CN114586745A - 一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生态保护领域，具体涉及一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用，所述多肽可有效预防和减少由传粉昆虫传播引起的植物疫病，也可添加其他治疗剂、辅料、载体或辅助性成分制成以本发明所述多肽为主要活性成分的制剂，用于预防和减少由传粉昆虫传播引起的植物疫病。本发明还公开了该多肽及其制剂在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用，所述多肽及其制剂可显著降低传粉昆虫携带的病原微生物，对传粉昆虫无毒副作用，不影响其正常生物活动，且有效预防和减少传粉昆虫对植物疫病的传播。与现有技术相比，本发明所述多肽及其制剂具有安全性高、无耐药性，有效预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播，具有较高价值的应用前景。

Description

一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用
技术领域
本发明涉及生态保护领域，具体涉及一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用。
背景技术
传粉昆虫指的是习惯于花上活动并能传授花粉的昆虫，主要的传粉昆虫多属于鞘翅目(14.1％)、双翅目(28.4％)、膜翅目(43.7％)，此外还见于鳞翅目、直翅目、半翅目、缨翅目。绝大多数传粉昆虫都是野生昆虫，包括蜜蜂、蝴蝶、飞蛾、黄蜂、甲虫等。
蜜蜂作为一个有代表性的传粉昆虫，其对花粉和花蜜等植物资源的依赖，使得其成为是野生和栽培植物的主要传粉群体，全世界约有20000种蜜蜂，其中约5000种出现在新热带地区。蜜蜂授粉对世界上三分之一的粮食作物的产量贡献很大(Rader R,BartomeusI,Garibaldi L A,et al.Non-bee insects are important contributors to globalcrop pollination[J].Proceedings of the National Academy of ences of theUnited States of America,2016,113(1):146.)，是自然界最主要的授粉昆虫，在保持生物多样性和维持生态系统平衡方面发挥着极为重要的作用，尤其是为农作物授粉，具有重要的经济价值和社会效应。当然，其他昆虫群体在维持自然和农业环境中授粉服务的重要性不容忽视。
全世界68％的显花植物(约170000种)依赖传粉昆虫传粉完成正常的繁衍。人类广泛利用的1300种经济作物中，有1100多种需借助昆虫传粉，同时，提高传粉也是实现杂交育种的关键环节，要想提高授粉率和杂交率，依靠传粉昆虫是最为有效的方法之一(王洪岩.传粉昆虫在大豆杂交育种中的应用[J].现代农业研究,2020,26(02):85-86.)。
传粉昆虫和植物二者间的相互作用是多方面的，一方面植物为昆虫提供了食物来源以及生存的环境，对昆虫有生态保护作用；另一方面由于植物自身不会移动，只有依靠昆虫来协助运输植物种子和花粉(沈登荣,和绍禹,张宏瑞,李正跃.蜜蜂作为病原物载体的研究进展[J].中国生物防治,2010,26(S1):118-122.)。故动物授粉作为一种调节性生态系统服务(Pires C S S,M.M.Maués.Insect Pollinators,Major Threats and MitigationMeasures[J].Neotropical Entomology,2020,49(4):469-471.)，保证了植物的异花授粉，维持自然界植物的遗传多样性，是生态系统(尤其是农林交错带生态系统)维持稳定的关键环节之一。
达尔文很早就发现了异花授粉的重要性，因为维持物种稳定主要依靠杂交来完成。昆虫通过异花传粉携带的异质基因可以进一步增强后代的变异性和适应性，进而推动物种本身的进化。据不完全统计，如果没有传粉昆虫，约有40000种植物将因繁育困难而濒临灭绝(黄敦元,黄思程,李红英,窦飞越,寇若玫,李月,罗安才.传粉昆虫蜜(粉)源植物的鉴定方法探讨[J].重庆师范大学学报(自然科学版),2020,37(03):1-8.)。
