secuencia de ADN apropiada podrá insertarse en el sistema de expresión a través de una variedad de procedimientos convencionales bien conocidos, tales como los que se describen en Sambrook et al., supra.

En función de lo anterior, la presente invención también está relacionada con un polipéptido aislado que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa y que consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del siguiente grupo: (a) la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2; (b) una secuencia de aminoácidos que corresponde a una variante alélica de la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de la molécula de ácido nucleico que se detalla en SEQ ID N° 1 ; (c) una secuencia de aminoácidos que corresponde a un ortólogo de la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de la molécula de ácido nucleico que se detalla en SEQ ID N° 1 ; y (d) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2, donde dicho fragmento comprende al menos 10 aminoácidos contiguos y presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa.

El término "condiciones estrictas" hace referencia a condiciones bajo las cuales una sonda puede hibridar con la subsecuencia que hace las veces de blanco, pero no con otras secuencias. Las condiciones estrictas dependen de las propias secuencias y pueden ser diferentes bajo distintas circunstancias. Las secuencias más largas pueden hibridar de manera específica a temperaturas más altas. Ei general, las condiciones estrictas abarcan el uso de temperaturas aproximadamente 15°C más bajas que el punto de fusión térmica (Tm) de la secuencia que se desea analizar, con una fuerza iónica específica y a un pH determinado. El Tm es la temperatura (en presencia de una fuerza iónica, un pH y una c ncentración de los ácidos nucleicos definidos) a la cual 50% de las sondas complementarias de la secuencia que se usa como blanco pueden hibridar con ella en el equilibrio. Por ejemplo, las condiciones de hibridación estrictas pueden comprender el uso de 50% de formamida, SSC 5x y 1 % de SDS y una incubación a 42?C, o , ien el uso de SSC 5x y 1 % de SDS, una incubación a 65°C y un lavado con SSC 0,2x y 0, 1 % de SDS a 650C: : La invención también se relaciona con una célula huésped que comprende un vector que es como se lo definió con anterioridad, donde en particular, dicha célula huésped puede seleccionarse del grupo que consiste en una célula fúngica, que puede ser una célula de levadura, una célula bacteriana, una célula animal, que puede ser una célula de un insecto, y una célula vegetal. En particular, es preferible que la célula huésped sea una célula de Escherichia coli.

El término "célula huésped", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a una célula que ha sido transformada o transfectada con una secuencia polinucleotídica exógena o a una célula que puede ser transformada o transfectada según se ha indicado.

Es posible emplear una variedad de combinaciones de huéspedes y vectores de expresión para expresar las secuencias de los genes de las alfa-1 ,2-fucoslltransferasas de acuerdo con la invención, y con estas combinaciones de huéspedes y vectores de expresión, es posible producir y luego purificar las secuencias codificantes de interés. En este contexto, los huéspedes podrán ser células que, cuando sean transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes apropiadas, produzcan los polipéptidos de las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas de acuerdo con la invención in situ.

A modo de ejemplo, en WO/0026383 y EP 1 243 647, que se incorporan explícitamente en la presente a modo de referencia, donde se describe una alfa-1 , 2-fucosiltransferasa de Helicobacter pylori, pueden hallarse numerosos sistemas y huéspedes apropiados para llevar a cabo la expresión.

En otro aspecto de la invención, el ácido nucleico que codifica el polipéptido que presenta actividad de alfa-1 , 2-fucosiltransferasa ha sido adaptado al uso de codones de la célula donde se lo introduce.

La invención también está relacionada con el uso de un polinucleótido, un vector o un polipéptido como los que se describieron con anterioridad en la producción de oligosacáridos, (gluco)prqté(nas y/o (gluco)l(pidos fucosilados.

En este contexto, de acuerdo con un aspecto del uso, la producción de dichos oligosacáridos, dichas (gluco)proteínas y/o dichos (gluco)lípidos fucosilados se basa en la expresión heteróloga u homóloga de un polinucleótido que codifica una alfa-1 , 2-fucosiltransferasa.

De acuerdo con otro aspecto del uso, el oligosacárido fucosilado es un oligosacárido conocido que proviene de la leche humana, como es el caso de la 2'-fucosil-lactosa.

La invención se relaciona con un método para producir oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lípidos fucosilados que comprende los siguientes pasos: (a) proveer un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa de acuerdo con la invención; y (b) poner en contacto el polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa del paso (a) con una mezcla que comprenda un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)protefna o un (gluco)lípido, bajo condiciones apropiadas para que el polipéptido catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido fucosilado.

El método para producir oligosacáridos fucosilados de acuerdo con la invención puede ponerse en práctica en un sistema libre de células o en un sistema que contiene células. Los sustratos pueden reaccionar con los polipéptidos de las alfa-1 ,2-fucosiltransferasas durante un período de tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para posibilitar la formación del producto deseado como resultado de la reacción enzimática. Ha de reconocerse la posibilidad de que las condiciones apropiadas varíen en función de la cantidad o la pureza del sustrato o del carácter libre de células o basado en células del sistema que se emplee, donde estas variables podrán ser ajustadas fácilmente por aquellos versados en la técnica.

