CN105061576A - 大黄鱼C凝集素Nattectin基因及其重组蛋白和应用 - Google Patents

大黄鱼C凝集素Nattectin基因及其重组蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

大黄鱼C凝集素Nattectin基因及其重组蛋白和应用，涉及动物凝集素。大黄鱼C凝集素Nattectin氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1。大黄鱼C凝集素Nattectin基因核苷酸序列为SEQ？ID？NO:2。构建pET-32a-Nattectin重组表达载体；获得转化子高拷贝大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21；转化子发酵培养与诱导表达；重组蛋白Nattectin纯化和复性。大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白可在介导细菌凝集、介导红细胞凝集中应用。首例发现Nattectin的细菌凝集作用和一步脱盐法复性，最终获得大量可溶性生物活性蛋白，操作流程极其简单。

Description

大黄鱼C凝集素Nattectin基因及其重组蛋白和应用
技术领域
本发明涉及动物凝集素，尤其是涉及一种大黄鱼C凝集素Nattectin基因及其重组蛋白和应用。
背景技术
大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类之一，每年直接产值达数十亿元。但近年来由于养殖密度的增大和海水污染程度的加重，导致疫病频发，严重阻碍了大黄鱼养殖业的健康发展，导致了巨大的经济损失。目前对于大黄鱼疾病的防治主要采用化学药物，如抗生素类。但由此造成病原菌抗药性增强、水产品药物残留超标和环境污染严重等一系列问题。因此，寻找一种环境友好、切实可行的免疫防治方法、促进我国大黄鱼养殖业的可持续发展已成为当前海水养殖业关注的焦点。
C型凝集素是最早发现的动物凝集素之一。与其他凝集素所不同的是C型凝集素含有一个保守的糖基识别结构域(CRD)，可专一地与异物表面特定的糖基结合并吸附、凝集异物，从而促进机体清除异物。近年，C型凝集素作为模式识别受体受到国内外学者的广泛关注，其在动物的免疫防御系统中发挥了重要作用，包括凝集、吞噬、抗病毒、诱导酚氧化酶系统的激活和激发呼吸爆发等(DambuzaIMandBrownGD.C-typelectinsinimmunity:recentdevelopments.CurrOpinImmunol.2015.32:21-27)。一般C型凝集素分为两类：一类是甘露糖特异性C型凝集素，能够特异性结合甘露糖和/或海藻糖终止的多糖；另一类是半乳糖特异性C型凝集素，能够特异性识别半乳糖和N-乙酰氨基半乳糖终止的多糖(WeisWI,etal.TheC-typelectinsuperfamilyintheimmunesystem.ImmunolRev.1998,163:19e34)。Nattectin属于后者，其最早分离于有毒的纳氏海蟾鱼(Thalassophrynenattereri)，具有凝集红细胞的作用，并可以激活老鼠的嗜中性粒细胞，说明其具有免疫调节的功效(SaraivaTCetal.StructuralandbiologicalcharacterizationofNattectin,anewC-typelectinfromthevenomousfishThalassophrynenattereri.IntImmunopharmacol.2011,11:1546-1556)。但是，迄今尚未有Nattectin的细菌凝集作用的报道，本发明为首例发现Nattectin的细菌凝集作用。
C型凝集素重组蛋白，大多以包涵体的形式存在，包涵体存在复性困难且很难保持生物学活性等问题，因此，在实际应用中受到很大程度的限制。本发明采用一步脱盐法就可以同时达到蛋白复性和脱盐的目的。实验操作简单，蛋白产量高，使低成本的规模化生产成为可能，为研制新型鱼类免疫添加剂和细菌防治药物提供了一种新的途径。
发明内容
本发明的第一目的在于提供大黄鱼C凝集素Nattectin的蛋白和核苷酸序列。
本发明的第二目的在于提供大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法。
本发明的第三目的在于提供大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白在介导细菌凝集中的应用。
本发明的第四目的在于提供大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白在介导红细胞凝集中的应用。
