CN1793358A - 海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用 - Google Patents

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胡景杰
包振民
汪小龙
战爱斌
惠敏
陆维
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Abstract

一种海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用，其方法是利用利用GenBank公布的海湾扇贝ESTs序列，利用微卫星检索软件Repeat Reporter1.5查找并分离微卫星DNA；然后在微卫星重复的侧翼序列设计引物，并优化引物成为微卫星标记；再对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的17个微卫星标记作为标准微卫星标记评价体系，应用于海湾扇贝种质及群体遗传学分析；利用上述的17个微卫星标记组成的评价体系再进一步选取不同养殖条件下的海湾扇贝进行种质资源评价。本方法有望为保护和持续利用海湾扇贝种质资源，建立集约型、健康型养殖产业和品牌战略提供技术支持。

Description

海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法和应用。
背景材料：
在人类及动植物的基因组中，包括内含子、编码区及染色体上的任一区域，均存在着由1-6个碱基对组成的简单重复序列(Simple Sequence Repeats)，简称SSRs，又称之为微卫星DNA(Microsatellite DNA)。随着分子标记的不断发展和完善，尽管出现了RAPD、RFLP、AFLP等标记，但是微卫星标记有优于其它标记的诸多优点，如：随机分布在整个基因组中，多态性高；可通过PCR迅速扩增，需要的DNA样品量较少，并且重复性好；孟德尔式遗传，共显性标记；引物序列公开发表，易于在各个实验室之间共用。因此，微卫星标记在遗传图谱的构建、遗传多样性分析和种质鉴定等方面得到广泛的应用。
海湾扇贝自然分布于分布于美国的东海岸和墨西哥湾沿岸，是一种雌雄同体的双壳海生贝类。由于其生长快、肉质鲜美，我国于1982年从美国引进海湾扇贝，首次在世界上形成了海湾扇贝养殖业，并迅速发展成为我国北方重要的海水养殖贝类，在海水养殖产业中占有重要的地位。然而近十余年来，海湾扇贝在育苗与养殖过程中，病害频发、个体小型化，严重影响了海湾扇贝养殖业的发展。产生这些问题的原因是多方面的，但也与其种质质量有关。海湾扇贝为雌雄同体，易于发生自交，加之引种时间长、引进的种贝数量少、长期连续多代的人工近亲繁殖和生产者的逆向选择等，可能会引起养殖群体遗传多样性水平降低、生产性状质量下降等。因此，深入研究海湾扇贝的种质资源，才能够从根本上解决这些问题。同时利用DNA分子标记技术进行种质分析，对于海湾扇贝资源保护、持续利用和品牌战略具有十分重要的意义。
发明内容
本发明利用GenBank公布的海湾扇贝ESTs序列，利用微卫星检索软件RepeatReporter 1.5进行微卫星位点的查找，对于二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于4次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星片断进行快速分离，从而得到含有微卫星重复的序列；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，进一步优化引物成为微卫星标记；对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值(PIC)进行综合评价，得到17个标记微卫星标记评价体系(表1)，用于海湾扇贝种质及群体遗传学分析；然后再进一步选取不同养殖条件下的海湾扇贝对筛选成功的微卫星标记进行综合评价。
附图说明：
图1位点AIMS020扩增两个养殖群体的带谱图(每个群体示5个个体)
图2位点AIMS026扩增两个养殖群体的带谱图(每个群体示5个个体)
具体实施方式
位点的筛选及其用于种质资源评价位点的确定。
1、微卫星位点来源及引物的设计
利用微卫星检索软件Repeat Reporter 1.5对GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行微卫星DNA的查找，对于二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于4次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星DNA进行快速分离得到含有微卫星重复的序列。采用软件BioEdit对含有微卫星位点的ESTs序列进行聚类分析，选取不重复的序列进一步设计引物。
国外学者发展的位点参照Robert等(2005)。
2、引物的设计
在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5和Oligo 6.44设计引物；引物设计应满足下列条件：(1)引物长度为20-25mer；(2)GC含量大于40％；(3)退火温度大于45℃(4)预期PCR产物长度为80-400bp。
3、引物的优化：
不同的引物根据不同的Tm值，在温度梯度PCR仪上做温度梯度(在Tm值上下各做10度)优化。扩增反应采用Biometra T-Gradient PCR系统，PCR程序为：95℃下预变性5分钟，95℃变性45秒，退火45秒，72℃延伸45秒，反应进行30个循环。反应体系为20μL：含有正、反引物各0.2μM、dNTPs各0.2mM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg2+、1个单位的Taq酶，80ng DNA作为PCR模板，该模板是从40个个体中任意取5个个体的DNA等量混合得到。扩增得到的PCR产物用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取杂带较少、特异性产物亮度较高的PCR反应对应的温度为该引物的最佳退火温度Ta。
4、标准微卫星位点的确立
