CN112457376A

CN112457376A - 一种结构改造的抗菌肽bmap-14及其应用

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Publication number: CN112457376A
Application number: CN202011390981.7A
Authority: CN
Inventors: 刘炯宇; 江建平
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-03-09
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN112457376B

Abstract

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种结构改造的抗菌肽BMAP‑14及其应用。具体技术方案为：一种抗菌肽BMAP‑14，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种新的改造抗菌肽，保留了BMAP‑18的N端结构，保留了广谱抗菌性能，具有良好的耐热性、一定的血浆稳定性和极低的溶血性；可广泛应用于抗菌领域。

Description

一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用。

背景技术

病原体对抗生素产生耐药性是全球公共卫生面临的严重威胁；解决办法之一是寻找新型的抗菌物质。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点，尤其具有不易产生耐药性的特点。虽然其抗菌效果略低于传统的抗生素，但在耐药性病原体大量出现的今天,仍被认为是能取代现有抗生素的重要选择。目前，已有多种抗菌肽正在进行可行性研究。其中，Cathelicidin类抗菌肽广泛分布在人体内，及猴、鼠、兔、猪、鸡、鹌鹑、牛、羊、马、驴、鱼、蛇、蛙等多种动物体内。牛源cathelicidin类抗菌肽(含衍生肽)主要包括BMAP-18、BMAP-27、BMAP-28、BMAP-34、Bac4、Bac5、Bac7、Indolicidin和Dodecapeptide等。

目前已知的抗菌肽种类较多，虽然从理论上来说，抗菌肽分子越小，抗原性越小，生产和存储成本也越低，但多肽的改造存在很多不确定性，简单的增减、替换氨基酸，可能不会对多肽性能带来实质性影响，也可能使多肽几乎完全失去核心功能。

另外，影响抗菌肽在医药领域发挥作用的一个重要限制是溶血率。溶血率是指受到破坏、发生溶解的红细胞占正常红细胞的比例。天然抗菌肽往往容易导致红细胞发生溶血。例如，一篇名为《新型血红蛋白抗菌肽抑菌活性及溶血性研究》(动物医学进展，2014,35(9)：54-57)中公开了一种溶血率较低的抗菌肽，但在抗菌肽浓度为2mg/mL(2000μg/uL)时，溶血率也达到了6.7％，依然超过安全阈值。

因此，如果能提供一种新的改造后的抗菌肽，既保留抗菌肽优异的广谱抗菌活性，又具有极低的溶血率，将在医药领域发挥巨大作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构改造后的抗菌肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

相应的，一种抗菌肽，将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得，BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

相应的，所述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

相应的，所述抗菌肽的制备方法，将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得。

相应的，所述抗菌肽的制备方法，按SEQ ID NO.1序列，化学合成或生物合成所述抗菌肽。

本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种新的改造抗菌肽，保留了BMAP-18的N端结构，保留了广谱抗菌性能，具有良好的耐热性、一定的血浆稳定性，而且具有极低的溶血率，在高达8192μg/mL的浓度下，溶血率依然不足1％，可广泛应用于抗菌领域。

附图说明

图1为不同氨基酸长度的BMAP抗菌肽的空间结构示意图；

图2为各抗菌肽浓度与溶血率间关系示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种结构改造后的抗菌肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抗菌肽由牛源cathelicidin抗菌肽BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得，为单链多肽，全文命名为：BMAP-14。

本发明提供的抗菌肽具有抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌活性的作用；并具有极低的溶血性、良好的耐热性和一定的血浆稳定性，可广泛应用于制备抗菌相关产品。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：构建BMAP-14

1、使用I-TASSER预测，建立未经改造的抗菌肽BMAP-18的空间结构；设计BMAP-18的C端减少4个氨基酸的BMAP-14，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时设计BMAP-18的C端分别减少5个、3个、2个的多肽，分别命名为BMAP-13、BMAP-15、BMAP-16。经I-TASSER预测，设计的各多肽的空间结构如图1所示。图1中，由A至B，分别对应：BMAP-13、BMAP-14、BMAP-15、BMAP-16、BMAP-18。

从图1可以看出：本发明提供的BMAP-14与BMAP-18的N端最为接近，基本保持了BMAP-18的N端部分不变，暗示其可能保持了母体抗菌肽BMAP-18的抗菌活性；其余多肽的空间结构均在BMAP-18的N端基础上发生明显变化。

2、委托多肽合成公司化学合成抗菌肽BMAP-14和BMAP-18以进行后继实验。合成的各多肽纯度均大于95％，且经脱盐处理，为干粉状，置于-20℃保存，使用前用PBS配成所需浓度。

