KR100872042B1 - 마이오스타틴을 발현하는 세포표면 발현벡터 및 상기벡터에 의해 형질전환된 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이오스타틴(myostatin)의 성숙(mature) 단백질을 발현하는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 세포표면에 발현된 마이오스타틴 성숙 단백질을 함유하는 사료첨가제 또는 백신에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 마이오스타틴 성숙 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 미생물의 표면발현을 유도하는 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자를 함유하는 세포표면 발현벡터와, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 제조된 마이오스타틴 성숙 단백질을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 또는 백신에 관한 것이다.
본 발명에 따른 마이오스타틴 성숙 단백질을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 또는 백신은 가축과 가금류 등의 근육발달 및 조절을 위해 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 근이영양증, 근육위축증과 같은 사람의 근육 소모성 질환 및 퇴행성 질환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있다. 또한, 마이오스타틴 성숙 단백질을 표면발현하는 형질전환 균주는 배양하여 균체 그대로 사용하여도 효과를 나타내므로 매우 경제적이다.
마이오스타틴, 백신, 사료첨가제
Description
도 1은 본 발명에 따른 닭의 마이오스타틴 성숙 단백질을 발현하는 표면발현벡터인 pBT:pgsA-CMyom의 유전자 지도이다.
도 2a는 본 발명에 따른 pBT:pgsA-CMyom로 형질전환된 유산균을 배양하여 수득된 세포를 분획하여 pgsA에 대한 특이 항체로 웨스턴블럿팅한 결과를 나타낸 것이고, 도 2b는 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질 항원에 대한 특이 항체로 웨스턴블럿팅한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 pBT:pgsA-CMyom으로 형질전환어, 마이오스타틴 성숙 단백질이 표면발현된 락토바실러스 카제이 균주를 경구투여한 마우스의 혈청내에서 마이오스타틴의 성숙(mature) 항원에 대한 IgG 항체가를 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent assay) 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-CMyom로 형질전환되어, 마이오스타틴 성숙 단백질의 표면발현된 락토바실러스 카제이 균주를 경구투여한 마우스에서 체중변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-CMyom로 형질전환되어, 마이오스타틴 성숙 단백질의 표면발현된 락토바실러스 카제이 균주를 사료와 함께 경구투여한 병아리들의 혈청내에서 마이오스타틴의 성숙(mature) 항원에 대한 IgG 항체가를 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-CMyom로 형질전환되어, 마이오스타틴 성숙 단백질이 표면발현된 락토바실러스 카제이 균주를 사료와 함께 경구투여한 병아리에서 체중변화를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-CMyom로 형질전환되어, 마이오스타틴 성숙 단백질이 표면발현된 락토바실러스 카제이 균주를 사료와 함께 경구투여한 병아리에서 사료효율을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 pBT:pgsA-PMyom로 형질전환된 유산균을 배양하여 수득된 세포를 분획하여 pgsA에 대한 특이 항체(a) 및 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질 항원에 대한 특이 항체(b)로 웨스턴블럿팅한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 는 본 발명에 따른 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-PMyom로 형질전환되어, 마이오스타틴 성숙 단백질이 표면발현된 락토바실러스 카제이 균주를 사료와 함께 경구투여한 돼지의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 소의 마이오스타틴 성숙 단백질을 발현하는 표면발현벡터인 pBT:pgsA-BMyom의 유전자 지도이다.
도 11은 본 발명에 따른 어류의 마이오스타틴 성숙 단백질을 발현하는 표면발현벡터인 pBT:pgsA-FMyom의 유전자 지도이다.
본 발명은 마이오스타틴(myostatin)의 성숙(mature) 단백질을 발현하는 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 미생물 및 세포표면에 발현된 마이오스타틴 성숙 단백질을 함유하는 사료첨가제 또는 백신에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 마이오스타틴 성숙 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 미생물의 표면발현을 유도하는 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자를 함유하는 세포표면 발현벡터와, 상기 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 제조된 마이오스타틴 성숙 단백질을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 또는 백신에 관한 것이다.
골격의 근육 성장을 선택적으로 하향-조절 (negative-regulation)하는 성장 조절 인자로서 GDF-8 (Growth and Differentioation Factor-8) 또는 미오스타틴(마이오스타틴)이 1997년 발견되었다 (McPherron, et al., Nature, 387:83, 1997). 마이오스타틴을 발견한 그룹은 과거 190년 동안 근육 질량이 높고 연한고기로 품질이 좋은 소의 두 품종, 벨젼 블루(Belgian Blue)와 피드몬테스(Piedmontese)가 마이오스타틴을 코딩하는 유전자 서열상 돌연변이를 포함하고, 이것이 근육발달의 원인이라고 발표하였고 (MaPherron and Lee, SJ, PNAS 94:12457, 1997), 이러한 "이중 근육화(double muscling)" 현상을 보이는 품종의 동물은 보통 동물보다 20-25% 증가 된 평균 근육질량을 갖는다고 보고하였다.
실험적으로 마이오스타틴이 넉-아웃(knock-out)된 생쥐 역시 골격 근육의 강한 질량 증가를 나타내었고, 마이오스타틴 음성 생쥐에서 분리한 근육은 야생형 생쥐의 근육보다 약 2-3배 정도의 무게를 나타내었다. 넉-아웃 생쥐는 야생형 생쥐보다 약 35% 높은 총 체중을 갖고, 마이오스타틴 유전자가 결핍된 생쥐는 정상적인 생쥐에 비해 80%이상의 근육 섬유를 갖는다고 보고되고 있으며, 이러한 넉-아웃 생쥐에서 관찰된 다량의 골격 근육 증대는 근육 섬유의 수 증가뿐 아니라 현저한 근육 섬유의 비대에 기인한 것이다.
이러한 골격의 근육성장을 선택적으로 하향-조절(negative regulator)하는 성장조절인자로서의 마이오스타틴은 TGF-α(transforming growth factor-α) 슈퍼패밀리에 속하며 375개의 아미노산 전구체로 구성되며, 약 109개의 아미노산 잔기의 C-말단 단편은 쥐과, 래트, 인간, 돼지, 닭 및 칠면조에서 100% 동일하며, 원숭이, 소, 양에 있어서는 C-말단 영역에서 세 개의 아미노산 잔기만 다르다. 이러한 C-말단 영역은 마이오스타틴의 생리적인 활성부분을 포함할 것으로 예측된다. 마이오스타틴은 진화과정에서 다양한 종들에 대하여 높은 보존률을 나타내고 있으며, 이는 마이오스타틴이 근육의 생물학적 조절과정에 있어서 필수적인 요소임을 시사한다.
마이오스타틴의 발현은 골격 근육에 제한되어 나타나고, 지방조직에서는 낮은 수준으로 발현된다. 마이오스타틴은 골격의 근육 성장에 대한 특이적인 음성 조절자로서 기능하는 것으로 보이나, 성인 개체에서 마이오스타틴의 생리적인 역할은 알려져 있지 않다. 마이오스타틴의 생리적인 역할에 대한 연구는 근육의 손상 후 유발되는 실제적인 비대 또는 재생상의 중요한 기능에 집중되고 있으나, 지방 조직의 성장을 억제한다고도 알려져 있다. 또한 마이오스타틴이 동물의 발육에 있어서 국부적으로 또는 전신적으로 작용하는가에 대해서는 아직까지도 알려져 있지 않다.
