CN103468673A

CN103468673A - 一种抗菌肽的制备方法和应用

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Publication number: CN103468673A
Application number: CN2013102453730A
Authority: CN
Inventors: 凌建群; 孟广荣; 姜超; 谢雯凡; 唐启慧
Original assignee: GENLOCI BIOTECHNOLOGIES Inc
Current assignee: GENLOCI BIOTECHNOLOGIES Inc
Priority date: 2013-06-19
Filing date: 2013-06-19
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-06-19
Also published as: CN103468673B

Abstract

本发明提供了一种抗菌肽的基因，编码SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的抗菌肽，具有如SEQ ID NO.2-4任一所述的核苷酸序列。本发明还提供了上述抗菌肽的制备方法,包括如下步骤：（1）构建含有SEQ ID NO.2-4任一所述核苷酸序列的表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达抗菌肽的重组细胞；（2）培养重组细胞，使其表达抗菌肽；（3）分离纯化表达产物，得到具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的抗菌肽。上述抗菌肽可以作为抗菌剂在农业、食品、卫生用品、医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程领域中的应用。

Description

一种抗菌肽的制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗菌肽的制备方法和应用。

背景技术

农杆菌介导法以其操作简单、适用范围广、转化效率高等优点广泛应用于植物基因工程领域，具有很高的认同度。但同时，转化后残留的农杆菌对后续工作的不良影响也日益突显。获得转化植株后，农杆菌在植株体内的残存状况，不仅影响到转化植株的存活率、PCR检测结果的可信度，而且还可能引起外源基因的遗传漂移，导致环境问题。

当前，研究人员都采用抗生素来去除残留的农杆菌，但不能完全清除农杆菌，进而影响愈伤组织的生长和分化，影响实验效率。对于广大科研工作者来说，找到一种有效的抗菌活性成分来替代抗生素的使用，解决农杆菌在转基因组织培养过程中和转化植株上的残留问题是研究的重点。

传统抗生素的大量使用造成耐药菌株不断产生，使得许多曾经高度有效的抗生素药物失效，因此寻求新的抗生素越来越重要。人们发现，生物受到微生物感染后，迅速、大量产生具有抗菌活性的小分子多肽（即抗菌肽）参与机体免疫。抗菌肽几乎是所有生命物种都有的重要免疫分子，具有广谱抗菌活性和抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性。目前已从微生物、植物、昆虫、节肢动物、两栖动物、哺乳动物甚至人体内鉴定出上千种抗菌肽，这些抗菌肽的发现为发展新型肽类抗生素提供了丰富的资源。其独特的作用方式使其有望解决传统抗生素长期使用带来的细菌耐药性问题，在医药卫生、农业生产、食品工业等领域都有广泛的应用前景。

天然抗菌肽由于活性较低或是存在对宿主哺乳动物的细胞毒性等，并不能直接用作抗生素药物。抗菌肽产量低,天然中分离难度大,且化学合成成本过高，因此,如何提高抗菌肽的生产效率,降低生产成本,是应用抗菌肽必须解决的问题。而通过基因工程技术则可以解决这一问题,主要是利用分子克隆技术克隆抗菌肽基因或进行适当的改造,然后将这些优良基因导入适当的宿主菌,进一步筛选出高产菌株,以达到提高抗菌肽产量的目的。国外,早在1989年Jaynes就成功地利用基因工程技术在大肠杆菌中融合表达了抗菌肽基因；1991年,Andersons等利用多角体病毒表达系统在昆虫细胞系中表达了抗菌肽基因；1993年,Piers等将抗菌肽基因在大肠杆菌中进行表达,通过对表达产物的产量、细胞定位、蛋白降解情况的系统研究,得到了具有抗菌活性的小肽。国内,对抗菌肽的研究起步较晚,但也取得了一定的进展,1999年沈国卿等成功地在酵母中表达了抗菌肽基因。

