CN117286258A - 墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用，针对现阶段培育墨西哥湾扇贝存在的问题，运用磁珠富集法筛选墨西哥湾扇贝微卫星分子标记，并利用微卫星标记对墨西哥湾扇贝的遗传多样性进行评价；由测序得到的微卫星序列设计并获得了20对能够在墨西哥湾扇贝基因组有效扩增且具有多态性的微卫星引物。本发明有助于了解墨西哥湾扇贝的遗传特征，为墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据。

Description

墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用
本申请是申请号为201910732693.6，申请日为2019.08.09，发明名称为“墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用“的分案申请。
技术领域
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，尤其涉及墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用。
背景技术
墨西哥湾扇贝原产于美国，主要分布在美国东部大西洋沿岸新泽西州至佛罗里达州之间的海域，由于其双壳比海湾扇贝更加膨凸，出柱率高于海湾扇贝。与海湾扇贝相比，墨西哥湾扇贝具有出肉率高、出柱率高、生长快、适合在中国南方海域养殖等特点。尤其是养殖周期较短，能够避开台风以减少损失，受到业界青睐。至2014年，其养殖面积已超过6600hm2，成为北部湾海域贝类养殖的重要产业。但是墨西哥湾扇贝引种至今已近30年，随着养殖世代的增加，加上近交和瓶颈效应，该品种出现了抗逆性降低、生长速度减慢、个体小型化、死亡率升高等一系列问题，养殖效益严重下滑。
微卫星DNA(Microsatellite DNA)，又称简单重复序列(Simple SequenceRepeats，SSR)，是目前应用最为广泛的分子标记之一，其核心重复序列一般为1-6个碱基，如(CA)n、(GT)n、(CAG)n、(AGCT)n等，首尾相连组成的串联重复序列，长度一般在100bp以内。微卫星标记在家系建立、减少或避免近交衰退，个体识别和亲缘关系鉴定等工作中具有重要作用。
申请号为201410750857.5中国专利，其公开了14个管角螺微卫星位点及其引物，所获引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，用于管角螺的种群遗传多样性检测、个体鉴定或分子辅助育种方法；但是没有给出具体的应用方法和应用结果分析。
现阶段，尚无一种对墨西哥扇贝的系统性遗传特征分析方法，为解决该品种容易出现的抗逆性降低、生长速度减慢、个体小型化、死亡率升高等一系列问题，养殖效益严重下滑，因此对墨西哥湾扇贝进行种质资源改良已经迫在眉睫，为进一步了解墨西哥湾扇贝养殖群体的遗传特征，为墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据，对墨西哥湾扇贝进行微卫星标记、遗传信息的有效分析十分迫切。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物及其构建方法和应用，针对墨西哥湾扇贝出现的养殖问题，开发筛选出微卫星分子标记，并利用微卫星标记分析墨西哥湾扇贝的遗传多样性，为了解墨西哥湾扇贝养殖群体的遗传特征、墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据。
为此本发明采用以下技术方案：
一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物，墨西哥湾扇贝的多态性微卫星位点序号、及用于扩增所述墨西哥湾扇贝微卫星位点的特异引物对包括如下20个中的任一个，其的特征如下：
进一步的，所述墨西哥湾扇贝微卫星位点在基因库中对应的编号位置如下：
本发明提供一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的构建方法，微卫星位点的筛选方法包括如下步骤：
(1)提取墨西哥湾扇贝的基因组DNA；
(2)以步骤(1)所述DNA为模板DNA，将所述模板DNA进行酶切，得到酶切DNA片段；
(3)接头的制备与连接：各取序列为Sau A：GATCGTCGGTACCGAATTCT和Sau B：GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC的引物，混合置于灭菌PCR管中，将所述PCR管放于PCR仪中进行变性处理，所得即为接头；再利用T4DNA连接酶将所述接头和步骤(2)所得DNA片段进行连接，得到连接产物；