현재에는 골격의 근육 성장을 하향-조절 (negative-regulation)하는 마이오스타틴을 이용하여 다양한 연구들이 진행되어지고 있다. 대표적으로 마이오스타틴 유전자를 불활성화시키거나, 마이오스타틴 단백질의 작용을 억제시키는 방법으로 인체 의약품 치료제로 개발하여 근이영양증이나 근육위축증 같은 근육 소모성 질환이나 AIDS, 암등으로 인한 근육 소실 등의 질병치료에 적용하기 위해 연구되고 있고, 좋은 육질의 가축을 생산시키기 위한 가축용 사료첨가제에 적용하려는 시도가 있다. 또한 마이오스타틴을 근육강화 보조제의 첨가물질로 개발 시 근육양의 증가로 지방축적을 억누르기 때문에 다이어트를 시도하는 사람들에게 효과가 있을 것으로 예상되어 연구가 수행되어지고 있다.
마이오스타틴 단백질의 작용을 억제시켜 상기의 근육성장을 유도하는 방법으로는 대표적으로 두가지의 연구가 수행되어지고 있다. 그 첫째로 마이오스타틴의 활성을 방해하여 그 기능을 억제시키는 여러 단백질 (follastatin, mutant activin type II receptor, 마이오스타틴 propeptide 등)의 발견 및 이용을 들 수 있다. 두 번째로는 마이오스타틴 폴리펩타이드, 그의 부속체(subsequence) 및 돌연변이 부속체를 이용한 동물의 면역화로 마이오스타틴 폴리펩타이드에 대항하는 항체의 생산을 들 수 있다. 척추동물에 있어서 마이오스타틴 면역원에 대한 항체의 생성방법은 척추동물내에서 내인성 마이오스타틴 활성을 감소시켜 체중의 증가, 근육질의 증가, 근육세포수의 증가, 근육세포 크기의 증가, 체지방량의 감소, 근육강도의 증가 등의 생물학적 효과를 보일 수 있다는 연구 결과가 있다. 그러나 현재까지는 마이오스타틴 폴리펩타이드 또는 그 부속체를 인위적으로 합성하거나 대장균에서의 발현에 의한 분리 정제를 통해서 준비하고 이를 적용하려는 연구가 대부분으로 실질적으로 산업적인 적용이 경제적으로 어려운 실정에 있다.
축산산업에 있어서, 동물의 성장률을 증가시키기 위한 방법으로 사료의 효율성을 증대시키기 위한 여러가지 사육프로그램 방법들이 개발 및 개선되어지고 있다. 그 중에서 의학적인 접근들로는 항생물질 또는 항생물질 유사 화합물을 사육 동물에게 투여하거나, 성장 호르몬과 같은 호르몬을 투여하는 접근방법들이 수행되어 지고 있다. 그러나 이러한 항생물질 및 항생물질 유사 화합물을 사육 동물에게 투여하는 것은 인간의 항생작용에 대한 교체-내성을 유발한다는 문제점을 야기시킬 수 있어, 법적으로 금지되는 추세에 있다. 또한, 사육동물에 성장 호르몬을 이용하는 경우 가격이 비싸고, 성장 호르몬의 짧은 반감기로 인해 다소 단기간으로 처치를 반복해야 하며, 처리된 동물로부터 얻은 고기에 잔류하는 성장 호르몬이 소비자들에게 문제를 야기시킬 우려가 있다.
이러한 의학적인 접근의 어려움으로 인해 동물의 성장률을 증가시키기 위한 다른 방법으로 사료의 효율성을 증대시키기 위한 여러 가지 사육프로그램 방법들이 계속적으로 개발되어지고 있다.
미생물의 세포표면에 원하는 단백질을 부착하여 발현시키는 기술을 세포표면 발현 (cell surface display)기술이라 한다. 이 세포표면 발현기술은 박테리아나 효모 등 미생물의 표면 단백질을 표면발현 모체(surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 표면에 발현시키는 기술로서 재조합 생백신의 생산, 펩타이드/항체 라이브러리 제작 및 스크리닝, 전세포 흡착제(whole cell absorbent), 전세포 생물전환 촉매 등 다양한 응용범위를 가지고 있는 기술이다. 이 기술은 어떤 단백질을 세포 표면에 발현시키는가에 따라 그 응용범위가 결정되어지며, 따라서 세포표면 발현기술을 이용한 산업적 응용 잠재력은 상당하다고 할 수 있다.
성공적인 세포표면 발현기술을 위해서는 표면발현모체가 가장 중요하다. 얼마나 효과적으로 외래단백질을 세포표면에 발현시킬 수 있는 모체를 선정하고 개발하느냐가 이 기술의 핵심이 된다. 따라서 다음의 성질을 가진 표면발현모체를 선정해야 한다. 먼저 외래단백질을 세포표면까지 보내기 위해 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 분비신호가 있을 것, 둘째 세포외막 표면에 안정되게 외래단백질이 부착될 수 있도록 도와주는 표적신호가 있을 것, 셋째 세포 표면에 다량으로 발현되나 세포의 성장에 거의 영향을 미치지 않을 것, 넷째 단백질의 크기에 관계없고 외래단백질의 3차원 구조에 변화가 없이 안정적으로 발현될 것 등이다. 하지만 위의 조건을 모두 만족시키는 표면발현 모체는 아직까지 개발되지 않은 상태이다.
지금까지 알려져 사용된 표면발현모체로는 세포 외막 단백질, 지질 단백질(lipoprotein), 분비 단백질(secretory protein), 편모 단백질과 같은 표면기관 단백질 등 크게 4가지이다. 그람음성균(Gram negative bacteria)의 경우 LamB, PhoE(Charbit et al., J. Immunol., 139:1658, 1987; Agterberg et al., Vaccine, 8:85, 1990), OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질을 주로 이용하였고, 지질단백질인 TraT(Felici et al., J. Mol. Biol., 222:301, 1991), PAL(peptidoglycan associated lipoprotein)(Fuchs et al., Bio/Technology, 9:1369, 1991) 그리고 Lpp(Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489:2713, 1992)이 역시 이용되었으며, FimA나 1 형(type 1) 핌브리아(fimbriae)의 FimH 어드헤신(adhesin)과 같은 핌브리아 단백질(Hedegaard et al., Gene, 85:115, 1989), PapA 필루(pilu) 서브유닛과 같은 필리(pili) 단백질 등을 세포 표면발현 모체로 이용하여 외래 단백질의 발현을 시도하기도 하였다. 이 외에도 빙핵활성 단백질(ice nucleation protein)(Jung et al., Nat. Biotechnol., 16:576, 1998; Jung et al., Enzyme Microb. Technol., 22:348, 1998; Lee et al., Nat. Biotechnol., 18:645, 2000), 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiela oxytoca)의 풀루라나제(pullulanase) (Kornacker et al., Mol. Microl., 4:1101, 1990), 니세리아(Neiseria)의 IgA 프로테아제(Klauser et al., EMBO J., 9:1991, 1990), 대장균의 adhesin인 AIDA-1, shigella의 VirG 단백질, Lpp와 OmpA의 fusion 단백질 등을 표면발현 모체로 사용할 수 있다는 보고가 있다. 그람양성균(Gram positive bacteria)을 이용하는 경우에는 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 protein A 및 FnBPB 단백질을 표면발현 모체로 사용하여 말라리아 항원을 효과적으로 발현시킨 보고가 있으며, 젖산 박테리아의 표면 코트(coat) 단백질을 이용하여 표면 발현에 이용했다는 보고와 Streptococcus pyogenes 유래의 M6 단백질 (Medaglini, D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92:6868, 1995), Bacillus anthracis의 S-layer protein EA1, Bacillus subtilis CotB 등 그람양성 박테리아의 표면 단백질을 모체로 이용했다는 보고가 있다.