然而，基因工程表达抗菌肽存在的问题主要有：抗菌肽分子小，易被蛋白酶降解，缺乏检测抗菌肽方法，基因的表达产物可能对宿主有害。因此，设计出活性更高、更有针对性而对宿主细胞无毒的肽类抗生素成为热点。

发明内容

天然抗菌肽资源有限,且提取工艺复杂,成本昂贵，化学合成法成本太高,产业化困难,同时难以保证合成肽类的生物活性。抗菌肽分子量较小且容易被蛋白酶水解,分离纯化工艺复杂,通常基因表达产量不高。本发明针对上述问题提供了用基因工程方法表达抗菌肽的方法，步骤简便易操作，不需要大型设备，大大降低了纯化成本，提高了得率。

本发明具体技术方案如下：

一种抗菌肽的基因，编码SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的抗菌肽GBB，具有如SEQ IDNO.2所述的核苷酸序列。由于三位密码子在编码对应的氨基酸时，第三位碱基具有简并性的特点，可从SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列反推得到GBB的核苷酸序列，不限于SEQ IDNO.2-4任一所述的核苷酸序列：

SEQ ID NO.2：

GGACGATTTAAACGGTTTCGGAAAAAATTTAAGAAACTATTTAAGAAATTGTCATGA

SEQ ID NO.3：

GGACGATTCAAGCGGTTCCGGAAGAAGTTCAAGAAGCTATTCAAGAAGTTGTCATGA

SEQ ID NO.4：

GGACGATTTAAGCGGTTTCGGAAGAAGTTTAAGAAGCTATTTAAGAAGTTGTCATGA

本发明还提供了一种上述抗菌肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）构建如SEQ ID NO.2-4所述的核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达抗菌肽的重组细胞；

（2）培养重组细胞，使其表达抗菌肽；

（3）分离纯化表达产物，得到具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的抗菌肽。

上述制备方法中，所述表达系统可以为不含有融合标签的原核表达系统，也可以为含有融合标签的原核表达系统，当选用含有融合标签的原核表达系统时，优选融合标签为融合蛋白proteinG。

上述抗菌肽的制备方法中，所述原核表达系统优选大肠杆菌表达系统，进一步的优选鼠李糖诱导表达系统，可更进一步使用IPTG进行诱导表达。

上述抗菌肽的制备方法中，表达系统选用不含有融合标签的原核表达系统时，可超声破菌后，将表达产物通过热变性去除杂蛋白，再进行超滤，截留分子量为10KD，分离纯化得到抗菌肽。

上述热变性条件为65-100℃，20-60分钟，优选，70℃热变性30分钟，可以根据变性溶液体积的大小，适当改变变性温度和时间，比如变性溶液多时，提高变性温度如100℃，延长变性时间。也可以在较低变性温度，如65℃下延长变性时间，可以达到同样的变性去除杂蛋白的效果。

上述抗菌肽的制备方法中，表达系统选用含有融合标签的原核表达系统时，可超声破菌后，将表达产物通过亲和纯化得到带有融合蛋白的抗菌肽，酶切去除融合标签，再将其酶切产物经过亲和纯化，收集抗菌肽。

上述制备方法制备得到的抗菌肽可作为抗菌剂用于农业、食品、卫生用品、医药、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程领域，如抗菌肽在制备抗菌药中的应用，或者作为抗菌剂用于清除农作物农杆菌。

上述抗菌肽，亦可用于动物细胞培养中解决支原体污染的难题，以及其他抑菌消毒产品，如牙膏，漱口液，口腔清新剂，假牙清洁片，口香糖等。

本发明还提供了一种抗菌口腔清洁护理产品，包含上述方法制备的抗菌肽，产品中抗菌肽的含量为10-200μM，所述产品优选牙膏、漱口水等。

本发明优点：

（1）文献Lee EK et al.Peptides.2011，32(6):1123-30.公开了抗菌肽的天然提取方法，然而天然的抗菌肽在动物体内含量极微，自然资源有限，且化学合成成本高，价格昂贵，本发明通过基因工程技术原核表达重组抗菌肽，解决了其来源问题。