(4)以连接产物作为模板，以Sau A：GATCGTCGGTACCGAATTCT作为引物，进行PCR扩增，得到第一次扩增产物；
(5)以第一次扩增产物为模板DNA，将生物素标记探针、第一次扩增产物混合进行杂交反应，得到杂交混合液；再将杂交混合液与磁珠充分混合，得到含有微卫星序列的DNA单链片段；
(6)以含有微卫星序列的DNA单链片段作为模板，以Sau A：GATCGTCGGTACCGAATTCT作为引物，进行PCR扩增，纯化后得到第二次扩增产物；
(7)将第二次扩增产物进行富集片段的克隆和筛选，然后进行测序，使用软件SSRHunter对测序结果中含有的微卫星核心序列进行查找，使用Primer 5.0软件设计引物，引物设计原则：退火温度为55-60℃，引物长度为18-25bp，(G+C)含量为45％-55％；再将选出的引物进行引物合成，得到合成的引物；
(8)以墨西哥湾扇贝DNA为模板，将合成的引物进行退火温度梯度PCR扩增，所得PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出能获得清晰条带的引物，并调节PCR反应条件以确定每对引物的最适退火温度；
将所述筛选出能获得清晰条带的引物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行群体多态性分析，筛选出20对具有多态性的特异引物。
进一步地，在步骤(2)中，所述酶切方法是用Sau3AI限制性核酸内切酶对墨西哥湾扇贝基因组DNA进行酶切，于温度37℃反应4h得到反应液，取4μL反应液混合6×loadingBuffer后，在1.2％的琼脂糖胶上电泳30min检测酶切反应是否完全，并用北京康为世纪公司的DNA胶回收试剂盒回收酶切300-1000bp的DNA片段；其中，所述酶切的反应体系为50μL，包含40μL的模版DNA、0.6μL的Sau3AI、5μL的10×Buffer、4.4μL的ddH2O。
进一步地，在步骤(3)中，所述变形处理的操作温度为95℃，处理时间为10min。
进一步地，在步骤(4)中，所述连接产物制作模板的方法是：取3μL步骤(3)所述连接产物置于新的灭菌PCR管中，加入27μL ddH2O，用稀释后的连接产物作为模板；
所述PCR扩增的方法是：用稀释后的连接产物作为模板，以10μmol/L的Sau A作为引物，进行PCR扩增；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，得到第一次扩增产物，4℃保存产物；
所述扩增的反应体系为25μL，包含1μL模版DNA、2μL Sau A、0.4μL的Taq酶、5μL的5×Buffer、2μL的Mg2+、1μL dNTP、13.6μL的ddH2O。
进一步地，在步骤(5)中，所述生物素标记探针是：以生物素标记的(CA)16和(GA)16为探针序列；
所述杂交反应体系为100μL，包含15μL的20×SSC、10μL模版DNA、200pmol的生物素标记探针。
进一步地，在步骤(6)中，所述PCR扩增的反应体系为25μL，包含6μL的模版DNA、2μL的Sau A、0.4μL的Taq酶、1μL dNTP、2μL的Mg2+、5μL的5×Buffer、8.6μL的ddH2O；
所述PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存产物；
所述纯化是利用PCR纯化试剂盒回收纯化。
进一步地，在步骤(8)中，所述PCR扩增的反应体系为10μL，包含1μL的模版DNA、1μL的10×Buffer、0.25U的Taq酶、1.5mM的Mg2+、10μM引物R、10μM引物F、2mM dNTP、4.35μL的ddH2O；
所述PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃预变性45s，退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存产物。
本发明提供一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的应用，是对墨西哥湾扇贝遗传多样性分析，包括如下步骤：
(1)提取墨西哥湾扇贝的基因组DNA；