또한, 본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성 복합체 유전자(pgsBCA)를 새로운 표면발현 모체로 활용하여, 외래단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터와 상기 벡터로 형질전환된 미생물의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 방법을 개발한바 있다 (대한민국 특허등록 제0469800호). 상기에서 소개된 표면발현 모체들을 이용하여 병원체의 항원 또는 항원 결정기를 유전공학적 방법을 이용하여 대량 생산이 가능한 세균에서 안정하게 발현시키고자 하는 연구가 시도되었다. 특히 비병원성의 세균 표면에 외래 면역원을 발현시켜 살아있는 상태로 경구투여할 경우 종래의 약독화된 병원성 세균이나 바이러스를 이용한 백신들 보다 더 지속적이고 강한 면역반응을 유도할 수 있다고 보고되었다. 이러한 면역반응 유도는 살아있는 상태의 균에 대한 체내의 면역 반응에 의한 것으로, 세균의 표면 구조물들이 표면 발현된 외래단백질의 항원성(antigenicity)을 증가시키는 보조제(adjuvant)로서 작용하기 때문인 것으로 알려져 있다. 이러한 표면발현 시스템을 이용한 비병원성 세균의 재조합 생백신의 개발은 주목할 만하다.
이에, 본 발명자들은 미아오스타틴을 세균표면에 효과적으로 발현시킬수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 바실러스속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성 복합체 유전자(pgsBCA)를 표면발현 모체로 활용하여 마이오스타틴 성숙 단백질을 유산균과 같은 비병원성 식품 안전성이 보장된 미생물의 표면에 다량 발 현시키고, 상기 마이오스타틴 성숙 단백질이 대량 발현된 미생물을 동물에 경구 투여하여 마이오스타틴에 대한 체내 혈중 항체 생성 및 이에 의한 피험동물의 체중 증가를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 및마이오스타틴 단백질의 성숙(mature) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 표면 발현벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 표면발현하는 미생물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 세포표면에 발현된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 또는 백신을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상과, 마이오스타틴 단백질의 성숙(mature) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포표면 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 마이오스타틴은 포유동물, 조류 또는 어류 유래인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 세포표면 발현벡터는 SlpA7 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 세포표면 발현벡터는 pBT:pgsA-CMyom, pBT:pgsA-PMyom, pBT:pgsA-BMyom 및 pBT:pgsA-FMyom으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 발명에 적용될 수 있는 미생물은, 생체 적용시 독성이 없거나, 약독화된(attenuated) 미생물이라면 어느 것이라도 가능하다. 바람직하게는, 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 미생물은 유산균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 미생물 표면에 발현하는 단계; 및 상기 마이오스타틴 성숙 단백질이 표면발현된 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 미생물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 근육성장 촉진 및 증체율 향상용 사료첨가제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 세포표면에 발현된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 유효항원으로 함유하는 근이영양증 또는 근육위축증의 예방 또는 치료용 백신을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 백신은 경구용 또는 식용섭취가 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 사료첨가제 또는 상기 백신을 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 체중, 근육질, 근육세포수 및/또는 근육세포 크기를 증가시키거나, 체지방량을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 동물용 사료첨가제 및 백신은 소, 돼지, 닭을 비롯한 사육동물들의 성장률을 증가시키기 위한 제제로 이용될 수 있다.
본 발명에 의한 인체용의 경구 백신은 근육과 관련된 질병인 근이영양증, 근육위축증 같은 근육 소모성 질환 및 퇴행성 질환이나 AIDS, 암등으로 인한 근육 소실 같은 근육질병의 치료 및 예방용 의약품으로 이용될 수 있다.
본 발명에 의한 백신은, 인간을 포함한 동물에 경구용 또는 식용으로 섭취할 수도 있고, 피하 또는 복강에 주사할 수도 있고, 비강 투여를 할 수 있다.
본 발명에 의해 제조된 마이오스타틴 성숙 단백질을 함유하는 백신을 척추동물에 투여하면 이에 의하여 생성된 항체에 의해 척추동물내에서 내인성 마이오스타틴 활성을 감소시켜 체중의 증가, 근육질의 증가, 근육세포수의 증가, 근육세포 크 기의 증가, 체지방량의 감소, 근육강도의 증가 등의 생물학적 효과를 나타낼 수 있다.
근육 섬유의 수와 종류는 배아기에 결정되므로, 성장한 사육용 동물에서의 본 발명 제제는 근육 섬유의 수를 증가시키지는 않을 것이다. 다른 TGF-α 패밀리와 마이오스타틴의 서열 동일성은 아미노산 수준에서 30-40%로 낮기 때문에, 생체 내에서 마이오스타틴(GDF-8)에 대항하여 유발되는 항체의 교차-반응성에 관하여 문제를 발생시키지는 않을 것이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히 하기 실시예에서는 성숙(mature) 형태의 마이오스타틴 단백질의 유전자를 적용하였으나, 성숙(mature) 마이오스타틴 단백질에 대한 면역성을 증가시키는 단백질의 유전자와 복합적으로 사용할 수 있다.
또한, 하기 실시예에서는 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilisvar. chungkookjang, KCTC 0697BP)으로부터 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 중 pgsBCA를 획득하여 이용하였으나, 유전자는 폴리감마글루탐산을 생산하는 모든 바실러스 속 균주로부터 pgsBCA를 획득하여 제조된 벡터 또는 이 벡터를 이용한 형질전환된 미생물 등도 본 발명의 범위에 포함된 다 하겠다. 예컨대, 바실러스 서브틸리스 청국장에 존재하는 pgsBCA 유전자의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 타균주 유래의 pgsBCA 유전자를 사용하여 백신용 벡터를 제조하거나, 이를 이용하는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 유전자 pgsBCA 중에서 pgsA만을 활용하여 표면 발현용 벡터를 제작하였으나, 간접실시예로부터 유추해 볼 수 있듯이, 유전자 pgsBCA의 전부 또는 일부만을 사용하여 백신용 벡터를 제작하는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.
또한, 하기 실시예에서는, 상기 벡터에 대한 숙주로서, 그람음성 세균인 살모넬라 타이피와 그람양성세균인 락토바실러스만을 사용하였으나, 이 세균 이외에 여하한 그람음성균 또는 그람양성균도 본 발명에 의한 방법으로 형질전환시키면 동일한 결과를 얻을 수 있다는 사실도 당업자에게는 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는, 백신용 벡터로 형질전환된 미생물 자체를 마우스, 닭 및 돼지의 생체에 적용한 예만이 제시되어 있다. 그러나, 동물용 사료첨가제 및 백신관련 기술분야의 지식으로 보아, 상기 미생물로부터 조추출된 미오스타틴 성숙(mature) 단백질 또는 정제된 발현단백질을 생체에 적용하더라도 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 사실일 것이다.
실시예 1: 표면발현용 전환 벡터 pBT:pgsA-CMyom의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람 양성 미생 물을 숙주로 하여 닭의 마이오스타틴 (마이오스타틴)의 성숙(mature) 도메인 단백질 부분을 표면발현 할 수 있는 전환벡터 pBT:pgsA-CMyom을 제조하였다.
