WO2010079991A2 - 안정적인 항시적 고발현 자궁경부암 치료백신용 벡터 및 그에 의해 형질전환된 재조합 유산균 - Google Patents

안정적인 항시적 고발현 자궁경부암 치료백신용 벡터 및 그에 의해 형질전환된 재조합 유산균 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a repE mutation gene having a amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a promoter, a polygamma glutamic acid synthase complex gene, and a tumor inducing antigen of human papilloma virus linked to the polygamma glutamic acid synthase complex gene
  • the present invention relates to a surface expression vector for preparing an HPV vaccine containing a gene encoding a protein.
  • HPV Human papilloma virus
  • Cervical cancer is the second most common cancer among women after breast cancer. According to the World Health Organization, there are more than 500,000 cervical cancer cases worldwide each year, and more than 300,000 people die of cervical cancer each year. have. Especially in developing and underdeveloped countries, it is the leading cause of death for women (Pisani, P. et al., Int. J. Cancer , 55: 891, 1993). According to IARC statistics, the long-term most effective way to combat HPV infection is to administer the HPV vaccine, especially in chronically infected countries, with far greater numbers in developing countries.
  • the development of vaccines related to cervical cancer focuses mainly on two forms: prophylactic and therapeutic vaccines.
  • the vaccine is intended to prevent the host from becoming infected by HPV L1 / L2 antigen protein, which prevents the host from becoming infected and prevents further development of the disease.
  • Therapeutic vaccines target HPV E6 / E7 but induce specific cellular immunity to degenerate previously formed lesions or malignant tumors.
  • HPV's E6 / E7 protein is a cancer-specific antigen that is involved in cancerous HPV-infected cells
  • research on therapeutic vaccines using E6 / E7 protein as a target of cervical cancer immunotherapy has been ongoing. Indeed, when HPV E6 / E7 protein synthesized in a microbial system is administered to mice injected with tumor cells, tumor formation is inhibited or delayed (Gao, L. et al., J. Gen. Viol ., 75: 157, 1994, Meneguzzi, G. et al., Virology , 181: 62, 1991).
  • live virus vaccines may cause problems due to excessive virus replication, and thus there are many cases of only actual studies, and long periods of commercialization and considerable clinical trials.
  • HPV antigens are produced more economically and stably for the prevention and treatment of papillomavirus-derived oral mucosal tumors of the reproductive organs. There is an urgent need for the development of methods.
  • the present inventors have developed a vector for effectively expressing the HPV antigen protein on the surface of the transformed recombinant microorganism and a method for expressing the HPV antigen protein on the surface of the microorganism (Korean Patent Registration No. 0609866).
  • the present inventors have made efforts to develop a vector that is more stable and constantly expressed on the surface of recombinant lactic acid bacteria transformed with HPV antigen protein, and thus, more stable in recombinant microorganisms transformed with a vector containing the repE mutation gene. It was confirmed that the expression of the protein of interest is improved, and the present invention has been completed.
  • the main object of the present invention is to provide a vector that can stably and always express high on the surface of recombinant lactic acid bacteria transformed with HPV antigen protein using the repE mutation gene.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant lactic acid bacteria transformed with the expression vector and a method for producing HPV antigen protein using the lactic acid bacteria.
  • Another object of the present invention to provide a recombinant lactic acid vaccine transformed for the treatment of cervical cancer using the transformed recombinant lactic acid bacteria.
  • the present invention provides a human papilloma virus (human papilloma) linked to the repE mutation gene having a amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a promoter, a polygamma glutamic acid synthase complex gene, and the polygamma glutamic acid synthase complex gene
  • a surface expression vector containing a gene encoding a tumor-associated antigen protein of the virus is provided.
  • the present invention also provides a recombinant microorganism transformed with the vector.
  • the present invention also provides a vaccine for the treatment of cervical cancer comprising the transformed recombinant microorganism expressed on the surface of the HPV antigen protein.
  • the present invention also provides a method for producing a microorganism surface-expressed HPV antigen comprising culturing the recombinant microorganism transformed with the vector surface-expressing HPV antigen and recovering the recombinant microorganism surface-expressed HPV antigen To provide.
  • the present invention provides a vaccine for the treatment of cervical cancer containing the microorganism surface-expressed as an active ingredient of the antigen prepared by the above method.
  • 1 shows a sequence map of the pKV-Pald-PgsA-Amylase vector into which the repE mutant gene is introduced.
  • Figure 2 shows a series map of two expression vectors that surface expression of the E7 gene.
  • Figure 3 shows the results confirmed by Western blotting the surface expression of E7 in recombinant lactic acid bacteria transformed with pKV-Pald-PgsA-E7.
  • Figure 4 shows the schedule for administering the transformed recombinant lactic acid bacteria to the mouse for the immunological efficacy of the transformed recombinant lactic acid bacteria surface-expressing E7.
  • Figure 5 shows the change of IgG and IgA upon oral administration of the transformed recombinant lactic acid bacteria surface-expressing E7.
  • Figure 6 shows the results of confirming the secretion of E7 specific IFN-gamma upon oral administration of the transformed recombinant lactic acid bacteria surface-expressing E7.
  • Figure 7 shows the progress of confirming whether the tumor size increase by the tumor challenge upon oral administration of the transformed recombinant lactic acid bacteria surface-expressing E7.
  • Figure 8 shows the sequence map of the expression vector surface expression of the E7 (Rb) gene.
  • Figure 9 shows the results confirmed that the surface expression of E7 (Rb) in recombinant lactic acid bacteria transformed with pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb).
  • Figure 11 shows the results confirming the secretion of E7 (Rb) specific IFN-gamma upon oral administration of the transformed recombinant lactic acid bacteria surface-expressing E7 (Rb).
  • the present invention provides a repE mutation gene having a amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a promoter, a polygamma glutamic acid synthase complex gene, and a tumor-associated antigen protein of human papillomavirus linked to the polygamma glutamic acid synthase complex gene It relates to a surface expression vector for the production of HPV vaccines containing the gene encoding the.
  • an aldolase promoter derived from an aldolase gene of Lactobacillus casei a repE mutation gene having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, in which a vector can be stably maintained in a transformed microorganism
  • a vector can be stably maintained in a transformed microorganism
  • amylase expression was confirmed by inserting the amylase gene into the target gene.
  • the polygamma glutamic acid synthase complex gene which is a surface expression motif, was positioned to be expressed in connection with the target protein, and the polygamma glutamic acid synthase complex gene is preferably pgsBCA, more preferably. Preferably it is pgsA (Korea Patent No. 469800).
  • a vector pKV-Pald-PgsA- capable of surface expression of HPV antigen protein in lactic acid bacteria by fusion of a gene encoding psgA and HPV16 E7 so that the target protein HPV16 E7 protein is fused to the PgsA C-terminus.
  • E7 was prepared, and the expression vector was inserted into the Lactobacillus casei to prepare a transformed recombinant lactic acid bacterium expressing the HPV antigen protein.
  • the "target protein” or “foreign protein” means a protein that can not normally exist in the transformed host cell expressing the protein.
  • the protein is called a foreign protein or a protein of interest.
  • the present invention relates to a recombinant microorganism transformed with the vector expressing the HPV antigen protein, and a vaccine for treating cervical cancer containing the transformed recombinant microorganism as an active ingredient.
  • 'host', or 'microorganism' means a lactic acid bacterium that is a gram-positive bacterium of probiotic
  • the selection criteria for general probiotic microorganisms include (i) human-derived microorganisms; (ii) be stable to bile, acid, enzyme and oxygen; (iii) have the ability to adhere to the intestinal mucosa; (iv) have the ability to form colonies in the digestive tract; (v) be capable of producing antibacterial substances; And (vi) conditions such that efficacy or stability can be demonstrated. Based on the above conditions, it is clear that lactic acid bacteria are bacteria that are friendly and harmless to growth in the human body.
  • the lactic acid bacteria may include the genus Lactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium.
  • Lactobacillus genus Lactobacillus also know pillar's (L. acidophilus), Lactobacillus casei (L. casei), Lactobacillus Planta Room (L. plantarum), Lactobacillus spread lactofermentum (L. ferementum), Lactobacillus L. delbrueckii , L. johnsonii LJI , L. reuteri and L. bulgaricus ; Streptococcus genus includes S.
  • thermophilus The genus Bifidobacterium Bifidobacterium Infante Tees (B. infantis), Bifidobacterium Bifidobacterium bonus (B. bifidum), Bifidobacterium rongeom (B. longum), Bifidobacterium pseudo rongeom (B. psuedolongum ), Bifidobacterium breve , Bifidobacterium lactis Bb-12 ( B. lactis Bb-12 ), and Bifidobacterium adolescents ( B. adolescentis ) can be used as hosts. More preferably Lactobacillus genus.
  • the present invention comprises the steps of culturing the recombinant microorganism transformed with the vector to generate HPV antigen; And it relates to a method for producing a microorganism surface-expressed HPV antigen comprising the step of recovering the microorganisms surface-expressed the generated HPV antigen.
  • Cultivation of the recombinant microorganism according to the present invention can be carried out according to well-known methods, conditions such as the culture temperature and time, the pH of the medium can be appropriately adjusted.
  • Recovery of the recombinant microbial cells in the culture may use conventional separation techniques, such as centrifugation, filtration.