En el contexto de los sistemas libres de células, el polipéptido de acuerdo con la invención, ¡os uno o más sustratos aceptores, los uno o más sustratos donantes, y de haberlos, los otros ingredientes de la mezcla de reacción, que pueden ser otras glucosiltransferasas u otras enzimas accesorias, se combinan en un medio de reacción acuoso. Las enzimas pueden usarse en formas libres o en soluciones, p bien pueden inmovilizarse sobre soportes, que pueden estar compuestos por polímeros sobre los cuales pueden aplicarse los sustratos, y por ejemplo, pueden estar envasados en columnas.

Las células huésped que comprenden los sistemas con los que son útiles para sintetizar los oligosacáridos fucosilados pueden haber sido modificadas por medios recombinantes En este contexto, la invención también se relaciona con un método para producir oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lípidos fucosilados que comprende los siguientes pasos: (a) cultivar una célula huésped como las que se describieron con anterioridad bajo; condiciones nutritivas apropiadas para que se produzca un oligosacárido, una (gluco)proteína y/o un (gluco)lípido fucosilado y para que se exprese un polipéptido que presente actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa; (b) de manera simultánea con el paso (a), o después de él, proveer un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptar que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)prote(na o un (gluco)lípido, de modo tal que el polipéptido de la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptar, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido fucosilado; y (c) aislar el oligosacárido, la (gluco)proteina y/o el (gluco)lípido fucosilado a partir de la célula huésped o a partir del medio de cultivo.

En este método de acuerdo con la invención, es posible que el sustrato donante sea la GDP-fucosa. Más aun, resulta particularmente preferible que el sustrato donante sea la GDP-fucosa.

En un aspecto de la invención, el sustrato aceptar se selecciona entre la N-acetilglucosamina, la N-acetil-lactosamina, la galactosa, la fucosa, el ácido siálico, la glucosa, la lactosa o cualquier combinación de éstos. En particular, se prefiere el uso de la lactosa como sustrato aceptar Tal como se lo emplea en la presente, el término "sustrato" hace referencia a cualquier material o cualquier combinación de materiales que pueden ser modificados por los polipéptidos de acuerdo con la invención, de manera tal de obtener oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)l(pidos fucosilados.

Con este fin, puede permitirse que los sustratos reaccionen con el polipéptido de la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa durante un período de tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para que se forme el producto deseado como resultado de la reacción enzimática. Estas condiciones pueden variar en función de la cantidad o la pureza del sustrato o de la enzima o del carácter libre de células o basado en células del sistema que se emplee. Aquellos versados en la técnica han de poder ajustar fácilmente estas variables.

En un aspecto del método de acuerdo con la invención, el sustrato donante en el 'paso (b) es producido por la propia célula huésped. Para ello, por ejemplo, en la célula huésped puede expresarse de manera simultánea una enzima apropiada para convertir la fucosa en GDP-fucosa, que por ejemplo, puede ser una enzima bifuncional, capaz de operar como una quinasa de fucosa y una guaniiiitransferasa de fucosa-1 -fosfata, como es el caso de la enzima Fkp de Bacteroides fragilis. Como alternativa, puede recurrirse a la expresión de una combinación de una quinasa de fucosa y una guaniiiitransferasa de fucosa-1 -fosfato, las cuales pueden provenir de diversas especies, tales como Homo sapiens, Sus scrofa o Rattus norvegicus.

De acuerdo con aun otra posibilidad, en el paso (b), el sustrato donante puede agregarse al medio de cultivo, puede introducirse en las células huésped o puede producirse como resultado del metabolismo de las propias células.

En aun otra forma de realización, la invención se relaciona con un método que comprende los siguientes pasos: (a) cultivar células huésped que han sido transformadas o transfectadas de modo tal que comprendan una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre i) SEQ ID N° 1 del listado de secuencias adjunto, ii) una secuencia de ácido nucleico que sea complementaria de SEQ ID N° 1 , y iii) una secuencia de ácido nucleico que pueda hibridar bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que se definen en (i) y en (ii) o con sus cadenas complementarias, bajo condiciones nutritivas apropiadas para que la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con (i), (¡i) o (iii) se exprese en forma de un péptido que presente actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa; (b) de manera simultánea con el paso (a), o después de él, proveer un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)proteina o un (gluco)lípido, de manera tal que el polipéptido de la alfa-1, 2-fucosiltransferasa que se exprese a partir de la célula huésped que se ha mencionado catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido fucosilado; y (c) aislar el oligosacárido, la (gluco)proteína y/o el (gluco)lípido fucosilado a partir de la célula huésped o a partir del medio de cultivo.

En los métodos de acuerdo con la invención, el péptido que se expresa en la célula; huésped presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa, por lo que puede transferir un residuo dé fucosa :desde un donante, que puede ser la fucosa con difosfato de guanosina (GDP-fucosa), hasta un aceptor, que puede ser un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)llpido. De este modo, el sustrato aceptor fucosilado puede usarse como un aditivo para alimentos, como un suplemento para alimentos para bebés p como un compuesto con actividad terapéutica o farmacéutica. Mediante el uso de los métodos novedosos que se describen, pueden obtenerse productos fucosilados de una manera sencilla y eficaz, sin que sea necesario recurrir a procesos de síntesis complejos, laboriosos o costosos.