닭의 마이오스타틴 유전자 정보는 돼지, 마우스, 인간, 칠면조 등과 100% 동일하다. 우선, pBT:pgsA-Amylase(alpha-amylase 표면발현용 벡터: 간접실시예 참조)을 BamHI 및 KpnI으로 절단하여 amylase 유전자를 제거하여 표면발현용 벡터 pBT:pgsA를 준비하였다. 준비된 표면발현용 벡터 pBT:pgsA에 마이오스타틴의 성숙(mature) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위하여, pCR T7/NT-TOPO(Invitorgen)에 클론되어 있는 약 1.3kb의 닭 마이오스타틴 유전자(서열번호 1)를 주형으로 사용하고, 서열번호 2 (5-cgc ggatcc gag gtc aga gtt aca gac aca-3) 및 서열번호 3 (5-gga aagctt tta tta tca tga gca ccc gca acg atc a-3)의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 393 bp의 CMyom 단편을 수득하였다. 상기 CMyom 단편을 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 각각 절단하고, 표면발현용 벡터 pBT:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 각각 연결하여 닭 마이오스타틴 성숙 단백질을 표면발현하는 벡터인 pBT:pgsA-CMyom를 제작하였다(도 1).
상기 제작된 표면발현용 벡터 pBT:pgsA-CMyom을 락토바실러스에 형질전환시킨 후, 형질전환된 락토바실러스 내의 pBT:pgsA-CMyom 플라스미드의 존재를 각각 확인하였다.
실시예 2: pgsA와 융합된 닭 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질 표면발현
본 실시예에서는 실시예 1에서 표면 발현용 벡터 pBT:pgsA-CMyom으로 형질전환된 락토바실러스에서 pgsA와 융합된 닭 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질의 발현 여부를 조사하였다.
폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자 pgsA의 C-말단과 각각 융합된 닭 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질의 발현은 pBT:pgsA-CMyom으로 형질전환된 락토바실러스 카제이를 MRS배지 (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), 37℃에서 정치배양하여 표면발현을 유도하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA 및 마이오스타틴에 대한 특이 항체를 이용한 웨스턴블럿팅을 수행하여 상기 융합단백질 발현을 확인하였다.
구체적으로 발현이 유도된 락토바실러스 카제이 전세포를 동일한 세포농도에서 얻은 단백질로 디네이쳐(denature)시켜 시료를 준비하고, 이를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 분획된 단백질들을 PVDF (polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad) 멤브레인에 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액(50 mM 트리스 염산, 5 % 스킴 밀크(skim milk), pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음, pgsA 및 마이오스타틴에 대한 토끼 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에1000배 희석하여 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 바이오틴이 접합된 토끼에 대한 2차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 4시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 아비딘-바이오틴(avidin-biotin)시약을 1시 간 동안 반응시켜 다시 세척하였다. 세척된 멤브레인에 기질(H202)과 발색시약(DAB)을 첨가하여 발색시키고, pgsA 및 마이오스타틴에 대한 특이 항체와 상기 융합단백질간의 특이적인 결합을 확인하였다 (도 2).
도 2의 a 및 b에서 레인 1은 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이이고, 레인 2는 pBT:pgsA-CMyom/락토바실러스 카제이이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 각각의 유산균 전세포(whole cell)에서 특이 융합 단백질(약 55.5 kDa)의 pgsA-CMyom을 확인할 수 있었다. pgsA가 약 42 kDa이고, CMyom 단백질이 약 13.5 kDa이므로 상기 55.5 kDa을 나타내는 밴드는 pgsA와 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 융합된 융합단백질임을 알 수 있었다.
또한, pBT:pgsA-CMyom 표면발현벡터로 형질전환된 유산균에서 pgsA 및 마이오스타틴 항체에 의해 융합 단백질이 유산균의 표면에 발현되었는지를 확인하기 위하여, 각각의 벡터로 형질전환된 유산균을 ultracentrifuge을 이용한 세포분획법으로 세포벽 분획과 세포질분획을 나눈 후, 각각의 융합단백질의 위치를 pgsA 및 마이오스타틴에 대한 특이 항체를 이용한 웨스턴 블럿 (western blot)을 통하여 확인하였다.
구체적으로 상기의 방법으로 융합단백질의 표면발현이 유도된 락토바실러스를 형질전환되지 않은 락토바실러스와 동일한 세포농도가 되도록 수확하고, 세포를 TES 완충용액(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, 25% sucrose)으로 여러 번 세척한 다음, 5 ㎎/㎖ lysozyme, 1 mM PMSF 그리고 1 mM EDTA가 포함이 된 증류수로 부유 시키고, -60℃와 상온을 여러 번 이동하여 얼림과 녹임을 수회 반복한 후, DNase (0.5 mg/㎖)와 RNase (0.5 mg/㎖)를 첨가하고 초음파로 세포를 파쇄하였다. 이어서 파쇄액을 4℃, 20분 동안 10,000 X g에서 원심분리하여 파괴되지 않은 whole 락토바실러스(pellet; whole cell 분획)와 cellular debris(상등액)를 분리하고, 분리된 cellular debris를 4℃, 1시간 동안 21,000 X g에서 원심분리하여 락토바실러스의 세포질 단백질을 포함하는 상등액(soluble 분획)과 펠렛(pellet)을 얻었다. 상기 수득된 펠렛을 1% SDS를 포함하는 TE용액(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1mM EDTA, pH 7.4)에 부유시켜 락토바실러스의 세포벽 단백질(cell wall 분획)을 얻었다.
각각의 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA와 마이오스타틴 항원에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿팅(western immunoblotting)을 수행하여 각각의 락토바실러스 분획 중 pgsA와 융합된 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 세포벽에 위치함을 확인하였다 (도 2). 도 2의 a 및 b에서 레인 3 및 레인 4는 각각 pBT:pgsA-CMyom으로 형질전환된 균주의 가용성 분획 및 세포벽 분획이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 유산균 전세포(whole cell)와 세포벽 분획에서 약 55.5 kDa의 pgsA와 융합된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터, pgsA와 융합된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 발현되어 pgsA에 의해 유산균의 표면으로 이동하여 위치한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 마우스내 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 표면발현하는 락토바실러스의 면역반응 유도 및 체중 변화율조사
상기 표면발현용 전환벡터 pBT:pgsA-CMyom을 그람양성세균인 락토바실러스 카제이에 형질전환시키고 실시예 2에서와 같은 방법으로 상기 항원을 락토바실러스 카제이에서 표면발현을 유도한 후 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막단백질 pgsA와 융합된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질의 면역반응 유도 및 이에 의한 체중변화를 마우스 모델을 이용하여 조사하였다.
구체적으로, 본 발명의 표면발현 전환벡터 pBT:pgsA-CMyom을 락토바실러스 카제이에 형질전환시킨 후 배양하여 수확한 세포를 완충용액 (PBS buffer, pH7.4)으로 세척하고, 항원이 표면발현된 락토바실러스 5 X 109 균을 4-6주령의 B6SJL 마우스에 경구 투여하였다. 이때 실험군은 10마리를 한 군으로 정하여 경구로 1일 간격으로 다섯번, 1주 후 다시 1일 간격으로 다섯번, 그 후 1주 뒤에 역시 1일 간격으로 다섯번 투여한 후, 다시 2주 후에 1일 간격으로 다섯 번을 투여하였다. 그리고 대조군으로 동일한 수의 B6SJL 마우스에 유산균만 배양시킨 배양액을 동일한 스케쥴로 투여하였다.
