CN104004081B - 条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40及其应用。IL-12p40的序列为序列表SEQ？ID？No.1中的氨基酸序列所示。所述IL-12p40用于抗细菌感染制剂。本发明的IL-12p40注射后能够明显提高鱼类抗细菌感染能力。

Description

条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40及其应用。

背景技术

白细胞介素12(interleukin12，IL-12)是一类主要有炎性细胞产生的细胞因子，具有广泛生物学活性。IL-12是唯一一类异源二聚体的细胞因子。它由两个二硫键连接的亚基α-chain(p35)和β-chain(IL-12p40)组成形成异源二聚体，其中IL-12p40亚基则与造血细胞因子受体家族成员的胞外结构域(例如IL-6Rα和CNTFR)类似。IL-12p40亚基可以与p35或者p19分别形成IL-12和IL-23。IL-12p40和p35亚基必须同时表达在同一细胞才能形成有空能的IL-12。IL-12是连接固有免疫和获得性免疫的关键性细胞因子，它是在抵御微生物病原的早期免疫应答中，由巨噬细胞、树突状细胞和B细胞产生，可以诱导或者促进促炎性Th1的产生。IL-12还可以促进NK细胞和T细胞的增殖和细胞裂解活性，参与到调节细胞介导的免疫应答的过程中。鱼类中IL-12研究极少，其中IL-12p40的功能完全未知。

发明内容

本发明目的在于提供一种条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40：IL-12p40的序列为序列表SEQIDNo.1中的氨基酸序列所示。

白细胞介素12亚基IL-12p40的应用，所述IL-12p40用于抗细菌感染制剂。

本发明具有如下优点：

本发明的IL-12p40重组蛋白腹腔注射鱼类后能够显著抑制细菌侵染。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的IL-12p40重组蛋白(泳道2)。泳道1，分子量标准。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法(SambrookandRussell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratoryPress2001)。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

本发明的IL-12p40为序列表SEQIDNo.1中的氨基酸序列。

序列表SEQIDNo.1为：

MKTLSLWICGLLFTSLTGAHGLSHFPENFVVAKKANANPVTLTCGTKTDGAVTWKFEGEVLEDVGFEDKLQQDGQNLTASKLDSPMFGEYSCWRGVEMLSSTHLLLEADGGRESDSLLSCRAKSYDCNFGCKWTISGYTAARLGLGNDCSEGGESCHWVNSSDQLLDGGFQFELSHSLSPYAEESTMLELTAEAINDLSILRTTKRFYLRDIIQPDSPQIVRCQEVDQDLNVTIDPPASWSTPHSFFSLEHEIEYTFIDNGQNGFSSSTLIPKRISKLRVRSRDALVLSTWSQWTPWKNVTYWYYLNSTLSASALSLFLHVYRVLSCPLPSCFSLTVSGCLPLGQTHTDGQEITQHSPEAQ

(a)序列特征：

●长度：361(有效长度361)

●类型：氨基酸序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：条石鲷

结构特点：该蛋白含有一个保守的IL-12p40结构域(氨基酸114－197)。

实施例2

重组IL-12p40的制备：

1)IL-12p40表达质粒pP40的构建

以条石鲷cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,60℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃40s,65℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。将表达载体pET259(pET259构建过程参见HuYH,ZhengWW,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromreddrum(Sciaenopsocellatus).FishShellfishImmunol2010；28:678-86)用限制性内切酶EcoRV酶切后与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为pP40。DNA测序表明pP40含有编码序列表SEQIDNo.1中氨基酸序列的基因。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0％蛋白胨,0.5％酵母粉,1.0％氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCATGCTCAGCCACTTTCCAGAAA-3’；R1为5’-GATATCCTGAGCTTCTGGTGAGTGCT-3’。

2)重组IL-12p40的纯化

将上述的质粒pP40用常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)(购自于“天根生化科技有限公司”，北京)，在含有Ap(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18－24小时,挑取一个转化子，将其命名为BL21/pP40。将BL21/pP40于含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养液,加入100ml新鲜的含有Ap(100ug/ml)的LB液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至OD₆₀₀为0.6,加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续以转速160rpm摇动培养4－5h，而后以5000g，4℃离心10min，收集菌液，加入5ml裂解液，在室温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液以10000g，4℃离心30min，回收上清。将上清中的蛋白用HisTrapHPColumns(购于美国GEHealthcare公司)回收纯化，纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳检测(8v/cm电压下电泳25－30min，随后15v/cm电压下电泳2－2.5h)，测定其分子量大小，发现其分子量与IL-12p40相同(参见图1)。

所述裂解液含10mMNaH₂PO₄、10mMTris和8M尿素,pH8.0。

实施例3

重组IL-12P40的应用

步骤1)蛋白注射

将上述实施例2步骤2)的重组IL-12P40在PBS中稀释至0.2mg/ml，即为IL-12P40稀释液。将10条条石鲷(重约28g)随机分为2组，每组5条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼腹腔注射100ulIL-12P40稀释液，将B组(对照组)的每条鱼腹腔注射100ulPBS。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na₂HPO₄.12H₂O,0.024％NaH₂PO₄，余量为水。

步骤2)细菌悬液制备

在LB培养基中培养哈氏弧菌T4至OD₆₀₀为0.8,然后离心(5000g，4℃，10min)，收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5x10⁷cfu/ml，即为哈氏弧菌T4悬液。

所述菌株哈氏弧菌T41保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2007年3月22日，保藏编号为：CGMCCNo.1985，分类命名为哈氏弧菌T4(Vibrioharveyi)。

步骤3)攻毒感染

在上述步骤1)注射后4h，将A和B组鱼腹腔注射100ul上述步骤2)的细菌悬液。在注射后24h，取鱼肾脏组织，在2mlPBS中匀浆，将100ul匀浆液涂布于LB平板。将平板置于30℃培养48h，计算出现的菌落数。结果表明A组鱼肾脏的细菌数(4.2x10²)显著(P<0.01)低于B组鱼肾脏的细菌数(6.3x10²)。

这些结果表明，IL-12P40重组蛋白能够显著抑制细菌侵染。

Claims (2)

1.一种条石鲷白细胞介素12亚基IL-12p40，其特征在于：IL-12p40的序列为序列表SEQIDNo.1中的氨基酸序列所示。

2.一种权利要求1所述白细胞介素12亚基IL-12p40的应用，其特征在于：所述IL-12p40用于抗哈氏弧菌感染制剂的制备。