传粉昆虫作为生态系统的重要组成部分，其种类组成、传粉对象、数量变化直接或间接地反映着生态环境状况及其发展趋势；同时，传粉昆虫为生态系统提供了重要的生态服务功能，对于维持生态系统的动态平衡与相对稳定发挥了重要作用(张立微,张红玉.传粉昆虫生态作用研究进展[J].江苏农业科学,2015,43(07):9-13.)。
尽管动物传粉具有重要地位，但近半世纪以来，由于农药和杀虫剂的普遍使用、植物单一化程度越来越高等，使得传粉昆虫的生物种类及数量减少，导致生物防治功能降低(杨泉峰,欧阳芳,门兴元,戈峰.功能植物的作用原理、方式及研究展望[J].应用昆虫学报,2020,57(01):41-48.)。
农药和杀虫剂的使用大大促进了我国农业生产的发展，但同时也带来了生存环境的严重危害。使用农药后，仅不足0.03％的农药能够起到真正有效的杀虫作用，还有19％～29％的农药会因气流飘移到非目标区域，造成绝大部分有益或者没有害处的昆虫种类减少甚至灭亡，即使植物源杀虫剂，仍对昆虫产生不利影响，植物源杀虫剂虽然来源于植物，相对于化学农药有诸多优点，比如低毒、低残留等，但是植物源杀虫剂对环境并非完全的低毒、安全、无公害，有些植物源杀虫剂对蜜蜂仍有毒性(李剑飞,李志勇,庄明亮,牛庆生,王志,葛蓬,张发.蜜蜂安全与植物源杀虫剂[J].蜜蜂杂志,2020,40(05):12-15.)。
传粉昆虫除了受到农药的致死影响外，对发育、行为、生殖等也具有不好的影响，如蜜蜂，由于蜜蜂缺乏免疫系统，对环境当中污染物的抵抗力较低，对化学类农药品的感受性较高，大量的研究表明农药不仅能直接杀死蜜蜂,而且对蜜蜂的生长、觅食、繁殖、嗅觉、记忆能力、学习能力、感受性、解毒和免疫机制以及寿命长短等都能产生影响(邱敏群.农药对养蜂业的影响分析[J].乡村科技,2017(11):60-61.)。尤其在植物疫病区，会进行大量的农药喷洒，这对蜜蜂等传粉昆虫带来了不利的生存影响。
同时，由于蜜蜂等传粉昆虫在采蜜、授粉等生物活动过程中，易沾染患病植株的病原菌，在传播植物病害中起着重要作用，被认为是植物病原体的载体(Parish J B,Scott ES,Correll R,et al.Survival and probability of transmission of plantpathogenic fungi through the digestive tract of honey bee workers[J].Apidologie,2019(2).)，会导致植物疫病的传播，故在多数患有植物疫病地区，蜜蜂等传粉昆虫被禁止进入，已防止传粉昆虫传播疫病，虽然在一定程度上控制了植物疫病的传播，但也直接阻断了昆虫给植物疫病地区的植物传粉。
在这两个因素的作用下，植物疫病区的传粉工作只能由人工进行，采用人工授粉，但人工授粉有其局限性，不仅成本高、效率低，且容易错过花期，果实的产量和品质得不到保证，如常见的人工刷粉，地面液体喷粉等仅对靠近地面的花有较好的授粉效果，对树顶部枝条授粉效果差，甚至不授粉，而无人机授粉则相反，对顶部枝条授粉效果较好，但对内堂和下部枝条授粉不好，并且人工授粉在果实生长后期出现较多的畸形果，商品性差。
据统计，一只工蜂每天能够采集25万朵鲜花的花粉，满载而归时花粉重量能达到70mg，几乎为体重的一半。并且在蜜蜂将携带的花粉团卸下后，仍有大量花粉留在身上，因此只要蜜蜂在另一植株上停留，就会有大概率将花粉散落到雌蕊上。不仅如此，蜜蜂在采蜜行为上具有专一性，在同一时间只采集一种植物的花粉，这就避免了因不同植物的花粉混合，率先进入花粉管却导致远缘杂交不亲和而无法产生子代的问题，故蜜蜂传粉比人工传粉的果实产量和品质都有明显的提高(李依镁.蜜蜂对园艺生产的意义——以草莓为例[J].蜜蜂杂志,2019,39(09):16-19.)。
综上所述，蜜蜂等传粉昆虫授粉对植物疫病区的经济效益主要体现在2个方面，一方面是直接降低人工授粉产生的成本，另一方面是通过提高果实品质、产量来增加其商品价值，在植物疫病期间，能够获得更高的市场售价，减少损失，所以蜜蜂等传粉昆虫在一些需要传粉的植物疫病区的生产中显得非常有必要。