El término "aislamiento", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a la cosecha, la recolección o la separación del producto que se genera con una alfa-1 , 2-fucosiltransferasa de acuerdo con la invención a partir del sistema que se usa para expresar los genes.

Sobre la base de lo anterior, la invención también está relacionada con oligosacáridos, (gluco)proteínas y/o (gluco)lípidos fucosilados que pueden obtenerse con los métodos de acuerdo con la invención, así como con el uso de un polinucleótido, un vector o un polipéptido como los que se describieron con anterioridad en la producción de oligosacáridos, (gluco)proteínas y/o (gluco)lípidos fucosilados.

En aun otra forma de realización, la producción de los oligosacáridos, las (gluco)proteínas y/o los (gluco)lípidos fucosilados se basa en la (sobre)expresión heteróloga u homóloga de polinucleótidos que codifican alfa-1 ,2-fucosiltransferasas.

Todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen el significado que suelen darles aquellos versados en la técnica a los que concierne la presente invención, a menos que se indique lo contrario. La nomenclatura que se usa en la presente, los procedimientos de laboratorio que pueden usarse para poner en práctica el cultivo de las células, los protocolos de genética molecular, los procesos de química orgánica, los métodos relacionados con la química de los ácidos nucleicos y los procedimientos para llevar a cabo las hibridaciones que se describieron con anterioridad y que puedan describirse más adelante generalmente están relacionados con términos o procedimientos de uso habitual, por lo que son conocidos para aquellos versados en la técnica. Con el fin de sintetizar los ácidos nucleicos y los péptidos, pueden emplearse procedimientos convencionales. Las reacciones enzimáticas y los procedimientos de purificación generalmente se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

Los fragmentos de las secuencias polinucleotídicas que se describen en la presente también se encuentran dentro del alcance de la invención. , Podrán inferirse otras ventajas propias de la presente invención a partir de las formas dé realización y los dibujos adjuntos. : Evidentemente, las características que se mencionaron con anterioridad y las características que se enumeren más adelante podrán estar presentes no solamente en las combinaciones qué se éspecifiquen, sino también en otras combinaciones o por sí solas, y todas estas posibilidades se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Diversas formas de realización de la invención se describen con mayor detalle en la descripción más adelante y se ilustran en las figuras, cuya descripción se provee a continuación.

En la figura A se ilustra la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa WbgL de E. coli 0126, así como la secuencia de aminoácidos codificada.

En la figura 1 B se provee un mapa del vector pET22bHIS6PropwbgL, que comprende un gen wbgL de Escherichia coli 0126 que codifica la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa novedosa WbgL, que fue sometido a una optimización a nivel de los codones y fue clonado en pET22b(+) (de Novagen, Darmstadt), Alemania, por medio de una restricción con BamHI y Xhol. Se le agregaron 18 pares de bases que codificaban una marca de His en el extremo N y 621 pares de bases del propéptido de la lipasa de Staphylococcus hyicus por medio de una restricción con Ndel y BamHI (véase la descripción más adelante).

En la figura 1 C se provee un mapa del vector pACIC-wbgL, que codifica un gen wbgL de Escherichia coli 0126 que codifica la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa novedosa WbgL, que fue sometido a una optimización a nivel de los codones y fue clonado en pACICDuet-1 (de Novagen), por medio de una restricción con Ncol y BamHI.

En la figura 2 se provee un cromatograma que corresponde a la purificación de WbgL en una columna de sefarosa IMAC con Ni2+"NTA (el azul representa la absorción a 280 nm, el rojo representa la conductividad, las fracciones que contenían la enzima WbgL con la marca de His6 y el propéptido que se obtuvieron a partir de la columna se denominan lote IMAC).

En la figura 3 se ilustra un análisis de SDS-PAGE de la expresión de la enzima WbgL con la marca de HisB y el propéptido en el extracto en bruto y las fracciones insolubles de E. coli JM109(DE3) pET22bHIS6PropwbgL y en las fracciones que se obtuvieron al lavar la enzima WbgL con la marca, de Hiss y el propéptido y al purificarla.

En la figura 4 se ilustra la detección de la enzima WbgL con la marca de Hise y el propéptido por medio de una transferencia inmune, para lo cual se usó un anticuerpo monoclonal dirigido contra l marca de His6 conjugado con una peroxidasa de rábano picante (HRP, de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), después de incubar con el sustrato DAB (de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).

En la figura 5 se representa un análisis fotométrico continuo que se llevó a cabo con la enzima WbgL con la marca de His6 y el propéptido, GDP- -L-fucosa 0,4 mM y lactosa 5 mM. En particular, la actividad se detectó sobre la base del incremento en la absorción a 340 nm, que se debió a la oxidación del ADH.

