WO2014209096A1 - Nuevos anticuerpos monoclonales contra el receptor dec-205 de células dendríticas de pollo - Google Patents

Nuevos anticuerpos monoclonales contra el receptor dec-205 de células dendríticas de pollo Download PDF

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Lourival Domingos Possani Postay
María Martha PEDRAZA ESCALONA
Geraldo Pavel ESPINO SOLIS
Alejandro Olvera Rodriguez
Héctor Miguel CARDOSO TORRES
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Universidad Nacional Autónoma de México
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Definitions

  • the present invention relates to the production and characterization of novel murine monoclonal antibodies that recognize the CTLD-2 domain (SEQ ID NO: 1) of the DEC-205 cell receptor of dendritic cells in chickens ⁇ Gallus gallus), pigs (Sus scrofa) and humans (Homo sapiens).
  • Said invention relates to the production of new monoclonal antibodies from hybridomas made by fusion of SP2 myeloma cells with spleen cells of BALB / c mice immunized with the CTLD-2 fragment (SEQ ID NO: 1) of avian origin of said receiver.
  • the invention also relates to the ability of the new antibodies to significantly address and modulate the immune response at different levels in chickens (Gallus gallus), pigs (Sus scrofa), as well as recognize the DEC-205 receptor in dendritic cells and cell lines of human origin. Furthermore, the application of this invention in obtaining a specific humoral immune response in a short time against Hemagglutinin H5 (SEQ ID NO: 8) of the H5N2 avian influenza virus is briefly described. BACKGROUND OF THE INVENTION
  • the immune system has highly specialized cells to perform various processes, including dendritic cells (CD 's) have the ability to stimulate primary and secondary T and B lymphocyte response and the response of cytotoxic T lymphocytes in human mice and lymphocytes (Carter et al, 2006). This ability is due to the fact that CD ' s are the most specialized cells in the presentation of antigens, internalizing, processing and presenting them in the form of peptides bound to the major histocompatibility class II (MHC-II) major complex molecules. Its origin comes from myeloid progenitor cells, which are able to differentiate into immature dendritic cells and finally into mature dendritic cells through the expression of several surface markers.
  • MHC-II major histocompatibility class II
  • the function as an antigen presenter of dendritic cells has been related to high levels in the expression of the DEC-205 receptor, also called CD205 or lymphocyte antigen 75, especially in dendritic cells located in areas of T cells of peripheral or secondary lymphoid organs (Jiang et al., 1995; Kraal et al., 1986; Winter-Pack et al., 1995). This was verified by the intemalization of antibodies Human anti-DEC-205 by dendritic cells (Bonifaz et al., 2002; Steinman and Banchereau, 2007; Steinman, 2008; Ueno et al., 2010).
  • the DEC-205 receptor is an endocytic receptor with a long extracellular domain that contains several subdomains: a cysteine-rich domain (RC), a fibronectin type II (FN) domain and 10 contiguous carbohydrate recognition domains (CRDs), also known as type C lectin domains (or CTLDs) (Mahnke et al., 2000). These multilectin domains are involved in the efficiency of processing and presentation of antigens in vivo (Hawiger et al., 2001).
  • lectin-type C receptors include Langerin, DC-SIGN, ma ⁇ osa receptor and phospholipase A 2 receptor, which have also been implicated in the processing and presentation of antigen (Figdor et al., 2002; Idoyaga et al ., 2008).
  • helper T cells helper T cells
  • the targeting of antigens using this marker and CD1 1c have increased the kinetics of high-titre antibody production in the first 7 days after immunization (Wang et al., 2000; Cheong et al., 2010) .
  • DEC-205 receptor has been described in lineages other than human dendritic cells, as in B cells, T cells, NK cells and monocytes (Kato et al., 2006); capillaries of the brain, bone marrow stroma and cortical epithelium of the thymus; they are also found in other mammalian species such as chimpanzees, mice and other non-mammalian species (Kraal et al., 1986; Witmer-Pack et al., 1995), including chicken (Gallus gal I us).
  • the genomic and protein sequence for the Gallus gallus DEC-205 receptor is reported in the European Nucleotide Archive (http: //www.ebi. Ac. Uk / ena /, access number AJ574899); in the ENSEMBL database (http://www.ensennbl.org/), in the GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, access number NP_001032925.1.), as well as in the UniProtKB / TrEMBL where you have the access number Q4LDF5.
  • N-CRD-FNII-CTLD1 -CTLD2-CTLD3-CTLD4-CTLD5-CTLD6-CTLD7-CTLD8- CTLD9-CTLD10-TMC N-CRD-FNII-CTLD1 -CTLD2-CTLD3-CTLD4-CTLD5-CTLD6-CTLD7-CTLD8- CTLD9-CTLD10-TMC
  • N is the N-terminal region
  • CRD represents the cysteine-rich domain
  • FNII represents the Fibronectin type II domain
  • CTLD1 to CTLD10 represents the ten "C-type lectin domains"
  • TMC represents the domains transmembrane and cytoplasmic ( Figure 1).
  • the use of antibodies or immunoglobulins that recognize dendritic cell surface receptors is due to the ability of these molecules to interact specifically and with high affinity with the immunogens against which they are produced.
  • the antibodies are glycoproteins comprising two heavy chains and two light chains interconnected by disulfide bridges with an antigen binding region.
  • Heavy chains have a variable region (V H ) and a constant region (CH), the latter can have three to four domains, which are directly involved in the union with cells of the immune system or with the complement system (Padlan, 1994).
  • light chains comprise a variable region (V L ) and a constant region, which has a single C L domain.
  • the variable regions (V H and V L ) contain the antigen binding site; called hypervariability regions or complementarity determining regions (CDR). These regions are interspersed with more conserved regions called framework regions or "framework" (FR).
  • Those antibodies that show high binding specificity and affinity for a particular epitope are monoclonal antibodies, which are produced by a hybridoma, generated by the fusion of immortalized cells (myelomas), which do not secrete immunoglobulins, and B cells obtained of the spleen of mice immunized against an antigen, where the heavy and light chain information is contained.
  • genes that encode the variable domains of all possible immunogiobulins can be achieved by rearrangement of nucleotide sequences. This can be obtained from the lymphocytes of any vertebrate, including humans.
  • variable elements of the heavy and light chains of the antibodies can be selected at present, which can be linked by a linker peptide in such a way to obtain a single chain fragment of the antibodies, which are capable of recognizing the antigens
  • Our group has been able to prepare a gene bank that expresses the single chain fragments, and by means of the filamentous phage display technique, it has been possible to obtain antibodies that protect against toxins from the scorpion venom (Ria ⁇ o-Umbarilla et al., 2005, see also US Patent 7,381, 802 B2, June 3, 2008).
  • Figure. 1 schematically shows the different domains of the DEC-205 receptor, which belongs to the family of type C lectins.
  • N amino-terminal region
  • FNII cysteine-rich domain
  • C fibronectin type II
  • C ten "lectin domains type C”
  • C transmembrane and cytoplasmic domains
  • Figure. 2 shows the expression vector (pET22b) indicating several loci present, as well as the location of the CTLD-2 gene.
  • A His-Tag
  • B Stop cod
  • C Origin of F1.
  • Figure. 3 shows some of the steps in the process of purification of the CTLD-2 domain in a 12% SDS gel electrophoresis.
  • FIG. 4 A shows the polyclonal serum titer of two mice immunized with the recombinant CTLD-2 immunogen compared to preimmune polyclonal serum. The logarithm of the dilution is plotted on the abscissa axis and the absorbance at 405 nm is plotted on the ordinate axis; (a): Preimmune serum, (b): Mouse Serum 1 and (c) Mouse Serum 2. B) shows the binding plot of murine anti-CTLD-2 antibodies using supernatant of hybridomas obtained by means of the ELISA technique hint.
  • the different hybridomas obtained are placed on the abscissa axis and the absorbance at 405 nm is plotted on the ordinate axis.
  • C) shows the recognition of monoclonal antibodies 2F2E8E3B4, 2F2E8E3B6, 4D12R and 4D12F4 towards the CTLD-2 domain by indirect ELISA.
  • the different obtained monoclones are placed on the abscissa axis and the absorbance at 405 nm is plotted on the ordinate axis.
  • Figure. 5 shows the titer of the monoclonal antibody 2F2E8E3B6 compared against SP2 cell supernatant.
  • the logarithm of the dilution is plotted on the abscissa axis and the absorbance at 405 nm is plotted on the ordinate axis; (a): AbM 2F2E8E3B6 and (b): SP2 cell supernatant.
  • Figure. 6 shows immunoprecipitation of lysed cells from the chicken spleen (Gallus gallus) using murine monoclonal antibodies anti-CTLD-2.
  • Specific immunoisolation of the DEC-205 receptor (205 kDa) present in white chicken spleen cells is observed in a 10% SDS-PAGE gel under reducing conditions compared to a negative control (left lane).
  • the electrophoretic shift of the heavy (50 kDa) and light (25 kDa) chain of the 2F2E8E3B6 antibody is also observed; With: Control.
  • FIG. 7 shows the internalization of the chicken DEC-205 receptor using anti-CTLD-2 antibodies in the T-cell line (Jurkat) using intracellular staining analyzed by flow cytometry.
  • 7A shows the control and 7B shows the cells after 30 minutes of incubation with the anti-CTLD-2 antibody, on average a percentage of 13.91% of cells that internalize the antibody target is observed.
  • Co account and (a): PE cells.
  • FIG. 8 shows the purification process of Hemagglutinin H5 monitored by Western Blot.
  • FIG. 9 shows IgY titers towards avian hemagglutin H5 after intradermal immunization in two hens.
  • the logarithm of the dilution is plotted on the abscissa axis and the absorbance at 405 nm is plotted on the ordinate axis.
  • G1 hen 1
  • G2 hen 2
  • FIG. 10 A shows the recognition of lymphocyte receptor 75 (DEC-205) in species other than Gallus gallus, such as Homo sapiens (human) and Sus scrofa (pig) through immunoprecipitation using the anti-CTLD2 2F2E8E3B6 antibody.
  • B) shows the sequence alignment of the CTLD-2 segment of Gallus gallus 75 lymphocyte antigen (NP_001032925.1) compared to Homo sapiens sequences (NP_002340.2) and pig (Sus scrofa) (NP_001 171875.1), as well as their percentage of identity.
  • the present invention provides new monoclonal antibodies of murine origin capable of recognizing the DEC-205 receptor of Gallus gallas, which has particular and immunological specific properties in dendritic cells.
  • the antibodies produced have the potential to be used in a variety of targeted immunological processes, such as intervening in the ability to present different antigens, inducing the T-cell response or increasing the rate of antibodies produced against a variety of specific pathogens of birds.
  • cell and “cell culture” as used herein are used as synonyms and all these designations include their progeny. Therefore, the words “transformants” and “transformed cells” include the primary subject cell and cultures derived therefrom without considering the number of transfers. It is also understood that not every progeny must be precisely identical in its DNA content due to deliberate or inadvertent mutations. Mutant progeny that have the same biological function or activity as that detected in the originally transformed cell is included. When different designations are attempted, they must be clear from the context.
  • “Pharmaceutically acceptable vehicle” means solid or liquid filler, diluent or substance that can be safely used in systemic or topical administration. According to the particular route of administration, several vehicles well known in the industry are pharmaceutically acceptable and include solids or fillers, diluents, hydrotropes, surface active agents and encapsulating substances. The amount of vehicle employed together with the monoclonal antibodies supplies a manageable amount of material per unit dose of the compound.
  • compositions of the invention include sugar, starches, cellulose, vegetable oils, buffers, polyols and alginic acid.
  • Pharmaceutically acceptable specific vehicles are described in the following documents, all mentioned herein by reference: US 4,401, 663, Buckwalter et ai., Issued on August 30, 1983; European Patent Application No. 089710, LaHann et al., Published Sept. 28, 1983; and European Patent Application No. 0068592, Buckwalter et al., published January. 5, 1983.
  • Preferred vehicles for parenteral administration include propylene glycol, pyrrolidone, ethyl oleate, aqueous ethanol and combinations thereof.
  • Representative vehicles include acacia, agar, alginates, hydroxy alkyl alkyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, carrageenan, cellulose powder, guar gum, cholesterol, gelatin, agar gum, gum arabic, karaya gum, ghatti gum, locust 9 gum, octox , oleyl alcohol, pectin, polyacrylic acid and its counterparts, polyetylene glycol, polyvinyl alcohol, polyacrylamide, iauri!