所述大黄鱼C凝集素Nattectin的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
所述大黄鱼C凝集素Nattectin基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2。
所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建pET-32a-Nattectin重组表达载体，其具体方法如下：
用2条特异性引物扩增Nattectin基因开放阅读框，并将其插入表达载体的pET-32aBamHI和EcoRI多克隆位点间，经酶切鉴定和测序证明构建表达载体成功；
所述2条特异性引物为：
正向引物PF:CCGGAATTCATGGCATCAGCTCTTCATTTCA；
反向引物PR:CCGCTCGAGTTGTAAGGCGTCCTTGGCAC；
划线部分为BamHI和EcoRI内切酶位点；
(2)获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21，其具体方法可为：
经热转化，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆菌株pET-32a-Nattectin-BL21。
(3)转化子的发酵培养与诱导表达；
诱导表达条件为：菌液OD600值0.6～0.8，0.1mM的IPTG，18℃，90rpm过夜诱导12h。
(4)重组蛋白Nattectin的纯化和复性，具体方法如下：
用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白，再复性得到可溶性蛋白。
在步骤(4)中，所述用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白的洗脱液配方可为：160mMimidazole，8MUrea，100mMNaH2PO4，10mMTrisbase，pH8.0；所述复性可采用一步脱盐法复性，即脱盐柱直接对纯化的包涵体脱盐，可同时达到复性和脱盐的目的，最终得到溶于PBS的重组蛋白。
所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白可在介导细菌凝集中应用。
所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白可在介导红细胞凝集中应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供的Nattectin基因和蛋白序列为新型C凝集素，仅在有毒的纳氏海蟾鱼(T.nattereri)报道过，本发明为首次发现Nattectin凝集素具有细菌凝集活性。
本发明表达的重组蛋白Nattectin具有广谱凝集水产动物病原菌的作用，从而一方面把病原菌局限在一定范围内，限制病原菌继续侵染机体其他部位；另一方面可以促进机体快速清除病原菌。此外，表达的重组蛋白Nattectin对人类、家兔和大黄鱼血细胞具有凝集作用。
与以往天然获得凝集素或者体外表达凝集素技术相比，本发明的制备方法具有以下优点：①操作简单：规模化生产时只需培养已诱导表达重组蛋白的细菌即可。②蛋白产量高：因为蛋白以包涵体形式存在，产量非常高。③纯化操作简单且蛋白稳定：由于包涵体外有一层膜包裹，故纯化的时候蛋白不易散落，且容易与镍离子柱结合，故纯化操作简单、蛋白稳定。④复性简单：本发明首次发现一步脱盐法即可获得可溶性的生物活性蛋白，这在包涵体蛋白复性中是非常简单易行的，因为通常包涵体复性都是梯度尿素复性(即6、4、2、1、0M尿素复性，此操作工序繁琐，很难获得具有生物活性的蛋白)。综上所述优势，使得C凝集素Nattectin重组蛋白大批量，低成本的规模化生产成为可能，为研制新型鱼类免疫添加剂和细菌防治药物提供了一种新的途径。
重组蛋白对革兰氏阳性和阴性菌(包括多种水产动物致病菌)具有广泛的凝集作用。对大肠杆菌(Escherichia.Coli)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和溶壁微球菌(Micrococcuslysoleikticus)的最小凝集浓度分别为2.12、2.12、0.266、1.06、2.66、0.0664μg/ml。
重组蛋白对人、家兔和大黄鱼红细胞具有明显的凝集作用。最小凝集红细胞的浓度为18.75、37.5μg/ml，18.75μg/ml。
本发明采用一步脱盐法就可以同时达到蛋白复性和脱盐的目的。实验操作简单，蛋白产量高，使低成本的规模化生产成为可能，为研制新型鱼类免疫添加剂和细菌防治药物提供了一种新的途径。
