CN111214644A - 芬母多肽在制备抑制ii型单纯疱疹病毒感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗病毒感染药物技术领域，具体涉及芬母多肽在制备抑制II型单纯疱疹病毒感染药物中的应用。通过病毒空斑形成实验、qRT‑PCR、扫描电镜等方法进行检测和鉴定，在体外细胞试验中证实本发明使用的芬母多肽通过破坏HSV‑2包膜结构，进而使病毒丧失对易感细胞的侵染，达到抗病毒感染的功能，为研制新型抗HSV‑2感染药物提供重要实验依据。

Description

芬母多肽在制备抑制II型单纯疱疹病毒感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗病毒感染药物技术领域，具体涉及芬母多肽在制备抑制II型单纯疱疹病毒感染药物中的应用。

背景技术

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)属于疱疹病毒科α亚科，双链DNA囊膜病毒，根据抗原性差异分为I型(Herpes simplex virus I,HSV-1)和II型(Herpes simplexvirus II,HSV-2)两种血清型。其中II型单纯疱疹病毒主要感染生殖系统，同时也是宫颈癌，艾滋病合并感染的常见病原体，因此带来生理和心理的巨大威胁。目前缺乏特异有效的治疗药物。

HSV-2侵入宿主细胞是整个复制周期的首要环节，病毒囊膜通过细胞识别受体的介导，与宿主细胞发生膜融合，将病毒粒子内吞至胞内，引起内体的酸化，病毒囊膜蛋白以pH依赖或非依赖的方式与内体发生融合，进而释放病毒核酸至细胞核内，并开始病毒的复制。如能针对HSV-2设计破坏其囊膜结构的药物，使其无法被细胞受体识别，不能与靶细胞发生膜融合，破坏进入细胞或细胞核的途径，从而丧失对易感细胞的侵染，达到抗病毒感染的效果。

HSV-2的治疗一直缺乏特异有效的药物。近30年来，医生一直试图用阿昔洛韦等抗病毒药物治疗生殖器疱疹，这种方法还不能有效阻止疱疹病毒的传播。在全世界每周仍有超过100万的人口继续感染HSV-1或HSV-2，因为HSV具有潜伏感染的特性，因此，不适合开发减毒或灭活疫苗。基因工程疫苗免疫活性低，尚不能令人满意。现有的小分子抗病毒药物，缺乏特异性，广谱性抗病毒药物，如阿昔洛韦等在体内不能彻底清除病毒。因此急需探索抗疱疹病毒的新途径。

抗菌肽最初用于研究抑制细菌的作用，但尚未报道在单纯疱疹病毒感染中的抗病毒作用及应用。

发明内容

有鉴于上述技术问题，本发明提供了芬母多肽在制备抑制II型单纯疱疹病毒感染药物中的应用。

本发明的第一个目的是提供芬母多肽在制备抑制病毒感染药物中的应用，所述芬母多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述病毒为II型单纯疱疹病毒。

本发明的第二个目的是提供一种抑制II型单纯疱疹病毒的药物，所述药物的有效活性成分为所述芬母多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：

本发明首次发现芬母多肽(Funme peptide，FP)可通过破坏HSV-2包膜结构，进而使其丧失对易感细胞的侵染，达到抗病毒感染的功能。本发明为研制新型抗HSV-2感染药物提供重要实验依据。

附图说明

图1为芬母多肽二级结构图。

图2为芬母多肽抗HSV-2作用空斑形成实验检测及鉴定。

图3为芬母多肽抗HSV-2作用病毒核酸水平检测及鉴定。

图4为芬母多肽抗HSV-2作用扫描电镜检测及鉴定。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所应用的芬母多肽(Funme peptide，FP)由江苏吉锐生物技术有限公司提供，商品编号为2374916-29-5。

将来源于牛α-螺旋Cathelicidin抗菌肽BMAP-27的衍生物BMAP-18进行优化，在原有18个氨基酸结构中甲硫氨酸位点添加一个丝氨酸，通过生物工程技术制取，获得芬母多肽，所述芬母多肽氨基酸序列为如SEQ ID NO：1所示，其二级结构为α螺旋结构，如图1所示。