  • the present invention relates to a vaccine for treating cervical cancer, wherein the antigen produced by the above method contains a microorganism surface-expressed as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a vaccine for the treatment of cervical cancer, which is characterized by oral use.
  • Vaccines are agents used to stimulate the immune system using bioorganisms for the purpose of preventing disease.
  • Immune activation refers to a process for efficiently removing antigens by stimulating antibody production, stimulation of T-lymphocytes, or other immune cells (eg, macrophages) in an organism.
  • T-lymphocytes e.g, macrophages
  • the subject of administration of the transformed microbial vaccine which expresses the protein of interest as an antigen may be a mammal, more preferably a human.
  • the preparation of the vaccine composition can be carried out using standard techniques, and the dosage suitable for the recipient will vary depending on the antigenicity of the gene product and should be sufficient to induce a typical immune response of the vaccine present and undergo routine laboratory procedures. You can easily determine the required amount. Typical initial vaccine doses are between 0.001 and 1 mg antigen per kg body weight, either increasing amounts or using multiple doses as needed to provide the desired level of protection. The amount can be determined by one of ordinary skill in the art and depends on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response sensitivity of the recipient. It can also be prescribed in various ways.
  • the most preferred embodiment of the surface expression vector for HPV vaccine production encoding the HPV antigen protein E7 of the present invention is a gene encoding a repE variant protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, aldolase promoter derived from lactic acid bacteria, polygamma for surface expression A polygamma glutamic acid gene selected from the group consisting of the glutamic acid synthase complex genes pgsB, pgsC and pgsA and a gene encoding the tumor-associated antigen protein E7 of human papillomavirus linked to the polygamma glutamic acid synthase complex gene It is a surface expression vector for HPV vaccine production, and the recombinant lactic acid bacteria transformed with the vector can be cultured to surface-express HPV antigen protein E7, and then used directly as a vaccine.
  • the most preferred embodiment of the surface expression vector for HPV vaccine production encoding the HPV antigen protein E7 (Rb) of the present invention is a gene encoding a repE variant protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, lactic acid bacteria-derived aldolase promoter, surface expression Polygamma glutamic acid gene selected from the group consisting of the polygamma glutamic acid synthase complex genes pgsB, pgsC and pgsA and the tumor-associated antigen protein E7 (Rb) of human papillomavirus linked to the polygamma glutamic acid synthase complex gene It is a surface expression vector for producing a HPV vaccine containing a gene encoding a gene, and the recombinant lactic acid bacteria transformed with the vector are cultured to surface express the HPV antigen protein E7 (Rb), and then used directly as a vaccine.
  • the microbial carrier of the gene product must first be introduced into the body for the immune response.
  • the vaccine composition For oral administration of the vaccine composition to a recipient, it is useful to be provided in a lyophilic form, for example in the form of a capsule.
  • the capsule is provided in an enteric coating comprising Eudragate S, Eudragate L, cellulose acetate, cellulose phthalate or hydroxy propylmethyl cellulose.
  • the capsules may be used on their own or by reconstituting a lyophilic substance such as a suspension prior to administration.
  • Recomposition is effective to carry out in a buffer at a pH suitable for the survival of the transformed recombinant microorganism. It may be useful to administer the sodium bicarbonate preparation prior to each vaccine administration to protect the transformed recombinant microorganism and vaccine from gastric acid.
  • the vaccine may be prepared for parenteral, intranasal or intramammary administration.
  • a surface expression vector with improved expression of the target protein containing the repE mutation gene was prepared.
  • fragments of the aldolase promoter were obtained.
  • the aldolase promoter was obtained by PCR using pDT-PgsA-Amylase disclosed in the Republic of Korea Patent Publication No. 10-2008-0086161 using a primer of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 as a template.
  • the N-terminal part of the obtained DNA fragment contained 13bp of the 3 'end of the aldolase promoter and secured a 782bp fragment to which pgsA was directly linked.
  • the pgsA portion of this fragment contains a PstI restriction enzyme site.
  • the two fragments were joined and PCR was performed using primers at both ends to obtain 1175 bp DNA fragments, and the fragments including the Aldolase promoter and pgsA N-terminal fragment were obtained by cutting with SphI and PstI .
  • pBT pgsA-Amylase (pAT-PslpA-pgsA-amylase; see indirect example of Korean Patent No. 0872042) was digested with restriction enzymes SphI and PstI to remove the SlpA7 promoter portion and pgsA N-terminal portion to backbone the expression vector. It was made.
  • a pAT: Pald-PgsA-Amylase was constructed by linking a DNA fragment containing an aldolase promoter digested with SphI and PstI with pBT: PslpA-Amylase digested with the same restriction enzymes.
  • the pAT-Pald-PgsA-Amylase vector was constructed.
  • pKV-Pald encoded to have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 by cleaving 21 C-terminal amino acids of RepE protein by replacing TTA codon encoding repE gene 475th amino acid leucine with TGA stop codon by site-directed mutagensis method -PgsA-Amylase was completed (FIG. 1)
  • the vector pKV-Pald-PgsA which can surface-express in lactic acid bacteria by inserting a gene encoding HPV16 E7 protein into the C-terminal of PgsA using the surface expression vector (pKV-Pald-PgsA-Amylase) prepared in Example 1 -E7 was prepared.
  • amylase gene fused with pgsA was removed from the pKV-Pald-PgsA-Amylase vector prepared in Example 1, and a gene encoding HPV16 E7 was inserted.
  • a fragment including the HPV16 E7 gene was used as a template with pHAT: pgsA-E7 (Poo et al., Int. J. Cancer , 119: 1702, 2006) as a template. Obtained by performing PCR.
  • pKV-Pald-PgsA-Amylase was digested with BamHI and XbaI to remove the Amylase gene portion and to secure the vector portion.
  • PKV-Pald-PgsA-E7 was completed by linking DNA fragments containing the E7 gene cut with BamHI and XbaI with a vector cut with the same restriction enzyme (FIG. 2A).
  • Example 3 Confirmation of expression of lactic acid bacteria transformants of pHAT: PgsA-E7 and pKV-Pald-PgsA-E7
  • lactobacillus casei was transformed with pHAT: PgsA-E7 and pKV-Pald-PgsA-E7 prepared in Example 2, and the recombinant Lactobacillus casei was cultured to express E7 protein. Confirmed. The expression of E7 protein fused with pgsA in the transformed recombinant Lactobacillus casei was investigated.
  • PgsA-E7 and pKV-Pald-PgsA-E7 were cultured in an MRS medium (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA) at 30 ° C. to synthesize polygamma glutamic acid.
  • MRS medium Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA
  • Fusion protein was confirmed by performing the whole cells of the cultured Lactobacillus casei by Western blotting using SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and specific antibodies against pgsA.
  • the membrane was washed with a buffer solution and reacted for 1 hour by diluting a secondary antibody against rabbits HRP conjugated with blocking buffer solution 10000 times. After completion of the reaction, the membrane was washed with a buffer solution and added to the washed membrane by adding a substrate (lumigen PS-3 acridan, H202) for about 1 minute.
  • a substrate lumigen PS-3 acridan, H202
  • Lane C of FIG. 3 is transformed recombinant Lactobacillus casei expressing only PgsA (pKV-Pald-PgsA), lane 1 is the expression of recombinant Lactobacillus casei transformed with pHAT: PgsA-E7, and lane 2 Shows protein expression of recombinant Lactobacillus casei transformed with pKV-Pald-PgsA-E7.
  • the expression of PgsA-E7 fusion protein of 54.4 kDa in lanes 1 and 2 can be confirmed using PgsA specific Ab, compared with the expression of PgsA-E7 fusion protein by pHAT: PgsA-E7. It was confirmed that the fusion protein by pKV-Pald-PgsA-E7 was more strongly expressed.
  • the lactic acid bacteria transformant was obtained through the method of obtaining the lactic acid bacteria transformant carried out in the same manner as described above. could not be secured.
  • Humorality of HPV16 E7 fused with PgsA by transforming Lactobacillus casei with the surface expression vector and inducing surface expression in the same manner as in Example 2 and then using two transformed recombinant Lactobacillus casei Induction of immune responses was compared.
  • two transformants with different expression levels of fusion proteins were treated with various doses (1, 1/5, 1/10), respectively, to compare the induction of immune responses.
  • Lactobacillus casei was transformed with the vector, cultured and harvested, lyophilized powder was dissolved in buffer solution (PBS, pH 7.4) and then orally administered to 6-week-old female Balb / c mice.
  • buffer solution PBS, pH 7.4
  • ELISA dilutes HPV16 E7 protein with 500 ng / 100 ⁇ l of each well using coating buffer (0.1 M sodium carbonium, 0.02% sodium azide, pH 9.6) and dispenses 100 ⁇ l into 96-well ELISA plates. The reaction was reacted overnight at ° C. After washing three times with 300ul / well of PBST (PBS + 0.05% Tween20), 100 ⁇ l of 5% skim milk was added, blocked at 37 ° C. for 1 hour, the blocking buffer was removed, and then washed three times with PBST. 100 ⁇ l of diluted serum and mucosal washings were added, respectively. After the sample was added and reacted at 37 ° C.
  • coating buffer 0.1 M sodium carbonium, 0.02% sodium azide, pH 9.6
  • the average OD value of E7 specific serum IgG after immunization for the first two weeks was measured, and the pAT-E7 and pKV-E7 administration groups showed higher OD values than the pAT control group.