附图说明
图1为本发明的C凝集素Nattectin在大肠杆菌诱导表达的重组蛋白及纯化电泳图。在图1中，LaneM：蛋白Marker；Lane1：重组菌株未诱导；Lane2：诱导的总蛋白；Lane3：诱导蛋白的上清液；Lane4：诱导蛋白的沉淀；Lane5：纯化的重包涵体蛋白；Lane6：脱盐后溶于PBS的重组蛋白。
图2为本发明的C凝集素Nattectin对大肠杆菌(E.Coli)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和溶壁微球菌(M.lysoleikticus)的凝集作用。在图2中，左图为BSA阴性对照组，右图为Nattectin凝集组。
图3为C凝集素Nattectin对人、家兔和大黄鱼红细胞的凝集作用。在图3中，左图为BSA阴性对照组，右图为Nattectin凝集组。
具体实施方式
以下结合实施例进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
大黄鱼C凝集素NattectincDNA序列的获得
1.大黄鱼脾脏总RNA的提取和反转录cDNA的合成
用Trizol试剂抽提大黄鱼脾脏总RNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度法检测RNA的浓度和纯度。用M-MLV反转录酶试剂盒反转RNA，得到cDNA第一条链。
2.获得大黄鱼C凝集素NattectincDNA序列
根据本实验室大黄鱼转录组数据库拼接Nattectin基因序列，并设计一对特异性引物扩增获得大黄鱼C凝集素Nattectin。引物序列为：
正向引物NF:ATGGCATCAGCTCTTCATTTCA；
反向引物NR:TTGTAAGGCGTCCTTGGCAC。
PCR反应程序为：94℃预变性3min,然后30个循环：94℃变性45s,70℃退火45s，72℃延伸45s；最后72℃延伸10min。纯化的PCR产物与载体pMD-19T相连，筛选阳性克隆子并测序。
应用BLAST工具将大黄鱼Nattectin的核苷酸和氨基酸序列与NCBI数据库已有的Nattectin基因/蛋白比对，发现本发明所述的大黄鱼Nattectin与已有大黄鱼Nattectin的核苷酸序列相差4个碱基SEQIDNO:2，并且相差一个氨基酸序列SEQIDNO:1。
SEQIDNO:1的信息(参见序列表，下划线为相差的氨基酸序列)
MASALHFIVLLCGLWIGANVISAHHLGGCPHRWTKHGCRCFRFFNTPKPWAEAERFCTLHGGNLASVLTREEGNLISSMMTTTAWVGGYDKVQDGVWLWSDGRKFDFHLWRKFGNEPNNYNGGEGCMQFLKTRNANDNKCHTRIHFVCAKDALQ
SEQIDNO:2的信息(参见序列表，下划线为相差的碱基序列)
ATGGCATCAGCTCTTCATTTCATCGTCCTCCTTTGTGGACTCTGGATCGGAGCAAACGTGATAAGTGCTCATCATTTAGGTGGCTGCCCTCATCGTTGGACTAAACATGGCTGTCGCTGCTTCAGGTTCTTCAACACTCCGAAGCCGTGGGCTGAGGCAGAGCGTTTCTGCACTCTTCATGGTGGCAATCTGGCTTCCGTCCTGACTAGAGAAGAGGGCAATTTGATCAGCAGCATGATGACAACAACAGCTTGGGTTGGAGGCTATGATAAAGTGCAGGATGGTGTGTGGCTCTGGAGTGATGGTAGAAAGTTTGACTTCCATCTGTGGAGGAAGTTCGGTAACGAGCCTAACAACTACAATGGAGGAGAAGGATGCATGCAGTTTTTGAAAACAAGAAATGCCAACGATAATAAATGTCATACTCGCATACATTTTGTCTGTGCCAAGGACGCCTTACAATGA。
实施例2
大黄鱼新型C凝集素Nattectin重组蛋白的制备
1.构建pET-32a-Nattectin表达载体
(1)Nattectin基因的PCR扩增
提取大黄鱼脾脏总RNA，以OligdT为引物扩增获得脾脏的cDNA。根据大黄鱼转录组数据(本实验室测得)设计引物如下：
PF:CCGGAATTCATGGCATCAGCTCTTCATTTCA(划线部分为BamHⅠ酶切位点)；PR:CCGCTCGAGTTGTAAGGCGTCCTTGGCAC(划线部分为EcoRI酶切位点)。
以大黄鱼脾脏cDNA为模版，引物PF/R扩增获得约477bp的Nattectin基因。