(2)以墨西哥湾扇贝的特异引物对、步骤(1)所述基因组DNA，进行PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物的通过采用8％非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，以10bp DNA ladder为对照，银染显色，使用凝胶扫描仪进行扫描；所述PCR扩增的反应体系和反应程序与步骤(8)中相同。
(3)用POPGENE软件计算每个位点的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度和期望杂合度；用软件CERVUS计算每个位点的多态信息含量；用GENPOP软件根据等位基因频率对各群体各个位点进行哈迪-温伯格平衡的检验；用POPGENE软件对各群体间的遗传距离进行计算，使用MEGA7.0软件根据各群体间的遗传距离构建聚类关系树。
本发明所用原料如下，限制性核酸内切酶Sau3AI、链亲和素免疫磁珠、10×Buffer(含Mg2+)、Taq DNA聚合酶(5U/μL)购自Promega公司；T4 DNA连接酶(350U/μL)、质粒pMDTM20-T载体、6×loading Buffer购自TaKaRa生物公司；dNTP(2.5mmol/L)、40％丙烯酰胺/甲双叉丙烯酰胺母液、LB固体培养基、过硫酸铵(APS)、TEMED(N,N,N',N'-四甲基二乙胺)、LB液体培养基购自生工生物(上海)工程有限公司；DM2000 DNA Marker、氨苄青霉素(AMP)、PCR纯化试剂盒、蛋白酶K、DNA胶回收试剂盒购自北京康为世纪有限公司；Mg2+(25mmol/L)、DH5α感受态细胞、5×Buffer购自全式金(北京)生物有限公司；10bpDNAladder购自Invitrogen(上海)生物技术有限公司；常用试剂AgNO3(分析纯)、NaCl(分析纯)、Na2EDTA·2H2O(二水合二胺四乙酸二钠)、无水乙醇(分析纯)、Na2CO3(分析纯)、NaOH(分析纯)、SDS(十二烷基磺酸钠)、甲醛溶液等购自上海国药有限公司；实验所需的引物、接头、探针均由生工生物(上海)工程有限公司合成。
所述合成的通用引物及序列如下：
本发明以墨西哥湾扇贝为研究对象，运用磁珠富集法筛选墨西哥湾扇贝微卫星分子标记，并利用微卫星标记对墨西哥湾扇贝的遗传多样性进行评价。由测序得到的微卫星序列设计并获得了20对能够在墨西哥湾扇贝基因组有效扩增且具有多态性的微卫星引物。本发明有助于了解墨西哥湾扇贝的遗传特征，为墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明利用磁珠富集法首次开发墨西哥湾扇贝微卫星标记，以生物素标记的(CA)16和(GA)16为探针来捕获微卫星序列，结果获得了大量的微卫星序列，证明墨西哥湾扇贝中含有丰富的(CA/GT)n和(GA/CT)n，微卫星核心序列具有高重复数，高达35次，表现出高度多态性。
2.本发明方法有助于了解墨西哥湾扇贝的遗传特征，为墨西哥湾扇贝种质资源改良提供相关的遗传背景资料和理论依据。
附图说明
附图1为本发明的微卫星位点AIC1-94在30个墨西哥湾扇贝个体中的PCR扩增电泳图。
附图2为本发明的微卫星位点AIC3-47在30个墨西哥湾扇贝个体中的PCR扩增电泳图。
附图3为本发明的墨西哥湾扇贝7个养殖群体的UPGMA聚类分析图。
具体实施方式
一、配制试剂
10％SDS：10g SDS水浴加热溶解于80mL灭菌超纯水中，定容至100mL。
1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)：称取121.1g Tris-base到烧杯中，在烧杯中加入800mL灭菌超纯水，完全溶解后缓慢加入HCl将pH调至8.3，再加入超纯水定容至1000mL备用。
5mol/L NaCl溶液：称取29.25g NaCl溶于85mL蒸馏水中，定容至100mL。
组织裂解液：5M NaCl 6.25mL，1M Tris-HCl 2.5mL，1M EDTA 2.5mL，尿素(CH4N2O)90.09g，10％SDS2.5mL，加蒸馏水定容至250mL。
50×TAE缓冲液：在烧杯中加入242g Tris-base，57.1mL冰醋酸(C2H4O2)，37.2gNa2EDTA·2H2O，溶于800mL灭菌超纯水中，充分溶解后加入灭菌超纯水定容至1000mL。
20×SSC(pH＝7.0)：88.2g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)，175.3g NaCl，溶解于800mL灭菌超纯水中，再用10mol/L NaOH调节pH至7.0，加入蒸馏水定容至1000mL，高压灭菌。可以其为母液稀释至实验所需浓度。