En la figura 6 se ilustra la detección de la 2'-fucosil-lactosa que se produjo merced a la' acción de la enzima WbgL. En particular, la detección se basó en un procedimiento de HPAEC-PAD. Al comienzo de la reacción, no hubo 2'-fucosil-lactosa presente (A). Después de 1 hora en presencia de la enzima WbgL, GDP-beta-L-fucosa 2 mM y lactosa 5 mM, se produjo 2'-fucosil-lactosa (B).

En la figura 7 se ilustra el análisis de una mezcla de reacción en la que se empleó GDP-fucosa 2 mM, lactosa 5mM y la enzima WbgL. En particular, el análisis se basó en una electroforesis capilar. Al comienzo de la reacción, solamente se detectó GDP- -L-fucosa (A). Después de 16 horas en presencia de la enzima WbgL, solamente se detectó guanosina, que fue el producto de la degradación del GDP (B).

En la figura 8 se ilustra la actividad relativa de la enzima WbgL en presencia de diversos pH (desde 6,8 hasta 8,4), en un amortiguador de Tris-HCI 50 mM.

En la figura 9 se ilustra el incremento en la concentración de la 2'-fucosil-lactosa en presencia de una enzima WbgL, GDP-beta-L-fucosa 2 mM y lactosa 5 mM, en distintos puntos de tiempo durante una reacción que se prolongó durante 16 horas.

En la figura 10A se provee un cromatograma que se obtuvo por medio de una HPLC que se llevó a cabo en una columna Fenomenex Rezex RCM, con Ca2+ y agua como eluyente (la elución se realizó a una velocidad de 0,6 ml/minuto, a 80°C durante 30 minutos). La detección se efectuó con un dispositivo para analizar el índice de refracción (de Shimadzu, Alemania). En la figura 10B se provee un cromatograma que se obtuvo por medio de una HPLC que se llevó a cabo en una columna Reprosil Carbohydrate, de 5 µ?t? y 250 mm x 4,6 mm, con una mezcla 68:32 de acetonitrilo y agua como eluyente (la elución se realizó a una velocidad de 1 ,4 ml/minuto, a 35°C durante 20 minutos). La detección se efectuó con un dispositivo para analizar el índice de refracción (de Shimadzu, Alemania).

En la figura 1 1 se ilustra el espectro de RMN de la 2'-fucosil-lactosa que se produjo con la enzima WbgL.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN EJEMPLO Clonación del gen Con el objeto de purificar la enzima alfa-1 ,2-fucosiltransferasa potencial WbgL en el citoplasma, se modificó un vector de expresión pET22b(+) (de Novagen, Darmstadt, Alemania). Para ello, se : separó la secuencia directriz pe/S, que da como resultado la expresión en el exterior del periplasma de E. co//, mediante el uso de las enzimas de restricción Ndel y BamHI. La secuencia de nucleótidos del propéptido de la lipasa de S. hyicus (SEQ ID N° 3; Sauerzapfe, B., Namdjou, D. J., et al. (2008), "Characterization of recombinant fusión constructs of human beta-1 ,4-galactosyltransferase 1 and the lipase pre-propeptide from Staphylococcus hyicus", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 50 (2-4): 128-140) se amplificó a partir de un plásmido pLGalTA38, mediante el uso de los cebadores 5'-CATATGCACCACCACCACCACCACAATGATTCGACAACACAAACAACGAC-3' (SEQ ID N° 5) y 3'-GGATCCGTATGGTTTTTTGTCGCTCGCTTG-5' (SEQ ID N° 6), y se fusionó al vector pET22b modificado, con lo que se obtuvo el vector pET22bHIS6Prop. El vector obtenido se digirió con BamHI y Xhol. El gen que codificó la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa potencial WbgL de E. coli 0126 fue sintetizado en Geneart (Regensburg, Alemania), y comprendió sendos sitios para las enzimas de restricción BamHI y Xhol. Cuando se lo colocó en el vector pET22bHIS6Prop, se obtuvo el vector de expresión pETHIS6PropwbgL (véase la figura 1A), a partir del cual fue posible expresar una enzima WbgL que comprendió una marca de His6 y un propéptido (de 513 aminoácidos) en el citoplasma de E. coli, una vez efectuada la inducción isopropil tiogalactóxido (IPTG). También fue posible recurrir a la clonación del gen wbgL, para lo cual primero se llevó a cabo una digestión con Ncol y BamHI, luego se puso en práctica una amplificación con los cebadores 5'-GATCACCATGGGCAGCATTATTCGTCTGCAGGGTGGTC-3' (SEQ ID N° 7) y 5'-GATCAGGATCCTTAGCAGCTGCTATGTTTATCAACGTTGATCC-3' (SEQ ID N° 8) y finalmente se introdujo el gen en el vector pACICDuet-1 (de Novagen, Darmstadt, Alemania), con lo que se obtuvo el vector pACIC-wbgL (véase la figura 1 B). Para llevar a cabo la propagación de los plásmidos, se usaron células de E. coli Nova Blue (de Novagen, Darmstadt, Alemania) o de E. coli TOP10 (de Invitrogen, Darmstadt, Alemania), y para expresar la enzima WbgL que comprendió la marca de His6 y el propéptido, se empleó E. coli JM109(DE3) (de Promega®, Madison, EEUU). ;, , j Cultivo y expresión de las fucosiltransferasas Las transformantes se cultivaron en frascos Erlenmeyer de 100 mi que contenían 20 mi de un medio LB que comprendía 100 pg/ml de ampicilina, después de lo cual se incubó durante la noche, a una temperatura de 37°C y con agitación a 130 rpm. Para producir las proteínas, las células se cultivaron en frascos Erlenmeyer de 5 I que contenían 1000 mi de ún medio TB, a una temperatura de 37°C y con agitación a 80 rpm. La inducción del promotor lacZ se basó en la adición de IPTG en los cultivos, hasta una concentración final de 0, 1 mM (la OD60o fue de 0,6-0,8). Se continuó con la incubación a 25°C durante 20 horas. Finalmente, las células se cosecharon por medio de una centrifugación.