  • sodium sulfate polyethylene oxide, polyvinyl pyrrolidone, glycol monostearate, propylene glycol monostearate, xanthan gum, tragacanth, sorbitan esters, stearic alcohol, starch and its modifications. Suitable ranges vary from 0.5% to 1%.
  • Cysteine-rich domain located in the amino-terminal region of the extracellular side of the DEC-205 receptor (see Figural)
  • FN fibronectin type II
  • the present invention encompasses the recombinant production of the CTLD-2 domain of the DEC-205 receptor of Gallus gallus, a domain selected as an immunogen to generate monoclonal antibodies, since it is easier to access to foreign molecules because it is located on the extracellular surface of the DEC receptor -205, and whose cloning and recombinant expression were satisfactory.
  • IP intraperitoneally
  • mice with increasing concentrations of antigen (25, 50, 100, 150 and 200 micrograms) in Freund's complete adjuvant, in a 1: 1 ratio ( 100 ⁇ total volume), followed every ten days by IP immunizations of the antigen mixed alternately with incomplete adjuvant or alumina (1: 1 ratio) (up to a total of 5 immunizations).
  • the immune response was monitored during the immunization protocol by taking samples of murine serum obtained from the retro-orbital plexus at the fourth immunization.
  • mice with high titers of chicken anti-DEC-205 antibodies were used to fuse with immortalized spleen cells.
  • Mice were reinforced via IP with the antigen, 1 or 2 days before sacrificing and removing the spleen.
  • the present invention encompasses the generation of murine monoclonal antibodies capable of recognizing the Gallus gallus DEC-205 receptor through the CTLD- domain. 2 (SEQ ID NO: 1).
  • Monoclonal antibodies that bind DEC-205 with high recognition included those produced by hybridomas of the 4D 2 and 2F2 family ( Figure 4B), which were produced as example 2 shows in detail, according to well protocols standardized (Kohler and Milstein, 1975; Goding, 1986).
  • hybridomas were identified as producing the antibodies with the desired specificity, subcloning was carried out by limiting dilution and growth in D-MEM medium under standard conditions (Goding, 1986). Where four monoclones, 2F2E8E3B4, 2F2E8D3B6, 4D12R and 4D12F4 presented high recognition for the CTLD-2 domain, identified by the indirect ELISA method ( Figure 4C).
  • the isotype of the monoclonal antibodies obtained was determined by sandwich ELISA using the hybridoma culture supernatants and the commercial Mouse Typer Sub-lsotyping Kit (Bio Rad).
  • hybridomas were cultured in vivo by inducing liquid tumors (ascites) in several mice of the BALB / c strain to produce sufficient amount of antibodies.
  • Monoclonal antibodies secreted by hybridomas were separated from ascites fluid and culture medium by conventional immunoglobulin purification procedures such as affinity chromatography using Protein A-Sepharose, as illustrated in example 3. Those from which they were obtained Better yields in the purification process were selected to determine their EC 50 ( Figure 5) and proceed to sequencing the heavy and light variable chains of these antibodies (Example 12).
  • monoclonal anti-CTLD-2 antibodies bind to the DEC-205 receptor expressed in living cells of Gallus gallus and other species, and whether these antibodies allow the receptor to function in internalization and antigen processing, they were flow cytometry and immuprecipitation techniques were used, as illustrated in examples 5, 6 and 10. For example, clear lysates of previously purified white cells from different organs, and from several cell lines, were used, to which it was determined the presence of the DEC-205 receptor by means of the immunoprecipitation technique; using the monoclonal antibody with better recognition of the present invention, 2F2E8E3B6, at saturating concentrations.
  • the H5N2 avian influenza virus RNA was used from a collection of RNAs donated by Dr. R. Webster (St. Jude Hospital, Tenesse, USA), to isolate the gene that contains the Hemagglutinin H5 (SEQ ID NO: 8), the main antigenic determinant to develop the pathogenesis of influenza virus, clone it and express it heterologously using the baculovirus system, which is described in example 7.
  • the monoclonal antibodies were activated with succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC; Pierce, Rockford, IL USA), which adds maleimide and ester groups to proteins that allow covalent conjugation with molecules containing sulfhifrile or amino groups; while the antigen used, the recombinant Hemaglutinin H5 protein (SEQ ID NO: 8) of the avian influenza virus was modified with 2-inminothiolane (Traut, Pierce, Rockford, IL USA), reagent that reacts with primary amines to introduce groups sulfhydryl at these sites, generating white sites of the modified antibodies and carrying out covalent conjugation, which is detailed in example 8.
  • SCC succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate
  • SEQ ID NO: 8 2-inminothiolane
  • the proposal of the present invention extends to veterinary use, specifically towards broilers and laying hens using the Gallus gallus species as a model, because the mobilization of these specimens from the producing areas to the consuming areas can focus points of risk for the spread of contagious diseases.
  • This proposal uses the Gallus gallus DEC-205 receptor as a modulator of the immune response since those molecules that specifically recognize dendritic cells through this receptor, as specific antibodies directed against the complete protein or any of its domains, have the potential to direct the immune response to different levels, and produce a potent immune response to those antigens that are bound to these antibodies; through chemical conjugation or genetic engineering.
  • the immune response can be expedited against a number of specific infectious diseases of these birds.
  • the molecular conjugates of the present invention have the ability to be used to treat or prevent a variety of diseases and / or specific conditions of the. Gallus gallus species and in animals in which there is cross-reactivity in recognition by said receptor.
  • ViralS-antibody antigen conjugates can be used for the prevention of viral diseases, such as avian smallpox, New castle, coronavirus, enterovirus, among others.
  • bacterial antigen-antibody conjugates can be used for the prevention of bacterial diseases such as avian cholera or infectious coryza.
  • Cp39 protein from Pasteurella multocida for the case of avian cholera (Sthitmatee, et al., 2008) or the outer membrane protein HMTp210 (210 kDa) of Avibacterium paragallinarum that produces infectious coryza (Sakamoto et al ., 2012).
  • some viral agents that cause cancer in this species can be used as antigens to make the conjugates, for example, the gp85 protein of the subgroup J avian leukosis virus (Sun, et al., 2012).
  • Hemagglutinin H5 the main antigenic determinant of avian influenza virus type H5N2
  • the conjugates of the present invention can be administered to individuals indirectly, for example, by previously culturing or incubating the conjugates with antigen presenting cells, such as dendritic cells and then administered to individuals (ex vivo) ( Gunzer and Grabbe, 2001; Steinman, 1996; Tacken et al., 2006; Tacken et al., 2007).
  • the conjugates are administered in effective amount to carry out their desired therapeutic effect, for example, eliminating bacterial, viral or fungal infection.
  • the effective amount for each particular application may vary depending on the type of disease or the condition to be treated.
  • Preferred routes of administration of the conjugates include, for example, subcutaneous or intraperitoneal injection or even oral route, if necessary. Examples
  • the amino acid sequence of the Gallus galius DEC-205 cell receptor is reported in GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) under accession number NP_001032925.1.
  • the CTLD-2 domain that was cloned is presented as SEQ ID NO: 1, which was obtained from peripheral blood genomic DNA of a healthy chicken using specific oligos CTLD-E1 FNco, CTLD-E1 R, CTLD-E2F, CTLD-E2R, CTLD-E3F and CTLD-E3RHin (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 and 7, respectively) to obtain the three exons that comprise it, which were assembled, cloned and transformed for recombinant expression in the Rosetta-ll strain of E.coli.
  • Fig. 2 The cloning site of CTLD-2 within the expression vector pET22b (+) is shown in Fig. 2, which is flanked by the pelB sequence in the aminoterminal region, which directs the recombinant protein towards the bacterial periplasm , in addition to a contiguous sequence of six histidines in the carboxyterminal region, used for purification, and at the end a stop codon is attached.
  • This system was optimal for expression in recombinant CTLD-2 protein (SEQ ID NO: 1) inclusion bodies, after being induced with IPTG at a final concentration of 0.2 mM once a D0 6 oonm of 0.7 was reached.
  • This material subjected to mass spectrometry analysis, proved to be homogeneous and have a molecular weight of 21229 Da, indicating that the domain is bound to the signal peptide according to the construction shown in Figure 2.
  • the concentration of the CTLD-2 protein (SEQ ID NO: 1) was determined through the molar extinction coefficient theoretically estimated with the ProtParam server (http://ca.expasy.org/tools/protparam.html). Following this purification protocol, a yield of 1.0 mg of 98% pure protein per liter of culture was obtained.
  • mice were immunized intraperitoneally with the CTLD-2 domain (SEQ ID NO: 1) in increasing concentrations of antigen (25, 50, 100, 150 and 200 micrograms) in Freund's complete adjuvant, in a 1: 1 ratio, followed every ten days by IP immunizations of the alternately mixed antigen with incomplete adjuvant or alumina (1: 1 ratio) (up to a total of 5 immunizations).
  • murine splenocytes were isolated and fused in the presence of 50% PEG (w / v) to an immortal cell line, in this case the mouse myeloma cell line SP2.
  • the fused cells were placed in 96-well plates and incubated at 37 ° C in 5% C0 2 in in 100 ⁇ HAT selective medium (Sigma Aldrich, USA) at 48 h 100 ⁇ of HT medium was added in order to reduce the concentration of aminopterin with respect to the volume of culture; at ten days of culture, wells where there was growth of hybridomas were observed and replaced by the selective medium HT (Sigma Aldrich, USA). Once the extensive growth of the hybridomas was verified, a test was performed taking 100 ⁇ of the medium of culture and the evaluation in the production of specific murine IgG antibodies against the CTLD-2 domain was carried out by means of the indirect ELISA technique. The results are shown in Fig.
  • murine antibodies produced by the 2F2 and 4D12 hybridomas are those that showed the highest level of recognition by indirect ELISA.
  • Those antibody-secreting hybridomas (2F2 and 4D12) were expanded, re-evaluated and subcloned at least three or four times by limiting dilution. The results are shown in Fig. 4B, which shows that monoclones 2F2E8E3B4, 2F2E8D3B6, 4D12R and 4D12F4 have the highest levels of binding by CTLD-2 antigen (SEQ ID NO: 1) by indirect ELISA.
  • Monoclones 2F2E8E3B4, 2F2E8D3B6, 4D12R and 4D12F4 were grown in vitro in DMEM medium (Hyclone Laboratories, Thermo Fisher Scientific, USA) with 10% inactivated fetal calf serum (Byproducts, Mexico), OPI (SIGMA Aldrich, USA) and antibiotics ( Streptomycin / Penicillin, SIGMA Aldrich, USA) to generate antibodies in the supernatant and proceed to its subsequent characterization and purification.
  • ascites fluid was induced in vivo by inducing liquid tumors by intraperitoneal administration of the aforementioned monoclones in BALB / c mice that were previously stimulated with Pristane (Sigma Aldrich, USA). After a period of 15 to 20 days, the hybridomas were inoculated and within 8 to 10 days the ascitic fluid was milked and stored in freezing for later purification and characterization.
  • Monoclonal antibodies secreted by the hybridomas were separated from the culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification procedures such as affinity chromatography using Protein A-Sepharose (Pierce, Rockford IL USA). In the case of clones grown in culture medium, these were expanded in flat bottom bottles of 75 cm 2 . The supernatants were filtered, concentrated and dialyzed against PBS before being purified by affinity chromatography and eluted by pH change, using 100 mM acetic acid pH 3.0. All elution samples were received in 1 M Tris buffer pH 8.0 to be neutralized. Protein concentration was determined by DO280nm using the extinction coefficient of 1.43. The immunoglobulin purification process was verified by SDS-PAGE and ELISA.
  • Figure 5 shows the titration curve of the purified antibody 2F2E8E3B6 performed in triplicate, obtaining an EC 50 of 4.4 ng, while the 4D12R antibody has an EC 50 of 1,377 ⁇ g, so the 2F2E8E3B6 antibody turned out to have the best recognition by the domain CTLD-2.
  • the isotype of the monoclonal antibodies obtained was determined by sandwich ELISA using the hybridoma supernatants and the Mouse Typer Sub-lsotyping Kit commercial kit (BioRad CA, USA) following the manufacturer's instructions.