  • the E7 specific antibody increased in accordance with the amount administered.
  • the mean OD value of E7 specific serum IgG after the first boost showed an increased OD value compared to Immunization for the first 2 weeks in both pAT-E7 and pKV-E7 administration groups and showed a boosting effect.
  • the mean OD value of E7 specific serum IgG after the second boost also showed a boosting effect in both treatment groups, especially in the pKV-E7-treated group with a significantly higher surface expression of E7 fusion protein compared to pAT-E7.
  • pAT-E7 1/1 administration group showed similar IgG boosting effect.
  • the E7 specific IgA antibody in the intestine and vagina was measured by ELISA.
  • the average OD value after immunization for the first two weeks was pAT control.
  • the E7 specific IgA was increased, and the E7 specific antibody was increased according to the amount administered.
  • the average OD value after the first boost was further increased, and the second boost effect was slightly more effective than the first boost.
  • Oral administration of the transformed recombinant Lactobacillus casei expressing HPV16 E7 according to the present invention could induce HPV16 E7 specific humoral immunity (serum IgG induction) and mucosal immunity (Interstinal / Vaginal IgA induction)
  • HPV16 E7 specific humoral immunity serum IgG induction
  • mucosal immunity Interstinal / Vaginal IgA induction
  • the pKV-E7 group expressing more E7 was able to induce an immune response more effectively than the pAT-E7 group.
  • splenocytes were isolated from mice orally administered with the transformed recombinant Lactobacillus casei expressing E7.
  • Splenocytes of 5 x 10 6 cells were suspended in RPMI-1640 medium containing 10% FBS and dispensed into 24 well plates. Each well was treated with E7 peptide (aa 49-57, AniGen, Korea) and GolgiPlug (BD Biosciences) containing MHC class I epitope and incubated at 37 ° C. for 16 hours.
  • the cultured cells were stained with phycoerythrin (PE) -conjugated monoclonal rat anti-mouse CD8 antibody for 40 minutes at 4 ° C.
  • Intracellular IFN- ⁇ was incubated with Cytofix / Cytoperm kit using FITC-conjugated monoclonal rat anti-mouse IFN- Stained with ⁇ antibody.
  • PE phycoerythrin
  • IFN- ⁇ ELISPOT was performed to determine the total number of T cells secreting IFN- ⁇ specifically for stimulation by the E7 peptide.
  • the plate was coated with anti-mouse IFN-g capture antibody the day before the splenocytes were separated.
  • Splenocytes isolated on the day of the experiment were divided into 2 X 10 5 cells per well. Cells were treated with E7 peptide or PHA-M, media in wells dispensed with cells and incubated for 2 days. After 2 days, the contents of the plate were removed, washed twice with distilled water and three times with PBS containing 0.05% tween-20. The biotinylated anti-mouse IFN-g was dispensed and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the contents were removed, washed three times with PBS containing 0.05% tween-20, and streptavidin-HRP was dispensed and reacted at room temperature for one hour.
  • the contents were removed, washed four times with PBS containing 0.05% tween-20, washed twice with PBS, and then reacted with a substrate to observe color development for 5 to 60 minutes.
  • the reaction was stopped with distilled water and the ELISPOT reader was stopped. The number of spots of each well was measured.
  • TC-1 tumor cell model expressing E7 protein to confirm anticancer effects and dose-dependent anticancer effects of two transformed recombinant Lactobacillus (pHAT-E7, pKV-E7) with different surface expression levels of HPV 16 E7 antigen Tumor cell challenge was performed using.
  • mice 6-8 weeks old were prepared for each group and orally administered with a transformed recombinant Lactobacillus casei expressing E7.
  • Oral administration was performed five times per week, with a 1 week rest period after the initial 1 week administration, followed by a first boost of 1 week and a second boost of 1 week after a 1 week rest period.
  • 2 x 10 4 cells of TC-1 tumor cells were induced by subcutaneous injection (sc) inside the left thigh. The size of the formed cancer was measured three times a week using a caliper.
  • tumor cells were about 50% larger in size than the control group orally administered with Lactobacillus casein. It could be confirmed that it is formed small.
  • the group treated with pKV-E7 recombinant Lactobacillus casei reduced by 1/5 showed smaller tumor cell size than the control group.
  • Example 7 Variation of amino acid of HPV type16 E7 related site Introduction of protein surface expression immunolactic acid bacterium (pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb))
  • the expressed E7 protein and pRb (Retinoblastoma Growth Suppressor Protein) protein may bind to each other and cause cancer, resulting in a mutation in the nucleotide sequence of the portion that binds to the pRb protein of the E7 gene.
  • the mutant-induced E7 (Rb) gene was fused to the PgsA terminus using a pKV shuttle vector stably expressed in Escherichia coli and lactic acid bacteria to prepare a vector pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb) that can be surface-expressed in lactic acid bacteria. It was.
  • a 87bp fragment containing the HPV16 E7 gene was obtained by SEQ ID NOs: 7 and 8, and the 5 'end of the DNA fragment contained a BamHI restriction enzyme site and a 249bp variant obtained by SEQ ID NOs: 9 and 10.
  • the 3 'end of the DNA fragment contained an XbaI restriction enzyme site.
  • the 5 'end of the obtained 312 bp DNA fragment contained a BamHI restriction enzyme site and a 3' end of the XbaI restriction enzyme site. This fragment was digested with BamHI and XbaI to obtain a 306 bp mutated E7 (Rb) gene fragment.
  • pKV-Pald-PgsA-Amylase was digested with BamHI and XbaI to remove the Amylase gene portion and to secure the vector portion.
  • PKV-Pald-PgsA-E7 was completed by linking a DNA fragment containing a mutated E7 (Rb) gene digested with BamHI and XbaI with a vector digested with the same restriction enzyme (FIG. 8).
  • constructs were transformed using the Lactobacillus casei electroporation method, and the lactic acid transformants transformed with the constructs were obtained.
  • Example 8 Confirmation of expression of pKV-Pald-PgsA-E7 (Rb) lactic acid bacteria transformant
  • the transformed recombinant Lactobacillus casei was cultured at 30 ° C. (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), and cultured at 30 ° C., and the cells were recovered and Western blotting was performed in the same manner as in Example 3. It was confirmed that expression took place. Western blotting was performed using PgsA specific antibody and HPV16 E7 specific antibody (E7 monoclonal Ab, Invitrogen, USA). As shown in FIG. 9, expression of mutant E7 protein fused with PgsA of about 54.7 kDa was confirmed. .
  • Transgenic recombinant Lactobacillus casei confirmed expression of the mutant E7 protein fused with PgsA was orally administered to mice to confirm whether a humoral immune response was induced.
  • the vector was transformed into Lactobacillus casei, cultured, harvested, lyophilized powder was dissolved in buffer (PBS, pH 7.4) and then orally administered to 6-week-old female Balb / c mice.
  • the average OD value of E7 specific serum IgG after immunization for the first two weeks was measured, and the E7-Rb administration group showed higher OD value than the L525 (-control) administration group.
  • the mean OD value of E7 specific serum IgG after the first boost showed an increased OD value compared to Immunization for the first 2 weeks in the E7-Rb administration group and showed a boosting effect.
  • the mean OD value of E7 specific serum IgG after the second boost also showed a boosting effect. However, there was no boosting effect in the L525 group.
  • the intestinal and vaginal E7 specific IgA antibodies were measured by ELISA, and as shown in B of FIG. 10 and C of FIG. 10, the average OD after the first two weeks of immunization.
  • the value of E7-Rb was higher in the E7-Rb group than in the L525 (-control) group.
  • the average OD value after the first boost was increased and the second boosting effect was increased compared to the first boost. Seemed.
  • HPV16 E7 specific systemic humoral immune response serum IgG induction
  • mucosal humoral immune response Interstinal / Vaginal IgA induction
  • Splenocytes were isolated from mice orally administered with the transformed recombinant Lactobacillus casei expressing E7 (Rb) prepared in Example 7. Splenocytes of 5 x 10 6 cells were suspended in RPMI-1640 medium containing 10% FBS and dispensed into 24 well plates. Each well was treated with E7 peptides (aa 49-57, AniGen, Korea) and GolgiPlug (BD Biosciences) containing MHC class I epitope and incubated at 37 ° C. for 16 hours.
  • E7 peptides aa 49-57, AniGen, Korea
  • GolgiPlug GolgiPlug
  • the cultured cells were stained with phycoerythrin (PE) -conjugated monoclonal rat anti-mouse CD8 antibody for 40 minutes at 4 ° C, and the intracellular IFN- ⁇ was FITC-conjugated monoclonal rat anti-mouse IFN using Cytofix / Cytoperm kit. Staining with - ⁇ antibody.
  • PE phycoerythrin
  • E7 (Rb) specifically IFN- ⁇ As shown in FIG. 11, E7 (Rb) It was confirmed that the number of E7 (Rb) specific IFN- ⁇ secreting CD8 + T cell precursors by the transformed recombinant Lactobacillus casei expressing In particular, in the early days of inducing an immune response, it was confirmed that the cell mediated immune response by pKV-E7 (Rb) lactic acid bacteria having a large surface expression was increased. The response also increased to a similar level.