那如何解决在不禁止蜜蜂等传粉昆虫授粉、采蜜的情况下对植物疫病区的植物疫病传播呢。在20世纪90年代，美国、加拿大的研究者发现，在蜜蜂对植物的授粉过程中，还可以利用其作为病原真菌、细菌、病毒的携菌载体，将蜜蜂的授粉行为与害虫防治相结合，从而达到控制农作物病虫害的目的，在作物生产上取得了双赢的效果，也有少量相关的报道，如peng等首次利用蜜蜂作为病原微生物的传播载体，让病原物随蜜蜂的授粉传播至草莓的叶片和花朵上，从而控制了草莓灰病毒(Peng G,Sutton J C.Evaluation ofmicroorganisms for biocontrol of Botrytis cinerea in strawberry[J].CanadianJournal of Plant Pathology,1991,13(3):247-257.)；Escande A R等利用蜜蜂传播木霉属以控制向日葵菌核病(Escande A R,Laich F S,Pedraza M V.Field testing ofhoneybee-dispersed Trichoderma spp.to manage sunflower head rot(Sclerotiniasclerotiorum)[J].Plant Pathology,2010,51(3):346-351.)；再如申请号为ZL202010181057.1的中国专利，也公开了利用中华蜜蜂定向传播哈茨木霉孢子粉防控草莓灰霉病方法等等。
但是以上都是利用蜜蜂作为载体，将微生物、孢子粉等对疫病有作用效果的物质传播至植物疫病区，仅接触到物质的植物疫病得以缓解，并不能减少蜜蜂本身沾染疫病病原物的可能性，蜜蜂在传粉、采蜜过程中，仍可以病原菌携带至其他植株，造成传播疫病的可能；并且，现有技术中，对疫病有作用效果的物质，多采用微生物、孢子等进行疫病的治疗，但这类物质的衍生物，如一些微生物会产生抗生素、激素等并不能保证其不对植物疫病区产生除疫情之外的其他有害作用；同时，也不能保证这类物质对传粉昆虫自身的生存、活动等不具有不利影响，蜜蜂携带微生物的过程中，蜜蜂外表皮与微生物直接接触导致微生物通过昆虫外表侵入昆虫体内，可能对蜜蜂造成不同程度的感染。
故，迫切的需要寻找一种可预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播，且对传粉昆虫本身无伤害的方法。
申请人在研究中惊讶的发现了本发明所述多肽可有效杀灭传粉昆虫携带的植物病原微生物，故其可用于预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播，具有极大的应用和研究前景。现有技术中未公开其可用于预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明一个目的在于提供一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用；同时，本发明另一个目的在于提供一种预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的多肽类制剂；本发明的再一个目的在于提供一种预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的多肽类制剂的使用方式。
本发明所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
所述传粉昆虫包括蜜蜂、蝴蝶。
所述植物包括蜜源植物。
所述蜜源植物包括蔷薇科植物。
优选的，所述蔷薇科植物包括梨、苹果、山楂、海棠。
优选的，所述植物疫病包括细菌感染引起的疫病。
优选的，所述细菌包括解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
本发明另一个方面提供了一种预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播的多肽类制剂，其特征在于，所述多肽类制剂包括：多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
所述制剂也可包括药学上可接受的其他辅料、载体或辅助性成分。
优选的，所述药学上可接受的其他辅料包括糖浆、蜂蜜、米浆。
所述多肽类制剂可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂的任一一种或几种的组合形式。
本发明再一个方面提供了一种预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播的多肽类制剂的使用方式，其特征在于，所述多肽类制剂包括：多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
所述使用方式包括饲喂、喷洒、接触消毒。
优选的，所述接触消毒包括添加所述多肽类制剂到介质上通过所述传粉昆虫的爬行消毒。
优选的，所述介质包括滤纸条、无纺布。