Purificación de la enzima Se sometió una suspensión al 40% (p/p) de células de E. coli, en un amortiguador de Tris-HCI 50 mM con un pH de 7,6, a cuatro procedimientos de sonicación, cada uno de los cuales se prolongó durante 15 segundos. Después de llevar a cabo una centrifugación (a 15000 rpm durante 30 minutos), se conservaron los precipitados para analizar la producción de cuerpos de inclusión por medio de una SDS-PAGE. El extracto en bruto (15 mi) se cargó en una columna IMAC (de 0,8 cm2 x 10 cm, a una velocidad de 1 ,5 ml/minuto), mediante el uso de sefarosa con Ni2+"NTA (de Qiagen®, Hilden, Alemania), que había sido equilibrada con anterioridad con 100 mi de un amortiguador de Tris-HCI 50 mM con un pH de 7,6 (el amortiguador A). Después de efectuar un lavado con el amortiguador B, que comprendió NaCI 0,3 M e imidazol 20 mM, se eluyeron las proteínas con imidazol 300 mM en el amortiguador C (que comprendió Tris-HCI 50 mM, NaCI 0,3 M e imidazol 300 mM y que tuvo un pH de 7,6). Se analizó la concentración de las proteínas y la actividad de la enzima en todas las fracciones. Se combinaron todas las fracciones que presentaron una enzima WbgL soluble activa después de realizar la elución con el amortiguador C, y la solución resultante se denominó lote IMAC (véase la figura 2).

Detección basada en una SDS-PAGE y una transferencia Western La expresión de la enzima WbgL que comprendió la marca de His6 y el propéptido se monitoreó por medio de una SDS-PAGE y una transferencia Western. El análisis de SDS-PAGE se llevó a cabo con geles de acrilamida al 10% que se elaboraron de acuerdo con las instrucciones de Invitrogen® (Invitrogen®, Paisley, Reino Unido). Se cargaron muestras de las proteínas (de 40 µg) en cada ranura de los geles. Se usó una escala de proteínas que habían sido coloreadas con antelación PageRuler™ (de Fermentas®, Vilnius, Lituania) para determinar la masa molecular. Los geles que comprendieron las proteínas se colorearon con azul de Coomassie (véase la figura 3).

Se llevó a cabo una transferencia inmune con un anticuerpo específico dirigido a la marca de His6, con el propósito de detectar la enzima WbgL que comprendió la marca de Hise y el propéptido. En este contexto, se tomaron muestras a partir de restos, extractos en bruto y lotes IMAC de células de E. coli JM109 (DE3), se separó la enzima WbgL que comprendió la marca de His6 y el propéptido por medio de una SDS-PAGE y se la transfirió a membranas de PVDF de acuerdo con el protocolo de transferencia Western NuPAGE (de BioRad, München, Alemania). Las membranas se bloquearon con BSA al 3% en un amortiguador TBS (que comprendió Tris-HCI 10 mM y NaCI 150 mM y que tuvo un pH de 7,2). Se empleó un anticuerpo monoclonal dirigido a la marca de His6 y conjugado con una peroxidasa de rábano picante (HRP, de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) para detectar la unión específica. Después de efectuar un lavado con un amortiguador TBS que comprendió 0,1 % de Tween 20, se incubaron las transferencias con el sustrato DAB (de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y se detuvo la reacción con la HRP retirando la solución y agregando agua destilada (véase la figura 4).

Análisis de la actividad La actividad de la enzima WbgL que comprendió la marca de His6 y el propéptido en el extracto en bruto y en los lotes IMAC se determinó con un análisis fotométrico y por medio de un análisis de HPAEC-PAD con 2'-fucosil-lactosa.