(2)将PCR产物与pET-32a同时进行BamHⅠ和EcoRI双酶切并回收，然后16℃过夜连接。
(3)连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，获得转化菌，提取质粒并经双酶切鉴定，pET-32a基因正确插入到pET-32a相应酶切位点中，表明构建载体正确。
2.获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21
(1)将鉴定正确的重组质粒pET-32a-Nattectin约5μl加入到预冷的200μlBL21(DE3)感受态细胞中，冰上预冷30min，42℃水浴热应激90s，然后冰上放置冰上2min；加入37℃预热的LB液体培养基，37℃摇床(150r/min)复活培养60min；然后涂布在含有氨苄的LB平板上，37℃培养至单菌落出现。
(2)挑取单菌落接种到含有氨苄的液体LB培养基中培养过夜，提取质粒，酶切鉴定，筛选出阳性转化子pET-32a-Nattectin-BL21。
3.转化子的发酵培养与诱导表达
将筛选得到的阳性转化子细菌pET-32a-Nattectin-BL21接种于LB培养液中，37℃，200rpm过夜培养，按1∶100接种于新的LB培养液中，37℃，200rpm摇菌至OD600＝0.6，然后加入0.1mM的IPTG诱导剂，18℃，90rpm诱导表达12h，收集菌体。
4.重组蛋白Nattectin的表达形式的鉴定。
将诱导的菌液离心收集(4℃,12000g,15min)，用PBS洗涤(4℃,12000g,5min)三次后再次加入PBS重悬，冰浴，20％功率，超声20～30min，超声3s，间隙5s,直至菌液较为澄清。4℃，12000g，离心20min，分离出蛋白上清和沉淀。SDS-PAGE电泳检测发现重组蛋白以包涵体的形式存在(参见图1，lane3，4)。
5.包涵体蛋白Nattectin的纯化
将样品经0.45μm滤器过滤后，加入到层析柱中，与介质混匀，弃流出液。用5-10倍体积的平衡缓冲液洗涤层析柱(8MUrea，100mMNaH2PO4，10mMTrisbase，pH8.0)，再用洗脱缓冲液(160mMimidazole，8MUrea，100mMNaH2PO4，10mMTrisbase，pH8.0)洗脱目的蛋白，最终获得高纯度的包涵体重组蛋白Nattectin(参见图1，lane5)。
6.重组蛋白Nattectin的复性和脱盐
样品经0.45μm滤器过滤后，用注射器加到柱内，速率1～10ml/min，弃流出液。再用注射器将PBS加入柱内，洗脱目的蛋白，收集流出液。发现所收集的蛋白溶液透明澄清，SDS-PAGE检测蛋白完整，此方法可同时达到重组蛋白复性和脱盐的目的。
实施例3
重组蛋白Nattectin对细菌的凝集作用
(1)分离纯化细菌，并将菌体浓度调至2.0×108cell/ml。
(2)细菌凝集作用在96孔U型板上进行。先在第1孔以后的每孔中加入50fμlTBS.再往第l孔中加入100μl(150ug/mL)蛋白样品，混匀后，再从第1孔中吸取50μl加入第2孔，以此类推作倍比稀释.最后在每孔中分别加入各种菌体的悬浮液并充分混匀，室温放置1h。于显微镜下观察各种细菌的凝集状况并记录Nattectin对不同菌的最小凝集浓度。同时用BSA来做为阴性对照进行平行试验。
(3)结果表明，C凝集素Nattectin重组蛋白对大肠杆菌(E.Coli)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和溶壁微球菌(M.lysoleikticus)的最小凝集浓度分别为2.12、2.12、0.266、1.06、2.66、0.0664μg/ml。(参见图2)。
实施例4
重组蛋白Nattectin对红细胞的凝集作用
(1)采取人、大黄鱼和兔的血液，用1％肝素钠溶液抗凝；
(2)分离红细胞，制备2％(v/v)的红细胞悬液；
(3)凝集诱导最小蛋白浓度测定在96孔U型板中进行，先在第1孔以后的每孔中加入50μlTBS溶液，再往第l孔中分别加入100μl蛋白样品(150μg/mL)，再从第1孔中吸取50μl加入第2孔，以此类推作倍比稀释，最后在每孔中加入50μl2％(v/v)的红细胞悬浮液，温和混匀，在室温放置1～2h；
(4)肉眼观察，以有红细胞凝集活力的最大稀释度为该蛋白的红细胞凝集活力。如红细胞不发生凝集则在“U”型板底部形成一界线清晰的红色小点；如发生凝集，红细胞之间则形成一似网络扩散的红斑块。光学显微镜观察微观凝集形态，拍照；
(5)结果表明，C凝集素Nattectin重组蛋白对人、家兔和大黄鱼红细胞具有明显的凝集作用，最小凝集红细胞的浓度为18.75、37.5μg/ml，18.75μg/ml(参见图3)。