10×TBE缓冲液(pH＝8.3)：在800mL灭菌超纯水中加入108g Tris-base，7.44gNa2EDTA·2H2O，55g H3BO3，充分溶解后加入灭菌超纯水定容至1000mL，并用pH计调节。
10％APS：0.5g APS，超纯水溶解后定容至5mL，保存于4℃冰箱，1w后重新配制。
0.1％AgNO3溶液：0.5g AgNO3溶于350mL灭菌超纯水中，充分溶解后加灭菌超纯水定容至500mL。
二、墨西哥湾扇贝微卫星标记的构建方法
微卫星位点的筛选方法包括如下步骤：
1、提取墨西哥湾扇贝的基因组DNA；具体包括如下步骤：
(1)将无水乙醇中冻存的扇贝闭壳肌组织取出，使用超纯水洗净后，切取20-30mg，充分剪碎后放入1.5mL的灭菌离心管中，在每个离心管中加入500μL组织裂解液，蛋白酶K10μL，在漩涡振荡器上振荡混匀，金属浴55℃直至消化至透明；
(2)等待组织消化至透明后，加入500μL DNA提取试剂(苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)，轻轻震荡混合20min，于室温下，以转速10000rpm离心10min，用移液枪小心吸取上清液置于1.5mL灭菌离心管中；
(3)于步骤(2)所述上清液中加入其体积的DNA提取试剂，在室温下以转速10000rpm离心10min，用移液枪小心吸取上清液置于新的1.5mL灭菌离心管中；
(4)于步骤(3)所得上清液中加入其等体积的核酸提取试剂(氯仿:异戊醇＝24:1)，在室温下以转速10000rpm离心10min，用移液枪小心吸取上清液置于新的1.5mL灭菌离心管中；
(5)于步骤(4)所得上清液中加入其等体积的异丙醇，沉淀核酸，12000rpm离心15min，弃上清液；
(6)加入1000μL预先在-20℃冰箱中冷冻的无水乙醇，12000rpm离心1min，弃上清液；
(7)重复步骤(6)，打开离心管口，在室温下等待无水乙醇完全挥发；
(8)加入50μL TE溶液完全溶解DNA；
(9)取2μL DNA原液混合6×loading Buffer后，用1.2％的琼脂糖凝胶电泳30min，在凝胶成像仪中观察检测基因组DNA的质量，将DNA原液调整需浓度后保存在4℃冰箱中。
2、墨西哥湾扇贝基因组DNA酶切与回收
用Sau3AI限制性核酸内切酶对墨西哥湾扇贝基因组DNA进行酶切，37℃4h，50μL反应体系包含：
取4μL反应液混合6×loading Buffer后，在1.2％的的琼脂糖胶上电泳30min检测酶切反应是否完全，并用北京康为世纪公司的DNA胶回收试剂盒回收酶切300-1000bp DNA片段。具体操作步骤如下：
(1)在紫外灯照射下用灭菌手术刀快速切取目标DNA 300-1000bp酶切片段，将含有目的片段的琼脂糖凝胶切碎并分装到1.5mL灭菌离心管中。
(2)预估离心管中胶块的体积，向离心管中加入等体积的Buffer PG；
(3)50℃水浴，每隔2-3min轻轻震荡离心管，使胶块充分溶解。在胶块完全溶解后，溶胶液为黄色透明液体；
(4)柱平衡：将吸附柱装入收集管，加入200μL Buffer PS，室温13000rpm离心1min，弃净收集管中的废液；
(5)将步骤(3)所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，单次加入的体积不可大于750μL，可分批加入，放置2min等待吸附膜吸附，室温13000rpm离心1min，弃净收集管中的废液；
(6)将吸附柱装入收集管，向吸附柱中加入450μL Buffer PW，室温13000rpm离心1min，弃净收集管中的废液；
(7)重复步骤(6)，室温13000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；
(8)将吸附柱装入一个新的1.5mL灭菌离心管中，等待吸附膜晾干，往吸附柱中的吸附膜位置悬空滴加30μL Buffer EB，室温放置2min以等待目的DNA溶解；室温13000rpm离心1min，收集DNA溶液，保存在4℃冰箱中。
3、接头的制备与连接
(一)接头的制备
Sau A：GATCGTCGGTACCGAATTCT和Sau B：GTCAAGAATTCGGTACCGTCGAC
将Sau A和Sau B分别加灭菌超纯水溶解至100μmol/L；
各取30μL Sau A和Sau B溶液，混合置于灭菌PCR管中，PCR仪中95℃变性10min，室温放置等待其自然冷却，在混合液中取5μL置于新的灭菌PCR管中，加入20μL ddH2O。稀释后的混合液即为接头。
(二)接头的连接
10μL反应体系：
混合液经轻微混匀离心后，PCR仪中16℃过夜以充分连接，然后65℃10min使T4DNA连接酶失活。