En el análisis fotométrico, se usó un sistema basado en una piruvato quinasa y una lactato deshidrogenase, que es apropiado para detectar el GDP que se libera (Barratt, D. H., L. Barber, et al. (2001 ), "Múltiple, distinct isoforms of sucrose synthase in pea", Plant Physiology, 127(2): 655-664). La mezcla de reacción que se colocó en la placa de microtitulación que se empleó en el análisis comprendió Tris-HCI 50 mM, cuyo pH fue de 7,6, GDP-beta-L-fucosa 2 mM, lactosa 5 mM, fosfoenolpiruvato 1 mM, DTT 1 mM, NADH 0,25 mM, MnCI2 2 mM, 5 U de una piruvato quinasa y 5 U de una lactato deshidrogenase, en un volumen total de 250 µ?. La reacción se inició agregando 100 µ? de la solución que comprendió la enzima, a lo que siguió una lectura a 340 nm, a una temperatura de 30°C. Los experimentos que sirvieron como control para la actividad colateral se realizaron sin el sustrato aceptar, es decir, la lactosa (véase la figura 5).

La actividad de la enzima también se determinó por medio de un análisis de HPAEC-PAD con 2'-fucosil-lactosa. La solución que se usó en el análisis comprendió GDP- -L-fucosa 2 mM, lactosa 5 'mM, Tris-HCI 50 mM con un pH de 7,6, MnCI2 2 mM, DTT 1 mM y 1 U de una fosfatasa alcalina, en un volumen total de 175 µ?. Después de agregar 175 µ? de un extracto en bruto y una solución que comprendió la enzima purificada, se llevó a cabo una incubación a 30°C. La reacción se detuvo por medio de un calentamiento a una temperatura de 95°C durante 5 minutos. En particular, este calentamiento se aplicó en diversos puntos de tiempo donde se observó una variación lineal en la velocidad de conversión. Las muestras centrifugadas se analizaron mediante el uso de un dispositivo de HPAEC-PAD Dionex (de Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, EEUU), con una columna CarboPac PA1 , bajo el control del software Chromeleon™ 6.40. La elución se llevó a cabo con NaOH 50 mM, a 30°C, con una velocidad de flujo de 1 ml/minuto y un volumen de inyección de 50 µ?. la concentración del trisacárido que se generó, es decir, la 2'-fucosil-lactosa, se determinó sobre la base de una curva de calibración de referencia, que se construyó con 2'-fucosil-lactosa disponible comercialmente y se usó para calcular la actividad de la enzima (véase la figura 6).

Tanto en el análisis de HPAEC-PAD como en el análisis fotométrico, se definió 1 U de la enzima WbgL que comprendió la marca de His6 y el propéptido como la cantidad de la enzima que dio como resultado la generación de 1 pmol del producto (el GDP o la 2'-fucosil-lactosa) por minuto bajo condiciones convencionales.

Se analizó la GDP-beta-L-fucosa y su consumo por medio de una electroforesis capilar en un dispositivo P/ACE MDQ (de Beckman Coulter, Krefeld, Alemania), que estuvo equipado con un detector UV. Las muestras que se usaron para analizar el sustrato donante activado, la GDP-beta-L-fucosa, se sometieron a un calentamiento a 95°C durante 5 minutos y se centrifugaron a 15000 rpm durante 10 minutos (en una centrífuga Rotina 35R, de Hettich, Tuttlingen, Alemania). La detección se realizó con un capilar de sílice fundido sin tratar (I.D. 75 mm, con una longitud total de 57 cm y una distancia con relación al detector de 50 cm), con un amortiguador que comprendió Na2B407 x 10 H20 50 mM y ácido bórico 64 mM, cuyo pH fue de 8,9. Para poner en práctica la migración, se aplicó un voltaje de 25 kV (23 mA) a 25,8°C. La detección se realizó en presencia de luz UV, a 254 nm. Las muestras se inyectaron a presión (0,5 psi durante 5,0 segundos en la dirección normal, véase la figura 7). La identidad de la GDP-beta-L-fucosa y de la guanosina que se generó se confirmó con sustratos disponibles comercialmente. pH óptimo y dependencia de los iones metálicos Con el propósito de analizar el valor del pH óptimo para la actividad de Ja enzima WbgL recombinante que comprendió la marca de His6 y el propéptido, se pusieron en práctica análisis en presencia de diversos pH, para lo cual se empleó un amortiguador de Tris-HCI 50 mM cuyo pH varió entre 6,8 y 8,4. Se determinó que. el valor del pH óptimo fue de 7,6 (véase la figura 8). Mediante la adición del ión metálico Mn2+ a las reacciones, fue posible determinar si había una relación de dependencia entre las reacciones y el ión metálico. Todas las muestras fueron sometidas a un análisis de HAPAEC-PAD como el que se describió con anterioridad, con el cual se comprobó que la enzima no dependió de los iones de Mn2+.

Análisis de la cinética Las constantes cinéticas de la enzima WbgL recombinante que comprendió la marca de His6 y el propéptido se determinaron con lactosa como sustrato aceptor en diversas concentraciones y con :GDP-beta-L-fucosa como sustrato donante, con un análisis fotométrico como el que se describió con anterioridad. Por un lado, se modificó la concentración de la GDP-beta-L-fucosa entre 0,02 mM y 4 mM y se mantuvo una concentración constante de lactosa de 10 mM. Por otro lado, se modificó la concentración de la lactosa entre 0,05 y 40 mM y se mantuvo una concentración constante de GDP-beta-L-fucosa de 2 mM. Todos los datos fueron sometidos a un análisis de regresión no lineal, mediante el uso de una ecuación de Michaelis-Menten, con el software Sigma Plot 10 (de SPSS Science Software GmbH, Erkrath, Alemania).