综上所述，本发明提供了一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用，同时，提供了一种以所述多肽为有效成分，添加药学上可接受的辅料、载体或辅助性成分而制成的多肽类制剂。与现有技术相比，本发明所述的多肽类制剂可显著降低传粉昆虫携带的病原微生物，对传粉昆虫无毒副作用，不影响其正常生物活动，且有效预防和减少传粉昆虫对植物疫病的传播，安全性高、无耐药性，有效预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明一方面提供了一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用。
本发明所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
所述传粉昆虫包括蜜蜂、蝴蝶。
所述植物包括蜜源植物。
所述蜜源植物包括蔷薇科植物。
优选的，所述蔷薇科植物包括梨、苹果、山楂、海棠。
优选的，所述植物疫病包括细菌感染引起的疫病。
优选的，所述细菌包括解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
本发明另一方面提供了一种预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的多肽类制剂，其特征在于，所述多肽类制剂包括：多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
所述制剂也可包括药学上可接受的其他辅料、载体或辅助性成分，根据需要可制备成药学上可接受的剂型。
本发明所述药学上可接受的其他辅料、载体或辅助性成分可以含有用于改变、维持或保持例如该组合物的pH、渗量、黏度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、解离或释放速率、吸附或渗透的配制材料。
优选的，合适配制材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单醣；二醣；和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；防腐剂(例如苯扎氯胺、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如PEG，脱水山梨聚糖酯，聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯，曲通(triton)，氨丁三醇，卵磷脂，胆固醇)；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；递送媒剂；稀释剂；赋形剂和/或药用佐剂必要时，还可加入香味剂、甜味剂等。
关于药学上可接受的载体或辅料不再一一例举，本领域普通技术人员可根据所掌握的公知常识进行具体选择。
优选的，药物的主要媒剂或载体本质上可以为水性或非水性的，如合适媒剂或载体可以为注射用水或生理盐水溶液。
优选的，所述药学上可接受的其他辅料包括糖浆、蜂蜜、米浆。
所述多肽类制剂可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂的任一一种或几种的组合形式。
本发明再一方面提供一种预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的多肽类制剂的使用方式，其特征在于，所述多肽类制剂包括：多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
所述使用方式包括饲喂、喷洒、接触消毒。
优选的，所述接触消毒包括添加所述多肽类制剂到介质上通过所述传粉昆虫的爬行消毒。
优选的，所述介质包括滤纸条、无纺布。
本发明所述多肽类以治疗有效量的剂量施用至传粉昆虫。另外，这些制剂的一天的给药量可以根据给药对象的生物活动、体表面积、作用方式等适当变更，只要可以抑制和杀灭植物疫病微生物的生产就无特别限制。该制剂不限于一天给药一次，可以分多次给药。
“有效量”或“治疗有效量”是指在预防和减少传粉昆虫在植物疫病传播的过程提供有杀灭病原菌的多肽施用量。
本发明的制剂可以通过本领域已知的任何合适的方法制备，可根据剂型要求进行删减或调整。
本领域技术人员可以根据所需要制备的剂型，按照本领域该剂型的一般技术常识和要求，选择合适的辅料，在多肽的基础的上，加入适当的辅料和添加剂，并按照常规的制剂技术来制备，可以制成片剂、粉剂、液体等剂型。