4、第一次PCR扩增
取3μL连接产物置于新的灭菌PCR管中，加入27μL ddH2O，用稀释后的连接产物作为模板，以Sau A(10μmol/L)作为引物，进行PCR扩增；
反应体系为25μL：
PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存产物。
取4μL的PCR产物与6×loading Buffer混合后，使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳30min检测。在确认PCR成功后，将所有的PCR产物混合后用PCR产物纯化试剂盒去除多余的dNTP、Sau A等；具体操作如下：
(1)加入PCR产物5倍体积的Buffer PB，充分混匀；
(2)柱平衡：向吸附柱中加入200μL Buffer PS，装入收集管中，室温13000rpm离心1min，弃净收集管中的废液；
(3)将吸附柱装入收集管中，将步骤(1)中混合液加入到吸附柱中，室温放置1min使混合液与吸附膜充分接触，室温13000rpm离心60s，弃净收集管中的废液，若样品体积大于吸附柱容积可分批加入；
(4)将吸附柱装回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer PW，静置3min使充分反应，室温13000rpm离心1min，弃净收集管中的废液；
(5)将吸附柱装回收集管中，室温13000rpm离心1min，弃净收集管中的废液。为除去吸附材料中残留的乙醇，将吸附柱开盖后于室温下放置数分钟使无水乙醇完全挥发；
(6)将吸附柱装入一个新的1.5mL灭菌离心管中，向吸附柱中的吸附膜中间位置悬空滴加30μL Buffer EB，室温放置2min使DNA完全溶解，室温13000rpm离心1min，离心管中为纯化后的DNA溶液，保存于4℃冰箱中。
5、探针杂交与含微卫星核心序列片段的富集
各取100μM的生物素标记探针3μL，加入27μL ddH2O以稀释10倍，充分混匀后，保存于-20℃冰箱；
(1)PCR产物的变性与杂交：取回收的纯化DNA 10μL与200pmol的生物素标记探针反应；
100μL杂交反应体系：
在PCR管中加灭菌超纯水补足100μL，先变性DNA 95℃10min，完成后马上置于冰盒中，然后温浴68℃1h。
(2)准备磁珠：用移液枪轻柔吹打混匀后吸取100μL磁珠悬浮液，置于1.5mL的灭菌离心管中，用磁力架固定磁珠，静置2min，弃净上清，在磁力架上用100μL 0.5×SSC清洗3次。
(3)富集：
1)将(1)中的杂交混合液加入到装有磁珠的离心管中，金属浴中25℃30min，期间每3min上下颠倒混匀一次使磁珠能与反应液充分反应，然后用磁力架固定磁珠，静置2min，弃上清；
2)经SSC多次清洗后，弃上清；加入30μL灭菌超纯水，95℃热洗脱10min，用磁力架固定磁珠，吸取上清液至一新的1.5mL灭菌离心管中；加入20μL的灭菌水，95℃热洗脱10min，用磁力架固定磁珠，吸取上清液至另一1.5mL灭菌离心管中，即为杂交后单链DNA。
6、第二次PCR扩增
以含有微卫星序列的DNA单链片段为模版，以Sau A为引物进行PCR扩增。
(1)反应体系为25μL：
(2)PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃预变性50s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存产物。
产物使用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，用PCR纯化试剂盒回收纯化后的DNA，放入4℃冰箱备用。
7、富集片段的克隆及筛选
(1)连接：将纯化后的DNA片段连接到质粒pMDTM20-T载体(TaKaRa)上。载体连接的反应体系为10μL：纯化DNA 4μL；pMDTM20-T Vector 1μL；solution I 5μL；PCR仪中16℃过夜反应连接。
(2)转化：
1)在-80℃冰箱中将DH5α感受态细胞取出，等待细胞冰浴中溶化后加入5μL连接产物，轻轻混匀后静置30min；
2)将离心管水浴42℃准确热激90s，放回冰中2min；
3)无菌操作，加入900μL已灭菌的LB液体培养基，检查离心管的管盖是否盖好，防止污染，37℃恒温振荡培养箱200rpm转动培养1h；
4)无菌操作，移液枪吸取40μL转化产物菌液均匀涂布于氨苄青霉素抗性LB固体培养基上，37℃培养1h，等待液体被完全吸收后，37℃生化培养箱中倒置培养12h后观察，如果菌落大小合适则可挑取菌落；