  • the antibodies of the 2F2 family have a heavy chain with the lgG2a isotype and a lambda type light chain, while the antibodies of the 4D12 family have a heavy chain with the lgG1 isotype and a kappa type light chain.
  • Multilectin domains are involved in the efficiency of antigen processing and presentation in vivo, an indirect way to evaluate this process is by measuring the internalization of anti-CTLD2 antibodies (SEQ ID NO: 1) by isolated dendritic cells of chicken spleen and by Jurkat cells.
  • SEQ ID NO: 1 10E6 cells were stimulated with LPS for 24 h, subsequently harvested, washed with PBS and resuspended in 100 microliters of 4% p-formaldehyde for 15 minutes at room temperature. After a second wash with PBS, they were resuspended in 100 microliters of the 1X permeabilization buffer (Biolegend, CA USA) for 20 minutes.
  • the cells were blocked with species-specific serum (1: 20 dilution) for 30 minutes at room temperature and washed with PBS, then incubated for 1 h with 26.7 ⁇ g / mL of the anti-CTLD2 antibody diluted in 1 mL of permeabilization buffer for its internalization.
  • the secondary antibody anti-mouse conjugated to Phycoerythrin
  • the cells were washed and incubated with the secondary antibody (1: 1000) for 1 h. After washing the cells in PBS, they were resuspended in 100 microliters of 4% p-formaldehyde.
  • Fig. 7 the intracellular detection of the DEC-205 receptor is shown in Jurkat cells permeabilized and stimulated with LPS using the murine monoclonal antibody 2F2E8E3B6 anti-CTLD-2 for its detection. Internalization of the DEC-205 receptor is carried out by stimulation with LPS up to 14% (Fig. 7B) compared to the control (3%) (Fig. 7A). This experiment was carried out in triplicate, where on average 13.5% of cells that present internalization of the antibodies were observed, which indicates that the phenomenon of internalization is carried out.
  • Avian influenza virus RNA type H5N2 was obtained from a collection of RNAs donated by Dr. R. Webster (St. Jude Hospital, Tenesse, USA).
  • H5 int R, H5 int F, H5R and H5F oligonucleotides (SEQ ID NO: 9, 10, 11 and 12, respectively) that flank the hemagglutinin gene (H5) were designed for amplification by RT-PCR.
  • the gene coding for Hemagglutinin H5 (SEQ ID NO: 8, reported in GenBank with accession number gb
  • This gene was subcloned into the vector pFAST-BacHTb (Invitrogen) that adds 6 contiguous histidines to the amino terminal region of hemagglutiinin H5 (His 6- H5) and allows its expression in insect cells.
  • pFAST-BacHTb Invitrogen
  • His 6- H5 hemagglutiinin H5
  • the plasmid pFAST Bac / H5 was obtained, it was transformed into DH10-bac cells, in which by double recombination a recombinant bacmid was obtained capable of being transfected into insect cells of the Sf9 (Spodoptera frugiperda) and H5 (Trichopulsia) lines ni) for subsequent expression and purification.
  • the infected cells were washed with PBS and collected by centrifugation 10 minutes at 10,000 rpm.
  • Cells were treated with the lysis buffer under native conditions (50 mM NaH 2 P0 4 , 300 mM NaCI, 10 mM imidazole, 1% Nonident P40 and protease inhibitor without EDTA) by incubating 10 min at 4 ° C.
  • the cleared lysate was subjected to purification using Ni-NTA-Agarose affinity chromatography (Qiagen, USA) and the protein of interest was eluted by competition using a concentration gradient of up to 200 mM imidazole. His 6- H5 protein was monitored by 10% SDS-PAGE and Western-blot ( Figure 8) in the latter case anti-Histidine antibodies were used (Pierce, Rockford, IL USA).
  • Hemagglutinin H5 (SEQ ID NO: 8) is shown in Fig. 8 using a Nickel-NTA-Agarose column (Qiagen, USA) and eluting by competition with increasing concentrations of imidazole. This process was monitored by Western Blot, using peroxidase-bound anti-histidine antibodies (Pierce, Rockford, IL) and developing with HRP Luminata Forte substrate (Millipore Corporation, Billerica).
  • Lane 1 Material not attached to the Nickel-Agarose column; Lane 2) Elution 1 with 50 mM imidazole; Lane 3) Elution 2 with 50 mM imidazole; Lane 4) Elution 1 with 100 mM imidazole; Lane 5) Elution 2 with 100 mM imidazole; Lane 6) Elution 1 with 150 mM imidazole; Lane 7) Elution 2 with 150 mM imidazole; Lane 8) Elution 1 with 200 mM imidazole. The molecular weights of 70 and 130 kDa are marked.
  • Hemagglutinin H5 (SEQ ID NO: 8) with a molecular weight of 70 kDa is obtained homogeneously with an elution with 150 mM imidazole, eliminating dimers and contaminants, which allows working with it for conjugation processes subsequent.
  • Anti-CTLD-2, 2F2E8D3B6 monoclonal antibodies in a concentration of 1 mg / mL were activated with a 20X molar excess of the SMCC crosslinker (succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC; Pierce, Rockford , IL USA) in PBS with 5 mM EDTA for 2 h at 4 ° C.
  • This crosslinker contains an NHS ester group and a maleimide group that allows covalent conjugation of molecules containing amino groups and sulfhydryl groups, respectively.
  • the samples were dialyzed against PBS to eliminate the free reagent, and the H5 recombinant protein, obtained in the previous example, was modified with 2-inminothiolane (Traut Reagent, Pierce, Rockford, IL USA) , which reacts with primary amines to add a sulfhydryl group
  • This modification was made by incubation for 1 hour at room temperature of the H5 protein at a concentration of 14.5 mg / mL in PBS pH 8.0 with 5 mM EDTA with a molar excess (10X) of the Traut reagent, which was prepared at a concentration of 2 mg / mL.
  • the sample was dialyzed against PBS to remove the free reagent.
  • the activated antibodies and the modified protein were incubated for 12 h at 4 ° C for covalent coupling.
  • the eggs of the immunized hens and those used as control were subjected to manual extraction of the yolk, ensuring the release of the membrane that covers it.
  • 15 mL of yolk were obtained for each sample.
  • the lipids present therein were then removed by means of aqueous-organic phase separation using the PBS-chloroform suspension (one volume of chloroform per three volumes of PBS pH 7.2).
  • the aqueous phase was recovered for subsequent precipitation with 50% saturation of ammonium sulfate, stirring at 4 ° C overnight.
  • the samples were centrifuged at 3000 xg for 20 minutes at 4 ° C to obtain the protein precipitate that was reconstituted in 15 mL of PBS pH 7.2.
  • A-Sepharose protein (Pierce Rockford, IL USA) was used for immunoprecipitation by incubating 1 h at room temperature. The immune complexes formed were washed thoroughly. The immunoprecipitates were eluted by boiling for 5 min in sample buffer with SDS. These were analyzed on a 10% SDS-PAGE gel under reducing conditions using molecular weight markers.
  • FIG. 10B shows the sequence alignment of the CTLD-2 segment of the lymphocyte antigen 75 (DEC-205) of Gallus gallus (NP_001032925.1) compared to the sequences of Homo sapiens (NP_002340.2) and pig (Sus scrofa ) (NP_001 171875.1), as well as its percentage of identity. It is observed that both domains have a 65% identity compared to the chicken (Gallus gallus) domain, this percentage is sufficient to establish the molecular recognition observed in immunoprecipitations.
  • Example 12 shows the sequence alignment of the CTLD-2 segment of the lymphocyte antigen 75 (DEC-205) of Gallus gallus (NP_001032925.1) compared to the sequences of Homo sapiens (NP_002340.2) and pig (Sus scrofa ) (NP_001 171875.1), as well as its percentage of identity. It is observed that both domains have a 65% identity compared to the chicken (Gallus gallus) domain, this percentage is sufficient to establish the
  • murine antibodies that specifically recognize the CTLD-2 domain of the DEC-205 receptor were purified by affinity chromatography with Protein A.
  • the purified antibodies were transferred to nitrocellulose membranes to determine the aminoterminal sequence. of the variable regions of the heavy and light chains by means of Edman degradation in a PPSQ-31A protein sequencer (Shimadzu, Kyoto, Japan). Once this sequence was obtained, the oligos of the aminoterminal regions were designed (SEQ ID NO.
  • the oligos used to amplify the carboxyterminal regions of the heavy and light chains were taken from the specific sites where the chains begin constants of both chains according to the previously obtained isotype, for the case of the kappa light chain the oligo (SEQ ID NO: 20) reported in Yuan et al, 2004; in the case of the lambda light chain, oligo (SEQ ID NO: 18) reported in Miller and Glasel, 1989 was used.
  • the oligo for the hinge region (SEQ ID NO: 23) of heavy chains was made according to the consensus sequence of the hinge regions.
  • the sequence of the heavy and light chain regions (VH and VL) of the antibodies from the 2F2 and 4D12R hybridomas were identified using the RNA of said hybridomas, which was purified using the "SV total RNA isolation" kit (Promega, Madison USA).
  • the cDNA was obtained by reverse transcription from RNA using the reverse transcriptase enzyme Expand (Roche Applied Science, Germany).
  • the variable regions were amplified by PCR, where the products were separated on a 1% agarose gel and purified with the QIAQuick gel extraction kit (Qiagen, USA).
  • variable regions of the heavy and light chain of the 2F2E8E3B6 antibody SEQ ID NO 13 and 15
  • of the 4D12R antibody SEQ ID NO 14 and 16
  • CDRs complementarity determining regions
  • Heavy chains have CDR1 H of amino acid 26 to 35, CDR2 H of amino acid 50 to 65 and CDR3 H of amino acid 99 to 103; the light chains present the CDR1
  • Boscardin SB Hafalla JC
  • Masilamani RF Kamphorst AO
  • Zebroski HA Rai U
  • Morrot A Zavala F
  • Steinman RM Nussenzweig RS
  • Nussenzweig MC Nussenzweig MC. 2006.
  • Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses. J Exp Med 203: 599-606.
  • the receiver DEC-205 expressed by dendritic cells and thymic epithelial cells is involved in antigen processing. Nature 375: 151-5.
  • the dendritic cell receptor for endocytosis can recycle and enhance antigen presentation via major histocompatibility complex class ll-positive lysosomal compartments. J Cell Biol 151: 673-84.
  • Patent "Human antibody variants that specifically recognize the toxin Cn2 from Centruroides noxius scorpion venom".
  • a single mutation in framework 2 of the heavy variable domain improves the properties of a diabody and a related single-chain antibody. J Mol Biol 423: 337-350.

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Abstract

La presente invención se refiere a la producción y caracterización de nuevos anticuerpos monoclonales murinos que reconocen al dominio CTLD-2 (SEQ ID NO: 1) del receptor celular DEC-205 de células dendríticas en pollos (Gallus gallus), puercos (Sus scrofa) y humanos (Homo sapiens). La invención también se relaciona con la capacidad de los nuevos anticuerpos de direccionar y modular la respuesta inmune a diferentes niveles en pollos (Gallos gallus), puercos (Sus scrofa), así como reconocer al receptor DEC-205 en células dendríticas y líneas celulares de origen humano. Además se describe brevemente la aplicación de esta invención en la obtención de una respuesta inmune humoral especifica en corto tiempo en contra de la Hemaglutinina H5 del virus de la gripe aviar H5N2.