（2）本发明的一个优选技术方案中采用无融合标签的大肠杆菌KRX中直接表达抗菌肽，相对于融合表达的方法，无需酶切步骤，降低成本，进一步的简化了纯化步骤。本技术方案采用热变性去除大部分杂蛋白，提高了分离纯化的效率，提高了目的蛋白纯度；使用超滤分离纯化小分子量蛋白。根据目的蛋白分子量选择合适截留分子量的超滤膜或离心管，一步即可分离得到目的蛋白；相对于纯化通常使用的离子交换、凝胶过滤等常规手段，本发明方法操作简便，成本低，高效、经济，实现了无标签抗菌肽GBB的原核高效表达，大大简化了纯化步骤，而且达到了经济适用的目的。

（4）本发明的另一个优选技术方案，在表达载体中加入了共表达的protein G融合标签和TEV核酸酶酶切位点，通过亲和层析、酶切融合标签、再次亲和纯化目的蛋白，产品所得抗菌肽纯度高，以上方法为实现GBB的大规模纯化提供了可能。

附图说明

图1为抗菌肽GBB基因PCR结果电泳图。

图2为抗菌肽GBB诱导表达Tricine-SDS-PAGE全菌电泳图。

图3为热变性及超滤后的抗菌肽GBB纯化产物电泳图。

图4为protein G-TEV-GBB PCR结果电泳图。

图5为经诱导，protein G-GBB共表达的SDS-PAGE全菌电泳图。

图6为经过Ni亲和层析柱纯化的protein G-GBB SDS-PAGE电泳图。

图7为经过TEV protease酶切反应纯化的protein G-GBB SDS-PAGE电泳图。

图8为二次经过Ni亲和层析柱纯化最终得到抗菌肽GBB的SDS-PAGE电泳图。

图9为不同浓度抗菌肽GBB以及3种抗生素对农杆菌的抑制菌落数结果图。

图10为不同浓度抗菌肽GBB以及3种抗生素对农杆菌的抑制率结果图。

图11为抗菌肽GBB对植物组织分化的影响实验结果。

图12为抗菌肽GBB与抗支原体药物Plasmocin的活性比较结果。

图13为云南白药牙膏、中华牙膏以及添加抗菌肽GBB的中华药膏三组样品抗菌效果比较。

图14为黑妹漱口液与高露洁漱口液添加抗菌肽GBB前后抗菌效果比较。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体工艺步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1使用无融合标签表达系统制备抗菌肽GBB

1、pET28a-GBB载体的构建

根据文献Lee EK et al.Peptides.2011，32(6):1123-30.公开的抗菌肽GBB的氨基酸序列：GRFKRFRKKFKKLFKKLS*（SEQ ID NO.1），翻译设计抗菌肽GBB的基因序列P1，使用软件Genetyx设计得到P1的互补序列P2，以P1、P2退火后产物为模板，P3、P4为引物，通过PCR（PCR条件：98℃1min;98℃15s,63℃15s,72℃15s,35cycles;72℃5min）获得GBB基因，使用Phusion DNA聚合酶（NEB Biolabs），P1、P2、P3和P4序列如下：

P1:5’GGACGATTCAAACGGTTCCGGAAAAAATTCAAGAAACTATTCAAGAAATTGTCATGA3’SEQ ID NO.2；

P2:5’TCATGACAATTTCTTGAATAGTTTCTTGAATTTTTTCCGGAACCGTTTGAATCGTCC3’SEQ ID NO.5；

P3:5’GAAGGAGATATACCATGGGACGATTCAAACGGTTCCG3’SEQ ID NO.6；

P4:5’TGTTAGCAGCCGGATCTCATGACAATTTCTTGAATAG3’SEQ ID NO.7。

下划线部分用于扩增GBB基因序列，无下划线部分为载体pET28a(+)接头序列。

将含有GBB基因的PCR产物（图1）克隆到载体pET28a(+)(

69864)，得到含有GBB基因的表达载体，并命名为pET28a-GBB。将质粒测序，验证了GBB基因的插入。

2、诱导表达

质粒pET28a-GBB转化表达菌KRX（Promega公司，货号：L3002），转化菌鼠李糖加IPTG诱导（鼠李糖终浓度0.2%，IPTG终浓度0.1mM），离心收集菌体用于GBB分离纯化。取少部分菌体做Tricine-SDS-PAGE全菌电泳，用于检测诱导表达情况(图2)。