本领域技术人员可按常规方法确定适于某种情况的优选剂量。
本发明中所述多肽可通过化学合成，也可以通过基因工程技术表达、分离纯化得到(具体方法可参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入的各试剂等除特别说明外，均为市售。
本部分实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
由于专利申请号为202010302661.5的发明专利已经公开了本发明所述多肽对由解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)引起的植物病害有明显的预防与治疗效果，对蔷薇科植物尤其是梨、苹果、山楂和海棠等经济作物火疫病有突出的预防与治疗作用。故此处不再描述本发明所述多肽对解淀粉欧文氏菌的抗抑菌效果。
实施例1多肽在蜜蜂体表对解淀粉欧文氏菌的杀灭效果由于解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)引起的梨火疫病是第一个被确定的植物细菌病害。梨火疫病是一种毁灭性病害，是我国一类进境植物检疫危险性有害生物，故选取解淀粉欧文氏菌为此次试验的植物疫病病原菌。
而蜜蜂作为一个有代表性的传粉昆虫，是野生和栽培植物的主要传粉群体，故选取其代表传粉昆虫，作为此次的试验对象。
供试制剂：多肽水溶液
供试菌株(病原菌)：解淀粉欧文氏菌，由新疆农业大学馈赠
供试蜜蜂：意大利蜂，由巴州种蜂场提供菌种培养：将已经活化的菌株挑单菌落在NA平板上划线，28℃培养48h后在平板上加5mL无菌水并用无菌棉签轻轻刮下菌体，调至OD600＝0.5±0.02备用。
蜜蜂体外带菌检测：将备用菌液稀释10倍后雾化喷到直径15cm的无菌培养皿中；配好的多肽水溶液雾化喷到干净的无菌培养皿中。多肽水溶液的浓度为250、150、100、50、25mg/L。
抓取蜜蜂放入-20℃冰箱5min，待蜜蜂停止活动后取出放入喷有菌液的培养皿中，从蜜蜂开始活动计时5分钟，以同样的方式将蜜蜂转移到喷有多肽水溶液的培养皿中并计时5min，用无菌水代替多肽水溶液为阳性对照组。将蜜蜂放入1.5mL含0.1％吐温-80的无菌水中浸泡1h，取1mL浸泡液加入培养皿中，采用倾注平板法培养48h，在荧光显微镜下对带有GFP标记的EA菌落计数。每个多肽水溶液浓度设置3次重复，每个重复处理10只蜜蜂。
个体病原菌荷载率和群体病原阳性率计算公式：
个体病原菌荷载率＝(检测阳性菌落数/检测总菌落数)×100％；
群体病原阳性率＝(检测阳性蜂头数/检测总蜂头数)×100％。
检测总菌落数为固定值20，即在每皿培养基上随机选20个菌落进行鉴定。
消毒结果通过蜜蜂个体携带病原菌数量和群体带菌率评估，见表1和表2。
表1蜜蜂体外消毒后个体病原菌荷载率
浓度(mg/L) 0 25 50 100 150 250
重复1 82.50％ 53.50％ 11.00％ 0.50％ 0.00％ 0.00％
重复2 80.00％ 45.50％ 8.00％ 1.00％ 0.00％ 0.00％
重复3 87.00％ 57.50％ 9.00％ 0.00％ 0.00％ 0.00％
平均值 83.17％ 52.17％ 9.33％ 0.50％ 0.00％ 0.00％
表2蜜蜂体外消毒后群体病原检测阳性率
浓度(mg/L) 0 25 50 100 150 250
重复1 100.00％ 100.00％ 50.00％ 10.00％ 0.00％ 0.00％
重复2 100.00％ 100.00％ 40.00％ 10.00％ 0.00％ 0.00％
重复3 100.00％ 100.00％ 50.00％ 0.00％ 0.00％ 0.00％
平均值 100.00％ 100.00％ 46.67％ 6.67％ 0.00％ 0.00％
由表1和表2可知，当多肽水溶液的有效浓度达到150mg/L以上时，体外消毒针对蜜蜂个体和群体，均检测不到病原菌，病原菌全部被杀灭。
实施例2多肽在蜜蜂体内对解淀粉欧文氏菌的杀灭效果
供试制剂：多肽水溶液
供试菌株(病原菌)：解淀粉欧文氏菌，由新疆农业大学馈赠
供试蜜蜂：意大利蜂，由巴州种蜂场提供菌种培养：将已经活化的菌株挑单菌落在NA平板上划线，28℃培养48h后在平板上加5mL无菌水并用无菌棉签轻轻刮下菌体，调至OD600＝0.5±0.02备用。