  • IFN- ⁇ ELISPOT was performed to measure the total number of T cells secreting IFN- ⁇ specific to stimulation by E7 peptide.
  • the plate was coated with anti-mouse IFN-g capture antibody the day before the splenocytes were separated.
  • Splenocytes isolated on the day of the experiment were divided into 2 X 10 5 cells per well. Cells were treated with E7 peptide or PHA-M, media in wells dispensed with cells and incubated for 2 days. After 2 days, the contents of the plate were removed, washed twice with distilled water and three times with PBS containing 0.05% tween-20. The biotinylated anti-mouse IFN-g was dispensed and reacted at room temperature for 2 hours.
  • IFN- ⁇ secreting cell numbers increased due to stimulation of the E7 peptide.
  • a greater number of IFNs were found in the group receiving the recombinant Lactobacillus casei transformed with pKV-E7 (Rb) than the group receiving the recombinant Lactobacillus casei transformed with pHAT-E7 (Rb).
  • the distribution of - ⁇ secreting cell number was confirmed.
  • Recombinant lactic acid bacteria transformed with the surface expression vector of the human papillomavirus antigen protein according to the present invention and a composition comprising the same as a main component can be utilized as a vaccine for the treatment of cervical cancer, and transformed recombinant to always express high HPV antigen It is very economical because the strain can be economically mass-produced and applied directly as an oral vaccine or directly to the vaginal region.

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 유전자, 프로모터, 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스(human papilloma virus)의 종양 유발관련 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인간 파필로마바이러스의 항원단백질의 표면발현용 벡터로 형질전환된 재조합 유산균 및 이를 이용한 조성물은 자궁경부암 치료용 백신으로 활용하여 경구 또는 질 부위에 직접 적용할 수 있으므로 매우 경제적인 효과가 있다.

Description

안정적인 항시적 고발현 자궁경부암 치료백신용 벡터 및 그에 의해 형질전환된 재조합 유산균
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 유전자, 프로모터, 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스(human papilloma virus)의 종양 유발관련 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현벡터에 관한 것이다.
세균에서 유용한 외래단백질을 다량 발현시키려는 시도에 있어서 외래단백질의 생산량은 유전자 복제수, 즉, 플라스미드 수와 전사를 조절하는 데 사용되는 프로모터의 세기에 의존한다는 것이 알려져 있다. 통상적으로 많이 사용되고 있는 고발현 프로모터 외에 세균 개체당 플라스미드 벡터의 수를 변화시켜 목적단백질 발현량을 증가시킬 수 있음이 보고되었고 (Tomio, M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 28: 170, 1988), mini-F 플라스미드에서 RepE의 변이가 세균 개체 내에서 플라스미드 수를 변화시킬 수 있음이 보고되었다 (Yasuo, K. et al., J. Biol. Chem., 267:11520,1992).
인간 파필로마바이러스 (Human papilloma virus, HPV)는 세계적으로 전체 성인중 50% 이상이 감염되어 있다고 추정되며 파필로마바이러스중에 특히 HPV 16, 18, 31 및 45의 네 가지 타입은 80% 이상의 자궁경부암(cervical cancer)의 원인으로 확인되었다 (Lowy, D. R. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 91: 2436, 1994).
세계적으로 자궁경부암은 유방암 다음으로 여성들에게 발생 빈도수가 높은 암으로써 세계 보건 기구에 의하면 매년 전세계적으로 50만명 이상의 자궁 경부암 환자가 발생하고 있으며, 매년 300,000명 이상이 자궁경부암에 의해 사망하는 것으로 추정되고 있다. 특히 개발 도상국 및 저개발국가에서는 여성 사망의 주원인이 되고 있다 (Pisani, P. et al., Int. J. Cancer, 55: 891, 1993). IARC 통계에 의하면 특히 만성감염자가 선진국에 비해서 월등히 많은 개발도상국에 HPV 감염을 퇴치하기 위하여, 장기적으로 가장 효과적인 방법은 HPV 예방백신을 투여하는 것으로 보고되었다.
자궁경부암과 관련된 백신 개발의 방법으로는 크게 예방 백신(prophylactic)과 치료 백신(therapeutic)의 두 가지 형태에 초점이 맞추어지고 있다. 예방백신은 HPV L1/L2 항원 단백질에 의해 강한 중화항체(neutralizing antibody)가 생성되게 함으로써 숙주가 HPV에 감염되는 것을 막고, 이미 감염되었더라도 더 이상 병이 진전되지 않도록 하는데 목적이 있다. 한편, 치료 백신은 HPV E6/E7을 대상으로 하되 특이적인 세포성 면역을 유도시켜 이미 형성된 병반이나 악성 종양을 퇴화시키는 것을 목적으로 하고 있다.
HPV의 E6/E7 단백질은 HPV에 감염된 세포들의 암화에 돤련 된 암 특이 항원이기 때문에 자궁경부암의 면역치료의 타겟으로 E6/E7 단백질을 이용한 치료백신 연구가 계속 진행되어 왔다. 실제로 미생물 시스템에서 합성된 HPV E6/E7 단백질을 종양 세포를 주입한 쥐에 투여하였을 경우 종양 형성이 저해되거나 지연된다는 보고가 있다 (Gao, L. et al., J. Gen. Viol., 75: 157, 1994, Meneguzzi, G. et al., Virology, 181: 62, 1991). 그러나 다른 경우들과 마찬가지로 생바이러스 백신을 이용할 경우 과다한 바이러스 복제로 인한 문제점을 유발할 수 있으므로 실제 연구에 그치는 경우가 많고 상업화까지 오랜 기간과 상당한 임상실험이 필요한 단점이 있다.
한편, 박테리아 벡터를 이용한 백신 개발 연구도 활발히 진행 중인데, 약독화된 살모넬라균(attenuated Salmonella typhimurium)에서 합성된 HPV 16 VLP가 쥐의 점막이나 전신에서 항원 특이적인 항체의 생성을 유도한다는 보고도 있다 (Denis, N. et al., Infection and immunity, 65: 3328, 1997). 합성 펩타이드를 이용한 백신은 면역반응을 유도하는데 필요한 에피토프만을 합성하여 접종(vaccination)시키는 것으로, 이미 HPV 16 E6/E7에 대한 세포성 면역 반응(Cytotoxic T Lymphocyte ; CTL)을 일으키는 에피토프가 밝혀져 있다 (Ressing, M. E. et al., J. Immunol., 154: 5934, 1995).
이러한 시도 이외에 식물에서 바이러스의 항원을 생산하기 위해 토마토 및 감자 등의 채소류를 이용하여 그 형질 전환체 채소류 자체를 경구용 백신(oral vaccine) 또는 식용 백신(edible vaccine)으로 사용하려는 연구가 진행 중에 있다. 대표적인 예로서 간염 바이러스 표면 항원 입자(Hepatitis B surface antigen particle) (Thavala, Y. F. and Artzen, C. J., Pro. Natl. Acad. Sci. USA., 92: 3358, 1995)와 파필로마바이러스의 캡시드 L1과 L2단백질 (대한민국 특허등록 제 0366608호)이 그 예이다. 그러나 식물을 이용한 시스템의 경우 발현되는 HPV L1 단백질의 양이 적고 정제의 문제가 있어 역시 상업적인 제약이 따른다는 문제가 있다.
따라서, HPV의 감염 인구가 주로 저개발 국가에 집중되어 있는 점을 감안 할 때에 파필로마바이러스 유래의 구강 또는 생식기관의 피부점막의 종양에 대한 예방과 치료를 위해, 보다 경제적이고 안정적으로 HPV 항원을 제조하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 HPV 항원단백질을 형질전환된 재조합 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 벡터와 미생물의 표면에 HPV 항원단백질을 발현시키는 방법을 개발한바 있다 (대한민국 특허등록 제0609866호).
이에, 본발명자들은 HPV 항원단백질이 형질전환된 재조합 유산균 표면에서 보다 안정적이고 항시적으로 고발현되는 벡터를 개발하고자 예의 노력한 결과, repE 변이 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 재조합 미생물에서 보다 안정적으로 목적단백질의 발현이 향상된다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은 repE 변이 유전자를 이용하여 HPV 항원단백질이 형질전환된 재조합 유산균의 표면에서 안정적이고, 항시적으로 고발현시킬 수 있는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 재조합 유산균 및 상기 유산균을 이용하여 HPV 항원단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 재조합 유산균을 이용하여 자궁경부암 치료용으로 형질전환된 재조합 유산균 백신을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 유전자, 프로모터, 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스(human papilloma virus)의 종양 유발관련 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 표면발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, HPV 항원단백질이 표면에 발현된 형질전환 재조합 미생물을 유효성분으로 하는 자궁경부암 치료용 백신을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여 HPV 항원을 표면발현시키는 단계 및 상기 HPV 항원이 표면발현된 재조합 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 HPV 항원이 표면발현된 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 항원이 표면발현된 미생물을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신을 제공한다.
도 1은 repE 변이 유전자가 도입된 pKV-Pald-PgsA-Amylase 벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 2은 E7 유전자를 표면발현하는 2종의 발현벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 pKV-Pald-PgsA-E7로 형질전환된 재조합 유산균에서 E7의 표면발현을 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 E7을 표면발현하는 형질전환된 재조합 유산균의 면역효능실험을 위해 mouse에 형질전환된 재조합 유산균을 투여하는 일정을 나타낸 것이다.