3、超声破菌

按每100ml发酵液离心所得菌体加入5ml PBS（pH7.4）比例重悬菌体，再加1M PMSF至终浓度1mM，冰浴超声。超声参数：功率30%,超5s，停10s，总时间45min。12000rpm离心15min（4℃）收集上清。

4、热变性

70℃水浴30min,12000rpm离心5min，收集上清。

5、超滤离心

用15ml10KD(截留分子量)超滤离心管4000g超滤离心(4℃)，至截留液少于500ul，收集滤出液，即为纯化后GBB溶液(图3)。每一步的分离纯化效果用Tricine-SDS-PAGE检测。

实施例2使用融合标签表达系统制备抗菌肽GBB

1、pET28a-proteinG-GBB载体的构建

根据文献Lee EK et al.Peptides.2011，32(6):1123-30.公开的抗菌肽GBB的氨基酸序列：GRFKRFRKKFKKLFKKLS*，翻译设计抗菌肽GBB的基因序列P1：

P1:5’GGACGATTCAAACGGTTCCGGAAAAAATTCAAGAAACTATTCAAGAAATTGTCATGA3’SEQ ID NO.2。

1)设计引物P5、P6以质粒pCeMM NTAP(GS)(GenBank登录号EF467047)为模板，通过PCR（PCR条件：98℃1min;98℃20s,60℃20s,72℃20s,35cycles;72℃5min）获得proteinG基因（融合标签）。

P5:5’CAGCCATCATCATCATCATCACATGGGCACCCCCGCAGTCA3’SEQ ID NO.8；P6:

5’GCCCTGGAAGTACAGGTTTTCACCAGAACCCTCAGTCACAGTGAATGTCTTCG3’SEQ ID NO.9。

2)设计引物P7、P8，先以步骤1）产物为模板进行PCR反应（PCR条件：98℃1min;98℃20s,63℃20s,72℃20s,35cycles;72℃5min），再以此PCR产物为模板，P5、P8为引物，通过PCR（PCR条件：98℃1min;98℃20s,53℃30s,72℃30s,touchup+0.5℃,35cycles;72℃5min）获得proteinG-GBB基因，且在proteinG和GBB基因间构建入TEVprotease酶切位点：GAAAACCTGTACTTCCAGGGC（图4）。

P7:5’CAGTTTCTTGAATTTTTTACGGAAACGTTTGAAACGGCCCTGGAAGTACAGGTTTTC3’SEQ ID NO.10；

P8:

5’TGTTAGCAGCCGGATCTCAAGACAGTTTCTTGAACAGTTTCTTGAATTTTTTACGG3’

SEQ ID NO.11。

3)将含有proteinG-GBB基因的PCR产物（图4）克隆到载体pET28a(+)

69864)，得到含有proteinG-GBB基因的表达载体，并命名为pET28a-protein G-GBB。将质粒测序，验证了proteinG-GBB基因的插入。

Protein G-GBB基因序列为：

5’cagccatcatcatcatcatcacatgggcacccccgcagtcaccacctacaagctggtcattaacggcaagactctgaagggcgagaccaccaccaaggccgtggacgcagaaaccgcggaaaaggcgttcaagcagtacgcgaacgacaacggggtggacggagtctggacctacgatgacgctacaaaaacgttcaccgtgaccgaggttaacacccccgctgtgactacgtacaagctggtgatcaatgggaagaccctgaagggcgagaccaccacgaaagctgtagacgccgagacagccgagaaggccttcaagcagtacgccaatgacaacggcgtggatggcgtgtggacctatgacgacgccacgaagacattcactgtgactgagggttctggtgaaaacctgtacttccagggccgtttcaaacgtttccgtaaaaaattcaagaaactgttcaagaaactgtcttgagatccggctgctaaca3’SEQ ID NO.12