처음 경구투여후 약 5, 9, 13, 17 및 21주에 각각의 마우스군의 혈청을 취하여 혈청내 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 IgG 항체가를 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 3은 마우스 혈청내 마이오스타틴 항원단백질에 대한 IgG 항체가를 나타낸 것으로 A는 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 표면발현하는 유산균을 먹인 군이고, B는 유산균만을 먹인 대조군이다.
도 3에 나타난 바와 같이, pBT:pgsA-CMyom으로 형질전환시킨 락토바실러스를 투여한 B6SJL 마우스군의 혈청에서 마이오스타틴 항원단백질 성숙(mature) 단백질에 대한 IgG 항체가가 대조군에 비해 상당히 높게 나타난다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 미생물은 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 항체를 효과적으로 생성할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 경구투여 후 매주 B6SJL 마우스의 체중을 측정하여 각군의 체중 차이를 비교분석하였다. 도 4는 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 표면발현하는 유산균을 먹인 실험군 (A)과 일반 유산균을 먹인 대조군 (B)의 체중 변화를 나타낸 그래프로 약 6주부터 pBT:pgsA-CMyom로 형질전환시킨 락토바실러스를 투여한 B6SJL 실험군의 체중이 대조군에 비해 상당히 높게 나타났으며 시간이 흐름에 따라 계속적으로 그 차이를 보임을 확인할 수 있었다. 이러한 체중의 증가 현상은, 본 발명에 의한 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면 발현된 미생물에 의해 생성 유도된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 항체가 작용하여 그 효과를 나타낸 것이라 할 수 있다.
실시예 4: 병아리에서 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 표면발현하는 락토바실러스의 면역반응 유도 및 체중 변화율조사
실시예 2와 동일한 방법으로 락토바실러스 카제이에 pBT:pgsA-CMyom로 형질전환시켜, 세포외막단백질 pgsA에 의해 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 표면 발현하는 락토바실러스 카제이를 제조하고, 상기 표면발현 락토바실러스 카제이를 이용하여, 병아리에서의 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 면역반응 유도 및 이에 의한 체중변화를 조사하였다.
구체적으로, 본 발명의 표면 발현벡터 pBT:pgsA-CMyom을 락토바실러스 카제이에 형질전환시켜 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 락토바실러스 균을 다음의 코브육용 계품종 병아리에 공급하는 배합사료에 섞어 실험을 수행하였다. 실험군은 각각 30마리씩 대조군을 포함하여 4개 군으로 구성하였다.
실험군들로는 대조군의 병아리에는 1주부터 5주까지 배합사료만 먹였고, 실험군 A는 첫 일주일동안 배합사료에 0.5%의 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 락토바실러스 배양액을 섞어 먹이고, 2, 3, 4 및 5주에는 배합사료만 먹였다. 실험군 B는 첫 일주일동안 배합사료에 0.5%의 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 락토바실러스 배양액을 섞어 먹이고, 2주와 3주에는 배합사료에 0.1%의 상기 유산균 배양액을 섞어 먹인 후 4, 5주에는 배합사료만 먹였다. 실험군 C는 첫 일주일 배합사료에 0.5%의 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 락토바실러스 배양액을 섞어 먹이고, 제2, 3, 4, 5주에 배합사료에 0.1%의 상기 유산균 배양액을 섞어 먹였다.
실험시작 후 5주뒤 각 실험군의 병아리의 혈청을 취하여 혈청내 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 IgG 항체가를 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 5는 각 실험군 병아리 혈청내 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질에 대한 IgG 항체가를 평균하여 나타낸 것으로 배합사료만 먹인 대조군의 항체가 보다 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 유산균 배양액을 배합사료에 섞어 먹인 실험군에서의 항체가가 높게 나타났으며, 3주 연속 혹은 5주 연속으로 유산균 배양액을 먹은 실험군의 항체가가 비교적 높게 나타남을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의한 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 유산균은 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 항체를 병아리에서도 효과적으로 생성할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
또한, 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 유산균 배양액을 먹인 각 실험군에서 매주 병아리들의 체중을 측정하여 각군의 체중 차이를 비교분석하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군 (D), 실험군 A (A), 실험군 B (B) 및 실험군 C (C)의 체중 변화를 나타낸 그래프에서 약 2주부터 각 실험군마다의 체중차이가 약간씩 나기 시작하여 5주령이 되었을 때, 대조군의 평균 체중은 1507.68 g 이었고, 각 실험군 마다의 평균체중은 실험군 A는 1697.48g, 실험군 B는 1747.93g 그리고 실험군 C는 1797.20g을 나타내었다. 마우스에서와 마찬가지로 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 유산균 배양액을 긴 시간 동안 먹인 각 실험군에서의 체중증가가 대조군에 비해서 상당히 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 이러한 체중의 증가 현상은, 본 발명에 의한 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면 발현된 유산균에 의해 생성 유도된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 항체가 작용하여 그 효과를 나타낸 것이라 할 수 있다.
더불어 각 실험군마다의 사료효율을 측정하였다. 도 7은 각 실험군별 사료효율을 측정한 그래프로 섭취한 사료의 총량을 병아리의 총 체중으로 나눈 값으로 상 기의 실험군 C의 사료효율이 가장 좋게 나타났다.
실시예 5: 돼지 마이오스타틴 성숙 단백질을 표면발현하는 락토바실러스의 면역반응 유도 및 체중 변화율조사
실시예 1과 동일한 방법으로 돼지 마이오스타틴 성숙(porcine myostatin mature) 단백질을 표면발현할 수 있는 벡터 pKT:pgsA-PMyom을 제조하고, 실시예 2와 동일한 방법으로, 상기 돼지 마이오스타틴 성숙(porcine myostatin mature) 단백질 표면발현 벡터 pKT:pgsA-PMyom을 락토바실러스 카제이에 형질전환시키고, 형질전환된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 표면발현하는 락토바실러스 카제이를 이용하여 돼지에서의 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 면역반응 유도 및 이에 의한 체중변화를 조사하였다.
폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자 pgsA의 C-말단과 각각 융합된 돼지 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질의 발현은 pKT:pgsA-PMyom으로 형질전환된 락토바실러스 카제이를 MRS배지 (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), 30℃에서 16시간 정치배양하여 표면발현을 유도하였다. 그다음 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA 및 마이오스타틴에 대한 특이 항체를 이용한 웨스턴블럿팅을 수행하여 상기 융합단백질 발현을 확인하였다 (도 8).
도 8의 레인 1은 형질전환되지 않은 락토바실러스 카제이이고, 레인 2-4는 pKT:pgsA-PMyom/락토바실러스 카제이이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 각각의 유산균 세포에서 특이 융합 단백질(약 56.5 kDa)의 pgsA-PMyom을 확인할 수 있었다. pgsA linker가 약 43 KDa이고, PMyom 단백질이 약 13.5 KDa이므로 상기 56.5 KDa를 나타내는 밴드는 pgsA와 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 융합된 융합단백질임을 알 수 있었다.
동물실험에서 구체적으로, 표면 발현벡터 pKT:pgsA-PMyom을 락토바실러스 카제이에 형질전환 시켜 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면 발현된 락토바실러스균을 10배로 농축시켜 자돈에게 직접 경구 투여 하는 실험을 수행하였다. 실험대상 돼지는 A그룹 및 B그룹으로 나누고 각 그룹에 대하여, 각각 대조군(con) 15마리, 마이오시타틴 실험군(myo) 15마리씩 모두 60마리로 실험대상을 구성하였다.