Claims (10)

1.大黄鱼C凝集素Nattectin的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.大黄鱼C凝集素Nattectin基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2。
3.大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建pET-32a-Nattectin重组表达载体；
(2)获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21；
(3)转化子的发酵培养与诱导表达；
(4)重组蛋白Nattectin的纯化和复性。
4.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(1)中，所述构建pET-32a-Nattectin重组表达载体的具体方法如下：
用2条特异性引物扩增Nattectin基因开放阅读框，并将其插入表达载体的pET-32aBamHI和EcoRI多克隆位点间，经酶切鉴定和测序证明构建表达载体成功；
所述2条特异性引物为：
正向引物PF:CCGGAATTCATGGCATCAGCTCTTCATTTCA；
反向引物PR:CCGCTCGAGTTGTAAGGCGTCCTTGGCAC；
划线部分为BamHI和EcoRI内切酶位点。
5.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(2)中，所述获得转化子高拷贝的大肠杆菌表达菌株pET-32a-Nattectin-BL21的具体方法为：
经热转化，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆菌株pET-32a-Nattectin-BL21。
6.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(3)中，所述诱导表达的条件为：菌液OD600值0.6～0.8，0.1mM的IPTG，18℃，90rpm过夜诱导12h。
7.如权利要求3所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于在步骤(4)中，所述重组蛋白Nattectin的纯化和复性的具体方法如下：
用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白，再复性得到可溶性蛋白。
8.如权利要求7所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于所述用镍离子柱纯化包涵体重组蛋白的洗脱液配方为：160mMimidazole，8MUrea，100mMNaH2PO4，10mMTrisbase，pH8.0。
9.如权利要求7所述大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白的制备方法，其特征在于所述复性采用一步脱盐法复性，即脱盐柱直接对纯化的包涵体脱盐，可同时达到复性和脱盐的目的，最终得到溶于PBS的重组蛋白。
10.如权利要求1～9中任一所述制备方法所制备的大黄鱼C凝集素Nattectin重组蛋白在介导细菌凝集以及介导红细胞凝集中应用。
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CHANGHUAN LV等: "A novel C-type lectin, Nattectin-like protein, with a wide range of bacterial agglutination activity in large yellow croaker Larimichthys crocea", 《FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY》 *
MÔNICA LOPES-FERREIRA等: "Structural and biological characterization of Nattectin,a new C-type lectin from the venomous fish Thalassophryne nattereri", 《BIOCHIMIE》 *
PAUL A. POLAND等: "《Galectins》", 25 August 2014, SPRINGER *

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