实施例二：BMAP-14性能检测

1、抗菌活性检测。

(1)采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的肉汤微量稀释法抗菌实验(M7-A8)，测定BMAP-14和BMAP-18对细菌的最小抑菌浓度(MIC值)，检测培养基为钙调MH肉汤培养基。

(2)采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的肉汤微量稀释法抗酵母样真菌药敏实验(M27-A2)，测定BMAP-14和BMAP-18对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC值)，检测培养基为沙氏葡萄糖液体培养基。

(3)检测结果如表1所示。表1中，“ND”表示未检测到活性，“/”表示未进行对应试验。

表1各抗菌肽及对照抗生素的MIC值(μg/mL)

从结果可以看出：BMAP-14对细菌的整体抗性略弱于BMAP-18，对真菌的抗性略强于BMAP-18。这两种抗菌肽对所检测的两株耐药菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌)均具有较好的抗性，其MIC值小于或等于对应的敏感菌(金黄色葡萄球菌ATCC29213和大肠埃希菌ATCC25922)，说明相比敏感菌，BMAP-14和BMAP-18对耐药菌的整体抗性更强。氨苄西林对两株耐药菌的MIC值已经超过本实验的检测上限(32μg/mL)，四环素对产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌的MIC值已经超过本实验的检测上限(64μg/mL)，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC值(64μg/mL)相对其敏感菌的MIC值(1μg/mL)提高了数十倍，说明作为对照的各抗生素对耐药菌株的整体抗性明显更弱。

2、溶血活性检测。

取健康成人新鲜血液(添加抗凝剂EDTA-K2)，900×g离心15min，吸去血浆层。加入3倍的PBS，轻轻吹吸混匀，离心弃上清。如此反复三次，配成压积红细胞。

在U形底96孔板的孔中加入8％(v/v)的压积红细胞125μL，再加入倍比稀释(16384μg/mL、8192μg/mL、……、8μg/mL，浓度依次减少1倍)的各抗菌肽溶液125μL(即终浓度为8192μg/mL、4096μg/mL、……、4μg/mL)，阴性对照孔加入125μL的PBS，阳性对照孔加入含0.2％Triton×100的125μL的PBS液。后续操作中，涉及倍比稀释的操作与此处相同，下文不再赘述。将各组分别在37℃的恒温箱中温育1小时后，将96孔板在1000×g下离心5分钟，转移上清入新的平底96孔板中，读取各孔540nm下的OD值。根据下面公式计算溶血率：

溶血率(％)＝(ODt－ODnc)/(ODpc－ODnc)×100％。

其中，ODt为试验孔吸光度，ODnc为阴性对照孔吸光度，ODpc为阳性对照孔吸光度。

结果如图2所示。从图中可以看出，BMAP-14和BMAP-18都具有很低的溶血率，即使高达8192μg/mL的浓度都未达到最小溶血率(5％)。而BMAP-14的溶血率测试表现更为优越：在所有检测浓度下，溶血率均不足1％。因此，BMAP-14具有极低的溶血活性,非常适合应用于医药领域。

3、血浆稳定性检测。

取健康成人新鲜血液(添加抗凝剂EDTA-K2)，1000×g离心20min，吸取上清中的血浆。将血浆经0.22微米微孔滤膜过滤后，按1：1(v/v)加入倍比稀释的BMAP-14和BMAP-18抗菌肽溶液，分装，立即放入37℃水浴锅中孵育。孵育时间0.5小时、2小时、20小时后分别取出冷冻保存备用。再按照前述抗菌活性检测的方法检测抗菌活性。

实验结果表明：血浆孵育后的BMAP-14和BMAP-18对细菌无抗性。在血浆中孵育0.5小时和2小时后，对检测的真菌(白色念珠菌)的MIC值同表1，血浆中孵育20小时后的抗真菌MIC值变弱为256μg/mL。说明这两种抗菌肽在血浆中无抗细菌能力，但具有抗真菌能力，也说明了这类抗菌肽对细菌和真菌的抗菌机理可能有所不同。

4、热稳定性检测。

取倍比稀释的BMAP-14和BMAP-18抗菌肽溶液，分装，并立即分别放入30℃、60℃、90℃水浴锅中孵育0.5小时。按照前述抗菌活性检测方法进行实验。实验结果表明：不同温度处理后的BMAP-14和BMAP-18抗细菌和抗真菌能力不变，MIC值同表1，说明这两种抗菌肽都具有良好的热稳定性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 抗菌肽(BMAP-14)

<400> 1

Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe

1 5 10

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 抗菌肽(BMAP-18)

<400> 2

Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys Lys

1 5 10 15

Leu Ser

Claims

1.一种抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种抗菌肽，其特征在于：将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得，BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

4.权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得。

5.权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法，其特征在于：按SEQ ID NO.1序列，化学合成或生物合成所述抗菌肽。