Description

NUEVOS ANTICUERPOS MONOCLONALES CONTRA EL RECEPTOR DEC-205 DE
CÉLULAS DENDRÍTICAS DE POLLO
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a la producción y caracterización de nuevos anticuerpos monoclonales murinos que reconocen al dominio CTLD-2 (SEQ ID NO: 1 ) del receptor celular DEC-205 de células dendríticas en pollos {Gallus gallus), puercos (Sus scrofa) y humanos (Homo sapiens). Dicha invención se refiere a la producción de nuevos anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas elaborados por fusión de células de mieloma SP2 con células de bazo de ratones BALB/c inmunizados con el fragmento CTLD-2 (SEQ ID NO: 1 ) de origen aviar de dicho receptor. La invención también se relaciona con la capacidad de los nuevos anticuerpos de direccionar y modular importantemente la respuesta inmune a diferentes niveles en pollos (Gallus gallus), puercos (Sus scrofa), así como reconocer al receptor DEC-205 en células dendríticas y líneas celulares de origen humano. Además se describe brevemente la aplicación de esta invención en la obtención de una respuesta inmune humoral específica en corto tiempo en contra de la Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO:8) del virus de la gripe aviar H5N2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El sistema inmune cuenta con células muy especializadas para realizar distintos procesos, entre ellas, las células dendríticas (CD's) tienen la capacidad de estimular la respuesta primaria y secundaria de los linfocitos B y T, así como la respuesta de linfocitos T citotóxicos en ratones y linfocitos humanos (Cárter et al, 2006). Esta capacidad se debe a que las CD's son las células más especializadas en la presentación de antígenos, internalizando, procesando y presentando a estos en forma de péptidos unidos a las moléculas del complejo mayor de histocompatiblidad clase II (MHC-II). Su origen procede de las células progenitoras mieloides, las cuales son capaces de diferenciarse en células dendríticas inmaduras y finalmente en células dendríticas maduras a través de la expresión de varios marcadores de superficie. La función como presentador de antígeno de las células dendríticas ha sido relacionada con altos niveles en la expresión del receptor DEC-205, también llamado CD205 ó antígeno linfocitario 75, sobre todo en células dendríticas ubicadas en áreas de células T de órganos linfoides periféricos o secundarios (Jiang et al al., 1995; Kraal et al., 1986; Winter-Pack et al., 1995). Esto fue comprobado por la intemalización de anticuerpos anti-DEC-205 humanos por las células dendríticas (Bonifaz et al., 2002; Steinman and Banchereau, 2007; Steinman, 2008; Ueno et al., 2010). El receptor DEC-205 es un receptor endocítico con un largo dominio extracelular que contiene varios subdominios: un dominio rico en cisteína (RC), un dominio de fibronectina tipo II (FN) y 10 dominios contiguos de reconocimiento a carbohidratos (CRDs), también conocidos como dominios de lectinas tipo C (ó CTLDs por sus siglas en inglés) (Mahnke et al., 2000). Estos dominios multilectina intervienen en la eficiencia de procesamiento y presentación de antígenos in vivo (Hawiger et al., 2001 ). Entre otros ejemplos de receptores tipo lectinas C se encuentran Langerina, DC-SIGN, receptor de mañosa y receptor de fosfolipasa A2, los cuales también han sido implicados en el procesamiento y presentación de antígeno (Figdor et al., 2002; Idoyaga et al., 2008).
Cabe señalar que los experimentos pioneros que describen los procesos celulares del direccionamiento de un antígeno fueron realizados empleando al receptor DEC-205 humano; en donde la respuesta celular mediada por células T cambia dramáticamente cuando el estímulo de maduración de las células dendríticas es agregado al mismo tiempo que el direccionamiento del antígeno empleando un anticuerpo dirigido contra el receptor DEC-205 (Bonifaz et al., 2002; Hawiger et al., 2001 ). La proliferación de células T se incrementa en varios órdenes de magnitud cuando es comparada con un protocolo clásico de inmunización. También se ha observado que al dirigir los antígenos a las células dendríticas a través de DEC-205 se incrementa la estimulación de las células T cooperadoras (Th), lo cual permite o favorece la respuesta inmune humoral o producción de anticuerpos (Bonifaz et al, 2004; Boscardin et al, 2006). De hecho, el direccionamiento de antígenos utilizando a este marcador y a CD1 1 c han aumentado la cinética de producción de anticuerpos de alto título en los primeros 7 días posteriores a la inmunización (Wang et al., 2000; Cheong et al., 2010). Además, la presencia del receptor DEC-205 ha sido descrita en linajes distintos a las células dendríticas en humano, como en células B, células T, Células NK y monocitos (Kato et al., 2006); capilares del cerebro, estroma de médula ósea y epitelio cortical del timo; además se encuentran en otras especies de mamíferos como chimpancé, ratón y en otras especies no mamíferos (Kraal et al., 1986; Witmer-Pack et al., 1995), incluyendo pollo (Gallus gal I us).
Receptor OEC-205 de Gallus gallus
La secuencia genómica y proteica para el receptor DEC-205 de Gallus gallus está reportada en el European Nucleotide Archive (http://www.ebi . ac. uk/ena/, número de acceso AJ574899); en la base de datos ENSEMBL (http://www.ensennbl.org/), en el GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov, número de acceso NP_001032925.1 .), así como en el UniProtKB/TrEMBL donde tiene el número de acceso Q4LDF5. Estas bases reportan la presencia de 35 exones que tienen secuencia codificante, las cuales conforman los dominios del receptor DEC-205 de pollo, representados como N-CRD-FNII-CTLD1 -CTLD2- CTLD3-CTLD4-CTLD5-CTLD6-CTLD7-CTLD8-CTLD9-CTLD10-TMC, donde N es la región N-terminal, CRD representa al dominio rico en cisteínas, FNII representa el dominio tipo II de Fibronectina, CTLD1 a CTLD10 representa los diez "dominios lectina tipo C" y el TMC representa los dominios transmembrana y citoplásmico (Figura 1 ).
En los últimos años la investigación en torno a las células dendríticas está dirigida principalmente hacia la aplicación de nuevos procedimientos clínicos, en particular a la implementación de nuevas herramientas que aumenten la respuesta inmune en tiempos cortos. Anticuerpos
El uso de anticuerpos o inmunoglobulinas que reconozcan a los receptores de superficie de células dendríticas se debe a la capacidad de estas moléculas de interaccionar de manera específica y con alta afinidad con los inmunógenos contra los que son producidos. Los anticuerpos son glicoproteínas que comprenden dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras interconectadas por puentes disulfuro con una región de unión al antígeno. Las cadenas pesadas tiene una región variable (VH) y una región constante (CH), ésta última puede presentar de tres a cuatro dominios, los cuales intervienen directamente en la unión con células del sistema inmune o con el sistema del complemento (Padlan, 1994). Por otro lado, las cadenas ligeras comprenden una región variable (VL) y una región constante, la cual presenta un solo dominio CL. Las regiones variables (VH y VL) contienen el sitio de unión al antígeno; denominadas regiones de hípervariabilidad o regiones determinantes de complementariedad (CDR). Estas regiones están intercaladas con regiones más conservadas llamadas regiones marco o "framework" (FR).
Aquellos anticuerpos que muestran una alta especificidad de unión y afinidad por un epitope en particular son los anticuerpos monoclonales, los cuales son producidos por un hibridoma, generado por la fusión de células inmortalizadas (mielomas), las cuales no secretan inmunoglobulinas, y células B obtenidas del bazo de ratones inmunizados contra un antígeno, en donde está contenida la información de las cadenas pesada y ligera. Aunado a la tecnología de los anticuerpos monoclonales, en el estado del arte actual, se pueden conseguir los genes que codifican los dominios variables de todas las inmunogiobulinas posibles, por re-arreglos de las secuencias nucleotídicas. Esto se puede obtener a partir de los linfocitos de cualquier vertebrado, incluyendo los humanos. En realidad, actualmente se pueden seleccionar solamente los elementos variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos, los cuales se pueden unir por un péptido conector de tal manera a obtener un fragmento de cadena única de los anticuerpos, que son capaces de reconocer a los antígenos. Nuestro grupo ha podido preparar un banco de genes que expresan los fragmentos de cadena única, y mediante la técnica de despliegue en fagos filamentosos, se ha podido obtener anticuerpos que protegen en contra de toxinas del veneno de alacranes (Riaño-Umbarilla y col., 2005, ver también patente US 7,381 ,802 B2, Junio 3, 2008). Una idea subyacente a estos adelantos de la técnica y complementario de la presente invención, es conseguir fragmentos de cadena única de anticuerpos humanos, con la finalidad de aplicar el mismo principio que describimos aquí, en contra de posibles antígenos que causan problemas de salud en humanos (Rodríguez-Rodríguez y col. 2012). En otras palabras, obtener por Ingeniería Genética la variabilidad de cadenas únicas de anticuerpos humanos para posibles aplicaciones en el desarrollo de vacunas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura. 1 muestra de manera esquemática los diferentes dominios del receptor DEC- 205, el cual pertenece a la familia de lectinas tipo C. En la región amino-terminal (N) se encuentra el dominio rico en cisteínas (CRD), seguido de un dominio de fibronectina tipo II (FNII) y diez "dominios lectinas tipo C" (CTLD-1 a CTLD-10). En la región carboxilo- terminal se representa a los dominios transmembrana y citoplásmico (TMC).
Figura. 2 muestra el vector de expresión (pET22b) indicando varios loci presentes, así como la ubicación del gen CTLD-2. A: His-Tag; B: Codón de paro y C: Origen de F1. Figura. 3 muestra algunos de los pasos en el proceso de purificación del dominio CTLD- 2 en una electroforesis SDS en gel al 12%.
Figura. 4 A) muestra el título del suero policlonal de dos ratones inmunizados con el inmunógeno CTLD-2 recombinante comparado contra suero policlonal preinmune. En el eje de las abscisas se gráfica el logaritmo de la dilución y en el eje de las ordenadas se gráfica la absorbancia a 405 nm; (a): Suero preinmune, (b): Suero de Ratón 1 y (c) Suero de Ratón 2. B) muestra la gráfica de unión de los anticuerpos murinos anti-CTLD- 2 usando sobrenadante de los hibridomas obtenidos por medio de la técnica de ELISA indirecta. En el eje de las abscisas se colocan los diferentes hibridomas obtenidos y en el eje de las ordenadas se gráfica la absorbacia a 405 nm. C) muestra el reconocimiento de los anticuerpos monoclonales 2F2E8E3B4, 2F2E8E3B6, 4D12R Y 4D12F4 hacia el dominio CTLD-2 por ELISA indirecta. En el eje de las abscisas se colocan las diferentes monoclonas obtenidas y en el eje de las ordenadas se gráfica la absorbacia a 405 nm. Figura. 5 muestra el título del anticuerpo monoclonal 2F2E8E3B6 comparado contra sobrenadante de células SP2. En el eje de las abscisas se gráfica el logaritmo de la dilución y en el eje de las ordenadas se gráfica la absorbancia a 405 nm; (a): AbM 2F2E8E3B6 y (b): Sobrenadante de células SP2.
Figura. 6 muestra la inmunoprecipitación de células lisadas del bazo de pollo (Gallus gallus) utilizando los anticuerpos monoclonales murinos anti-CTLD-2. Se observa el inmunoaislamiento específico del receptor DEC-205 (205 kDa) presentes en células blancas de bazo de pollo en un gel SDS-PAGE al 10% bajo condiciones reductores comparados con un control negativo (carril izquierdo). También se observa el corrimiento electroforético de la cadena pesada (50 kDa) y ligera (25 kDa) del anticuerpo 2F2E8E3B6; Con: Control.
Figura. 7 muestra la internalización del receptor DEC-205 de pollo utilizando a los anticuerpos anti-CTLD-2 en la línea celular de linfocitos T (Jurkat) utilizando tinción intracelular analizada por citometría de flujo. 7A muestra el control y 7B muestra a las células después de 30 minutos de incubación con el anticuerpo anti-CTLD-2, en promedio se observa un porcentaje de 13.91 % de células que internalizan el blanco del anticuerpo. Co: cuenta y (a): Células PE.
Figura. 8 muestra el proceso de purificación de la Hemaglutinina H5 monitoreado por Western Blot.
Figura. 9 muestra los títulos de IgY hacia la Hemaglutina H5 aviar después de la inmunización intradérmica en dos gallinas. Las IgY's obtenidas de las yemas de los huevos a los 15, 18 y 21 días posteriores a la inmunización, se compara con IgY's de los huevos de gallinas control. En el eje de las abscisas se gráfica el logaritmo de la dilución y en el eje de las ordenadas se gráfica la absorbancia a 405 nm. G1 : gallina 1 ; G2: gallina 2; (a): Suero preinmune, (b): 15 días, (c): 18 días y (d): 21 días.