蜜蜂体内带菌检测：将备用菌液稀释10倍配成含有8％蔗糖的菌悬液，多肽水溶液的浓度为250、150、100、50、25mg/L。
抓取蜜蜂放入-20℃冰箱5min，待蜜蜂停止活动后取出用双面胶固定在纸板上，饥饿2h后喂食10μL菌悬液；3h后喂食10μL药液，用无菌水代替多肽水溶液为阳性对照组；2h后解剖蜜蜂，取蜜囊和肠道放入1.5mL含0.1％吐温-80的无菌水中浸泡1h，取1mL浸泡液加入培养皿中，采用倾注平板法培养48h，在荧光显微镜下对带有GFP标记的EA菌落计数。每个多肽水溶液浓度设置3次重复，每个重复处理10只蜜蜂。
个体病原菌荷载率和群体病原阳性率计算公式：
个体病原菌荷载率＝(检测阳性菌落数/检测总菌落数)×100％；
群体病原阳性率＝(检测阳性蜂头数/检测总蜂头数)×100％。
检测总菌落数为固定值20，即在每皿培养基上随机选20个菌落进行鉴定。
消毒结果通过蜜蜂个体携带病原菌数量和群体带菌率评估，见表3和表4。
表3蜜蜂体内消毒后个体病原菌荷载率
浓度(mg/L) 0 25 50 100 150 250
重复1 57.50％ 38.00％ 2.50％ 0.50％ 0.00％ 0.00％
重复2 55.50％ 34.00％ 2.50％ 0.50％ 0.00％ 0.00％
重复3 54.00％ 35.00％ 2.00％ 0.00％ 0.00％ 0.00％
平均值 55.67％ 35.67％ 2.33％ 0.33％ 0.00％ 0.00％
表4蜜蜂体内消毒后群体病原检测阳性率
浓度(mg/L) 0 25 50 100 150 250
重复1 100.00％ 100.00％ 20.00％ 10.00％ 0.00％ 0.00％
重复2 100.00％ 100.00％ 30.00％ 10.00％ 0.00％ 0.00％
重复3 100.00％ 100.00％ 20.00％ 0.00％ 0.00％ 0.00％
平均值 100.00％ 100.00％ 23.33％ 6.67％ 0.00％ 0.00％
由表3和表4可知，当多肽水溶液的有效浓度达到150mg/L以上时，体内消毒针对蜜蜂个体和群体，均检测不到病原菌，病原菌全部被杀灭，并且体内对病原菌的杀菌效果优于体外。
实施例3多肽对蜜蜂消毒后在田间试验对解淀粉欧文氏菌的传播抑制效果供试制剂：多肽水溶液
供试菌株(病原菌)：解淀粉欧文氏菌，由新疆农业大学馈赠
供试蜜蜂：意大利蜂，由巴州种蜂场提供春季清园：彻底修剪树上病枝，将梨园病残体清理出梨园集中焚毁。在3月中上旬使用可杀得叁仟3000倍对试验地全面清园。
初花期施药：试验地在初花期(开花5％)用72％农用硫酸链霉素4000倍喷施。
将一整片梨园分成4块，每两块为1组，分别为试验组和对照组，将患病程度较轻的命名为试验组1、对照组1，患病程度稍重的命名为试验组2、对照组2。
蜜蜂在香梨开花20％左右进入试验地，进园前按100mL/箱的量用多肽水溶液对蜜蜂喂食消毒。
蜜蜂授粉期在每棵树的南北两侧用装水的瓶子或袋子各插上一枝砀山梨花枝作为授粉枝。
在蜂巢门口放置含100mg/L多肽水溶液的滤纸条供蜜蜂进出爬行消毒，并在巢门口放置100mg/L的多肽水溶液供蜜蜂采食。
每天及时更换多肽水溶液，保证溶液足量，直至授粉结束。
对照组的蜜蜂用水溶液替代多肽水溶液进行同样的处理。田间其他管理相同。
蜜蜂授粉结束后一个月调查果腐及枝条发病情况，计算株发病率和病情指数，计算公式如下：
株发病率＝发病株数/总株数×100％；
病情指数＝(∑(各级病株数×该病级数))/(总调查株数×最高级值)×100。
分级标准见表5。
表5田间病害分级标准
病级 分级标准
0 无病症
1 仅枝梢发病，枯梢、花腐、果腐总计不超过5个
2 枯梢、花腐、果腐总计超过5个，或大枝发病
3 主干流菌脓或主干新生枝条发病到主干
蜜蜂授粉结束后1个月对试验地进行调查，各组的数据统计见表6。
表6果园蜜蜂授粉传播病情结果统计
Figure BDA0002819837340000101
Figure BDA0002819837340000111
经计算，试验组1的P＝0.01，试验组2的P＝0.022，均小于005，表明对于发病区果园，不论是株发病率还是病情指数，蜜蜂消毒授粉都显著低于普通蜜蜂授粉，显著降低病害传播的程度。
由此可见，本发明所述多肽可显著减低传粉昆虫对植物病原菌的传播，可预防和降低传粉昆虫对植物疫病的传播。