도 5는 E7을 표면발현하는 형질전환된 재조합 유산균의 경구 투여 시 IgG와 IgA의 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 E7을 표면발현하는 형질전환된 재조합 유산균의 경구 투여 시 E7 specific IFN-gamma 분비를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 E7을 표면발현하는 형질전환된 재조합 유산균의 경구 투여 시 tumor challenge에 의한 tumor size 증가 여부를 확인한 경과를 나타낸 것이다.
도 8은 E7(Rb) 유전자를 표면발현하는 발현벡터의 계열지도를 나타낸 것이다.
도 9는 pKV-Pald-PgsA-E7(Rb)로 형질전환된 재조합 유산균에서 E7(Rb)이 표면발현된 것을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 E7 specific ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 E7(Rb)를 표면발현하는 형질전환된 재조합 유산균의 경구 투여 시 E7(Rb) specific IFN-gamma 분비를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 유전자, 프로모터, 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스의 종양 유발관련 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서는 형질전환된 미생물 내에서 벡터가 안정적으로 유지될 수 있는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 유전자, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 알돌레이즈(aldolase) 유전자에서 유래한 알돌레이즈 프로모터(Pald)를 함께 도입한 결과로 목적단백질의 발현이 향상되는 것을 확인하였다. 본 발명의 셔틀벡터가 안정적으로 유지되고, 목적단백질이 발현되는 것을 확인하기 위하여 목적 유전자로 amylase 유전자를 삽입하여 amylase 발현을 확인하였다.
또한, 목적단백질의 표면발현을 위하여, 표면발현모티브인 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자를 목적단백질과 연결되어 발현되도록 위치시켰으며, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자는 pgsBCA 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 pgsA인 것이 바람직하다 (대한민국 등록특허 제 469800호).
본 발명의 일양태에서, PgsA C-말단에 목적단백질인 HPV16 E7 단백질이 융합되도록 psgA 와 HPV16 E7 코딩하는 유전자를 융합시켜서 유산균에서 HPV 항원단백질을 항시 표면발현할 수 있는 벡터 pKV-Pald-PgsA-E7을 제조하였고, 상기 발현벡터를 락토바실러스 카제이에 삽입하여 HPV 항원단백질을 발현하는 형질전환된 재조합 유산균을 제조하였다.
본 발명에서, 상기 ‘목적단백질’또는 ‘외래단백질’은 상기 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포에서는 정상적으로는 존재할 수 없는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 유산균에서 바이러스 유래 또는 종양 유래 단백질을 인위적으로 발현하도록 조작하였을 경우, 상기 단백질을 외래단백질 또는 목적단백질이라 한다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기의 HPV 항원단백질을 표면발현하는 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기의 형질전환된 재조합 미생물을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신에 관한 것이다.
본 명세서에서 ‘숙주’, 또는 ‘미생물’은 프로바이오틱(probiotic)의 그람양성균인 유산균을 의미하며, 일반적인 프로바이오틱 미생물의 선별기준에는 (i) 인간유래의 미생물일 것; (ii) 담즙, 산, 효소 및 산소에 안정적일 것; (iii) 장내 점막에 부착하는 능력이 있을 것; (iv) 소화기관 내에서 콜로니를 형성할 수 있는 능력이 있을 것; (v) 항박테리아성 물질을 생산할 수 있을 것; 및 (vi) 효능이나 안정성이 증명될 수 있을 것 등의 조건이 포함되어 있다. 상기 조건을 근거로 유산균은 인체 내에서의 생장이 친화적, 무해한 균이라는 것이 명백하다. 따라서, 유산균을 숙주로 하는 형질전환체를 인체에 적용시켜 질병의 예방 또는 치료를 위한 유전자 전달 또는 단백질 전달 등의 용도로 사용할 경우, 균주를 사용하는 통상의 백신제조 방법과는 달리 균주의 비독성화 또는 무독성화의 단계가 요구되지 않는다.
본 발명에서 상기 유산균은 락토바실러스 속, 스트렙토코커스 속 및 비피도박테리움 속을 포함할 수 있다. 대표적으로 락토바실러스 속은 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼(L. ferementum), 락토바실러스 델브루엑키(L. delbrueckii), 락토바실러스 존스니(L. johnsonii LJI), 락토바실러스 료터리(L. reuteri) 및 락토바실러스 불가리커스(L. bulgaricus); 스트렙토코커스 속은 스트렙토코커스 서모필러스(S. thermophilus); 비피도박테리움 속은 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 론검(B. longum), 비피도박테리움 슈도론검(B. psuedolongum), 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 락티스 Bb-12(B. lactis Bb-12) 및 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis) 등을 숙주로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 속이다.
본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하여 HPV 항원을 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 HPV 항원이 표면발현된 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 HPV 항원이 표면발현된 미생물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 재조합 미생물의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있으며, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 상기 배양물에서의 재조합 미생물 균체의 회수는 통상적인 분리 기술, 예를 들어 원심분리, 여과법 등을 이용할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 상기의 방법으로 제조된 항원이 표면발현된 미생물을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 경구용인 것을 특징으로 하는 자궁경부암 치료용 백신에 관한 것이다.
백신은 질병에 대한 예방의 목적으로 생유기물을 사용하여 면역 시스템을 자극시키는데 사용되는 약제이다. 면역 활성화는 유기체 내에서 항체 생성, T-림프구의 자극, 또는 다른 면역세포(예: 대식세포)를 자극하여 항원을 효율적으로 제거하기 위한 과정을 의미한다. 상기에 대한 자세한 면역학의 개관은 당업계의 통상의 기술을 가진 자들은 쉽게 이해된다 (Barrett, J.T., Textbook of Immunology, 1983). 항원으로서의 목적단백질을 발현하는 형질전환된 미생물 백신의 투여대상은 포유동물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다.
상기 백신 조성물의 제법은 표준 기법을 사용하여 실시할 수 있으며, 투여자에게 적합한 투여량은 유전자 생성물의 항원성에 따라 변하며 존재하는 백신의 전형적인 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이면 되며 일상적 실험 과정을 거쳐 필요량을 쉽게 판단할 수 있다. 전형적인 초기의 백신 용량은 체중 kg당 항원 0.001 내지 1mg이며, 바람직한 수준의 보호를 제공하기에 필요에 따라 양을 증가하거나 다중 용량을 사용한다. 상기의 양은 당해 기술분야에 속하는 전문가에 의해 결정될 수 있고, 제제화 방법, 투여 방식, 투여자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해서도 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 HPV 항원 단백질 E7을 코딩하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터의 가장 바람직한 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 단백질을 코딩하는 유전자, 유산균 유래 알돌레이즈 프로모터, 표면발현을 위한 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 폴리감마글루탐산 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스의 종양 유발관련 항원 단백질 E7을 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터이고, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 유산균을 배양하여 HPV 항원단백질 E7을 표면발현시킨 다음, 백신으로 바로 사용할 수 있다.
본 발명의 HPV 항원 단백질 E7(Rb)를 코딩하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터의 가장 바람직한 양태는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 단백질을 코딩하는 유전자, 유산균 유래 알돌레이즈 프로모터, 표면발현을 위한 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 폴리감마글루탐산 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스의 종양 유발관련 항원 단백질 E7(Rb)를 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터이고, 상기 벡터로 형질전환된 재조합 유산균을 배양하여 HPV 항원단백질 E7(Rb)를 표면발현시킨 다음, 백신으로 바로 사용할 수 있다.
백신이 항체를 생성함에 있어 효과적이기 위해서는, 항원성 물질이 백신 처리된 대상의 항체-생성 기전이 실현될 수 있도록 체내로 방출되어야 한다. 따라서 면역반응을 위해서는 유전자 산물의 미생물 운반체가 체내에 우선 도입되어야 한다. 본 발명의 형질전환된 재조합 유산균에서 제시되는 항원에 의한 바람직한 반응을 자극하기 위해서는 경구 투여 또는 분무제 형태로 자궁 경부에 직접 투여함이 바람직하다.
백신 조성물을 투여자에게 경구 투여하기 위해서는 친액성 형태, 예를 들면 캡슐 형태로 제공되는 것이 유용하다. 상기 캡슐은 Eudragate S, Eudragate L, 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 프탈레이트 또는 히드록시 프로필메틸 셀룰로오즈를 포함하는 장용피복으로 제공된다. 상기 캡슐류는 그 자체로 사용하거나 투여하기 전에 현탁액과 같이 친액성 물질을 재조성하여 사용할 수도 있다. 재조성은 형질전환된 재조합 미생물의 생존에 적합한 pH의 완충액에서 수행하는 것이 효과적이다. 위산으로부터 상기 형질전환된 재조합 미생물 및 백신을 보호하기 위하여 매회 백신 투여 이전에 중탄산나트륨 제제를 투여하는 것이 유용할 수 있다. 선택적으로 백신은 비경구투여, 비내투여 또는 유선내 투여용으로 제조될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 즉, 하기 단계들은 하나의 예시로써 설명되며, 본 발명의 범위가 이에 한정되지 않는다.
실시예 1: repE 변이 유전자를 함유하는 표면발현 벡터의 제조 (pKV-Pald-PgsAL- Amylase)
본 실시예에서는 숙주세포에서 발현벡터를 안정화시키기 위하여, repE 변이 유전자를 함유하는 목적단백질의 발현이 향상된 표면발현 벡터를 제작하였다.