마이오스타틴 실험군(A myo군, B myo군)은 pKT:pgsA-PMyom을 락토바실러스 카제이에 형질전환 시켜 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 락토바실러스 균을 10배로 농축시켜 자돈에게 매일 10ml씩 10일간 직접 경구 투여하였고 대조군(A con군 및 B con군)은 아무것도 투여하지 않고 일반적인 사양방식으로 사육하였다. A 미오스타틴 실험군(A myo군)은 28일령의 이유일부터 10일간 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 락토바실러스 균 농축액을 투여하고 132일령까지 사육하고 실험종료 하였으며, B 미오스타틴 실험군( B myo조)는 20일령(이유 6일전)부터 10일간 투여하고, 126일령까지 사육하고 실험종료 하였다. 실험종료 후 돼지 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 유산균 배양액을 먹인 실험군과 대조군의 체중 차이를 비교분석하고, 각 그룹별 각군의 실험 시작과 실험 종료후 체중 변화를 그래프로 나타내었다 (도 9).
도 9에 나타난 바와 같이, 마우스와 병아리 실험에서와 마찬가지로 마이오스타틴의 성숙(mature) 단백질이 표면 발현된 유산균 배양액을 먹인 각 실험군에서의 체중증가가 대조군에 비해서 상당히 높게 나타남을 확인할 수 있었다. 체중은 실험 시작 전, 실험 종료 후 각각 개체별로 측정하였다. 실험결과를 보면 A그룹과 B그룹에서 실험 시작 전 체중은 대조군와 myo군이 거의 비슷했으나 실험 종료 후 A 그룹에서 마이오스타틴 실험군은 대조군보다 약 10,5%정도 증체율을 보였고 B그룹에서는 마이오스타틴 실험군의 돼지 체중이 대조군보다 약 11.5% 증가한 것으로 나타났다. 이러한 체중의 증가 현상은, 본 발명에 의한 돼지 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면 발현된 유산균에 의해 생성 유도된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질에 대한 항체가 작용하여 그 효과를 나타낸 것이라 할 수 있다.
또한, 유산균 농축액을 20일령부터 투여한 B그룹 마이오스타틴 실험군의 성적이 유산균 농축액을 28일령부터 투여한 A그룹 마이오스타틴 실험군보다 우수한 것으로 보아 자돈이 어릴 때 마이오스타틴을 표면발현하는 유산균을 투여하는 것이 더욱 효과적인 것으로 나타났다.
실시예 6: 표면발현용 벡터 pBT:pgsA-BMyom의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람 양성 미생물을 숙주로 하여 소의 마이오스타틴의 성숙(mature) 도메인 부분을 표면발현 할 수 있는 전환벡터 pBT:pgsA-BMyom을 제조하였다.
소의 마이오스타틴 유전자 정보는 원숭이, 양 등과 100% 동일하나 인간을 비롯한 돼지, 닭, 마우스 등과는 3개의 아미노산이 다르다. 우선, 상기의 표면발현 벡터 (pBT:pgsA-CMyom)에서 CMyom 유전자를 제거한 후 소(bovine) 마이오스타틴유전자를 도입하기 위해 pCR T7/NT-TOPO에 클론되어 있는 약 1.3kb의 소 마이오스타틴 유전자(서열번호 4)를 주형으로 사용하고, 성숙(mature) domain (BMyom)을 코딩하는 유전자 유래 서열번호 5 (5-cgcggatccg aagtcaaggt aac-3) 및 서열번호 6 (5-cgcaagcttt tatcatgaac acccacagcg-3)의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 369 bp의 BMyom를 수득하였다. 상기 BMyom을 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 절단하여 미리 준비된 표면발현용 벡터 pBT:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 각각 연결하여 전환벡터 pBT:pgsA-BMyom를 제작하였다 (도 10).
제작된 표면발현용 벡터 pBT:pgsA-CMyom를 이용하여 그람양성 세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 락토바실러스 내의 pBT:pgsA-BMyom 플라스미드의 존재를 각각 확인하였다.
실시예 7 : 표면발현용 벡터 pBT:pgsA-FMyom의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용하여 그람음성 미생물 및 그람양성 미생물을 숙주로 하여 어류(연어)의 마이오스타틴의 성숙(mature) 도메인 단백질 부분을 표면발현 할 수 있는 전환벡터 pBT:pgsA-FMyom을 제조하였다.
어류 (연어)의 마이오스타틴 유전자 정보는 다른 척주동물의 마이오스타틴 유전정보와 30% 이상 다르다. 우선, 상기의 표면발현 벡터 (pBT:pgsA-CMyom)에서 CMyom 유전자를 제거한 후 어류(연어) 마이오스타틴유전자를 도입하기 위해 pGEM-T 벡터에 클론되어 있는 약 1.1 kb의 어류 (연어) 마이오스타틴 유전자(서열번호 7)를 주형으로 사용하고, 성숙(mature) domain (FMyom)을 코딩하는 유전자 서열번호 8 (5-cgggatcc GAT TCG GGC CTG GAC TGT GAT GAG-3) 및 서열번호 9 (5-ggggtacc TCA CGA GCA GCC GCA GCG GTC C-3)의 염기서열을 갖는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 369 bp의 FMyom 유전자 단편을 수득하였다. 상기 유전자 단편을 제한효소 BamHI 및 KpnI으로 절단하여 미리 준비된 표면발현용 벡터 pBT:pgsA의 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA의 C-말단 부위에 번역코돈을 맞추어 각각 연결하여 전환벡터 pBT:pgsA-FMyom를 제작하였다 (도 11).
제작된 표면발현용 벡터 pBT:pgsA-FMyom를 이용하여 그람양성 세균인 락토바실러스를 형질전환시킨 후, 락토바실러스 내의 pBT:pgsA-FMyom 플라스미드의 존재를 각각 확인하였다.
간접실시예 1: 표면 발현용 벡터 pBT-pgsA의 제조
바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA) 중 pgsA를 이용한 그람음성 및 그람양성 미생물을 숙주로 하는 그람음성 및 그람양성 범용 벡터인 pAT에 항시적 고발현 프로모터인 HCE 프로모터 및 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)중 pgsA 유전자를 포함하는 표면발현용 벡터 pHCE2LB:pgsA의 표면 발현율을 증가시키기 위해 pHCE2LB:pgsA 벡터의 HCE 프로모터 부분을 발현율이 높은 개량형의 프로모터를 탐색 및 연구하여 확인 후 프로모터를 교체하여 pBT-pgsA 벡터를 제작하였다.
그람음성 및 그람양성 범용 벡터인 pAT에 항시적 고발현 프로모터인 SlpA7 프로모터 및 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자(pgsBCA)중 pgsA 유전자를 포함하는 pBT-pgsA는 pHCE2LB:pgsA-HPVL1 (KCTC 10349BP)를 주형으로 HCE 프로모터 부분을 대신하여 SlpA7 프로모터를 교체하였다.
HCE 프로모터와 SlpA7 프로모터의 발현율을 비교하기 위해 알파-아밀라아제의 분비발현 벡터(pHCE2LB 플라즈미드에 알파-아밀라아제의 분비 신호와 함께 alpha-amylase을 삽입시킨 벡터로 pgsA가 삭제된 벡터)에 각각의 프로모터 부분을 삽입한 후, 분비된 alpha-amylase의 효소 활성도를 측정함으로써 프로모터의 발현율을 간접적으로 확인하였다.