5)挑菌：向细胞培养板每个孔中加入300μL氨苄抗性LB液体培养基，用灭菌10μL小枪头挑取圆形单个菌落。用枪头在菌落上沾一下，然后插入细胞培养板中的液体培养基液面以下，用移液枪轻柔吹打，每个细胞培养板孔中一个菌落，做好标记，然后放到37℃恒温培养箱中，200rpm转动培养3h，对着光观察菌液浓度；
6)用无生物素标记的探针序列(CA)12及载体引物RV-M和M13-47对随机挑选的菌液进行PCR反应。扩增得到的PCR产物利用1.2％琼脂糖电泳进行检测，将符合条件的菌落送往上海生工生物公司进行测序。
三、微卫星标记的特异性引物
1、引物设计
使用软件SSR Hunter对测序结果中含有的微卫星核心序列进行查找；使用Primer5.0软件设计引物，引物设计原则：退火温度Tm值为55-60℃，引物长度为18-25bp，最适(G+C)含量为45％-55％。
2、引物筛选
以3个墨西哥湾扇贝样品DNA为模版，对合成的引物进行退火温度梯度PCR扩增，以确定每对引物的最适退火温度；
10μL反应体系：
PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃预变性45s，退火45s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存产物。
PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出能获得清晰条带的引物，并调节PCR反应条件以确定每对引物的最适退火温度。
3、筛选结果
将上述设计所得引物在30个墨西哥湾扇贝样本中进行验证，其中20对引物在个体间具有不同程度的多态性(表1)。将这20对引物以墨西哥湾扇贝30个样本作为模版进行PCR扩增，经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，等待电泳完毕后，将凝胶轻轻取下放入显色盘中进行银染显色，出现条带后将胶放入凝胶扫描仪进行扫胶。
检测结果如图1-2所示，所述20对引物都能通过上述方法进行验证，本实施例仅公开(AIC 1-94、AIC 3-47)的扩增电泳图。
其中，所述8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的具体步骤包括：
(1)使用洗洁精洗净玻璃板；
(2)在玻璃板的底部和两侧放置封胶条，将另一块玻璃板压在上面，对齐后用夹子固定；
(3)配置好的胶用玻璃棒轻微搅拌混匀，由灌胶口慢慢灌入，如果有气泡产生，可以晃动玻璃板以驱赶气泡，检查玻璃板内无气泡后将齿梳沿灌胶口轻轻插入，等待凝胶完全聚合；
(4)等待玻璃板内的凝胶完全聚合后，平稳拔出齿梳，组装玻璃板与电泳槽，在电泳槽中倒入1×TBE缓冲液；
(5)用移液枪在点样孔中每个样品点入1μL，其中一个点样孔中点入1μL 10bp DNAladder。220v恒压电泳约2.5h。
结果显示，每个位点的等位基因数为2-5个，平均等位基因数为3.5；观测杂合度(HO)为0.267-0.833，期望杂合度(HE)为0.269-0.650，平均观测杂合度为0.7071，平均期望杂合度为0.6979；多态信息含量(PIC)为0.246-0.582。所有位点中，有5个位点的PIC>0.5，属于高度多态位点；有13个位点的PIC介于0.25和0.5之间，属于中度多态位点；2个位点(AIC 1-50、AIC 5-52)的PIC<0.25，属于低度多态位点。在20个位点中有1个位点(AIC 4-62)显著偏离哈迪-温伯格平衡。
表1墨西哥湾扇贝微卫星位点及特异引物对的信息
注：表中*表示经过Bonferroni矫正后显著偏离哈迪-温伯格定律(P<0.05/20)。
四、墨西哥湾扇贝微卫星标记的应用，对墨西哥湾扇贝遗传多样性分析，包括如下步骤：
1、群体基因组DNA的提取，包括如下步骤：
(1)将无水乙醇中冻存的扇贝闭壳肌组织取出，称取20-30mg，使用超纯水洗净后，充分剪碎放入1.5mL的灭菌离心管中，在每个离心管中加入500μL组织裂解液，蛋白酶K10μL，在漩涡振荡器上振荡混匀，金属浴55℃直至消化至透明；
(2)等待组织消化至透明后，加入500μL DNA提取试剂(苯酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)，轻轻震荡混合20min，室温10000rpm离心10min，用移液枪小心吸取上清液置于新的1.5mL灭菌离心管中；
(3)估计上清液体积，加入等体积DNA提取试剂，室温10000rpm离心10min，用移液枪小心吸取上清液置于新的1.5mL灭菌离心管中；