Figura. 10 A) muestra el reconocimiento del receptor linfocitario 75 (DEC-205) en especies diferentes a Gallus gallus, tales como Homo sapiens (humano) y Sus scrofa (cerdo) a través de inmunopreciptación utilizando el anticuerpo anti-CTLD2 2F2E8E3B6. B) muestra el alineamiento de secuencias del segmento CTLD-2 del antígeno linfocitario 75 de Gallus gallus (NP_001032925.1 ) comparado con las secuencias de Homo sapiens (NP_002340.2) y cerdo (Sus scrofa) (NP_001 171875.1 ), así como su porcentaje de identidad.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención provee nuevos anticuerpos monoclonales de origen murino capaces de reconocer al receptor DEC-205 de Gallus gallas, el cual presenta propiedades particulares y específicas a nivel inmunológico en células dendríticas. Así, los anticuerpos producidos tienen el potencial de ser usados en una variedad de procesos inmunológicos dirigidos, como intervenir en la capacidad de presentación de diferentes antígenos, inducir la respuesta de células T o aumentar la tasa de anticuerpos producidos contra una variedad de patógenos específicos de aves. Varios aspectos de la invención son descritos en detalle en las siguientes subsecciones:
Definiciones
Las expresiones "célula" y "cultivo de células" según se emplean aquí se usan como sinónimos y todas estas designaciones incluyen su progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas " incluyen la célula sujeto primario y cultivos derivados de ella sin considerar el número de transferencias. También se entiende que no toda progenie debe ser precisamente idéntica en su contenido de ADN debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye progenie muíante que tiene la misma función o actividad biológica como la detectada en la célula originalmente transformada. Cuando se intentan designaciones distintas, deben ser claras a partir del contexto.
El término "cantidad efectiva" o "cantidad farmacológicamente efectiva" de un compuesto en dosis unitaria de la mezcla depende de varios factores. Entre estos factores se incluyen cantidades de los otros ingredientes en caso de emplearse y tolerancia al ingrediente activo del compuesto.
"Vehículo farmacéuticamente aceptable" significa sólidos o líquidos de relleno, diluyente o sustancia que pueden usarse con seguridad en administración sistémica o tópica. Según la vía particular de administración son farmacéuticamente aceptables varios vehículos bien conocidos en la industria e incluyen sólidos o líquidos de relleno, diluyentes, hidrotropos, agentes tensoactivos y sustancias encapsulantes. La cantidad de vehículo empleada junto con los anticuerpos monoclonales suministra una cantidad manejable de material por dosis unitaria del compuesto.
Vehículos farmacéuticamente aceptables para administración sistémica que pueden incorporarse en la composición de la invención incluyen azúcar, féculas, celulosa, aceites vegetales, amortiguadores, polioles y ácido algínico. Vehículos específicos farmacéuticamente aceptables se describen en los siguientes documentos, todos mencionados aquí como referencia: U.S. 4,401 ,663, Buckwalter et ai., emitido en Agosto 30, 1983; European Patent Application No. 089710, LaHann et al., publicado Sept. 28, 1983; y European Patent Application No. 0068592, Buckwalter et al., publicado Enero. 5, 1983. Los vehículos preferidos para administración parenteral incluyen propilenglícol, pirrolidona, oleato etilo, etanol acuoso y combinaciones de estos.
Vehículos representativos incluyen acacia, agar, alginatos, hidroxíalquílcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, carragenina, celulosa en polvo, goma guar, colesterol, gelatina, goma agar, goma arábiga, goma karaya, goma ghatti, goma de frijol locust, octoxinol 9, alcohol oleil, pectina, ácido poliacrílico y sus homólogos, políetilenglicol, alcohol polivinílico, poliacrilamida, iauri! sulfato sódico, óxido polietilénico, polivinilpirrolidona, glicol monoestearato, propilenglícol monoestearato, goma xantana, tragacanto, ésteres sorbitan, alcohol esteárico, fécula y sus modificaciones. Los rangos adecuados varían desde 0.5% a 1 %.
1. Inmunógenos de DEC-205.
Utilizando modelado por homología (con los programas EsyPred3D y SWISS-MODEL Repository) de todos los dominios de DEC-205, tomando como molde estructuras de los dominios homólogos previamente reportados (www.pdb.org) se localizaron aquellos dominios con mayor exposición al disolvente, así como aquellos sitios que estuvieran involucrados en la unión a ligandos en la estructura de DEC-205 de pollo (Jiang, et al., 1995). Los dominios seleccionados para ser clonados y expresados en un sistema heterólogo fueron los siguientes:
1. Dominio rico en cistéínas (CRD, cystein rich-domain), ubicado en la región amino- terminal del lado extracelular del receptor DEC-205 (ver Figural)
2. Dominio de fibronectina tipo II (FN), ubicado la región amino-terminal del lado extracelular del receptor DEC-205 (ver Figural)
3. Dominio 2 similar a lectinas tipo C (CTLD-2, C-Type Lectin-Like Domain-2) ubicado en el lado extracelular del receptor DEC-205, involucrado en la unión a carbohidratos (Jiang, et al., 1995) (ver Figural)
Para llevar a cabo la clonación de estos fragmentos, se analizó los intrones y exones de los genes de cada uno de los dominios seleccionados, utilizando los programas Wise2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/Wise2/index.html) y Artemis (http://www.sanqer.ac.uk/resources/software/arterriis/). De los tres dominios seleccionados, solo el dominio CTLD-2 fue clonado y expresado satisfactoriamente en grandes cantidades. 2. Clonación y expresión del dominio CTLD-2
La presente invención abarca la producción recombinante del dominio CTLD-2 del receptor DEC-205 de Gallus gallus, dominio seleccionado como inmunógeno para generar anticuerpos monoclonales, por ser de más fácil acceso hacia moléculas extrañas pues se encuentra ubicado en la superficie extracelular del receptor DEC-205, y cuya clonación y expresión recombinante resultaron satisfactorias. Para tal efecto a partir de DNA genómicó obtenido de sangre periférica de un pollo sano se aislaron los exones de este dominio con los oligos específicos CTLD-E1 FNco, CTLD-E1 R, CTLD- E2F, CTLD-E2R, CTLD-E3F y CTLD-E3RHin (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, y 7, respectivamente), para después ser ensamblados, clonados en el vector pET-22b(+) (Figura 2) y transformados para su expresión recombinante en la cepa Rosetta II de E.coli. Posterior a su expresión se procedió a su purificación (Figura 3) y caracterización para ser utilizado como inmunógeno, según se detalla en ejemplo 1.
3. Inmunización de ratones BALB/c con el dominio CTLD-2 recombinante
La inmunización con el dominio CTLD-2 recombinante se realizó por vía intraperitoneal (IP) administrando a cinco ratones con concentraciones crecientes de antígeno (25, 50, 100, 150 y 200 microgramos) en adyuvante completo de Freund, en proporción 1 : 1 (100 μΙ volumen total), seguido cada diez días por inmunizaciones IP del antígeno mezclado de manera alternada con adyuvante incompleto o alúmina (proporción 1 : 1 ) (hasta un total de 5 inmunizaciones). La respuesta inmune fue monitoreada durante el protocolo de inmunización tomando muestras de suero murino obtenidas del plexo retro-orbital en la cuarta inmunización. Dichas muestras fueron analizadas por el método de ELISA indirecta (Figura 4 A), donde aquellos ratones con títulos altos de anticuerpos anti-DEC- 205 de pollo fueron utilizados para fusionarse con células de bazo inmortalizadas. Los ratones fueron reforzados vía IP con el antígeno, 1 o 2 días antes de sacrificar y remover el bazo.
4. Generación y producción de los anticuerpos que reconocen DEC-205
La presente invención abarca la generación de anticuerpos monoclonales murinos capaces de reconocer al receptor DEC-205 de Gallus gallus a través del dominio CTLD- 2 (SEQ ID NO:1). Los anticuerpos monoclonales que se unen a DEC-205 con alto reconocimiento incluyeron a los producidos por los hibridomas de la familia 4D 2 y 2F2 (Figura 4B), los cuales fueron producidos como lo muestra a detalle el ejemplo 2, de acuerdo a protocolos bien estandarizados (Kóhler y Milstein, 1975; Goding, 1986).
Después que los hibridomas son identificados como productores de los anticuerpos con la especificidad deseada, se procedió a la subclonación por dilución limitante y crecimiento en medio D-MEM en condiciones estándar (Goding, 1986). Donde cuatro monoclonas, 2F2E8E3B4, 2F2E8D3B6, 4D12R y 4D12F4 presentaron alto reconocimiento por el dominio CTLD-2, identificado por el método de ELISA indirecto (Figura 4C). El isotipo de los anticuerpos monoclonales obtenidos fue determinado por ELISA sandwich utilizando los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas y el kit comercial Mouse Typer Sub-lsotyping Kit (Bio Rad). Además, los hibridomas fueron cultivados in vivo induciendo tumores líquidos (ascitis) en varios ratones de la cepa BALB/c para producir cantidad suficiente de anticuerpos.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas fueron separados del fluido ascítico y del medio de cultivo por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, cromatografía de afinidad utilizando Proteína A-Sefarosa, como se ilustra en el ejemplo 3. Aquellos de los cuales se obtuvieron mejor rendimientos en el proceso de purificación fueron seleccionados para determinar su EC50 (Figura 5) y proceder a la secuenciación de las cadenas variables pesadas y ligeras de estos anticuerpos (Ejemplo 12).
5. Caracterización funcional de los anticuerpos monoclonales anti-DEC-205
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CTLD-2 se unen al receptor DEC- 205 expresado en células vivas de Gallus gallus y de otras especies, y si estos anticuerpos permiten que el receptor funcione en la internalización y en el procesamiento de antígenos, fueron utilizadas las técnicas de citometría de flujo e inmuprecipitación, como se ilustra en los ejemplos 5, 6 y 10. Por ejemplo, se utilizaron los lisados claros de células blancas previamente purificadas de diferentes órganos, y de varias líneas celulares, a los cuales se determinó la presencia del receptor DEC-205 por medio de la técnica de inmunoprecipitación; utilizando al anticuerpo monoclonal con mejor reconocimiento de la presente invención, 2F2E8E3B6, a concentraciones saturantes. Después de la incubación con el anticuerpo primario se realizó una segunda fase en la que se añadió resina de sefarosa-Proteína A (Pierce, Rockford IL, USA), éste complejo le confiere un carácter insoluble al anticuerpo una vez unido a la proteína A, logrando separar por centrifugación al anticuerpo con su blanco específico y analizar ésta interacción por SDS-PAGE. Ejemplo de esto, se muestra en las Figuras 6 y 10A, donde se observa la presencia de una banda de 205 kDa aproximadamente reconocida por los anticuerpos monoclonales producidos en este trabajo, indicando la presencia del receptor DEC-205 en las células de bazo de Gallus gallus, Sus scrofa y líneas celulares de Homo sapiens. Por otra parte, utilizando preparaciones celulares, en las que previamente se identificó la presencia del receptor DEC-205, y anticuerpos monoclonales de la familia 2F2 anti-CTLD-2 se analizó la internalización de dichos anticuerpos vía su blanco, a través de la determinación de la presencia de dichos anticuerpos ubicados intracelularmente utilizando citometría de flujo (Ejemplo 6, Figura 7). En el caso de los anticuerpos utilizados se observó su presencia en el interior de las células usadas, lo cual confirma el proceso de internalización.
6. Obtención de Hemaglutinina 5 del virus de la influenza aviar H5N2
En la presente invención se utilizó el RNA del virus de la influenza aviar tipo H5N2 a partir de una colección de RNAs donados por el Dr. R. Webster (St. Jude Hospital, Tenesse, USA), para aislar el gen que contiene a la Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO:8), principal determinante antigénico para desarrollar la patogénesis del virus de la influenza, clonarlo y expresarlo de manera heteróloga utilizando el sistema de baculovirus, el cual se describe en el ejemplo 7.
7. Conjugados moleculares con los anticuerpos monoclonales
La posibilidad de una obtener una variedad muy amplia de conjugados moleculares que se basan de manera general en un antígeno unido a anticuerpos monoclonales, de la presente invención, capaces de reconocer al receptor DEC-205 presente en células presentadoras de antígeno (CPA) de pollo. Esto permite un direccionamiento del antígeno a las CPAs para incrementar el procesamiento, presentación y respuesta inmune contra el antígeno, por ejemplo, la liberación de citocinas inmunoestimuladoras o el aumento en la respuesta humoral. Dichos anticuerpos anti-CTLD-2 pueden ser unidos a células o patógenos por medio de "linkers" químicos, o con cualquier otro método relacionado como los que describen Kruif et al., 2000 y Nizard et al., 1998. En el ejemplo 8 se describe el procedimiento utilizado de conjugación o acoplamiento. Brevemente, los anticuerpos monoclonales fueron activados con succinimidil-4-(N-maleimidometilo) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC; Pierce, Rockford, IL USA), el cual le adiciona grupos maleimido y ester a las proteínas que permiten la conjugación covalente con moléculas que contengan grupos sulfhifrilo o amino; mientras el antígeno utilizado, la proteína recombinante de Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO:8) del virus de la influenza aviar fue modificado con 2-inminotiolano (Traut, Pierce, Rockford, IL USA), reactivo que reacciona con aminas primarias para introducir grupos sulfhidrilo en estos sitios, generando sitios blancos de los anticuerpos modificados y llevar a cabo conjugación covalente, la cual es detallado en el ejemplo 8.
