CN102021124A

CN102021124A - 对虾白斑综合征病毒vp37酵母表面展示与应用

Info

Publication number: CN102021124A
Application number: CN2009102159365A
Authority: CN
Inventors: 刘庆慧; 黄捷; 李新新; 张秀丽
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2011-04-20

Abstract

本发明公开了一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白VP37的重组酵母菌的制备方法，是利用酵母表面展示载体pYD1，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌EBY100，得到表面展示VP37的重组酵母菌。其特征在于含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP37。本发明的另一个目的是提供表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母活疫苗在甲壳类动物养殖中的应用。所制备的重组酵母菌可以作为口服疫苗免疫对虾，用来保护对虾免受对虾白斑综合征病毒的侵染。本发明的基因工程活疫苗的优点在于，所用酿酒酵母菌安全，培养方法简单易行，便于大规模生产。相对于其它疫苗，展示的VP37蛋白易被免疫系统识别，展示的VP37蛋白稳定性好。

Description

对虾白斑综合征病毒VP37酵母表面展示与应用

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术，具体地说，本发明涉及对虾白斑综合征病毒结构蛋白VP37酵母表面展示方法，本发明还涉及展示的对虾白斑综合征病毒VP37的生产方法与应用。

背景技术

对虾白斑杆装病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产养殖业造成严重的经济损失。因此针对对虾白斑综合征病毒的药物开发受到广泛关注。

对虾为无脊椎动物，不具备特异性免疫系统，但近年的研究表明，对虾存在类免疫(quasi-immune)应答机制，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。目前有关对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导产生高效免疫应答能力的囊膜蛋白进行免疫接种方式来展开。已研发的包括以WSSV结构蛋白为抗原的蛋白类疫苗(Witteveldt J，Cifuentes C C，Vlak J M，et al.Protection of Penaeusmonodon against White Spot Syndrome Virus by Oral Vaccination.Journal of Virology，2004，2057-2061.和Vaseeharan B，Anand T P，Murugan T，et al.Shrimp vaccination trials with the VP292protein of white spotsyndrome virus.Letters in Applied Microbiology，2006，137-142.和Jha R K，Xu Z R，Shen J，Bai S J，et al.Theefficacy of recombinant vaccines against white spot syndromevirus in Procambarus clarkii.Immunology Letters，2006，105：68-76等)、核酸类疫苗(Rout N，Kumar S，Jaganmohan S，et al.DNA vaccines encoding viralenvelope proteins confer protective immunity against WSSVin black tiger shrimp.Vaccine，2007，25：2778-2786.和Rajeshkumar S，Venkatesan C，Sarathi M.Oral delivery of DNA vaccine encoding VP37against white spotsyndrome virus in crayfish by attenuated Salmonellatyphimurium.Fish&Shellfish Immunology，2009，26(3)：429-437等)。然而，为了增强免疫效果的持续性并更有效地诱导对虾的细胞免疫应答，对虾用活疫苗的研究和开发受到重视。以往研制人体和动物用活疫苗的方法主要是将病原体置于各种条件下培养，通过诱导其发生基因突变而确立弱毒株的。采用这种方法研制活疫苗不仅需要很长时间，而且存在很大的盲目性。而且长期以来，由于担心用于制备减毒活疫苗的病原菌在水体中扩散和毒力回复的危险，各国均不允许使用减毒的活疫苗。现在，应用基因操作技术可以将病原体上有免疫保护性的抗原基因克隆到非致病微生物载体上，从而使这种既能表达目的抗原又没有致病性的微生物充当活疫苗的角色，又称为活载体疫苗。其中以酒精酵母为载体，将目的蛋白表达在酵母菌体的细胞表面作为抗原递呈的口服活疫苗，在小鼠和人体中的研究已有成功的报道。