下划线部分为载体pET28a(+)接头序列。

2、诱导表达

质粒pET28a-proteinG-GBB转化表达菌KRX（Promega公司，货号：L3002），转化菌鼠李糖加IPTG诱导（鼠李糖终浓度0.2%，IPTG终浓度0.1mM），离心收集菌体用于分离纯化proteinG-GBB。取少部分菌体做SDS-PAGE全菌电泳，用于检测诱导表达情况(图5)。

3、超声破菌

按每100ml发酵液离心所得菌体加入5ml溶液A（Ni-NTA平衡液体，50mM Tris,300mMNaCl,10mM咪唑，pH7.4）比例重悬菌体，再加1M PMSF至终浓度1mM，冰浴超声。超声参数：功率30%,超5s，停10s，总时间30min。12000rpm离心15min（4℃）收集上清。

4、Ni-NTA（QIAGEN30410）亲和纯化

平衡液：50mM Tris,300mM NaCl,10mM咪唑，pH7.4

洗脱液母液：50mM Tris,300mM NaCl,250mM咪唑，pH7.4

将母液分别配制成100mM和150mM的咪唑洗脱液，电泳图结果表明100mM的咪唑洗脱液分离效果较好，结果见图6。

5、TEV protease酶切

TEV protease购自sigma(T4455-1MG)，4度过夜酶切，Tricine-SDS-PAGE检测酶切效果（图7）。

6、Ni-NTA(QIAGEN30410)亲和纯化

将步骤5的酶切产物过Ni-NTA柱，GBB在流穿液中（图8）。

实施例3抗菌肽GBB的抑菌试验

分别取浓度为5、10、20、30、40和50μM的GBB溶液以及3种抗生素（450mg/L替卡西林钠（Tic）、500mg/L羧苄青霉素（Car）、200mg/L头孢霉素（Cef））对10⁸/ml农杆菌EHA105作用2h，28℃培养48h后，菌落计数。计算抑菌率（图9、图10）。

抑菌率（%）=(阳性对照OD值—试验OD值)/(阳性对照OD值—阴性对照OD值)×100

结果表明，抗菌肽GBB的抑菌率高达98%以上，显著高于浓度较高的三种抗生素对比组。

实施例4抗菌肽GBB对水稻愈伤组织诱导分化以及对烟草叶片诱导分化影响试验

1.抗菌肽GBB对水稻愈伤组织诱导分化影响试验

（1）按照表1-4所示内容配置水稻愈伤组织诱导分化培养基；

（2）加入抗菌肽GBB（工作浓度为15μM），充分混匀；

（3）121℃灭菌20min；

（4）将分化培养基以50ml/皿分装至培养皿中，室温放置至凝固；

（5）挑选健康的水稻愈伤组织进行接种，并封上封口膜；

（6）放入光照培养箱（28℃，16h光照/8h黑暗）培养分化成苗。

表1水稻愈伤组织诱导分化培养基（定容至1L）

组成	用量
		N6大量母液	50ml
B5微量母液	10ml
		铁盐母液	10ml
烟酸	1mg
		盐酸吡哆醇	1mg
烟酸硫胺素	1mg
		肌醇	10mg
L-pro	0.5g
		L-Glu	0.5g
CH	0.3g
		6-BA	3mg
NAA	0.5mg
		蔗糖	30g
Phytagel	4g
		pH	5.8

表2水稻愈伤组织诱导分化培养基N6大量母液（定容至1L）

组成	用量（g）
		KNO₃	56.6
CaCl₄·2H₂O	3.32
		MgSO₄·7H₂O	2.7
KH₂PO₄	8
		(NH₄)₂SO₄	9.26

表3水稻愈伤组织诱导分化培养基B5微量母液（定容至1L）

组成	用量（g）
		KI	0.075
H₃BO₃	0.3
		MnSO₄·H₂O	1
ZnSO₄·7H₂O	0.2
		Na₂MoO₄·2H₂O	0.025
CuSO₄·5H₂O	0.0025
		CoCL₂·6H₂O	0.0025