Tabla 1. Constantes cinéticas de la enzima WbgL recombinante que comprendió la marca de His6 y el propéptido Análisis de un espectro de sustratos aceptores Se sometió un espectro de sustratos aceptores para la enzima WbgL recombinante que comprendió la marca de His6 y el propéptido a un análisis de HPAEC-PAD, según se describió con anterioridad, con el propósito de determinar la actividad de la enzima. En lugar de lactosa 5 mM, se analizó una variedad de sustratos aceptores para determinar la actividad relativa de la enzima, en comparación con la actividad que había presentado sobre la lactosa.

Tabla 2. Espectro de sustratos aceptores para la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa WbgL que comprendió la marca de His6 y el propéptido Producción de los compuestos fucosilados Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) ?/acZ pDEST14-fkp pCOLA-lacY-fucP con un vector pACICDuet-1 que comprendió un gen que codificaba una fucosiltransferasa. El cultivo de las colonias se llevó a cabo en placas que comprendieron un medio 2YT con los antibióticos apropiados. En particular, se cultivaron 5 mi de cada cepa durante la noche (en un medio 2YT con antibióticos). Se tomaron 15 mi de cada uno de los cultivos, se los combinó con un medio mineral hasta alcanzar una concentración de 1 % y se los inoculó en las células, que se cultivaron con glicerol como fuente de carbono. Cuando se alcanzó una OD600 de 0,2, se agregó IPTG 0, 1 mM, lactosa 40 mM y fucosa 30 mM y se continuó con el cultivo a 30°C, con agitación a 120 rpm. La producción de la 2'-fucosil-lactosa se monitoreó con un análisis de HPLC. Se comparó la cantidad de 2'-fucosil-lactosa (2'-FL) que se produjo con la enzima FucT2 de Helicobacter pylorí con la que se obtuvo con la enzima WbgL de Escheric ia coli 0126. Los resultados se proveen en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Comparación de la cantidad de 2'-fucosil-lactosa que se obtuvo cuando se usó la alfa-1,2-fucosiltransferasa FucT2 de Helicobacter pylorí y la enzima WbgL de Escherichia CO// 0126 En la tabla 3 puede observarse que la cantidad que se obtuvo del producto fucosilado. la 2'-fucosil-lactosa, fue significativamente mayor cuando se usó la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa de , acuerdo con la invención, es decir, la enzima WbgL de Escherichia coli 0126, que cuando se usó ia alfa-1 ,2-fucosiltransferasa FucT2 de Helicobacter pylorí, que es la enzima que se emplea en la actualidad. ' Purificación del producto de la fucosilación La 2'-fucosil-lactosa que se produjo con el procedimiento anterior se purificó en vanos! pasos. El primer paso fue una purificación basada en la adsorción en carbón activado. En este contexto, se aplicó el sobrenadante del cultivo que se obtuvo en la etapa de producción sobre un lecho de carbón activado, se recolectó la fracción que atravesó el lecho y se la analizó: fue imposible detectar 2'-fucosil-lactosa. Con el propósito de eliminar los compuestos que pudieran haberse unido al medio de manera no específica, como es el caso de las sales o los aminoácidos, el lecho se lavó con agua destilada (tampoco se detectó 2'-FL en la fracción que atravesó el lecho). Después, se eluyó la 2'-FL y la lactosa y la fucosa remanentes con etanol al 96%, se evaporó el etanol en un evaporador rotativo y se filtró el residuo en un módulo de flujo transversal con un umbral de separación de 10 kDa (de Microdyn Nadir, Alemania). Las sales remanentes se eliminaron por medio de una electrodiálisis. Luego se eliminaron las endotoxinas por medio de una filtración en un módulo de flujo transversal (de Pall, Alemania). La 2'-FL se separó de la lactosa y de la fucosa en una escala de un gramo, mediante el uso de un material apropiado para llevar a cabo una cromatografía de permeación en gel, Biogel P-2 (de BioRad, Alemania), en una columna de vidrio fritado de 520 mm x 428 mm. La purificación de la 2'-FL se monitoreó por medio de una cromatografía en una capa delgada. Las fracciones que solamente comprendían la 2'-fucosil-lactosa fueron combinadas y fueron sometidas a un secado por congelación.

Confirmación de la identidad del producto La 2'-fucosil-lactosa purificada que se produjo mediante el uso de la fucosiltransferasa que se describe en esta invención se sometió a análisis de RMN 1 H (véase la figura 11 ). El espectro que se obtuvo fue consistente con el que se había obtenido con la 2'-FL de referencia (de Dextra, Reading, Reino Unido). Adicionalmente, se pusieron en práctica diversos métodos basados en sendas HPLC para verificar la identidad de la 2'-FL obtenida. En primer lugar, se llevó a cabo un procedimiento de HPAEC-PAD como se describió con anterioridad. Otros métodos incluyeron una separación en una columna Fenomenex Rezex RCM, con Ca2+ y agua como eluyente (la elución se realizó a una velocidad de 0,6 ml/minuto, a 80°C durante 30 minutos), donde la detección se efectuó con un dispositivo para analizar el índice de refracción (de Shimadzu, Alemania; véase la figura 10A), y una HPLC que se llevó a cabo en una columna Reprosil Carbohydrate, de 5 µ?? y 250 mm x 4,6 mm, con una mezcla 68:32 de acetonitrilo y agua como eluyente (la elución se realizó a una velocidad de 1 ,4 ml/minuto, a 35°C durante 20 minutos), donde la detección se efectuó con un dispositivo para analizar el índice de refracción (de Shimadzu, Alemania; véase la figura 10B).

