CN112457376A - 一种结构改造的抗菌肽bmap-14及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质工程领域,具体涉及一种结构改造的抗菌肽BMAP‑14及其应用。具体技术方案为:一种抗菌肽BMAP‑14,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供了一种新的改造抗菌肽,保留了BMAP‑18的N端结构,保留了广谱抗菌性能,具有良好的耐热性、一定的血浆稳定性和极低的溶血性;可广泛应用于抗菌领域。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程领域,具体涉及一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用。
背景技术
病原体对抗生素产生耐药性是全球公共卫生面临的严重威胁;解决办法之一是寻找新型的抗菌物质。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高等特点,尤其具有不易产生耐药性的特点。虽然其抗菌效果略低于传统的抗生素,但在耐药性病原体大量出现的今天,仍被认为是能取代现有抗生素的重要选择。目前,已有多种抗菌肽正在进行可行性研究。其中,Cathelicidin类抗菌肽广泛分布在人体内,及猴、鼠、兔、猪、鸡、鹌鹑、牛、羊、马、驴、鱼、蛇、蛙等多种动物体内。牛源cathelicidin类抗菌肽(含衍生肽)主要包括BMAP-18、BMAP-27、BMAP-28、BMAP-34、Bac4、Bac5、Bac7、Indolicidin和Dodecapeptide等。
目前已知的抗菌肽种类较多,虽然从理论上来说,抗菌肽分子越小,抗原性越小,生产和存储成本也越低,但多肽的改造存在很多不确定性,简单的增减、替换氨基酸,可能不会对多肽性能带来实质性影响,也可能使多肽几乎完全失去核心功能。
另外,影响抗菌肽在医药领域发挥作用的一个重要限制是溶血率。溶血率是指受到破坏、发生溶解的红细胞占正常红细胞的比例。天然抗菌肽往往容易导致红细胞发生溶血。例如,一篇名为《新型血红蛋白抗菌肽抑菌活性及溶血性研究》(动物医学进展,2014,35(9):54-57)中公开了一种溶血率较低的抗菌肽,但在抗菌肽浓度为2mg/mL(2000μg/uL)时,溶血率也达到了6.7%,依然超过安全阈值。
因此,如果能提供一种新的改造后的抗菌肽,既保留抗菌肽优异的广谱抗菌活性,又具有极低的溶血率,将在医药领域发挥巨大作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种结构改造后的抗菌肽,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
为实现上述发明目的,本发明所采用的技术方案是:一种抗菌肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
相应的,一种抗菌肽,将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得,BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
相应的,所述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
相应的,所述抗菌肽的制备方法,将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得。
相应的,所述抗菌肽的制备方法,按SEQ ID NO.1序列,化学合成或生物合成所述抗菌肽。
本发明具有以下有益效果:本发明提供了一种新的改造抗菌肽,保留了BMAP-18的N端结构,保留了广谱抗菌性能,具有良好的耐热性、一定的血浆稳定性,而且具有极低的溶血率,在高达8192μg/mL的浓度下,溶血率依然不足1%,可广泛应用于抗菌领域。
附图说明
图1为不同氨基酸长度的BMAP抗菌肽的空间结构示意图;
图2为各抗菌肽浓度与溶血率间关系示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种结构改造后的抗菌肽,氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抗菌肽由牛源cathelicidin抗菌肽BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得,为单链多肽,全文命名为:BMAP-14。
本发明提供的抗菌肽具有抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌活性的作用;并具有极低的溶血性、良好的耐热性和一定的血浆稳定性,可广泛应用于制备抗菌相关产品。
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一:构建BMAP-14
1、使用I-TASSER预测,建立未经改造的抗菌肽BMAP-18的空间结构;设计BMAP-18的C端减少4个氨基酸的BMAP-14,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示;同时设计BMAP-18的C端分别减少5个、3个、2个的多肽,分别命名为BMAP-13、BMAP-15、BMAP-16。经I-TASSER预测,设计的各多肽的空间结构如图1所示。图1中,由A至B,分别对应:BMAP-13、BMAP-14、BMAP-15、BMAP-16、BMAP-18。
从图1可以看出:本发明提供的BMAP-14与BMAP-18的N端最为接近,基本保持了BMAP-18的N端部分不变,暗示其可能保持了母体抗菌肽BMAP-18的抗菌活性;其余多肽的空间结构均在BMAP-18的N端基础上发生明显变化。
2、委托多肽合成公司化学合成抗菌肽BMAP-14和BMAP-18以进行后继实验。合成的各多肽纯度均大于95%,且经脱盐处理,为干粉状,置于-20℃保存,使用前用PBS配成所需浓度。