微卫星位点的多态性水平可用多态信息含量值[PIC(Polymorphism InformationContent)]衡量。一般情况下，多态信息含量值能反映出某一个遗传标记所包含的或所能够提供的遗传信息的容量，当PIC＞0.5时，表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息；当0.25＜PIC＜0.5时，表明该遗传标记能够较为合理的提供遗传信息，而当PIC＜0.25时，表明该遗传标记可提供的遗传信息较差。依据上述优化获得的Ta值，选取40个个体作为群体进行多态性信息含量值的计算。PCR程序为在95度下预变性5分钟，95度变性45秒，Ta(各引物优化的最佳退火温度)退火45秒，72度下延伸45秒，反应进行30个循环。反应体系为20μL，含有正反引物各0.2μM、dNTPs 0.2mM、1×PCR buffer、1.2mM的Mg2+、1个单位的Taq酶、20ng DNA模板。PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，电泳完毕后用溴化乙锭(浓度为0.15μg/mL)染色，紫外观察成像并对电泳谱带利用公式PIC＝1-∑Pi 2进行计算，其中Pi是第i个等位基因的频率，所有位点的等位基因频率由软件POPGENE32计算得出。根据PIC值的计算结果，去除重复性、稳定性差，PIC小于0.25标记，最后共筛选出重复性、稳定性好，PIC值大于0.25的17个位点，作为海湾扇贝标准微卫星评价体系，用于海湾扇贝的种质资源评价。
以下为利用上面得到的评价体系进行栉孔扇贝不同地理群体评价的实例及其方法步骤
1、提取海湾扇贝DNA：
本试验选用的海湾扇贝采自黄岛和蓬莱两个养殖场，每个养殖场随机选取50只健康的贝做为实验材料，贝样活体解剖后取闭壳肌约0.1克，加入500μl STE裂解缓冲液(NaCl：100mM；EDTA：1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃处理，直到裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250μl)、氯仿/异戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10min。将核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发。加入100μl的无菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存用于PCR扩增。
2、PCR扩增
PCR反应条件为：40ng海湾扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR程序参数为：95℃变性45秒，Ta退火45秒，72℃延伸45秒，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存得到的PCR扩增产物。
3、电泳检测
PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准(pUC19/HaeIII)。电泳2-3小时后用溴化乙锭(浓度0.15mg/mL)染色，凝胶成像系统上紫外成像(代表图谱见图1、图2)，并利用软件QuantityOne对扩增产物和标准分子量相比照，对每个个体的扩增产物进行准确的大小确定，从而进行快速的、准确的确定基因型。将谱带转换成软件POPGENE 32能够识别的数据，利用软件POPGENE 32对遗传学数据进行计算。其结果可以反应出不同地理群体(种群)的Hardy-Weinberg平衡性、杂合度、等位基因频率等遗传学数据，从而应用于海湾扇贝不同地理群体(种群)的种质资源分析。因此，以17个微卫星标记作为标准评价体系的建立，为相关研究室之间数据的比对和交流提供了基础，也有望为保护和持续利用海湾扇贝种质资源，建立集约型、健康型养殖产业，坚持品牌战略提供技术支持。
位点名称   GenBank注册号 重复单位 引物序列(5’→3’)   退火温度(℃)   等位基因数目 PIC
AIMS001 CF197476 (CAA)10   F：TTCCTAATGGTGCGGGCTACR：CATCATCGTACTCCTGGTTATC 61 3 0.47
AIMS003 CK484134 (AT)11   F：AGGCATTGAAGCAGAGGCTGACR：CATGTCATCATCCGACTCCTCG 61 3 0.65
AIMS004 CK484445   (GAT)5...(CAG)5   F：GCCATCTAGAATGGGTCAGACAR：TGTCCTGAGGTGTGTCTTTTGTAG 62 3 0.51
AIMS009 CK484242 (GA)8   F：CTTGTTGCACAAAAGCACAGR：GTTCCATACGAACTTCTATGTC 54 3 0.41
AIMS011 CV660848 (GAT)10   F：GACAGCAGAACAGTCAGTAGTTGTGR：GCACGTCTGCTTTCTCTGTATTAAC 63 6 0.78
AIMS012 CN783420 (TTAT)10   F：GAGAGTACAAGCACTGTTCTCATGR：GGTGCTATATCGACCTATATCTGAG 63 4 0.60
AIMS019 CN782436   (GA)14(AG)5   F：CTCCACCTTCAGAACCATCCR：CGAAAGAAAATATCAAGCACAC 60 4 0.61
AIMS020 CB416269 (AGG)7   F：AGTAGAGCGGAACGGATGTGCR：GAAGTTTGAGATAATGAGGTAGGG 61 8 0.79
AIMS022 CB413627 (AACA)6   F：GACCCTGGATACCAATAAGACGR：TTGTATTCCGGGTGAGCGATAG 61 5 0.67
AIMS024 CB412325 (AG)15   F：AGATAAGTTGTACGCTGTTATGGCGR：ACATACATGGCTTGTCTGAGCG 68 11 0.80
AIMS025 CB413181 (AT)10   F：AAGCCACGTGTCCCTTGTGCGR：CGGCGGGTCAATTCTCATGTCG 66 9 0.79
AIMS026 CB416920 (GAT)6   F：CACTTCAGACACAAGTTACCGCR：TGAACCACCAAAGGTGACGGGG 66 4 0.74
AIMS028 CB412414 (TA)11   F：ATCTTATCCTGTGCCATTGGACR：CTAAATCCTGAAACAAGATGCC 63 10 0.82
GL23 CV828452 (CA)11   F：ATAAAACAGGCAAAGAGGCACR：TGCTTGGTGAATGGGGC   55   5   0.65
S336 CN783139 (CAG)5   F：GCGGAGGCAGATTCTTTCTTTTCR：GGTCGTGGATTGTAAGCATTGTC 54 4 0.61
G340 CN783297 (GAT)5   F：CGCTTGTGTTTTACGAGGAGAAGGR：TGACGGGGTGTGATGTCTGACC 53 5 0.64
GP63 CK484125 (CAG)5   F：AACTTTTCCCTCATCGTGTCACCR：CAGTCACAACTATCAACCTGCCC 54 4 0.52
表1.用于海湾扇贝(Argopecten irradians)种质资源分析的微卫星标记