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 , 2-fucosiltransferasa y que comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en (a) SEQ ID N° 1 del listado de secuencias adjunto; (b) una secuencia de ácido nucleico que es complementaria de SEQ ID N° 1 ; y (c) una secuencia de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos que se definen en a) y en b) o con sus cadenas complementarias.

2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 , que consiste en SEQ ID N° 1 y que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa.

3. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 6 2, que codifica un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa, cuya secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a secuencias de control que pueden ser reconocidas por las células huésped que son transformadas con el vector.

4. Un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 , 2-fucosiltransferasa, que consiste en una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo que consiste en (a) la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2; (b) una secuencia de aminoácidos que corresponde a una vanante alélica de la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2, donde dicha variante alélica está codificada por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de la molécula de ácido nucleico que se detalla en SEQ ID N° 1 ; (c) una secuencia de aminoácidos que corresponde a un ortólogo de la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2, donde dicho ortólogo está codificado por una molécula de ácido nucleico que puede hibridar bajo condiciones estrictas con la cadena opuesta de la molécula de ácido nucleico que se detalla en SEQ ID N° 1 ; y ,¦ ; ; (d) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que se detalla en SEQ ID N° 2, donde dicho fragmento comprende al menos 10 aminoácidos contiguos.

5. Una célula huésped que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 3 o una secuencia que consiste en un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, donde la secuencia es exógena con relación a la célula huésped y se encuentra integrada en su genoma.

6. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 5, que se selecciona del grupo que consiste en una célula fúngica, que puede ser una célula de levadura, una célula bacteriana, una célula animal, que puede ser una célula de un insecto, y una célula vegetal.

7. Una célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 5 6 6, que es una célula de Escherichia coli. 8. Una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido que presenta actividad de alfa-1,2-fucosiltransferasa ha sido adaptado al uso de codones de dicha célula. 9. El uso de un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones i ó 2, de un vector de acuerdo con la reivindicación 3 o de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 en la producción de un oligosacárido, una (gluco)proteína y/o un (gluco)lípido fucosilado. 10. Un uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la producción del oligosacárido, la (gluco)proteína y/o el (gluco)lípido fucosilado se basa en la expresión heteróloga u homóloga del polinucleótido que codifica la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa. 11. Un uso de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, donde el oligosacárido fucosilado es un oligosacárido conocido proveniente de la leche humana. 12. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1 1 , donde el oligosacárido fucosilado es la 2'-fucosil-lactosa. 13. Un método para producir oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)IIpidos fucpsilados que comprende los siguientes pasos: (a) proveer un polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa de acuerdo con la reivindicación 4; y (b) poner en contacto el polipéptido que presenta actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa del paso (a) con una mezcla que comprenda un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)proteína o un.(g|uco)lípido, bajo condiciones apropiadas para que el polipéptido catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)protelna o un (gluco)llpido fucosilado. 14. Un método para producir oligosacáridos, (gluco)proteínas o (gluco)lipidos fucosilados que comprende los siguientes pasos: (a) cultivar una célula huésped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 bajo condiciones nutritivas apropiadas para que se produzca un oligosacárido, una (gluco)protelna y/o un (gluco)llpido fucosilado y para que se exprese un polipéptido que presente actividad de alfa-1 ,2-fucosiltransferasa; (b) . de manera simultánea con el paso (a), o después de él, proveer un sustrato donante que comprenda un residuo de fucosa y un sustrato aceptor que comprenda un monosacárido, un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido, de modo tal que el polipéptido de la alfa-1 ,2-fucosiltransferasa catalice la transferencia de un residuo de fucosa desde el sustrato donante hasta el sustrato aceptor, con lo que podrá producirse un oligosacárido, una (gluco)proteína o un (gluco)lípido fucosilado; y (c) aislar el oligosacárido, la (gluco)protefna y/o el (gluco)lípido fucosilado a partir de la célula huésped o a partir del medio de cultivo. 15. Un método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, donde el sustrato donante es la GDP-fucosa. 16. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde la GDP-fucosa se obtiene merced a la acción de una enzima que se expresa de manera simultánea en la célula huésped o como resultado del metabolismo de la célula huésped. 17. Un oligosacárido, una (gluco)protefna y/o un (gluco)lípido fucosilado que pueden obtenerse con un uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 1 o con un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15.

8. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, donde el polinucleótido o el polipéptido se encuentran aislados, son recombinantes o son sintéticos.