8. Análisis del efecto en la respuesta inmune en aves por la inmunización del conjugado molecular anticuerpos anti-DEC-205- hemaglutinina H5
Para llevar a cabo este análisis se inmunizaron dos gallinas ponedoras tipo Rhode Island Red, de 25 semanas de edad, con la mezcla del conjugado Ab 2F2E8D3B6- Hemaglutinina H5. Después se procedió a la purificación de IgY's a partir de la yema de huevo para determinar el título de los anticuerpos de pollo (IgY's) anti-Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO: 8) por medio de una ELISA indirecta (ver Ejemplo 9). De forma exitosa, las gallinas generaron anticuerpos capaces de reconocer a la proteína viral con títulos mayores comparados con el control a partir del día 15 (Figura 9), confirmando que los conjugados anticuerpos anti-CTLD-2-Hemaglutinina H5 de la presente invención tiene el potencial de ser utilizado para la generación de una respuesta inmune eficientemente rápida con la generación de anticuerpos protectores en contra de posibles infecciones virales.
9. Usos de la invención
La propuesta de la presente invención se extiende al uso veterinario, en específico hacia los pollos de engorda y gallinas ponedoras utilizando como modelo a la especie Gallus gallus, debido a que la movilización de estos especímenes desde las áreas productoras hacia las áreas consumidoras puede focalizar puntos de riesgo para la propagación de enfermedades contagiosas. Esta propuesta utiliza al receptor DEC-205 de Gallus gallus como modulador de la respuesta inmune ya que aquellas moléculas que reconozcan específicamente a las células dendríticas a través de este receptor, como anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína completa o alguno de sus dominios, tienen el potencial de direccionar la respuesta inmune a diferentes niveles, y producir una potente respuesta inmune hacia aquellos antígenos que sean unidos a estos anticuerpos; a través de conjugación química o por ingeniería genética. Así, se puede agilizar la respuesta inmune contra un sinnúmero de enfermedades infecciosas específicas de éstas aves.
Los conjugados moleculares de la presente invención tienen la capacidad de ser usados para tratar o prevenir una variedad de enfermedades y/o condiciones específicas de la . especie Gallus gallus y en animales en los que exista reactividad cruzada en el reconocimiento por dicho receptor. Los conjugados antígeno viraS-anticuerpo pueden ser usados para la prevención de enfermedades virales, tales como la viruela aviar, New castle, coronavirus, enterovirus, entre otros. Así mismo, conjugados antígeno bacteriano- anticuerpo pueden ser usados para la prevención de enfermedades bacterianas como el cólera aviar o la coriza infecciosa. Por ejemplo, utilizando la proteína Cp39 de Pasteurella multocida, para el caso del cólera aviar (Sthitmatee, et al., 2008) o la proteína de la membrana externa HMTp210 (210 kDa) de Avibacterium paragallinarum que produce la coriza infecciosa (Sakamoto et al. , 2012). De igual forma, algunos agentes virales causantes de cáncer en ésta especie pueden ser usados como antígenos para realizar los conjugados, por ejemplo, la proteína gp85 del virus de la leucosis aviar subgrupo J (Sun, et al., 2012).
Entre estas enfermedades, la influenza aviar altamente patógena afecta gravemente a los avicultores en todos los lugares donde se presenta, siempre con la posibilidad de una pandemia, la cual sería devastadora tanto para la economía como para la población.
Como un ejemplo reciente, en el año 2012 hubo un brote de influenza aviar en nuestro país, que ocasionó pérdidas económicas importantes en la avicultura mexicana. En la presente invención se utilizó a la Hemaglutinina H5, principal determinante antigénico del virus de la influenza aviar tipo H5N2, como antígeno que es direccionado por los nuevos anticuerpos de la presente invención producidos contra el dominio 2 de lectinas tipo C de
DEC205 (anti-CTLD-2) al ser conjugado a estos.
Para el uso en terapia, los conjugados de la presente invención pueden administrarse a los individuos indirectamente, por ejemplo, cultivando o incubando previamente los conjugados con células presentadoras de antígeno, tal como las células dendríticas y después administrarse a los individuos (ex vivo) (Gunzer y Grabbe, 2001 ; Steinman, 1996; Tacken et al. , 2006; Tacken et al., 2007). En todos los casos, los conjugados son administrados en cantidad efectiva para llevar a cabo su efecto terapéutico deseado, por ejemplo, eliminar la infección bacteriana, viral o fúngica. La cantidad efectiva para cada aplicación particular puede variar dependiendo del tipo de enfermedad o de la condición a ser tratada. Las rutas preferentes de administración de los conjugados, incluyen, por ejemplo, la inyección subcutánea o intraperitoneal o inclusive, la vía oral, si fuera necesario. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan a modo de ilustrar algunos de los métodos para obtener o utilizar la presente invención. Es posible llevar a cabo muchas variaciones de los mismos sin salirse del alcance de la presente invención y por lo tanto de ninguna manera deberá considerarse que la limitan de alguna forma.
Ejemplo 1
Clonación, expresión y purificación del dominio CTLD-2 (SEQ ID NO: 1)
La secuencia de aminoácidos del receptor celular DEC-205 de Gallus galius está reportada en el GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con el número de acceso NP_001032925.1. En la lista de secuencias el dominio CTLD-2 que fue clonado se presenta como la SEQ ID NO: 1 , el cual se obtuvo a partir de DNA genómico de sangre periférica de un pollo sano utilizando oligos específicos CTLD-E1 FNco, CTLD-E1 R, CTLD-E2F, CTLD-E2R, CTLD-E3F y CTLD-E3RHin (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente) para obtener los tres exones que lo conforman, los cuales fueron ensamblados, clonados y transformados para su expresión recombinante en la cepa Rosetta-ll de E.coli. En la Fig. 2 se muestra a detalle el sitio de clonación de CTLD-2 dentro del vector de expresión pET22b(+), el cual está flanqueado por la secuencia pelB en la región aminoterminal, la cual direcciona la proteína recombinante hacia el periplasma bacteriano, además de una secuencia contigua de seis histidinas en la región carboxiloterminal, utilizada para su purificación, y al final se anexa un codón de paro. Este sistema fue el óptimo para la expresión en cuerpos de inclusión de proteína CTLD-2 (SEQ ID NO: 1 ) recombinante, después de ser inducido con IPTG a una concentración final de 0.2 mM una vez alcanzado una D06oonm de 0.7. Después de 12 horas de inducción se obtuvo el precipitado celular, el cual fue solubilizado en condiciones desnaturalizantes (amortiguador de Fosfatos-TrisHCI pH 8.0 y urea 8M), sonicado y centrifugado. La fracción soluble conteniendo la proteína de interés fue purificada por cromatografía de afinidad utilizando una columna de Niquel-NTA-Agarosa (Qiagen, USA), siendo eluída por cambio de pH. En la Fig. 3 se muestra algunos de los pasos en el proceso de purificación del dominio CTLD-2 por cromatografía de afinidad (SEQ ID NO: 1 ) en una electroforesis SDS-PAGE al 12%, teñido con coomassie coloidal. Carriles: 1) Precipitado solubilizado en amortiguador de Fosfatos-Tris HCI pH 8.0 y 8 urea; 2) primer lavado con 4M de urea; 3) con 2M Urea; 4) con 0.2M urea; 5) lavado con 25 mM de imidazol, 6) Elución 1 con 250 mM de Imidazol, 7) elución 2 con 250 mM de imidazol; 8) elución pH 5.9; 9) elución a pH 4.5; 10) marcadores de peso molecular (Prestained Protein Marker Broad Range, New England, Biolabs). Posteriormente, la muestras eluídas por cambio de pH 4.5 fueron reducidas con DTT (Sigma Aldrich, USA) 100 mM por 1 hora a 52 °C, para un segundo paso de purificación por HPLC fase- reversa, utilizando una columna (Vydac, USA) Ci8 preparativa en un aparato Waters 600E equipado con un detector de absorbancia dentro del espectro luz ultravioleta (UV) Waters 486 y un graficador Waters 745B, con un gradiente lineal de 20 a 70% de acetonitrilo en presencia de 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA) a un flujo de 1.60 mL/min, durante 50 minutos, en donde el pico de CTLD-2 se obtiene en un tiempo de retención de 33.74. Este material, sometido a análisis de espectrometría de masas, demostró estar homogéneo y tener un peso molecular de 21229 Da, lo que indica que el dominio se encuentra unido al péptido señal de acuerdo a la construcción mostrada en la Figura 2. La concentración de la proteína CTLD-2 (SEQ ID NO: 1) fue determinada a través del coeficiente de extinción molar estimado teóricamente con el servidor ProtParam (http://ca.expasy.org/tools/protparam.html). Siguiendo este protocolo de purificación se obtuvo un rendimiento de 1.0 mg de proteína al 98% de pureza por litro de cultivo.
Ejemplo 2
Generación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales murinos hacia DEC-205.
Con el objetivo de generar hibridomas productores de anticuerpos monoclonales hacia DEC-205 de Gallus gallus, cinco ratones fueron inmunizados por vía intraperitoneal con el dominio CTLD-2 (SEQ ID NO: 1 ) en concentraciones crecientes de antígeno (25, 50, 100, 150 y 200 microgramos) en adyuvante completo de Freund, en proporción 1 :1 , seguido cada diez días por inmunizaciones IP del antígeno mezclado de manera alternada con adyuvante incompleto o alúmina (proporción 1 : 1 ) (hasta un total de 5 inmunizaciones). Después de la última inmunización, los esplenocitos murinos fueron aislados y fusionados en presencia de 50% PEG (w/v) a una línea celular inmortal, en este caso la línea celular de mieloma de ratón SP2. Las células fusionadas fueron colocadas en placas de 96 pozos e incubadas a 37 °C en 5% de C02 en en 100 μΙ medio selectivo HAT (Sigma Aldrich, USA) a las 48 h se agregó 100 μΙ de medio HT con el fin de reducir la concentración de aminopterina con respecto al volumen de cultivo; a los diez días de cultivo se observaron los pozos donde había crecimiento de hibridomas y se reemplazó por el medio selectivo HT (Sigma Aldrich, USA). Una vez verificado el crecimiento extenso de los hibridomas, se realizó una prueba tomando 100 μΙ del medio de cultivo y se procedió a la evaluación en la producción de anticuerpos IgG murinos específicos contra el dominio CTLD-2 mediante la técnica de ELISA indirecta. Los resultados son mostrados en la Fig.4A, la cual muestra los ocho hibridomas con mejor reconocimiento por ELISA hacia el dominio CTLD-2 (SEQ ID NO: 1 ); de éstos, los anticuerpos murinos producidos por los hibridomas 2F2 y 4D12 son los que mostraron el mayor nivel de reconocimiento por ELISA indirecta.
Aquellos hibridomas secretores de anticuerpos (2F2 y 4D12) fueron expandidos, re- evaluados y subclonados al menos tres o cuatro veces por dilución limitante. Los resultados son mostrados en la Fig. 4B, la cual muestra que las monoclonas 2F2E8E3B4, 2F2E8D3B6, 4D12R y 4D12F4 presentan los mayores niveles de unión por el antígeno CTLD-2 (SEQ ID NO: 1 ) por ELISA indirecta.