E. coli-Lactobacillus 셔틀벡터인 pAT 벡터에 제한효소 사이트 SpeI과 BglII를 이용하여 HCE 프로모터(229 bp)와 SlpA7 프로모터(214 bp)를 각각 삽입하였고, 이 프로모터에 의해 아밀라아제가 분비 발현될 수 있도록 알파-아밀라아제 분비 시그널과 알파-아밀라아제 유전자가 연속되게 나열된 플라스미드 구조물 2종 (pAT-HCE-AmylSS-amylase, pAT-SlpA7-AmylSS-amylase)을 구축하였다.
SlpA7 프로모터는 HCE 프로모터 유래의 124 bp와 유산균에서 알려진 S-layer 단백질을 코딩하는 slpA 유전자의 프로모터들에서 나타나는 consensus 서열을 바탕으로 선택된 90 bp 부위가 연속적으로 연결된 총 214 bp의 염기서열(서열번호 10)을 가지며, 양 말단에 각각 SpeI과 BglII의 제한효소 사이트를 가진다.
구축된 구조물이 각각 형질전환된 두 종의 유산균을 확보하여 1% 녹말이 첨가된 MRS 고체배지에서 일정시간 배양 후, 분비된 알파-아밀라아제에 의해 배지 상에 포함된 녹말이 분해되는 정도를 요오드 염색을 통해 확인하여 알파-아밀라아제의 분비를 확인하였고, 플라스미드 유지를 위한 항생제 에리스로마이신이 16 μg/ml의 최종농도로 첨가된 MRS 배지에서 액상 배양하면서 일정 배양 시간 후, 배지로 분비된 알파-아밀라아제의 활성도를 측정하였다. 배양상등액내 분비되어진 알파-아밀라아제의 활성도를 측정하기 위해서 활성측정용키트 (Kikkoman Co., Tokyo, Japan)를 사용하였다. 기질은 N3-G5-β-CNP(2-chloro-4-nitrophenyl 65-azido-65-deoxy-β-maltopentaoside)가 사용되었으며, 배양 상등액 100μl와 400μl의 기질포함 용액을 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤 800μl의 반응 정지 용액을 첨가하여 반응을 종료시키고 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit의 활성은 37℃에서 1분 동안 N3-G5-β-CNP로부터 400 nm에서 흡광도를 보이는 CNP(2-chloro-4-nitrophenol)이 1 μmole 생성되는데 필요한 효소의 양으로 정의하였다. 활성 측정 결과, HCE 프로모터에 의한 알파-아밀라아제의 활성이 0.052 unit/ml 임에 비해 SlpA7 프로모터에 의한 알파-아밀라아제의 활성이 0.234 unit/ml로 약 4.5배 높았다 (표 1). 따라서 SlpA7 프로모터가 HCE 프로모터에 비해 약 4.5배 높은 발현율을 나타내는 것으로 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
본 발명은 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 및 마이오스타틴 단백질의 성숙(mature) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세 포표면 발현벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명은 또한, 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있으며, 상기 방법에 의해 제조된 세포표면에 발현된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 또는 백신을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 세포표면에 발현된 마이오스타틴 성숙 단백질을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 또는 백신은 가축과 가금류 등의 근육발달 및 조절을 위해 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 근이영양증, 근육위축증과 같은 사람의 근육 소모성 질환 및 퇴행성 질환의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있다. 또한, 마이오스타틴 성숙 단백질을 표면발현하는 형질전환 균주는 배양하여 균체 그대로 사용하여도 효과를 나타내므로 매우 경제적이다.
<110> Bioleaders Corp.
M. D. LAB
<120> Cell Surface Expression Vector of Myostatin and Microorganisms
Transformed Thereby
<130> P06-B193
<150> KR10-2005-0085543
<151> 2006-09-14
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<211> 1127
<212> DNA
<213> Gallus domesticus
<400> 1
atgcaaaagc tagcagtcta tgtttatatt tacctgttca tgcagatcgc ggttgatccg 60
gtggctctgg atggcagtag tcagcccaca gagaacgctg aaaaagacgg actgtgcaat 120
gcttgtacgt ggagacagaa tacaaaatcc tccagaatag aagccataaa aattcaaatc 180
ctcagcaaac tgcgcctgga acaagcacct aacattagca gggacgttat taagcagctt 240
ttacccaaag ctcctccact gcaggaactg attgatcagt atgatgtcca gagggacgac 300
agtagcgatg gctctttgga agacgatgac tatcatgcca caaccgagac gattatcaca 360
atgcctacgg agtctgattt tcttgtacaa atggagggaa aaccaaaatg ttgcttcttt 420
aagtttagct ctaaaataca atataacaaa gtagtaaagg cacaattatg gatatacttg 480
aggcaagtcc aaaaacctac aacggtgttt gtgcagatcc tgagactcat taagcccatg 540
aaagacggta caagatatac tggaattcga tctttgaaac ttgacatgaa cccaggcact 600
ggtatctggc agagtattga tgtgaagaca gtgctgcaaa attggctcaa acagcctgaa 660
tccaatttag gcatcgaaat aaaagctttt gatgagactg gacgagatct tgctgtcaca 720
ttcccaggac cgggtgaaga tggattgaac ccatttttag aggtcagagt tacagacaca 780
ccgaaacggt cccgcagaga ttttggcctt gactgtgatg agcactcaac ggaatcccgt 840
gttgtcgcta cccgctgaca gtggatttcg aagcttttgg atgggactgg attatagcac 900
ctaaaagata caaagccaat tactgctccg gagaatgcga atttgtgttt ctacagaaat 960
acccgcacac tcacctggta caccaagcaa atcccagagg ctcagcaggc ccttgctgca 1020
cacccaccaa gatgtcccct ataaacatgc tgtatttcaa tggaaaagaa caaataatat 1080
atggaaagat accagccatg gttgtagatc gttgcgggtg ctcatga 1127
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
cgcggatccg aggtcagagt tacagacaca 30
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ggaaagcttt tattatcatg agcacccgca acgatca 37
<210> 4
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<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 4
atgcaaaaac tgcaaatctc tgtttatatt tacctattta tgctgattgt tgctggccca 60
gtggatctga atgagaacag cgagcagaag gaaaatgtgg aaaaagaggg gctgtgtaat 120
gcatgtttgt ggagggaaaa cactacatcc tcaagactag aagccataaa aatccaaatc 180
ctcagtaaac ttcgcctgga aacagctcct aacatcagca aagatgctat cagacaactt 240
ttgcccaagg ctcctccact cctggaactg attgatcagt tcgatgtcca gagagatgcc 300
agcagtgacg gctccttgga agacgatgac taccacgcca ggacggaaac ggtcattacc 360
atgcccacgg agtctgatct tctaacgcaa gtggaaggaa aacccaaatg ttgtttcttt 420
aaatttagct ctaagataca atacaataaa ctagtaaagg cccaactgtg gatatatctg 480
aggcctgtca agactcctgc gacagtgttt gtgcaaatcc tgagactcat caaacccatg 540
aaagacggta caaggtatac tggaatccga tctctgaaac ttgacatgaa cccaggcact 600
ggtatttggc agagcattga tgtgaagaca gtgttgcaga actggctcaa acaacctgaa 660
tccaacttag gcattgaaat caaagcttta gatgagaatg gccatgatct tgctgtaacc 720
ttcccagaac caggagaaga tggactgact ccttttttag aagtcaaggt aacagacaca 780
ccaaaaagat ctaggagaga ttttgggctt gattgtgatg aacactccac agaatctcga 840
tgctgtcgtt accctctaac tgtggatttt gaagcttttg gatgggattg gattattgca 900
cctaaaagat ataaggccaa ttactgctct ggagaatgtg aatttgtatt tttgcaaaag 960
tatcctcata cccatcttgt gcaccaagca aaccccagag gttcagccgg cccctgctgt 1020
actcctacaa agatgtctcc aattaatatg ctatatttta atggcgaagg acaaataata 1080
tacgggaaga ttccagccat ggtagtagat cgctgtgggt gttcatga 1128
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
cgcggatccg aggtcagagt tacagaca 28
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
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ggaaagcttt tattatcatg agcacccgca acgatc 36
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<213> Oncorhynchus keta
<400> 7
atgcatgtga tgcaggttct aatttctctg agttttatgg ttgctttcgg ttcaatgggt 60