(4)估计上清液体积，加入等体积核酸提取试剂(氯仿:异戊醇＝24:1)，室温10000rpm离心10min，用移液枪小心吸取上清液置于新的1.5mL灭菌离心管中；
(5)加入等体积的异丙醇，沉淀核酸，12000rpm离心15min，弃上清液；
(6)加入1000μL预先在-20℃冰箱中冷冻的无水乙醇，12000rpm离心1min，弃上清液；
(7)重复步骤(6)，打开离心管口，在室温下等待无水乙醇完全挥发；
(8)加入50μL TE溶液完全溶解DNA；
(9)取2μL DNA原液混合6×loading Buffer后用1.2％的琼脂糖凝胶电泳30min，在凝胶成像仪中观察检测基因组DNA的质量，利用超微量紫外分光光度计测量A260/280的比值和DNA浓度，根据测定结果将DNA原液调整至后续实验所需浓度，所有样品保存在4℃冰箱中。
2、群体PCR扩增
选取10对多态性引物(序号为：AIC1-50、AIC1-94、AIC2-9、AIC2-77、AIC3-45、AIC3-47、AIC4-74、AIC4-78、AIC5-25、AIC5-39)对墨西哥湾扇贝7个养殖群体进行PCR扩增。反应体系和程序同上(2、引物筛选)。产物的电泳检测采用8％非变性聚丙稀酰胺凝胶，以10bp DNA ladder为对照，银染显色，使用凝胶扫描仪(Bio-6000)进行扫描。
3、数据统计与分析
根据每个个体电泳结果显示的条带位置的不同确定其基因型并记录条带大小。用POPGENE软件计算每个位点的等位基因数(NA)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)，用软件CERVUS计算每个位点的多态信息含量(PIC)，检测结果见表3；用GENPOP软件根据等位基因频率对各群体各个位点进行哈迪-温伯格平衡的检验。用POPGENE软件对各群体间的遗传距离进行计算，使用MEGA7.0软件根据各群体间的遗传距离构建聚类关系树。
五、实验对象和实验方法：
实验用墨西哥湾扇贝选育系和对照系，是由广东省湛江银浪海洋生物技术有限公司种苗场于2015年9月通过人工催产育苗而得，于2016年2月分养至钦州、北海、防城港海域。墨西哥湾扇贝选育系为人工选育得到的F8代，对照系为目前在广西北部湾海域普遍养殖的墨西哥湾扇贝(Control line表示对照系，简称C；Selective line表示选育系，简称S)。每个群体取样30个个体，取闭壳肌样品用无水乙醇保存于-40℃冰箱。
(1)对上述生物进行遗传多样性分析，结果见表2-4。
(2)根据每个群体之间的遗传距离，采用UPGMA法，使用MEGA7.0软件对墨西哥湾扇贝7个养殖群体进行聚类分析。如图3所示，防城港选育系群体先与钦州选育系群体聚类，再与北海选育系群体聚类，再与防城港对照系群体聚类，再与北海对照系群体聚类，再与湛江对照系群体聚类，最后与钦州对照系群体聚类。
表2墨西哥湾扇贝7个养殖群体在10个微卫星基因座的多样性指数
注：表中*表示经过Bonferroni矫正后显著偏离哈迪-温伯格定律
表2结果表明，在墨西哥湾扇贝7个养殖群体中：
北海选育系群体平均等位基因数为2.8，平均有效等位基因数为2.12，平均多态信息含量为0.415，平均观测杂合度为0.370，平均期望杂合度为0.494；
北海对照系群体平均等位基因数为4.4，平均有效等位基因数为3.04，平均多态信息含量为0.553，平均观测杂合度为0.382，平均期望杂合度为0.618；
钦州选育系群体平均等位基因数为2.9，平均有效等位基因数为1.82，平均多态信息含量为0.367，平均观测杂合度为0.419，平均期望杂合度为0.445；
钦州对照系群体平均等位基因数为3.7，平均有效等位基因数为1.98，平均多态信息含量为0.418，平均观测杂合度为0.457，平均期望杂合度为0.482；
防城港选育系群体平均等位基因数为3.7，平均有效等位基因数为2.36，平均多态信息含量为0.465，平均观测杂合度为0.420，平均期望杂合度为0.530；
防城港对照系群体平均等位基因数为4.2，平均有效等位基因数为2.71，平均多态信息含量为0.551，平均观测杂合度为0.396，平均期望杂合度为0.624；
湛江对照系群体平均等位基因数为3，平均有效等位基因数为1.72，平均多态信息含量为0.346，平均观测杂合度为0.411，平均期望杂合度为0.407。
期望杂合度(HE)和多态信息含量(PIC)越高，群体内越有可能发生变异，具有更高的自然选择潜力；反之，群体内越不可能发生变异，自然选择潜力越低。在本实验的4个对照系群体中，防城港对照系群体的遗传多样性程度与北海对照系群体基本一致，高于钦州对照系群体，高于湛江对照系群体；3个选育系群体中，防城港选育系群体遗传多样性程度高于北海选育系群体，高于钦州选育系群体。结果表明，连续的人工选育对墨西哥湾扇贝的群体遗传多样性有一定的影响，造成遗传多样性有一定程度的降低，7个养殖群体内部遗传变异处于中等程度。