通过表面展示技术将对虾白斑综合征病毒VP37蛋白展示在酵母细胞表面，使多肽抗原更容易被免疫系统识别，同时酵母细胞表面成分可以起到免疫佐剂的作用。而且酒精酵母菌为食品级微生物，具备安全、容易培养的优点，可以很容易地过渡到廉价的口服疫苗，通过简单而又安全的方式接种。另外酒精酵母菌特有的遗传体系使之具有同时表达几种不同蛋白抗原且以不同形式表达的能力，从而可以制备多价联合疫苗。酒精酵母根据交配型的差异分为MATa和MATα两种单倍体，其细胞表面分别表达α或a凝集素。它们是酵母细胞壁上的两种甘露糖蛋白，可介导细胞间的粘附使细胞融合。目的蛋白可分别与α或a凝集素融合，展示于酵母细胞表面。美国Invitrogen公司用于酒精酵母表面展示的质粒载体pYD1可以使得外源蛋白与a凝集素C端融合表达在酵母细胞的表面，并在目的蛋白的N端和C端分别设计了Xpress，V5和6His等抗原表位，可以使用相应的抗体通过免疫荧光染色法很方便地险测重组蛋白的表达。基于酵母细胞表面展示技术的基因工程活载体疫苗，在对虾类疫苗的研究中至今未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种以酿酒酵母为载体的对虾白斑综合征病毒VP37的展示方法，展示的对虾白斑综合征病毒VP37的重组酵母菌的生产方法，所制备的重组酵母菌作为活疫苗有WSSV感染抑制作用，可以免疫对虾，用来保护对虾免受对虾白斑综合征病毒的侵染。

本发明的基因工程活疫苗的优点在于，所用酿酒酵母菌安全，培养方法简单易行，经济价廉，便于大规模生产，可用于对虾白斑综合征病毒口服疫苗。相对于其它疫苗，展示的VP37蛋白易被免疫系统识别，展示的VP37蛋白稳定性好。

本发明的另一个目的是提供表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母活疫苗在甲壳类养殖中的应用。

本发明涉及编码VP37序列片段扩增的引物序列：

37-s GAAGAATTCATGGCGGTAAACTTGGAT

37-a TCCCTCGAGTGTCCAACAATTTAAAA

本发明所采用的技术方案是：

一种表面展示对虾白斑综合征病毒蛋白VP37的重组酵母菌的制备方法，是利用酵母表面展示载体pYD1，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌EBY100，得到表面展示VP37的重组酵母菌。其特征在于含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP37。

1.WSSV-VP37基因的制备：

(1)WSSV病毒基因组的制备：将提纯的病毒置于0.2mg/ml蛋白酶K和1％月桂酰肌氨酸钠中，在65℃中静置2h。用氯仿和苯酚抽提后将得到的产物溶于50μl TE。-20℃保存，作为PCR扩增模板。

(2)PCR扩增VP37基因：以病毒DNA为模板，PCR扩增目的基因VP37，凝胶电泳检测扩增PCR产物大小，回收PCR产物。PCR反应条件：94℃变性5min，94℃40s，56℃40s，72℃40s，35个循环，72℃延伸5min。取2μlPCR产物作1％琼脂糖凝胶电泳。

2.重组体的构建：

(1)表达载体的构建：用EcoRI和XhoI对VP37基因片段和质粒pYD1进行双酶切，酶切片段经过16℃连接过夜，然后转化到大肠杆菌Top10中，筛选重组体，提取重组载体质粒，进行双酶切并对该重组载体质粒进行测序鉴定，重组体命名为pYD1-VP37。

3.重组酵母菌的构建与诱导表达

提取重组质粒pYD1-VP37与EBY100感受态细胞混合，加入醋酸锂转化溶液，振荡，然后30℃水浴30分钟；再加入二甲基亚砜，42℃水浴7分钟后，离心，TE重悬细胞。取100μl细胞悬液涂布于缺乏色氨酸的YNB(含Leu)营养缺陷型选择平板上，25～35℃培养24～48h，获得转化成功的酵母菌落，菌落PCR鉴定阳性克隆。同法，用空载体pYD1转化感受态细胞作为不表达目的基因产物的阴性对照。于上述营养缺陷型平板上挑取阳性单个酵母菌落，接种于含有1～2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中，30℃、250r/min振荡培养过夜；当菌液OD₆₀₀值在2.0～5.0时，3000～5000r/min离心5～10分钟，弃上清，再用含有1.0～2.0％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬细胞(使其OD₆₀₀值为0.5～1.0)，20℃振荡培养诱导目的蛋白表达；在诱导表达的第0、12、24、42h分别取出1ml细胞培养物作为待鉴定的细胞样品，4℃保存备用。