并且本发明所述多肽为19个氨基酸组成，降解产物为天然氨基酸，不产生药物残留，同时，由于多肽的杀菌机理是其携带强大的正电荷吸附到菌体表面，使胞壁局部电位骤变形成高电位差，最终击穿胞壁形成穿孔，多肽分子积累到一定数量时，进一步扩大已经形成的孔洞，破坏细胞膜的完整性，从而使胞内物质外流，菌体死亡，其独特的杀菌机理决定了多肽不易产生耐药性，具有较好的优势，具有广阔的应用前景。
如本发明所采用的术语“预防”指预防传粉昆虫在生物活动中沾染病原菌。因此，“预防”可指防止性或预防性措施。
当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明肽可以是本发明肽的纯净形式、药物可接受的制剂形式，使用或不使用药物可接受的赋形剂。
如本发明所采用的术语“制剂”、“多肽类制剂”未特别说明，可相互转换，指的是包含多肽这一活性有效成分的制品，并任选其中还包含药学上可接受的载体。其中，“药学上可接受的载体”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、佐剂、包裹材料或其他制剂辅料。所用载体可与相应的给药形式相适应，可使用本领域技术人员所知晓的载体配成固体制剂、半固体制剂、液体制剂等任一一种或几种的组合形式制剂。
如本发明所采用的术语“药学上可接受的辅料、载体或辅助性成分”指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料、载体，可以根据给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，例如溶液剂、半固体剂及其他辅助性成分。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，且不打算限制仅由权利要求书限定的所披露的范围。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 江苏吉锐生物技术有限公司
江苏嘉肽生物技术有限公司
<120> 一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用
<141> 2020-12-07
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys
1 5 10 15
Lys Leu Ser

Claims (14)

1.一种多肽在预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述传粉昆虫包括蜜蜂、蝴蝶。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物包括蜜源植物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蜜源植物包括蔷薇科植物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蔷薇科植物包括梨、苹果、山楂、桃、樱桃、草莓、李。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物疫病包括细菌感染引起的疫病。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌包括解淀粉欧文氏菌（Erwiniaamylovora）。
8.一种预防和减少传粉昆虫对植物疫病传播的多肽类制剂，其特征在于，所述多肽类制剂包括：多肽，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
9.根据权利要求8所述的多肽类制剂，其特征在于，所述制剂也可包括药学上可接受的其他辅料、载体或辅助性成分。
10.根据权利要求9所述的多肽类制剂，其特征在于，所述药学上可接受的其他辅料包括糖浆、蜂蜜、米浆。
11.根据权利要求8、9、10任一所述的多肽类制剂，其特征在于，所述多肽类制剂可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂的任一一种或几种的组合形式。
12.一种上述权利要求8、9、10、11任一所述多肽类制剂的使用方式，其特征在于，所述使用方式包括饲喂、喷洒、接触消毒。
13.根据权利要求12所述的使用方式，其特征在于，所述接触消毒包括添加所述多肽类制剂到介质上通过所述传粉昆虫的爬行消毒。
14.根据权利要求13所述的使用方式，其特征在于，所述介质包括滤纸条、无纺布。
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