먼저, 유산균에서 더욱 발현량을 높이기 위하여, 락토바실러스 카제이 유래의 프로모터인 알돌레이즈 프로모터의 단편을 확보하였다. 상기 알돌레이즈 프로모터는 대한민국 공개특허 제10-2008-0086161호에 개시된 pDT-PgsA-Amylase를 주형으로 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 사용하여 PCR 방법을 통해 확보하였다.
서열번호 2: 5’-cgc gca tgc aat acc cac tta ttg cg-3’
서열번호 3: 5’-cag ttc ttt ttt cat gta gat atc ctc c-3’
그 결과, 알돌레이즈 프로모터를 포함하고, 5’ 말단에는 SphI 제한효소 부위를 포함하고 있으며 3’ 말단에는 pgsA의 N-terminal 17bp를 포함하고 있는 421bp의 DNA 절편을 확보하였으며, 동일한 벡터를 주형으로 서열번호 4과 서열번호 5의 프라이머를 사용해서 PCR하여 앞서 확보한 알돌레이즈 프로모터 절편과 연결될 수 있는 pgsA 유전자 부분을 확보하였다.
서열번호 4: 5’-gga gga tat cta cat gaa aaa aga act g-3’
서열번호 5: 5’-ggc gct ggc ggt cgt ttg g-3’
그 결과, 확보된 DNA 절편의 N-말단 부분은 알돌레이즈 프로모터의 3’ 말단의 13bp를 포함하고 pgsA가 바로 연결되어있는 782bp 절편을 확보하였다. 이 절편의 pgsA 부분 내부에 PstI 제한효소 부위가 포함되어있다.
확보된 두 절편을 연결하고 양쪽 말단의 프라이머를 사용해서 PCR을 수행하여 1175bp의 DNA 절편을 확보하였으며 SphI과 PstI으로 절단하여 알돌레이즈 프로모터와 pgsA N-terminal 일부분을 포함한 절편을 확보하였다.
pBT:pgsA-Amylase(pAT-PslpA-pgsA-amylase;대한민국 등록특허 제0872042호의 간접실시예 참조)를 제한효소 SphI 및 PstI으로 절단하여 SlpA7 프로모터 부분과 pgsA N-말단 부분을 제거하여 발현벡터의 backbone 으로 하였다.
SphI과 PstI으로 절단한 알돌레이즈 프로모터를 함유하고 있는 DNA 단편을 같은 제한효소로 절단한 pBT:PslpA-Amylase와 연결하여 pAT-Pald-PgsA-Amylase를 제작하였고, pAT-Pald-PgsA-Amylase 벡터에 site-directed mutagensis 방법으로 repE 유전자 475번째 아미노산 루신을 코딩하는 TTA 코돈을 TGA 정지 코돈으로 치환하여 RepE 단백질 중 21개의 C-말단 아미노산이 절단되어 서열번호 1의 아미노산서열을 가지도록 코딩한 pKV-Pald-PgsA-Amylase 를 완성하였다 (도 1)
실시예 2: HPV16 E7 표면발현 벡터(pKV-Pald-PgsA-E7)의 제조
실시예 1에서 제조된 표면발현 벡터(pKV-Pald-PgsA-Amylase)를 사용해서 PgsA의 C-terminal에 HPV16 E7 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입시켜서 유산균에서 표면발현할 수 있는 벡터 pKV-Pald-PgsA-E7을 제조하였다.
먼저, 실시예 1에서 제조된 pKV-Pald-PgsA-Amylase 벡터에서 pgsA와 융합된 Amylase 유전자를 제거하고 HPV16 E7을 코딩하는 유전자를 삽입하였다. HPV16 E7 유전자를 포함하는 단편을 도 1에서 보는 바와 같이 pHAT:pgsA-E7 (Poo et al., Int. J. Cancer, 119: 1702, 2006)를 주형으로 서열번호 6과 서열번호 7을 프라이머로 사용해서 PCR을 수행하여 수득하였다.
서열번호 6: 5’-gcg gga tcc cat gga gat aca cct aca ttg c-3’
서열번호 7: 5’- acg cag aag cgg tct gat aa -3’
그 결과, HPV16 E7 유전자를 포함하고 있는 386bp의 절편을 확보하였으며, 상기 절편의 5’말단에는 BamHI 제한효소 부위를 포함하고 있으며, 상기 절편의 3’말단에는 XbaI 제한효소 부위를 포함하고 있다. 확보된 DNA 절편에 BamHI과 XbaI 처리하여 절단하여 306bp 절편을 확보하였다.
pKV-Pald-PgsA-Amylase를 BamHI과 XbaI으로 절단하여 Amylase 유전자 부분을 제거하고 벡터부분을 확보하였다.
BamHI과 XbaI으로 절단한 E7 유전자를 함유하고 있는 DNA 단편을 같은 제한효소로 절단한 벡터와 연결하여 pKV-Pald-PgsA-E7을 완성하였다 (도 2의 A).
실시예 3: pHAT:PgsA-E7와 pKV-Pald-PgsA-E7의 유산균 형질전환체의 발현 확인
본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 pHAT:PgsA-E7와 pKV-Pald-PgsA-E7로 락토바실러스 카제이를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 배양하여 E7 단백질의 발현을 확인하였다. 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이에서 pgsA와 융합된 E7단백질의 발현 여부를 조사하였다.
pHAT:PgsA-E7 와 pKV-Pald-PgsA-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 MRS배지 (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), 30℃에서 정치배양하여 폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자 pgsA의 C-말단과 융합된 HPV16 E7 단백질의 표면발현을 유도하였다.
상기 배양된 락토바실러스 카제이의 전세포를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 pgsA 대한 특이 항체를 이용한 웨스턴블럿팅을 수행하여 상기 융합단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로 발현이 유도된 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이 전세포를 동일한 세포농도에서 얻은 단백질로 디네이쳐(denature)시켜 시료를 준비하고, 이를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 분획된 단백질들을 PVDF (polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad) 멤브레인에 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액(50 mM 트리스 염산, 5 % 스킴 밀크(skim milk), pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음, PgsA에 대한 토끼 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 HRP가 접합된 토끼에 대한 2차 항체를 블로킹 완충용액에 10000배 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 세척된 멤브레인에 기질(lumigen PS-3 acridan, H202)을 첨가하여 약 1분간 발색시켰고 CCD 카메라로 PgsA에 대한 특이 항체와 상기 융합단백질간의 특이적인 결합을 확인하였다 (도 3).
도 3의 레인 C는 PgsA만 발현시킨 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이 (pKV-Pald-PgsA)이고, 레인 1은 pHAT:PgsA-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 발현이며, 레인 2는 pKV-Pald-PgsA-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 단백질 발현을 나타낸 것이다. 도 3에서 나타난 바와 같이 PgsA specific Ab를 사용하여 레인 1과 2에서 54.4 kDa 의 PgsA-E7 융합단백질의 발현을 확인 할 수 있으며, pHAT:PgsA-E7에 의한 PgsA-E7 융합단백질의 발현과 비교하면 pKV-Pald-PgsA-E7에 의한 융합단백질이 더 강하게 발현됨을 확인하였다.
정상적인 RepE를 포함하고 있는 pHAT:PgsA-E7의 PslpA-PgsA-E7 부분을 Pald-PgsA-E7으로 치환한 구조물의 경우, 상기와 동일한 방식으로 수행한 유산균 형질전환체 확보 방법을 통해 유산균 형질전환체를 확보할 수 없었다.
실시예 4: HPV16 E7 항원을 표면발현하는 락토바실러스의 체액성 면역반응 유도능 비교
상기 표면발현용 벡터로 락토바실러스 카제이를 형질전환 시키고 실시예2에서와 같은 방법으로 표면발현을 유도한 후 두 가지 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 사용해서 PgsA와 융합된 HPV16 E7의 체액성 면역 반응 유도를 비교하였다. 또한 융합단백질의 발현량이 다른 두 가지의 형질전환체를 각각 다양한 투여량(1, 1/5, 1/10)으로 처리해서 면역 반응 유도를 비교하였다.
상기 벡터로 락토바실러스 카제이를 형질전환 시킨 후 배양하여 수확한 후, 동결건조 하여 준비한 파우더를 완충용액 (PBS, pH 7.4)에 녹인 후 6주령의 암컷 Balb/c 마우스에 경구로 투여하였다.
구체적으로, HPV16 E7를 발현하는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이 (pHAT-E7, pKV-E7) 와 발현하지 않는 락토바실러스 카제이 (pAT)의 동결건조 파우더를 각각 PBS에 농도별 (5 x 109 /200㎕, 1 x 109 /200㎕, 5 x 108 /200㎕)로 녹인 다음, 일주일에 5번씩 2주간 immunization (0-4 days, 7-11 days)하고 1주 후에 1차 부스팅 (21-25 days), 다시 1주 후에 2차 부스팅 (35-39 days)을 경구 투여하였다. 혈청내의 HPV16 E7 특이적인 IgG 항체와 점막 내에서 분비되는 HPV16 E7 특이적인 IgA 항체를 측정하기 위해서 장내(Intestinal) 세척액과 질내(Vaginal) 세척액을 14일, 28일, 그리고 42일에 각각 마우스에서 샘플을 채취하였다 (도 4). 혈액은 헤파린이 코팅된 microcapillary tube를 사용하여 마우스의 눈에서 얻었고, 1 mM PMSF가 포함된 PBS 세척액을 사용하여 장내와 질 내를 각각 0.8 ml 과 250 ㎕로 세척한 후 13,000 rpm 에서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하여 ELISA 를 수행하였다.