4.展示VP37蛋白的酵母细胞的鉴定

分别在诱导表达后0h、12h、24h、和42h测OD600nm的值，以EBY100为阴性对照，以EBY100/pYD1-VP37菌株为阳性对照做免疫荧光检测，一抗为anti-VP37抗体二抗为FITC标记的羊抗鼠抗体，各样品用PBS于4℃离心洗涤后，加入一抗，冰上放置30min，PBS洗涤后，加入二抗，避光冰上放置30min，PBS离心洗涤后加入PBS 40μL，取少量在荧光显微镜下检测并拍照。

5.展示的VP37的重组酵母菌生产方法

将活化的VP37重组酵母菌菌种接种于YNB-CAA(含1.0-2.0％葡萄糖)培养基中，20～30℃下振荡培养过夜，至OD₆₀₀值在2～5，离心菌体，用PBS洗去多余的培养基，用生理盐水悬浮菌体并接入YNB-CAA(含1.0～2.0％D-半乳糖)液体培养基中，其始OD₆₀₀控制在0.6～1.0，在20～30℃下诱导培养36～60h，将所得的培养物离心并用PBS洗涤，获得重组酵母菌活疫苗。

在本发明中，术语“编码VP37序列”是指编码具有WSSV蛋白活性的多肽的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与VP37相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些形式包括：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5‘和/或3’添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地10个以内，最佳的5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“VP37”指具有基因调控活性的SEQ ID NO.2的多肽。该术语还包括具有基因调控功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1～50个，较佳的1～30个，更佳的1～20个，最佳的1～10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为30个以内，较佳的为10个以内，更佳的5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括VP37多肽的活性片段和活性衍生物。

在本发明中，术语“WSSV感染抑制”是指在易感WSSV的动物中，WSSV感染的发生率和严重程度的降低，如降低动物死亡数量。如果相对于对照群体，VP37降低感染性至少20％，较好至少50％或更高时即达到WSSV感染抑制。

在本发明中，术语“甲壳动物”，通常指“虾”，“螃蟹”和“龙虾”甲壳动物。

在本申请的说明书和附图中，用于表示碱基(核苷酸)，氨基酸等的缩写是由生化命名IUPAC-IUB委员会推荐的那些和本领域常用的那些，说明如下：

DNA：脱氧核糖核酸；A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶；G：鸟嘌呤；C：胞嘧啶；

G，Gly：苷氨酸；A，Ala：丙氨酸；V，Val：缬氨酸；L，Leu：亮氨酸；L，Ile：异亮氨酸；S，Ser：丝氨酸；T，Thr：苏氨酸；C，Cys：半胱氨酸；M，Met：甲硫氨酸；E，Glu：谷氨酸；D，Asp：天门冬氨酸；K，Lys：赖氨酸；R，A：g：精氨酸；H，His：组氨酸；F，Phe：苯丙氨酸；Y，Tyr：酪氨酸；W，Trp：色氨酸；P，Pro：脯氨酸；N，Asn：天冬酰胺；Q，Gin：谷酰胺。

附图说明：

图1：PCR扩增VP37.泳道1和2为扩增的VP37.泳道M：DL2000(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)

图2：pYD1-VP37重组质粒转化酵母菌落PCR鉴定.M：DL2000；泳道1，2，4：pYD1-VP37重组质粒转化酵母菌EBY100；

图3：pYD1-VP37诱导表达的细胞免疫荧光检测.A：pYD1空载体转化组；B：pYD1-VP37重组质粒诱导表达24h；C：pYD1-VP37重组质粒诱导表达42h；

具体实施方式：

在本发明所用的术语，除特指外，一般为本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，分子克隆：实验室手册New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：VP37基因扩增

PCR引物由上海生物工程有限公司合成，PCR管中，建立如下反应体系：

10×Buffer 2.5μl；dNTP 2.0μl；WSSVDNA模板1.0μl；37-a(10pmol/μl)1.0μl；37-s(10pmol/μl)1.0μl；rTaq酶(5U/μl)0.5μl；ddH₂O 17μl。

PCR反应程序为：94℃变性5min；94℃40s，56℃40s，72℃40s 35个循环；72℃延伸5min。反应结束后，取PCR反应产物5μL加入1μL上样缓冲液(loading buffer)和Gene finder的混合液(1∶9)在含有Genefinder的1.0％的琼脂糖凝胶上电泳检测。PCR产物大小为800bp，结果鉴定见本发明附图说明及附图1。扩增片段由大连宝生物公司测序，VP37基因序列为SEQ ID No.1所示。