表4水稻愈伤组织诱导分化培养基铁盐母液（定容至1L）

组成	用量（g）
		Na-EDTA·2H₂O	7.45
FeSO₄·7H₂O	5.57

2.抗菌肽GBB对烟草叶片诱导分化影响试验

（1）按照表5-9所示内容配置烟草叶片诱导分化培养基；

（2）加入抗菌肽GBB（工作浓度为15μM），充分混匀；

（3）121℃灭菌20min；

（5）选取烟草苗第3片叶子，将其剪切成0.5cm×0.5cm的方形叶盘，放置于诱导分化培养基上，并封上封口膜；

（6）光照培养箱（28℃，16h光照/8h黑暗）培养分化成苗。

表5烟草叶片诱导分化培养基（定容至1L）

组成	用量
		大量母液	50ml
微量母液	5ml
		CaCl₂·H2O母液	50ml
铁盐母液	10ml
		肌醇	100mg
甘氨酸	1mg
		盐酸硫胺素	0.2mg
盐酸吡哆醇	0.25mg
		烟酸	0.25mg
6-BA	1.5mg
		NAA	0.1mg
蔗糖	20g
		Phytagel	4g
pH	5.8

表6烟草叶片诱导分化培养基大量母液（定容至1L）

组成	用量（g）
		NH₄NO₃	33
KNO₃	38
		MgSO₄·7H₂O	7.4
KH₂PO₄	3.4

表7烟草叶片诱导分化培养基微量母液（定容至1L）

组成	用量（g）
		ZnSO4·7H₂O	1.72
H₃BO₃	1.24
		KI	0.166
NaMoO₄·2H₂O	0.05
		CuSO₄·5H₂O	0.005
CoCl₂·6H₂O	0.005

表8烟草叶片诱导分化培养基CaCl₂·H₂O母液（定容至1L）

组成	用量（g）
		CaCl₂·2H₂O	8.8

表9烟草叶片诱导分化培养基铁盐母液（定容至1L）

组成	用量（g）
		Na-EDTA·2H₂O	7.45
FeSO₄·7H₂O	5.57

试验结果表明，工作浓度为15uM时，既可以保证对农杆菌有很好的杀菌效果，也可以保证不会对植物组织造成任何不良影响。图11显示的是添加了15uM抗菌肽GBB的分化培养基中，单子叶植物水稻的愈伤组织、双子叶植物烟草的叶片都能够正常分化。

实施例5抗菌肽GBB对支原体的抑制作用

（1）细胞铺24孔板（培养基中添加支原体），5x10⁴个/孔；

（2）细胞分成两组，一组添加GBB至终浓度为50uM，另一组添加plasmocin，参照使用说明书，其使用浓度为25μg/ml(Invivogen公司，货号ant-mpp）；

（3）每隔1d取细胞培养液留样，连取3d；

（4）细胞培养液95℃水浴加热5min，12000rpm离心1min，取上清做下一步的巢式PCR检测；

（5）巢式PCR第一轮体系和程序：

程序：

（6）巢式PCR第二轮体系和程序：

程序：

（7）1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

试验结果表明，50uM（工作浓度）的抗菌肽GBB处理支原体24h，即可达到良好的支原体清除效果，如图12所示，1和2为未被支原体污染的ddH₂O，用于配制培养基和GBB；3和4为未被支原体污染的培养基；5和6为支原体；7和8为将支原体添加进培养基中；9和10为添加50uM（工作浓度）抗菌肽GBB至7和8中处理24h后，已基本检测不到支原体；11和12为按照使用说明添加抗支原体药物plasmocin至7和8中处理24h后，仍可检测到少量支原体；13和14、17和18分别为GBB处理48h、72h之后，对培养基中支原体的检测结果；15和16、19和20分别为抗支原体药物plasmocin处理48h、72h之后，对培养基中支原体的检测结果。