ELISA는 HPV16 E7 단백질을 well당 각각 500 ng/100 ㎕로 코팅 완충용액 (0.1 M sodium carbonium, 0.02％ sodium azide, pH 9.6)을 사용해서 희석한 후 96-well ELISA 플레이트에 100 ㎕ 씩 분주하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. PBST (PBS+0.05% Tween20)를 300ul/well 씩 첨가하면서 세 번 세척한 후, 5％ 스킴밀크 100 ㎕를 넣고 37 ℃에서 1시간 동안 블로킹 시키고 블로킹 완충용액을 제거한 후, PBST로 3번 세척하고 희석시킨 혈청과 점막 세척액을 각각 100 ㎕씩 첨가하였다. 검체를 첨가한 후 37 ℃에서 2시간 반응시킨 후 세척용액으로 3번 세척한 뒤 horseradish peroxidase-conjugated 항-마우스 IgG 또는 IgA 항체를 1:5000으로 희석하여 well에 첨가 후 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 세척용액으로 세척한 뒤 TMB 발색용액으로 발색시켰고, 2.5 M 황산으로 발색을 고정시켰다. 450nm에서 ELISA 리더로 측정하여 HPV16 E7 특이항체의 양을 분석하였다.
그 결과, 도 5의 A에서 보는 바와 같이 처음 2주간 immunization한 후의 E7 특이적 혈청 IgG의 평균 OD값을 측정한 결과 pAT-E7과 pKV-E7 투여군이 pAT 대조군에 비해 높은 OD값을 나타냈다. 또한 투여한 양에 따라서 E7 특이적 항체가 증가함을 확인하였다. 1차 부스팅 후의 E7 특이적 혈청 IgG의 평균 OD값은 pAT-E7과 pKV-E7 투여군 모두에서 처음 2주간 Immunization에 비해 증가된 OD값을 나타내고 부스팅 효과를 보여주었다. 2차 부스팅 후의 E7 특이적 혈청 IgG의 평균 OD값 역시 두 투여군에서 부스팅효과를 나타내었으며, 특히 pAT-E7에 비해 E7 융합단백질의 표면발현량이 휠씬 높은 pKV-E7 투여군의 경우, 1/5 투여군과 pAT-E7 1/1 투여군이 비슷한 IgG 부스팅효과를 나타내었다.
또한 점막면역반응을 측정하기 위해서 장내와 질내에서의 E7 특이적 IgA 항체를 ELISA로 측정한 결과, 도 5의 B와 도 5의 C에서 보는 바와 같이 처음 2주간 immunization한 후의 평균 OD값은 pAT 대조군에 비해 pAT-E7, pKV-E7 투여군 모두 E7 특이적 IgA가 증가함을 확인하였고, 또한 투여한 양에 따라 E7 특이적 항체가 증가함을 확인하였다. 1차 부스팅 후의 평균 OD값은 더욱 증가하였으며 2차 부스팅 효과는 1차 부스팅에 비해 약간의 효과를 보였다.
본 발명에 의한 HPV16 E7을 발현하는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여할 경우, HPV16 E7 특이적인 체액성 면역 (serum IgG 유도)와 점막 면역 (Interstinal/ Vaginal IgA 유도)을 유도할 수 있었음을 보여주었으며, 특히 E7을 더 많이 발현하는 pKV-E7 투여군이 pAT-E7 투여군 보다 좀더 효과적으로 면역반응을 유도할 수 있었음을 시사했다.
실시예 5: HPV16 E7 항원을 표면발현하는 락토바실러스의 세포성 면역 반응 유도능 비교
HPV 16 E7 항원의 표면발현량이 다른 두가지 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이 (pHAT-E7, pKV-E7)를 경구 투여한 마우스로부터 E7 항원에 특이적인 CD8+ T cell 매개 면역반응 유도와 T cell 면역반응을 유도함에 있어서 차이가 있는지 확인하고자 각각 intracellular cytokine staining과 IFN-γ ELISPOT을 수행하여 세포성 면역 유도능을 조사하였다.
실시예 4에서 언급한 바와 같이 E7을 표면발현하고 있는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 마우스에서 비장세포를 분리하였다. 5 x 106 cell의 비장세포를 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에 부유하여 24 well plate에 분주하였다. 각 well에 MHC class I epitope를 포함하는 E7 펩타이드 (a.a 49-57, AniGen, Korea)와 GolgiPlug (BD Biosciences)을 처리했고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 phycoerythrin(PE)-conjugated monoclonal rat anti-mouse CD8 항체로 4℃에서 40분 동안 염색하였으며 Cytofix/Cytoperm kit를 이용하여 세포내부의 IFN-γ를 FITC-conjugated monoclonal rat anti-mouse IFN-γ 항체로 염색하였다.
두 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 후 intracellular cytokine staining을 수행하여 E7 특이적으로 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 수를 측정한 결과 도 6에서 보는 것과 같이, E7을 발현하는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이에 의한 E7 특이적인 IFN-γ secreting CD8+ T cell precursor의 수가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 특히 면역반응을 유도한 초기에는 표면 발현량이 많은 pKV-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이에 의한 세포 매개성 면역반응이 좀 더 증가됨이 확인되었으나, 부스팅함에 따라 pHAT-E7 유산균에 의한 세포 매개성 면역반응 또한 비슷한 수준으로 증가되었다.
E7 특이적인 T cell 면역반응 유도를 알아보기 위해서 E7 펩타이드에 의한 자극에 특이적으로 IFN-γ를 분비하는 전체 T cell 수를 측정하기 위해서 IFN-γ ELISPOT을 수행하였다.
비장세포를 분리하기 하루 전 plate에 anti-mouse IFN-g capture antibody를 코팅하였고, 실험 당일 분리한 비장세포는 well 당 2 X 105cell로 분주하였다. Cell이 분주된 well 에 E7 펩타이드 또는 PHA-M, media를 처리하고 2일간 배양하였다. 2일 후 plate의 내용물을 제거하고 증류수로 2회, 0.05% tween-20이 포함된 PBS로 3회 세척하였고 biotinylated anti-mouse IFN-g를 분주하고 상온에서 2시간 반응하였다. 반응 후 내용물을 제거하고 0.05% tween-20이 포함된 PBS로 3회 세척 후 streptavidin-HRP를 분주하고 상온에서 한 시간 반응시켰다. 내용물을 제거하고 0.05% tween-20이 포함된 PBS로 4회 세척하고 PBS로 2회 세척한 후, 기질과 반응시켜 발색을 확인하면서 5-60분간 관찰했고, 증류수로 반응을 정지하였으며 ELISPOT reader를 사용해서 각 well의 스팟 수를 측정하였다.
도 6에서 보는 바와 같이 pHAT-E7 또는 pKV-E7로 형질전환된 재조합 유산균을 경구 투여한 마우스의 경우 E7 펩타이드의 자극에 대한 IFN-γ 분비 세포수가 증가되는 것을 확인할 수 있었으며 pHAT-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 투여한 군보다 pKV-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 투여한 군에서 좀 더 많은 수의 IFN-γ 분비 세포수의 분포를 확인할 수 있었다.
실시예 6: HPV E7 항원을 표면발현하는 락토바실러스로 면역된 마우스의 종양세포 챌린지
HPV 16 E7 항원의 표면발현량이 다른 두가지 형질전환된 재조합 락토바실러스 (pHAT-E7, pKV-E7)의 항암효과와 투여량에 따른 항암효과를 확인하기 위해서 E7 단백질을 발현하는 TC-1 종양세포 모델을 이용하여 종양세포 챌린지를 수행하였다.
먼저 6-8 주령의 female C57BL/6 마우스를 각 집단별로 5마리씩 준비하여 E7을 표면발현하고 있는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여하였다. 경구 투여는 주당 5회에 걸쳐 행하였으며 초기 1주간 투여 후 1주일의 휴지기간을 가지고 다시 1주간 첫 번째 부스팅을, 다시 1주일의 휴지기간을 가진 후 1주간 두 번째 부스팅을 하였다. 초기 1주일의 경구투여 후 2 x 104 cell의 TC-1 종양세포를 왼쪽 허벅다리 안쪽에 피하주사(s.c.)로 암을 유도하였다. 형성된 암의 크기는 캘리퍼를 이용하여 일주일에 3번 측정하였다.
도 7에서 보는 바와 같이, pHAT-E7 또는 pKV-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 집단에서 대조군인 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 집단에 비해 종양세포의 크기가 50% 정도로 작게 형성됨을 확인할 수 있었다. 또한 pKV-E7로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 양을 1/5로 줄여 투여한 집단의 경우도 대조군 집단에 비해 작은 종양세포 크기를 보였다.