实施例二:BMAP-14性能检测
1、抗菌活性检测。
(1)采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的肉汤微量稀释法抗菌实验(M7-A8),测定BMAP-14和BMAP-18对细菌的最小抑菌浓度(MIC值),检测培养基为钙调MH肉汤培养基。
(2)采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)的肉汤微量稀释法抗酵母样真菌药敏实验(M27-A2),测定BMAP-14和BMAP-18对白色念珠菌的最小抑菌浓度(MIC值),检测培养基为沙氏葡萄糖液体培养基。
(3)检测结果如表1所示。表1中,“ND”表示未检测到活性,“/”表示未进行对应试验。
表1各抗菌肽及对照抗生素的MIC值(μg/mL)
从结果可以看出:BMAP-14对细菌的整体抗性略弱于BMAP-18,对真菌的抗性略强于BMAP-18。这两种抗菌肽对所检测的两株耐药菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌)均具有较好的抗性,其MIC值小于或等于对应的敏感菌(金黄色葡萄球菌ATCC29213和大肠埃希菌ATCC25922),说明相比敏感菌,BMAP-14和BMAP-18对耐药菌的整体抗性更强。氨苄西林对两株耐药菌的MIC值已经超过本实验的检测上限(32μg/mL),四环素对产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌的MIC值已经超过本实验的检测上限(64μg/mL),对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的MIC值(64μg/mL)相对其敏感菌的MIC值(1μg/mL)提高了数十倍,说明作为对照的各抗生素对耐药菌株的整体抗性明显更弱。
2、溶血活性检测。
取健康成人新鲜血液(添加抗凝剂EDTA-K2),900×g离心15min,吸去血浆层。加入3倍的PBS,轻轻吹吸混匀,离心弃上清。如此反复三次,配成压积红细胞。
在U形底96孔板的孔中加入8%(v/v)的压积红细胞125μL,再加入倍比稀释(16384μg/mL、8192μg/mL、……、8μg/mL,浓度依次减少1倍)的各抗菌肽溶液125μL(即终浓度为8192μg/mL、4096μg/mL、……、4μg/mL),阴性对照孔加入125μL的PBS,阳性对照孔加入含0.2%Triton×100的125μL的PBS液。后续操作中,涉及倍比稀释的操作与此处相同,下文不再赘述。将各组分别在37℃的恒温箱中温育1小时后,将96孔板在1000×g下离心5分钟,转移上清入新的平底96孔板中,读取各孔540nm下的OD值。根据下面公式计算溶血率:
溶血率(%)=(ODt-ODnc)/(ODpc-ODnc)×100%。
其中,ODt为试验孔吸光度,ODnc为阴性对照孔吸光度,ODpc为阳性对照孔吸光度。
结果如图2所示。从图中可以看出,BMAP-14和BMAP-18都具有很低的溶血率,即使高达8192μg/mL的浓度都未达到最小溶血率(5%)。而BMAP-14的溶血率测试表现更为优越:在所有检测浓度下,溶血率均不足1%。因此,BMAP-14具有极低的溶血活性,非常适合应用于医药领域。
3、血浆稳定性检测。
取健康成人新鲜血液(添加抗凝剂EDTA-K2),1000×g离心20min,吸取上清中的血浆。将血浆经0.22微米微孔滤膜过滤后,按1:1(v/v)加入倍比稀释的BMAP-14和BMAP-18抗菌肽溶液,分装,立即放入37℃水浴锅中孵育。孵育时间0.5小时、2小时、20小时后分别取出冷冻保存备用。再按照前述抗菌活性检测的方法检测抗菌活性。
实验结果表明:血浆孵育后的BMAP-14和BMAP-18对细菌无抗性。在血浆中孵育0.5小时和2小时后,对检测的真菌(白色念珠菌)的MIC值同表1,血浆中孵育20小时后的抗真菌MIC值变弱为256μg/mL。说明这两种抗菌肽在血浆中无抗细菌能力,但具有抗真菌能力,也说明了这类抗菌肽对细菌和真菌的抗菌机理可能有所不同。
4、热稳定性检测。
取倍比稀释的BMAP-14和BMAP-18抗菌肽溶液,分装,并立即分别放入30℃、60℃、90℃水浴锅中孵育0.5小时。按照前述抗菌活性检测方法进行实验。实验结果表明:不同温度处理后的BMAP-14和BMAP-18抗细菌和抗真菌能力不变,MIC值同表1,说明这两种抗菌肽都具有良好的热稳定性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种结构改造的抗菌肽BMAP-14及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 抗菌肽(BMAP-14)
<400> 1
Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe
1 5 10
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 抗菌肽(BMAP-18)
<400> 2
Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser
Claims (5)
1.一种抗菌肽,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种抗菌肽,其特征在于:将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得,BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。
4.权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法,其特征在于:将BMAP-18的C端截短4个氨基酸后获得。
5.权利要求1或2所述抗菌肽的制备方法,其特征在于:按SEQ ID NO.1序列,化学合成或生物合成所述抗菌肽。
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