墨西哥湾扇贝7个养殖群体的平均多态信息含量(PIC)在0.346-0.553之间，其中北海对照系群体和防城港对照系群体为高度多态(PIC>0.5)，其余群体为中度多态(0.25<PIC<0.5)。
所有位点经过哈迪-温伯格平衡检验后发现，墨西哥湾扇贝7个养殖群体在多个位点均发现不同程度的偏离哈迪-温伯格平衡，其中北海对照系群体在位点AIC1-50、AIC3-45；防城港对照系群体在位点AIC2-9、AIC3-45、AIC5-39；北海选育系群体在位点AIC1-94、AIC4-74、AIC4-78；防城港选育系群体在位点AIC2-9、AIC4-78表现为不平衡而在其它位点表现为平衡，这可能是由于无效等位基因引起基因频率改变。
表3墨西哥湾扇贝7个养殖群体间的遗传距离(对角线下方)及遗传相似指数(对角线上方)
注：表中*表示经过Bonferroni矫正后显著偏离哈迪-温伯格定律
如表3所示，墨西哥湾扇贝7个养殖群体间遗传距离为0.0041-0.3368，其中钦州选育系群体和钦州对照系群体遗传相似指数最小(0.7140)，而遗传距离最远(0.3368)，说明钦州选育系群体和钦州对照系群体间的遗传变异度较高。防城港选育系群体和钦州选育系群体遗传相似指数最大(0.9976)，而遗传距离最近(0.0041)，说明防城港选育系群体和钦州选育系群体间亲缘关系较近。
表4墨西哥湾扇贝7个养殖群体的遗传分化指数(Fst)
如表4所示，群体间遗传分化系数(Fst)为0.2458-0.4934，遗传距离为0.0041-0.3368，其中钦州对照系群体与湛江对照系群体的遗传分化系数(Fst)最高(0.4934)，防城港对照系群体与北海选育系群体的遗传分化系数(Fst)最低(0.2458)；防城港选育系群体和钦州选育系群体遗传相似指数最大(0.9976)，而遗传距离最近(0.0041)，说明防城港选育系群体和钦州选育系群体间亲缘关系较近；钦州选育系群体和钦州对照系群体遗传相似指数最小(0.7140)，而遗传距离最远(0.3368)，说明钦州选育系群体和钦州对照系群体间的遗传变异度较高。
本实验所用的墨西哥湾扇贝选育系F8为连续人工选育第8代得到的品系，北海选育系、防城港选育系、钦州选育系之间的遗传距离非常接近，分析原因可能与高强度的人工选择有关。聚类分析研究表明墨西哥湾扇贝内部遗传变异处于中等程度，并有一定程度的分化趋势，这可能是基因型与环境互作的结果。
经过上述的遗传信息分析，结果显示墨西哥湾扇贝对于环境的适应能力较差，对照系群体的平均期望杂合度与平均多态信息含量均高于选育系群体，对照系群体遗传多样性指数高于选育系群体，表明连续的人工选育对墨西哥湾扇贝的群体遗传多样性有一定的影响，造成遗传多样性有一定程度的降低。7个养殖群体的内部遗传变异处于中等程度，并有一定程度的分化趋势，这可能是基因型与环境互作的结果。
因此，采用本发明的微卫星标记方法、特异引物以及遗传多样性分析方法是一种极为稳定可靠有效的方法。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种墨西哥湾扇贝微卫星标记的特异引物，其特征在于，墨西哥湾扇贝的多态性微卫星位点序号、及用于扩增所述墨西哥湾扇贝微卫星位点的特异引物对特征如下：
2.一种如权利要求1所述墨西哥湾扇贝微卫星标记的应用，其特征在于，是对墨西哥湾扇贝遗传多样性分析，包括如下步骤：
(1)提取墨西哥湾扇贝的基因组DNA；
(2)以权利要求1所述墨西哥湾扇贝特异引物对步骤(1)所述基因组DNA，进行PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物的通过采用8％非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测，以10bp DNAladder为对照，银染显色，使用凝胶扫描仪进行扫描；
(3)用POPGENE软件计算每个位点的等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度和期望杂合度；用软件CERVUS计算每个位点的多态信息含量；用GENPOP软件根据等位基因频率对各群体各个位点进行哈迪-温伯格平衡的检验；用POPGENE软件对各群体间的遗传距离进行计算，使用MEGA7.0软件根据各群体间的遗传距离构建聚类关系树。
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