实施例6以抗菌肽GBB作为抗菌成分制备的口腔清洁产品的抗菌作用

1.牙膏添加GBB抗菌实验

（1）口腔菌菌种的制备

①将新用过的牙刷剪断，毛刷部分放入无菌三角瓶中，加入LB培养基没过牙刷，封口，置于振荡器上震荡30min，37℃，200rpm，培养6-8h；

②取培养好的菌液100μl加入等体积50%的无菌甘油混匀，-80℃保存。

（2）牙膏溶液的制备

称取0.4g牙膏放入1.5ml无菌离心管中，加入1ml LB，置于振荡器上，至膏体全部溶解为止。

（3）抗菌实验

①取100μl冻存的菌种加入到3ml LB培养基中，37℃，200rpm，培养3h；

②用LB将菌液调到OD600=0.5，此时菌液浓度约为10⁸/ml；

③分别取（2）中制备牙膏溶液50μl（1/10）、10μl（1/50）、5μl（1/100）于1.5ml无菌离心管中，加LB补至500μl，作为实验组1；

④分别加入GBB于步骤③溶液中，终浓度为200μM，作为实验组2；

⑤取浓度为10⁵/ml的菌液10μl加入到步骤③、④溶液中，混匀；37℃，200rpm，培养2-3h；

⑥将培养后的菌液用LB稀释200倍，取100μl涂无抗的LB平板（即菌液稀释20倍涂平板），37℃培养过夜，次日计数。

漱口水添加GBB抗菌实验

（1）口腔菌菌种的制备

（2）抗菌实验

②用LB将菌液调到OD600=0.5，此时菌液浓度约为10⁸/ml；

③分别取漱口水50μl（1/10）、10μl（1/50）、5μl（1/100）于1.5ml无菌离心管中，加LB补至500μl，作为实验组1；

1/10、1/50、1/100的中华优效抗敏牙膏和云南白药留兰香型牙膏，黑妹清朗抗蛀漱口水和高露洁护敏漱口水，添加抗菌肽GBB前后，对口腔细菌的抗菌效果，如图13和14所示，明显地，添加了GBB之后，抗菌率都在98%以上。

Claims

1.一种抗菌肽的基因，编码SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的抗菌肽，其特征在于具有如SEQ ID NO.2-4任一所述的核苷酸序列。

2.一种抗菌肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）构建含有如权利要求1所述的核苷酸序列表达系统，包括构建表达载体并将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达抗菌肽的重组细胞；

（2）培养重组细胞，使其表达抗菌肽；

3.如权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于所述表达系统为不含有融合标签的原核表达系统。

4.如权利要求2所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于所述表达系统为含有融合标签的原核表达系统。

5.如权利要求4所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于所述融合标签为融合蛋白proteinG。

6.如权利要求3-5之一所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述原核表达系统为大肠杆菌表达系统。

7.如权利要求6所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述表达系统为鼠李糖诱导表达系统。

8.如权利要求7所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述表达系统进一步使用IPTG进行诱导表达。

9.如权利要求3所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述分离纯化表达产物包括将表达产物通过热变性去除杂蛋白，再进行超滤，截留分子量为10KD。

10.如权利要求4所述抗菌肽的制备方法，其特征在于所述分离纯化表达产物包括将表达产物通过亲和纯化得到带有融合蛋白的抗菌肽，再将其酶切产物经过亲和纯化，收集目的产物。

11.如权利要求2-10之一项所述制备方法制备得到的抗菌肽作为抗菌剂在农业、食品、卫生用品、化妆品、生物农药、生物饲料添加剂、天然食品防腐剂、动植物抗病基因工程领域中的应用。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于抗菌肽作为抗菌剂在清除农作物农杆菌中的应用。

13.如权利要求2-10之一项所述制备方法制备得到的抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

14.一种抗菌口腔清洁护理产品，其特征在于包含如权利要求2-10之一项所述方法制备的抗菌肽。