Ejemplo 3
Producción y purificación de anticuerpos monoclonales murinos anti-DEC-205. Las monoclonas 2F2E8E3B4, 2F2E8D3B6, 4D12R y 4D12F4 fueron cultivadas in vitro en medio DMEM (Hyclone Laboratories, Thermo Fisher Scientific, USA) con 10% de suero fetal bovino inactivado (Byproducts, México), OPI (SIGMA Aldrich, USA) y antibióticos (Streptomicina/Penicilina, SIGMA Aldrich, USA) para generar anticuerpos en el sobrenadante y proceder a su posterior caracterización y purificación. De igual forma, se procedió a la inducción in vivo de fluido ascítico al inducir tumores líquidos por medio de la administración intraperitoneal de las monoclonas antes mencionadas en ratones BALB/c que fueron estimulados previamente con Pristano (Sigma Aldrich, USA). Después de un periodo de 15 a 20 días se inocularon los hibridomas y entre 8 a 10 días después se ordeñó el fluido ascítico y se guardó en congelación para su posterior purificación y caracterización.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los hibridomas fueron separados del medio de cultivo o fluido ascítico por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, cromatografía de afinidad utilizando Proteína A-Sefarosa (Pierce, Rockford IL USA). En el caso de las clonas crecidas en medio de cultivo, éstas fueron expandidas en botellas de fondo plano de 75 cm2. Los sobrenadantes fueron filtrados, concentrados y dializados contra PBS antes de ser purificados por cromatografía por afinidad y eluídos por cambio de pH, utlizando ácido acético 100 mM pH 3.0. Todas las muestras de elución fueron recibidas en amortiguador Tris 1 M pH 8.0 para ser neutralizadas. La concentración de proteína se determinó por DO280nm usando el coeficiente de extinción de 1.43. El proceso de purificación de las inmunoglobulinas fue verificado por SDS-PAGE y ELISA.
Ejemplo 4
Caracterización de los anticuerpos monoclonales hacia DEC-205 por ELISA indirecta
En placas de 96 pozos de poliestireno de alta unión se colocaron 100 μΙ/ροζο del antígeno CTLD-2 recombinante (SEQ ID NO: 1 ) expresado como en el ejemplo 1 , a una concentración de 3 μg/rríL· en amortiguador de carbonatos 50 mM y se incubaron toda la noche a 4 °C. La placas fueron bloqueadas con albúmina sérica bovina al 5% en Tris 50 mM pH 8.0 adicionado con Tween 20 al 0.2% durante 1 hr a 37 °C. Después de lavar tres veces con solución de lavado (Tris 50 mM pH 8, NaCI 150 mM, 0.05 % Tween), se incubaron a 37 °C por 1 h con diluciones seriadas de los anticuerpos monoclonales producidos y purificados como en el ejemplo 3. Después de repetir la operación de lavado, se procedió a la incubación por 1 h a 37 °C con el anticuerpo secundario de cabra anti-ratón acoplado a HRP (1 :5000, Zymed Laboratories Inc). Se utilizó el sustrato ABTS (2.2'-azino-di(3~etil~benzotiazolin)sulfonato)(Roche Applied Science, Germany) en el proceso de revelado. La lectura en unidades de absorbancia se llevó a cabo a 405 nm en el lector de ELISA Tecan Spectra. Se utilizó sobrenadante del cultivo celular Sp2 como control negativo. En la Figura 5 se muestra la curva de titulación del anticuerpo purificado 2F2E8E3B6 realizada por triplicado, obteniendo un EC50 de 4.4 ng, mientras que el anticuerpo 4D12R presenta un EC50 de 1.377 μg, por lo que el anticuerpo 2F2E8E3B6 resultó tener el mejor reconocimiento por el dominio CTLD-2.
El isotipo de los anticuerpos monoclonales obtenidos fue determinado por ELISA sandwich utilizando los sobrenadantes de los hibridomas y el estuche comercial Mouse Typer Sub-lsotyping Kit (BioRad CA, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos de la familia 2F2 presentan una cadena pesada con el isotipo lgG2a y una cadena ligera tipo lambda, mientras que los anticuerpos de la familia 4D12 presentan una cadena pesada con el isotipo lgG1 y una cadena ligera tipo kappa.
Ejemplo 5
Inmunoprecipitación con anticuerpos anti-CTLD-2
Células blancas del bazo de pollos (Gallus gallus) de 4 semanas de vida, fueron estimuladas con lipopolisacárido (LPS, SIGMA Aldrich USA) 200 ng/mL, por 24 h y después lisadas en buffer de inmunoprecipitación (PBS pH 7.4, 1 % Tritón X-100 con inhibidor de proteasas). El sobrenadante de este lisado fue incubado con los anticuerpos monoclonales 2F2 anti-DEC-205 por 16 h a 4°C en agitación. Posteriormente, 30 μί_ de proteína A-Sefarosa (Pierce Rockford, I L USA) fue usada para la inmunoprecipitación incubándose 1 h a temperatura ambiente. Los complejos inmunes formados fueron lavados exhaustivamente con PBS-Tween 0.1 %. Los inmunoprecipitados fueron eluídos por ebullición por 5 min en buffer de muestra con SDS. Los resultados son mostrados en la Figura 6, donde se observa el inmunoaislamiento específico del receptor DEC-205 (205 kDa) de células presentes en el bazo de pollos en un gel SDS-PAGE al 10% bajo condiciones reductoras, también se observan la cadena pesada (50 kDa) y ligera (25 kDa) del anticuerpo 2F2E8E3B6 con el cual se realizó la inmunoprecipitación. Los pesos moleculares son señalados. Este resultado indica que los anticuerpos generados en esta invención reconocen al receptor DEC-205 presente en células de bazo de pollo (Gallus gallus) a partir del reconocimiento del dominio CTLD-2 (SEQ ID NO: 1). Ejemplo 6
Ensayo de internalización
Los dominios multilectina intervienen en la eficiencia del procesamiento y presentación de antígeno in vivo, una forma indirecta de evaluar este proceso es midiendo la internalización de anticuerpos anti-CTLD2 (SEQ ID NO: 1) por las células dendríticas aisladas de bazo de pollos y por células Jurkat. De manera general, 1 x10E6 células fueron estimuladas con LPS por 24 h, posteriormente fueron cosechadas, lavadas con PBS y resuspendidas en 100 microlitros de p-formaldehido al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de un segundo lavado con PBS, se resuspendieron en 100 microlitros del buffer de permeabilización 1X (Biolegend, CA USA) por 20 minutos. Las células fueron bloqueadas con suero especie-específico (dilución 1 :20) por 30 minutos a temperatura ambiente y lavadas con PBS, después fueron incubadas por 1 h con 26.7 μg/mL del anticuerpo anti-CTLD2 diluido en 1 mL de buffer de permeabilización para su internalización. Como control negativo se utilizó el anticuerpo secundario (antiratón conjugado a Ficoeritrina). Las células fueron lavadas e incubadas con el anticuerpo secundario (1 :1000) durante 1 h. Después de lavar las células en PBS, éstas fueron resuspendidas en 100 microlitros de p-formaldehido al 4%. Un total de 10,000 células para cada condición, realizadas por triplicado, fueron analizadas en un FACSort (Becton- Dickinson, USA) usando el software FlowJo. En la Fig. 7, se muestra la detección intracelular del receptor DEC-205 en células Jurkat permeabilizadas y estimuladas con LPS utilizando al anticuerpo monoclonal murino 2F2E8E3B6 anti-CTLD-2 para su detección. La internalización del receptor DEC-205 se lleva a cabo por la estimulación con LPS hasta en 14% (Fig. 7B) comparadas con el control (3%) (Fig. 7A). Este experimento se realizó por triplicado, donde en promedio se observó un 13.5% de células que presentan internalización de los anticuerpos, lo cual indica que el fenómeno de internalización se lleva a cabo.
Ejemplo 7
Clonación, expresión y purificación de hemaglutinina H5
Se obtuvo RNA del virus de influenza aviar tipo H5N2 de una colección de RNAs donados por el Dr. R. Webster (St. Jude Hospital, Tenesse, USA). Se diseñaron oligonucleótidos H5 int R, H5 int F, H5R y H5F, (SEQ ID NO: 9, 10, 11 y 12, respectivamente) que flanquean al gene de la hemaglutinina (H5) para su amplificación por RT- PCR. El gen que codifica para la Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO: 8, reportada en el GenBank con el número de acceso gb|ABB88379.1 ) fue clonado en el vector de amplificación topo-TA (Invitrogen), el cual fue secuenciado para confirmar el origen viral de la hemaglutinina y su correcta amplificación. Dicho gen fue subclonado en el vector pFAST-BacHTb (Invitrogen) que agrega 6 histidinas contiguas a la región amino terminal de la hemaglutiinina H5 (His6-H5) y permite su expresión en células de insecto. Una vez obtenido el plásmido pFAST Bac/H5, este fue transformado en células DH10-bac, en las que por doble recombinación se obtuvo un bácmido recombinante capaz de ser transfectado en células de insecto de las líneas Sf9 (Spodoptera frugiperda) y H5 (Trichopulsia ni) para su posterior expresión y purificación. Después de una infección de 24, 48 y 72 horas, las células infectadas se lavaron con PBS y se colectaron por centrifugación 10 minutos a 10,000 rpm. Las células se trataron con el buffer de lisis en condiciones nativas (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCI, 10 mM ímidazol, 1 % de Nonident P40 e inhibidor de proteasas sin EDTA) incubándose 10 min a 4°C. Después de centrifugar, el lisado clareado, se sometió a purificación utilizando cromatografía de afinidad Ni-NTA-Agarosa (Qiagen, USA) y la proteína de interés fue eluída por competencia utilizando un gradiente de concentración de hasta 200 mM de imidazol. La proteína His6-H5 fue monitoreada por SDS-PAGE 10% y Western-blot (Figura 8) en este último caso se utilizaron anticuerpos anti-Histidinas (Pierce, Rockford, IL USA).
En la Fig, 8 se muestra el proceso de purificación de la Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO: 8) utilizando una columna de Niquel-NTA-Agarosa (Qiagen, USA) y eluyendo por competencia con concentraciones crecientes de imidazol. Este proceso fue monitoreado por Western Blot, utilizando anticuerpos anti-histidinas unidos a peroxidasa (Pierce, Rockford, IL) y revelando con sustrato HRP Luminata Forte (Millipore Corporation, Billerica). Carril 1) Material no pegado a la columna de Niquel-Agarosa; Carril 2) Elución 1 con 50 mM de imidazol; Carril 3) Elución 2 con 50 mM de imidazol; Carril 4) Elución 1 con 100 mM de imidazol; Carril 5) Elución 2 con 100 mM de imidazol; Carril 6) Elución 1 con 150 mM de imidazol; Carril 7) Elución 2 con 150 mM de imidazol; Carril 8) Elución 1 con 200 mM de imidazol. Se marcan los pesos moleculares de 70 y 130 kDa. Se puede observar que la Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO: 8) con un peso molecular de 70 kDa se obtiene a homogeneidad con una elución con 150 mM de imidazol, eliminando dímeros y contaminantes, lo cual permite trabajar con ella para los procesos de conjugación subsecuentes.
Ejemplo 8
Conjugación química de la hemaglutinina H5 (SEQ ID NO: 8) del virus de influenza aviar con los anticuerpos monoclonales anti-DEC-205
Los anticuerpos monoclonales anti-CTLD-2, 2F2E8D3B6, en concentración de 1 mg/mL fueron activados con un exceso molar de 20X del entrecruzador SMCC (succinimidil-4- (N-maleimidometilo) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC; Pierce, Rockford, IL USA) en PBS con 5 mM de EDTA durante 2 h a 4 °C. Este entrecruzador contiene un grupo ester NHS y un grupo maleimido que permite la conjugación covalente de las moléculas que contienen grupos amino y grupos sulfhidrilo, respectivamente. Después de la activación, las muestras se dializaron contra PBS para eliminar el reactivo que haya quedado libre. Por otro lado, la proteína recombinante H5, obtenida en el ejemplo anterior, fue modificada con 2-inminotiolano (Reactivo de Traut, Pierce, Rockford, IL USA), el cual reacciona con aminas primarias para adicionarle un grupo sulfhidrilo. Esta modificación se realizó por incubación durante 1 hora a temperatura ambiente de la proteína H5 a una concentración de 14.5 mg/mL en PBS pH 8.0 con 5 mM EDTA con un exceso molar (10X) del reactivo de Traut, el cual se preparó a una concentración de 2 mg/mL. Después de la modificación la muestra fue dializada contra PBS para eliminar el reactivo que haya quedado libre. Los anticuerpos activados y la proteína modificada fueron incubados por 12 h a 4°C para su acoplamiento covalente.