cttggtgatc aaacggcgca ccaccaatcc ccggccacgg atgacggtga gcagtgctca 120
acctgcgagg tccgacagca gatcaaaaac atgagattac acgccatcaa gtcacaaatt 180
cttagcaaac tgcgactcaa gcacgcgccc aatattagcc gagatgttgt caagcagctc 240
ttgcctaagg caccaccttt gcagaaactt cttgaccagt atgatgtact tggagatgac 300
aataaggatg gagttatgga agatgatgat gaacatgcca tcacagaaac aatcatgaca 360
atggccactg aacccgaatc catcgtccaa atcgatggga aacccaagtg ttgctttttc 420
tccttcagtt cgaagattca ggcgaaccgc atacttcggg cacagctatg ggtgcacctt 480
cagccagctg acgaagtcac caccgtgttg ctgcaaatct cccgcctgat ccctgtcacg 540
gacgggggca ggaacataca gatccggtct ctaaagatcg acgtgaatgc aggagtcagc 600
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cgctccagga gagattcggg cctggactgt gatgagaact cccccgagtc ccgctgctgc 840
cggtaccccc tcacggtgga ctttgaagac tttggctggg actggattat tgcccccaag 900
cgctacaagg ccaactactg ctctggtgag tgcgagtaca tgcacctgca gaagtacccc 960
cacacccacc tggtgaacaa ggctaaccct cgcggcaccg cggggccctg ctgcaccccc 1020
accaagatgt cccccatcaa catgctctac ttcaaccgca aagagcagat catctacggc 1080
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<223> primer
<400> 8
cgggatccga ttcgggcctg gactgtgatg ag 32
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<223> primer
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ggggtacctc acgagcagcc gcagcggtcc 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> promoter
<400> 10
tgatctctcc ttcacagatt cccaatctct tgttaaataa cgaaaaagca tcaatcaaaa 60
cggcggcatg tctttctata ttccagcaat gttttatagg ggacatattg atgaagatgg 120
gtattagtat ttttcggtca ttttaacttg ctattttttg aagaggtcag taaatatgaa 180
tcgtggtaag tattttcaca cttctggaaa aagg 214
Claims (15)
- 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코딩하는 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상과, 서열번호 11 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 서열로 표시되는 마이오스타틴 단백질의 성숙(mature) 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포표면 발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 마이오스타틴은 포유동물, 조류(가금류) 또는 어류 유래인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 표면 발현벡터는 SlpA7 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제1항에 있어서, pBT:pgsA-CMyom, pBT:pgsA-PMyom, pBT:pgsA-BMyom 및 pBT:pgsA-FMyom으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 발현벡터로 형질전환된 미생물.
- 제5항에 있어서, 상기 미생물은 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리오 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 바실러스, 유산균, 스테필로코커스, 코리네 박테리아, 리스테리아 모노싸이토제네스 및 스트랩토코커스로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제5항에 있어서, 상기 미생물은 유산균인 것을 특징으로 하는 형질전환된 미생물.
- 제5항의 형질전환된 미생물을 배양하여 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 미생물 표면에 발현하는 단계; 및 상기 마이오스타틴 성숙 단백질이 표면발현된 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 미생물을 제조하는 방법.
- 제8항의 방법에 의해 제조된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질이 표면발현된 미생물을 유효성분으로 함유하는 인간을 제외한 동물의 근육성장 촉진 및 증체율 향상용 사료첨가제.
- 제8항의 방법에 의해 제조된 세포표면에 발현된 마이오스타틴 성숙(mature) 단백질을 유효항원으로 함유하는 근이영양증 또는 근육위축증의 예방 또는 치료용 백신.
- 제10항에 있어서, 경구용 또는 식용섭취가 가능한 것을 특징으로 하는 백신.
- 제9항의 사료첨가제를 동물에 급여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 체중, 근육질, 근육세포수 또는 근육세포 크기를 증가시키거나, 체지방량을 감소시키는 방법.
- 제10항의 백신을 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 체중, 근육질, 근육세포수 또는 근육세포 크기를 증가시키거나, 체지방량을 감소시키는 방법.
- 삭제
- 삭제
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010079991A2 (ko) | 2009-01-08 | 2010-07-15 | 주식회사 바이오리더스 | 안정적인 항시적 고발현 자궁경부암 치료백신용 벡터 및 그에 의해 형질전환된 재조합 유산균 |
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Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| KR100923664B1 (ko) * | 2007-09-21 | 2009-10-28 | 대한민국(관리부서 : 농림수산식품부 국립수의과학검역원) | 돼지 ＩｇＧ의 Ｆｃ 도메인의 세포 표면 발현용 벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포, 상기 숙주세포를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스 백신 및 이의 제조방법 |
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| CN113679827A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-11-23 | 华南农业大学 | 一种基于斜带石斑鱼mstn自体基因疫苗的构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1072680A1 (en) | 1999-07-30 | 2001-01-31 | Pfizer Products Inc. | Myostatin regulatory region, nucleotide sequence determination and methods for its use |
| KR100469936B1 (ko) | 2003-06-04 | 2005-02-03 | 주식회사 바이오리더스 | 사스 바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물 |
Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| AU756620B2 (en) * | 1997-07-14 | 2003-01-16 | University Of Liege | Mutations in the myostation gene cause double-muscling in mammals |
| ATE342990T1 (de) * | 2001-08-10 | 2006-11-15 | Bioleaders Corp | Oberflächenexpressionsvektoren mit pgsbca, dem für poly-gamma-glutamat-synthetase codierenden gen, sowie verfahren zur expression eines zielproteins an der oberfläche eines den vektor benutzenden mikroorganismus |
-
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-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1072680A1 (en) | 1999-07-30 | 2001-01-31 | Pfizer Products Inc. | Myostatin regulatory region, nucleotide sequence determination and methods for its use |
| KR100469936B1 (ko) | 2003-06-04 | 2005-02-03 | 주식회사 바이오리더스 | 사스 바이러스 항원의 세포표면 발현벡터 및 상기 벡터에의해 형질전환된 미생물 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010079991A2 (ko) | 2009-01-08 | 2010-07-15 | 주식회사 바이오리더스 | 안정적인 항시적 고발현 자궁경부암 치료백신용 벡터 및 그에 의해 형질전환된 재조합 유산균 |
| US8685721B2 (en) | 2009-01-08 | 2014-04-01 | Bioleaders Corporation | Stable constitutively high expression vector for preparing HPV vaccine and recombinant lactic acid bacteria transformed thereby |
| US9228190B2 (en) | 2009-01-08 | 2016-01-05 | Bioleaders Corporation | Vector for constitutive high-level expression containing REPe mutant gene |
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