Claims (5)

1、一种海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是利用GenBank公布的海湾扇贝ESTs序列，利用微卫星检索软件Repeat Reporter 1.5进行微卫星位点的查找和微卫星片断进行快速分离；在微卫星重复的侧翼序列设计引物，并进一步优化引物成为微卫星标记；然后再对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的17个微卫星标记作为标准微卫星标记评价体系。
2、一种海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是得到含有微卫星重复序列的步骤为：利用GenBank公布的海湾扇贝ESTs序列，利用自行设计的微卫星检索软件Repeat Reporter 1.5进行微卫星位点的查找，对于二碱基重复大于7次、三碱基重复大于5次、四碱基重复大于4次、五碱基重复大于3次和六碱基重复大于3次的微卫星片断进行快速分离。
3、一种海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是在微卫星重复的侧翼序列设计引物步骤为：在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5和Oligo 6.44设计引物；引物设计应满足下列条件：(1)引物长度为20-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度大于45℃(4)预期PCR产物长度为80-400bp。
4、一种海湾扇贝标准微卫星标记的构建方法，其特征是对微卫星标记在扩增过程中的重复性、稳定性和多态性信息含量值进行综合评价，确认其中的17个微卫星标记作为标准微卫星标记评价体系。
5、一种海湾扇贝标准微卫星标记的应用，其特征是上述的17个微卫星标记组成的标准微卫星标记评价体系应用于不同养殖群体的海湾扇贝综合种质资源评价。
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