Ejemplo 9
Inmunización de gallinas con los complejos anticuerpo-antígeno (anticuerpos anti- DEC-205- hemaglutinina H5)
Se inmunizaron dos gallinas ponedoras tipo Rhode Island Red, de 25 semanas de edad, con el conjugado Ab 2F2E8D3B6-Hemaglutinina H5 administrada junto con lipopolisacáridos (LPS) (S!GMA Aldrich, USA) en relación 2:1. La inmunización fue una dosis única de aproximadamente 100 de conjugado por cada gallina, en un volumen de 200 microlitros administrada por vía intradérmica. Se colectaron los huevos pre- inmunización (antes de la inmunización) y durante la inmunización (por un periodo de 25 días) procurando mantenerlos a 4 °C hasta su procesamiento. Se procedió a la purificación de IgY's a partir de la yema de huevo para determinar el título de los anticuerpos de pollo anti-CTLD-2 por el método de ELISA Indirecta.
Ejemplo 10
Extracción, purificación de los anticuerpos IgY y determinación del efecto como moduladores de la respuesta inmune en pollos de los conjugados anticuerpo- antígeno (anticuerpos anti-DEC-205- hemaglutinina H5).
Los huevos de las gallinas inmunizadas y aquellos utilizados como control fueron sometidos a extracción manual de la yema, procurando la liberación de la membrana que la recubre. En general se obtuvieron 15 mL de yema por cada muestra. Después se procedió a la remoción de los lípidos presentes en ésta por medio de separación de fases acuosa-orgánica utilizando la suspensión PBS-cloroformo (un volumen de cloroformo por tres volúmenes de PBS pH 7.2). La fase acuosa fue recuperada para su posterior precipitación con sulfato de amonio al 50% de saturación, manteniendo en agitación y a 4°C toda la noche. Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a 3000 x g durante 20 minutos a 4 °C para obtener el precipitado proteico que fue reconstituido en 15 mL de PBS pH 7.2. Este material se precipitó nuevamente con sulfato de amonio al 30% de saturación, después del proceso de centrifugación y resuspensión, todas las muestras fueron sometidas a diálisis contra PBS pH 7.2 realizando varios cambios de amortiguador durante 24 h. La concentración de las proteínas extraídas de la yema de huevo fue determinada por absorbancia a 280 nm. Se procedió a realizar titulación de los anticuerpos de pollo anti-Hemaglutinina H5 por el método de ELISA indirecta utilizando 0.3 μg/pozo de antígeno H5 (SEQ ID NO: 8) y anticuerpo secundario anti-pollo unido a peroxidasa (Dilución 1:2500, Pierce, Rockford.IL) Los resultados son mostrados en la Fig. 9, la cual señala los títulos de IgY que reconocen a la Hemaglutinina H5 (SEQ ID NO: 8) del virus de la influenza aviar en las dos gallinas inmunizadas, a los días 15, 18 y 21 días pos-inmunización. De forma exitosa, las gallinas generaron anticuerpos capaces de reconocer a la proteína viral con títulos mayores comparados con el control a partir del día 15 (títulos por arriba de 2500), utilizando una sola inmunización, confirmando que los conjugados anticuerpo anti-CTLD-2- hemaglutinina H5 de la presente invención tiene el potencial de ser utilizados como reguladores de la respuesta inmune en pollo (Gallus gallus) para prevenir posibles infecciones virales. Estos resultados son comparados con esquemas de inmunización normales en pollos, donde de manera general se empiezan a obtener títulos mayores a 2000 a partir de la quinta semana de inmunización y después de varios refuerzos (Wen, et al., 2012).
Ejemplo 11
Reconocimiento del dominio CTLD2 de DEC 205 en otras especies
Con el objetivo de analizar si los anticuerpos producidos reconocen el receptor DEC-205 de otras especies, se realizaron pruebas de inmunoprecipitación en especies diferentes a pollo {Gallus gallus). Por lo que células Jurkat (línea celular de linfocitos T humanos), así como células blancas obtenidas del bazo de diferentes animales (cerdo y perro) fueron lisadas en buffer de inmunoprecipitación (PBS pH 7.4, 1 % Tritón X-100 con inhibidor de proteasas). El sobrenadante de estos lisados fue incubado con los anticuerpos monoclonales anti-DEC-205 por 16 h a 4 C en agitación. Posteriormente, 50 uL de proteína A-Sefarosa (Pierce Rockford, IL USA) fue usada para la inmunoprecipitación incubándose 1 h a temperatura ambiente. Los complejos inmunes formados fueron lavados exhaustivamente. Los inmunoprecipitados fueron eluídos por ebullición por 5 min en buffer de muestra con SDS. Estos fueron analizados en un gel SDS-PAGE al 10% bajo condiciones reductoras utilizando marcadores de peso molecular. Los resultados son mostrados en la Figura 10A, donde se observa el inmunoaislamiento específico del receptor DEC-205 (205 kDa) presentes en células Jurkat (linea inmortalizada de linfocitos T) de Homo sapiens y células blancas de bazo de puerco (Sus strofa) en un gel SDS-PAGE al 10% bajo condiciones reductoras, (esto no se observó al utilizar las células de bazo de perro). También se observan la cadena pesada (50 kDa) y ligera (25 kDa) del anticuerpo 2F2E8E3B6 con el cual se realizó la inmunoprecipitación. Los pesos moleculares son señalados. En la Fig. 10B se muestra el alineamiento de secuencias del segmento CTLD-2 del antígeno linfocitario 75 (DEC-205) de Gallus gallus (NP_001032925.1 ) comparado con las secuencias de Homo sapiens (NP_002340.2) y cerdo (Sus scrofa) (NP_001 171875.1 ), así como su porcentaje de identidad. Se observa que ambos dominios presentan un 65% de identidad comparados con el dominio de pollo (Gallus gallus), este porcentaje es suficiente para establecer el reconocimiento molecular observado en las inmunoprecipitaciones. Ejemplo 12
Secuenciación de las regiones variables de los anticuerpos anti-DEC205
Como se describió en el ejemplo 3, los anticuerpos murinos que reconocen de manera específica al dominio CTLD-2 del receptor DEC-205 fueron purificados mediante cromatografía de afinidad con Proteína A. Los anticuerpos purificados fueron transferidos a membranas de nitrocelulosa para determinar la secuencia aminoterminal de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera por medio de degradación de Edman en un secuenciador de proteínas PPSQ-31A (Shimadzu, Kyoto, Japón). Una vez obtenida dicha secuencia se diseñaron los oligos de las regiones aminoterminales (SEQ ID NO. 17, 19, 21 y 22) Los oligos utilizados para amplificar las regiones carboxiterminales de las cadenas pesadas y ligeras se tomaron de los sitios específicos donde comienzan las cadenas constantes de ambas cadenas de acuerdo al isotipo previamente obtenido, para el caso de la cadena ligera kappa se utilizó el oligo (SEQ ID NO: 20) reportado en Yuan et al, 2004; para el caso de la cadena ligera lambda se utilizó el oligo (SEQ ID NO: 18) reportado en Miller y Glasel, 1989. El oligo para la región bisagra (SEQ ID NO: 23) de las cadenas pesadas fue realizado de acuerdo a la secuencia consenso de las regiones bisagra.
La secuencia de las regiones de las cadena pesada y ligera (VH yVL) de los anticuerpos provenientes de los hibridomas 2F2 y 4D12R fueron identificados usando el RNA de dichos hibridomas, el cual fue purificado utilizando el kit "SV total RNA isolation" (Promega, Madison USA). El cDNA fue obtenido por transcripción reversa a partir del RNA utilizando la enzima transcriptasa reversa Expand (Roche Applied Science, Germany). Las regiones variables fueron amplificadas por PCR, donde los productos fueron separados en un gel de agarosa al 1 % y purificados con el kit de extracción de geles QIAQuick (Qiagen, USA). Estos productos fueron ligados utilizando la enzima T4 DNA Ligasa (Fermentas, Cánada) y clonados en el vector de clonación pBlueScriptks(-) (previamente digerido con la enzima EcoRV, Stratagene, USA). El producto de ligación fue transformado en células químicocompetentes DH5 . Las células transformadas son plateadas en cajas petri con medio YT2X adicionado con ampicilina 50 μg/mL, IPTG/XGal para la selección de colonias positivas (blancas). Se verificó la clonación de las cadenas pesadas y ligeras por medio de PCR de colonia, utilizando los oligos del vector, T7-like (SEQ ID NO 24) y T3-like (SEQ ID NO 25). Se amplificaron aquellas colonias con los insertos de tamaños esperados (para VH's 750 pb y para VL's 600 pb) y el DNA plasmídico se purificó con el kit "High Puré Plasmid Isolation" (Roche Applied Science, Germany). Después se procedió a la secuenciación del DNA de los plásmidos en un analizador de genes Applied Biosystems 3100 (Foster City, CA, USA). Se obtuvo las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo 2F2E8E3B6 (SEQ ID NO 13 y 15) y del anticuerpo 4D12R (SEQ ID NO 14 y 16), así como la definición de las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de cada cadena de acuerdo a la nomenclatura de Kabat (http://www.bioinf.org.uk/abs/), las cuales son las que reconocen de manera específica al dominio CTLD-2 del receptor DEC-205. Las cadenas pesadas (VH) presentan al CDR1H del aminoácido 26 al 35, al CDR2H del aminoácido 50 a 65 y al CDR3H del aminoácido 99 al 103; las cadenas ligeras presentan al CDR1 |_ del aminoácido 24 al 40, al CDR2L del aminoácido 56 al 62 y al CDR3[_ del aminoácido 95 a 102.
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Claims

REIVINDICACIONES
1- Un anticuerpo que reconoce el dominio CTLD-2 del receptor celular DEC-205 de Gallus gallus (SEQ. ID. NO: 1 ), caracterizado por que comprende un fragmento VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ. ID. NO: 15, SEQ. ID. NO: 16 y variantes funcionalmente equivalentes en las posiciones 26-35, 50-65 o 99-103 de dichas SEQ. ID. NO: 15 o SEQ. ID. NO: 16 y un fragmento VL con una secuencia seleccionada del grupo consistente de SEQ. ID NO: 13 y SEQ. ID. NO: 14, y variantes funcionalmente equivalentes en las posiciones 24-40, 56-62 o 95-102 de dichas SEQ. ID. NO: 13 o SEQ. ID. NO: 14.
2. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado por que comprende un fragmento VH con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID. NO: 15 y un fragmento VL con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID NO: 13.
3. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado por que comprende un fragmento VH con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID. NO: 16 y un fragmento Vi. con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID NO: 14.
4. Un conjugado molecular del anticuerpo de la reivindicación 1 que reconoce al dominio CTLD-2 del receptor celular DEC-205 de Gallus gallus, caracterizado por que el anticuerpo se encuentra unido covalentemente a un antígeno.
5. El conjugado molecular de la reivindicación 4, caracterizado por que el antígeno es una proteína seleccionado del grupo que consiste de proteínas selectas de las bacterias
Pasteurella multocida del cólera aviar, Avibacterium paragallinarum de coriza infecciosa aviar, el virus de la leucosis viral aviar y el virus de la influenza aviar.
6. El conjugado molecular de la reivindicación 5, caracterizado por que la proteína utilizada como antígeno es seleccionada del grupo que consiste de la proteína Cp39 de
Pasteurella multocida, la proteína de la membrana externa HMTp210 de Avibacterium paragallinarum, la proteína gp85 del virus de la leucosis aviar subgrupo J y la proteína H5 del virus de la Influeza aviar.
7. El conjugado molecular de la reivindicación 6, caracterizado por que el antígeno conjugado es la proteína H5 del virus de la Influeza aviar de secuencia aminoacídica SEQ.ID.NO:8.
8. El conjugado molecular de la reivindicación 4, caracterizado por que el anticuerpo comprende un fragmento VH con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID. NO: 15 y un fragmento VL con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID NO: 13.
9. El conjugado molecular de la reivindicación 4, caracterizado por que el anticuerpo comprende un fragmento VH con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID. NO: 16 y un fragmento VL con una secuencia de aminoácidos SEQ. ID NO: 14.
10. El uso de un conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para la fabricación de una vacuna veterinaria contra el cólera aviar, la coriza infecciosa aviar, la leucosis aviar subgrupo J y la influenza aviar.
11. El uso del conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para la fabricación de una vacuna veterinaria contra la influenza aviar.
12. Una composición veterinaria para prevenir enfermedades aviares caracterizada porque comprende un conjugado molecular de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. La composición de la reivindicación 12, caracterizada por que la enfermedad aviar es influenza y el conjugado molecular que comprende es de conformidad con la reivindicación 7.
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