实施例2：重组载体的构建

将PCR产物用EcoR I和Xho I进行双酶切，同时载体pYD1也用EcoR I和Xho I进行双酶切，酶切的结果电泳鉴定后，采用宝生物工程有限公司的胶回收试剂盒回收纯化质粒pYD1和VP37基因片断，将回收的双酶切纯化后的产物(VP37和pYD1)用T₄DNA Ligase连接，载体与目的片断的物质的量比为1∶8～1∶10。将上述连接产物25μl加入Top10感受态细胞中，42℃水浴热激45s，然后迅速置于冰上放置1分钟，加入一定量的LB培养基(无Amp)至1000μl，于37℃摇床上培养1小时，以恢复抗性；将转化菌液200μl涂到含Amp(50μg/ml)固体LB培养基上，用灭菌的玻璃珠使菌液均匀分布在培养基的表面；37℃培养12～16h。随机挑取12个单克隆分别为1～12号进行扩大培养，并以菌液为模板，以VP37的反应条件进行PCR，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。对扩大培养的单克隆阳性菌提取质粒并进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测VP37基因片段，重组质粒命名为VP37-pYD1。

实施例3：VP37-pYD1对酵母感受态细胞的转化

取100μl EBY100感受态细胞(1×10⁸细胞/ml)与5μl pYD1-VP37重组质粒(0.1μg/μl)在EP管中混匀后，加入醋酸锂转化溶液(1mmol/L liAc，40％PEG3350，1×TE)，振荡10秒，30℃水浴30分钟；再加入二甲基亚砜，42℃水浴7min后，14000r/min离心5秒，弃上清，用0.5ml TE缓冲液重悬细胞。取100μl细胞悬液涂布于缺乏色氨酸的YNB(Leu)营养缺陷型选择平板上(0.5～0.7％YNB，1.0～2.0％葡萄糖，0.005～0.01％亮氨酸，1.5～2.0％琼脂)，25～30℃培养24～48h，获得转化成功的酵母菌落。同法，用空载体pYD1转化感受态细胞作为不表达目的基因产物的阴性对照。

实施例4：VP37-pYD1蛋白的诱导表达

于上述营养缺陷型平板上挑取阳性单个酵母菌落，接种于5ml含有2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中(含0.5％～0.7％YNB，0.2～0.5％水解酪蛋白氨基酸)，30℃、250r/min振荡培养过夜；当菌液OD₆₀₀值在2.0～5.0时，3000～5000r/min离心5～10min，弃上清，再用含有1.0～2.0％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬细胞(使其OD₆₀₀值为0.5～1.0)，20℃振荡培养诱导目的蛋白表达；在诱导表达的第0、12、24、42小时分别取出1ml细胞培养物作为待鉴定的细胞样品，4℃保存备用。

实施例5：展示VP37蛋白的酵母细胞的鉴定

分别在诱导表达后0h、12h、24h、和42h测OD₆₀₀值，冰箱4℃存放，以EBY100为阴性对照，以EBY100/PYD1-VP37菌株为阳性对照做免疫荧光检测，一抗为anti-VP37，二抗为羊抗鼠-FITC，分别按照要求的稀释倍数用含1.0％BSA的PBS稀释后置冰上待用，各样品用PBS于4℃4000g离心洗涤后，加入一抗Anti-VP37，冰上放置30min，PBS洗涤后，加入二抗，避光冰上放置30min，PBS离心洗涤后加入PBS 40μL，取少量在荧光显微镜下检测并拍照。结果鉴定见本发明附图说明及附图3。

实施例6：重组酵母菌活疫苗安全性实验

分别注射展示VP37蛋白的重组酵母菌高、低二个浓度(10⁵cells/ml，10⁶cells/ml)，注射剂量每尾100μl，每天观察各实验组螯虾的存活情况，注射二个浓度组(10⁴cells/ml，10⁵cells/ml)的螯虾都没有发生死亡现象，说明表面展示有VP37蛋白的活酵母对实验虾无毒。