实施例1

芬母多肽在细胞水平抑制HSV-2增殖的鉴定

(1)病毒空斑形成实验鉴定

将Vero细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，过夜培养，待细胞密度达到70％时，取MOI＝1的HSV-2与10μM、20μM、40μMuM、8010μM的FP预混10min，分别感染Vero细胞，同时作HSV-2对照和正常Vero细胞对照，5％CO2培养箱中培养2h后，弃病毒液，加入4％甲基纤维素培养基2ml/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养48h，从第二天开始观察是否有空斑形成以及空斑的数量，待空斑数稳定，小心吸去覆盖液培养基，加入结晶紫染液，室温染色10min，弃染液，洗去多余染料，进行观察。结果如图2所示，空斑形成实验表明，相对于HSV-2对照，FP在10μM和20μM浓度时抗病毒效果较弱，随着浓度的增加，对HSV-2的抑制作用逐步加强，在40μM浓度时，具有很强的抗HSV-2活性。

(2)qRT-PCR检测

将Vero细胞消化后传代至6孔板细胞培养板，过夜培养，待细胞密度达到70％时，取MOI＝1的HSV-2与40μM浓度的FP预混10min，分别感染Vero细胞，同时作HSV-2对照和正常Vero细胞对照，5％CO2培养箱中培养2h后，弃病毒液，加入10％DMEM细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养。以24h和48h两个时间点提取细胞样本总RNA，定量2000ng总RNA反转录为cDNA。以SYBR green为荧光染料，HSV-2ICP27片段为目的基因，β-actin为内参进行qRT-PCR检测。结果如图3所示，结果显示，在感染病毒24小时和48小时两个时间点，相对于HSV-2病毒对照组，FP在40μM浓度时抗病毒作用效果明显，检测不到HSV-2病毒载量，具有很强的抗病毒作用。

HSV-2引物序列：

Forward:CCCTTTCTGCAGTGCTACCT，如SEQ ID NO：2所示；

Reverse:CCTTAATGTCCGACAGGCGT，如SEQ ID NO：3所示。

(3)扫描电镜鉴定

将Vero细胞消化后传代至25cm³细胞培养瓶，过夜培养，待细胞密度达到70％时，取MOI＝1的HSV-2与40μM浓度的FP预混10min，感染Vero细胞，同时作HSV-2对照和正常Vero细胞对照，5％CO2培养箱中培养2h后，弃病毒液，加入10％DMEM细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中培养48h后，离心手机细胞样本，浸入电镜固定液24h后制备超薄切片，进行透射电镜观察。结果如图4所示，从电镜结果表明，HSV-2感染Vero 48小时，在细胞核和细胞质中均有大量增殖的病毒颗粒，病毒核心被囊膜包裹，结构完整；与FP作用的样本中，可以看到细胞核周围聚集有大量不完整的HSV-2病毒颗粒，由于包膜结构被破坏，不能通过包膜上的识别受体进入细胞核，从而无法完成病毒增殖的过程，说明FP通过破坏病毒包膜结构，达到抑制病毒增殖的作用。

结论：芬母多肽通过自身强阳离子特性被HSV-2吸附，破坏病毒包膜结构，进而丧失对易感细胞的侵染，达到抗病毒感染的作用，本发明研究证明：芬母多肽可作为抗病毒候选药物，为研制新型抗HSV-2感染药物提供重要实验依据。

需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 芬母多肽在制备抑制II型单纯疱疹病毒感染药物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys

1 5 10 15

Lys Leu Ser

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctttctgc agtgctacct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccttaatgtc cgacaggcgt 20

Claims (3)

1.芬母多肽在制备抑制病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述芬母多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒为II型单纯疱疹病毒。

3.一种抑制II型单纯疱疹病毒感染的药物，其特征在于，所述药物的有效活性成分为权利要求1所述的芬母多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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