序列表

1.1.SEQ ID No.1的信息

(1)序列特征：

长度：843bp

类型：核酸

链性：双链

拓扑结构：线性

(2)分子类型：DNA

(3)序列描述：SEQ IDNo.1

1 atggcggtaa acttggataa tgttcttgtg aatatcaaca acaaggatga agatcttaca

61 aaactcgtat ccgaggcaat aaagcggcga gctaa actg tacttgacac taaaaatcaa

120 gcagggtttg gcatgagacg tcaagttgaa gctgcattat atgaagcaat atccaaaaag

180 aaagaaaagg ccataaaggc attcgatgag ctcatacaag aaagaggtga tgaaattaca

241 cctttgacta caatgcagta tgaagagtgg gtaaaccgtg caataactcc ctcattgacg

301 actgaaaatt tattaggtga tgttgagcac gccgattttt tactggaccg aatgacaccc

361 gtaagcgagg aagatattga aggtttcgct gcttctactt ttaaggaggt atcagattca

421 aaaactgcaa cagtcatagt taaggcagat tgtgaaacgg gggatatcga tgaagtgtat

481 aatcttgcac catcattcgg cgtcactcaa gaaattaaaa tatataggtc aaacaattcc

541 tcggaattgg ataatgtcgc agattctttc catatttata aaatttctgc aacagatagc

601 gacagtggca tactaaaaa attgttgtat gggttaagga ataaaaaagc aggttatacg

661 tgtttgtgta gaatttttgc agaaattgaa tcagatggga ttatggccaa tacaaatatc

721 ggtgtcgctg aaaacaacag agatgaaatt gatgaaaacg aagaaggtaa atatggtttt

781 ttaataccca aacaaccagc tggtgctaaa ttgatcatct acttcttttt aaattgttgg

841 aca

2.SEQ ID No.2的信息

(1)序列特征：

长度：281个氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线性

(2)分子类型：蛋白质

(3)序列描述：SEQ IDNo.2

1 MAVNLDNVLV NINNKDEDLT KLVSEAIKRR AKTVFDTKNQ

41 AGFDMRRQVE AALYEAISKK KEKAIKAFDE LIQERGDEIT

81 PLTTMQYEEW VNRTITPSLT TENLLGDVEH ADFLLDRMTP

121 VSEEDIEGFA ASTFKEVSDS KTATVIVKAD CETGDIDEVY

161 NLAPSFGVTQ EIKIYRSNNS SELDNVADSF HIYKISATDS

201 DSGNTKKLLY GLRNKKAGYT CLCRIFAEIE SDGIMANTNI

241 GVAENNRDEI DENEEGKYGF LIPKQPAGAK LIIYFFLNCW

281 T

Claims

1.一种表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母及其制备方法，是利用酵母表面展示载体，与对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因重组，构建融合表达的重组质粒，并转化酿酒酵母菌得到表面展示VP37的重组酵母菌。

2.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母及其制备方法，其特征在于，所述的重组酵母为含有对虾白斑综合征病毒蛋白VP37基因的重组酵母菌EBY100，所述的重组酵母菌表面有VP37。

3.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母菌活疫苗在养殖甲壳动物免疫中的应用。

4.如权利要求2所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组体的制备方法，其特征在于，构建所述的对虾白斑综合征病毒VP37表达载体时，先用EcoRI和XhoI两种限制性内切酶将PCR扩增的VP37产物与pYD1空载体分别双酶切，然后将双酶切的产物连接并转化入感受态大肠杆菌TOP10，PCR筛选插入VP28基因的阳性克隆，测序验证正确的阳性克隆即为重组表达体(pYD1-VP37)。

5.如权利要求4所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组体，其特征在于，它包括：编码VP37的核苷酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等严谨条件下与SEQ IDNO.1中1-843位的核苷酸杂交。

6.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母的制备方法，其特征在于，将所述的重组表达体转化入酵母菌EBY100感受态细胞，再将转化产物涂布在YNB选择培养基上于25-30℃下培养24-48h，挑取长出的单菌落，用菌落PCR的方法筛选阳性转化子，阳性转化子即为表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母。

7.如权利要求1所述的表面展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母，其特征在于，它包括，具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列，或其活性片段，或其活性衍生物。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于发酵生产所述的展示对虾白斑综合征病毒VP37重组酵母菌活疫苗时，是将所述的重组酵母菌接种于含1.0-2.5％葡萄糖的YNB-CAA的培养基中，在25-30℃下振荡培养过夜，至OD600值在2-5，离心菌体，用生理盐水悬浮菌体并接入YNB-CAA(含D-半乳糖)液体培养基中，在20-30℃下诱导培养36-60h，将所得的培养物离心并用PBS洗涤，获得重组酵母菌活疫苗。