실시예 7: HPV type16 E7 관련부위 아미노산의 변이 도입 단백질 표면발현 면역유산균(pKV-Pald-PgsA-E7(Rb))의 제조
파필로마바이러스가 세포에 감염될 경우 발현된 E7 단백질과 pRb (Retinoblastoma Growth Suppressor Protein) 단백질이 결합하여 암을 유발할 가능성이 있으므로 E7 유전자의 pRb 단백질과 결합하는 부분의 염기서열에 변이를 유발하였다. 이렇게 변이가 유발된 E7(Rb) 유전자를 대장균과 유산균에서 안정적으로 발현되는 pKV 셔틀 벡터를 사용해서 PgsA 말단에 융합시켜 유산균에서 표면발현할 수 있는 벡터 pKV-Pald-PgsA-E7(Rb)를 제조하였다.
HPV type16 E7 내 Rb binding site를 조사한 결과 pRb (Retinoblastoma Growth Suppressor Protein) binding site (DLxCxE)는 HPV16 E7 유전자의 21번째 아미노산부터 26번째 아미노산으로 알려져 있다 (Smahel M. et al., Virology, 281: 231, 2001). 그 중에서 21번째(D), 24번째(C), 26번째(E) 아미노산을 모두 glycin으로 치환시키기 위해서 프라이머를 사용한 point mutagenesis 방법을 사용해 E7 단백질의 pRb 단백질과의 결합 가능성을 제거하였다. 실시예 2에서 확보한 pKV-Pald-PgsA-E7 벡터를 주형으로 서열번호 8과 9, 서열번호 10와 11을 사용해서 각각 PCR 수행하였다.
서열번호 8: 5’-tct gga tcc atg cat gga gat aca cct ac-3’
서열번호 9: 5’-ttg ccc ata acc gta gag acc agt tgt c-3’
서열번호 10: 5’-act ggt ctc tac ggt tat ggg caa tta aat g-3’
서열번호 11: 5’-cat tct aga tca tta tgg ttt ctg aga aca g-3’
그 결과, 서열번호 7및 8에 의해 HPV16 E7 유전자를 포함하고 있는 87bp의 절편을 확보하였으며 DNA 절편의 5’말단에는 BamHI 제한효소 부위를 포함하고 있으며 서열번호 9및 10에 의해 확보된 변이된 249bp DNA 절편의 3’말단에는 XbaI 제한효소 부위를 포함하고 있었다. 두 개의 확보된 DNA 절편을 Mix하여 95℃ 30초, 42℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 10회 PCR 수행한 후, 서열번호 8및 11을 첨가하여 PCR(95℃ 30초, 53℃ 30초, 72℃ 30초)을 수행하였다. 확보된 312bp DNA 절편의 5’ 말단에는 BamHI 제한효소부위와 3’ 말단에는 XbaI 제한효소 부위를 포함하고 있었다. 이 절편을 BamHI과 XbaI을 처리하여 절단하여 306bp의 변이된 E7(Rb) 유전자 절편을 확보하였다. pKV-Pald-PgsA-Amylase를 BamHI과 XbaI으로 절단하여 Amylase 유전자 부분을 제거하고 벡터부분을 확보하였다. BamHI과 XbaI으로 절단된 변이된 E7(Rb) 유전자를 함유하고 있는 DNA 단편을 같은 제한효소로 절단한 vector와 연결하여 pKV-Pald-PgsA-E7(Rb)을 완성하였다 (도 8).
구축된 상기 구조물을 락토바실러스 카제이에 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 형질전환하였으며, 구조물이 형질전환된 유산균 형질전환체를 확보하였다.
실시예 8: pKV-Pald-PgsA-E7(Rb) 유산균 형질전환체의 발현 확인
확보된 유산균 표면발현용 벡터 pKV-Pald-PgsA-E7(Rb)로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이에서 PgsA와 융합된 E7 내 Rb 결합부위 변이 단백질의 발현 여부를 확인하였다.
형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 MRS배지(Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), 30℃에서 정치배양을 수행하였으며, 균체를 회수하여 실시예 3와 같은 방법으로 웨스턴블로팅을 수행하여 발현이 이루어지는 것을 확인하였다. PgsA 특이 항체와 HPV16 E7 특이 항체 (E7 monoclonal Ab, Invitrogen, USA)를 사용하여 웨스턴블로팅을 수행한 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 약 54.7kDa의 PgsA와 융합된 변이 E7 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 9: 변이된 HPV16 E7(Rb) 항원을 표면발현하는 락토바실러스의 체액성 면역반응 유도
PgsA와 융합된 변이 E7 단백질의 발현이 확인된 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 마우스에 경구투여하여 체액성 면역 반응이 유도되는지 확인하였다. 상기 벡터를 락토바실러스 카제이에 형질전환 시킨 후 배양하여 수확한 후, 동결건조 하여 준비한 파우더를 완충용액 (PBS, pH 7.4)에 녹인 후 6주령의 암컷 Balb/c 마우스에 경구로 투여하였다.
구체적으로 HPV16 E7(Rb)를 발현하는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이(E7-Rb)와 발현하지 않는 락토바실러스 카제이(L525)의 동결건조 파우더를 각각 PBS에 2~5 x 109 cell /200㎕로 녹인 다음, 일주일에 5번씩 2주간 immunization (0-4 days, 7-11 days)하고 1주 후에 1차 부스팅 (21-25 days), 다시 1주 후에 2차 부스팅(35-39 days)을 경구(oral)로 투여하였다. 혈청내의 HPV16 E7 특이적인 IgG 항체와 점막 내에서 분비되는 HPV16 E7 특이적인 IgA 항체를 측정하기 위해서 장내(Intestinal) 세척액과 질내(Vaginal) 세척액을 도 3에서 보는 바와 같이 14일, 28일, 그리고 42일에 각각 마우스로부터 샘플을 채취하였다. 실시예 4과 같이 혈액은 헤파린이 코팅된 microcapillary tube를 사용하여 마우스의 눈에서 얻었고, 1 mM PMSF가 포함된 PBS 세척액을 사용하여 장내와 질내를 각각 0.8 ml 과 250 ㎕로 세척한 후 13,000 rpm 에서 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하여 실시예 4와 동일한 방법으로 ELISA 를 수행하였다.
그 결과, 도 10의 A에서 보는 바와 같이 처음 2주간 immunization한 후의 E7 특이적 혈청 IgG의 평균 OD값을 측정한 결과 E7-Rb 투여군이 L525(-control) 투여군에 비해 높은 OD값을 나타냈다. 1차 부스팅 후의 E7 특이적 혈청 IgG의 평균 OD값은 E7-Rb 투여군에서 처음 2주간 Immunization에 비해 증가된 OD값을 나타냈고 부스팅 효과를 보여주었다. 2차 부스팅후의 E7 특이적 혈청 IgG의 평균 OD값 역시 부스팅효과를 나타내고 있었다. 그러나 L525 투여군에서는 별다른 부스팅 효과가 보이지 않았다. 또한 점막에서 유도되는 체액성 면역반응을 측정하기 위해서 장내와 질내에서의 E7 특이적 IgA 항체를 ELISA로 측정한 결과 도 10의 B와 도 10의 C에서 보는 바와 같이 처음 2주간 immunization한 후의 평균 OD값은 L525(-control) 투여군에 비해 E7-Rb 투여군이 E7 특이적 IgA가 증가함을 확인하였고 1차 부스팅 후의 평균 OD값은 더욱 증가하였으며 2차 부스팅 효과는 1차 부스팅에 비해 증가된 효과를 보였다.
이상의 결과에서 확인된 바와 같이, E7-Rb 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 경우, HPV16 E7 특이적인 systemic humoral immune response (serum IgG 유도)와 mucosal humoral immune response (Interstinal/ Vaginal IgA 유도)을 모두 유도할 수 있음을 보여주었다.
실시예 10: 변이된 HPV16 E7(Rb) 항원을 표면발현하는 락토바실러스의 세포성 면역반응 유도
변이된 HPV 16 E7(Rb) 항원을 표면발현 하는 형질전환된 재조합 락토바실러스(E7-Rb)를 경구 투여한 마우스로부터 E7(Rb) 항원에 특이적인 T cell 매개 면역반응 유도를 IFN-γ ELISPOT을 수행하여, 세포성 면역 유도능을 조사하였다.
실시예 7에서 제작한 E7(Rb)을 표면발현하고 있는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 마우스에서 비장세포를 분리하였다. 5 x 106 cell의 비장세포를 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에 부유하여 24 well plate에 분주하였다. 각 well에 MHC class I epitope를 포함하는 E7 펩타이드 (a.a 49-57, AniGen, Korea)와 GolgiPlug (BD Biosciences)을 처리하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 세포는 phycoerythrin(PE)-conjugated monoclonal rat anti-mouse CD8 항체로 4℃에서 40분 동안 염색하였으며, Cytofix/Cytoperm kit를 이용하여 세포내부의 IFN-γ를 FITC-conjugated monoclonal rat anti-mouse IFN-γ 항체로 염색하였다.
두 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 후 intracellular cytokine staining을 수행하여 E7(Rb) 특이적으로 IFN-γ를 분비하는 CD8+ T 세포의 수를 측정한 결과, 도 11에서 보는 것과 같이, E7(Rb)을 발현하는 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이에 의한 E7(Rb)특이적인 IFN-γ secreting CD8+ T cell precursor의 수가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 특히 면역반응을 유도한 초기에는 표면 발현량이 많은 pKV-E7(Rb) 유산균에 의한 세포 매개성 면역반응이 좀 더 증가됨이 확인되었으나, 부스팅함에 따라 pHAT-E7(Rb) 유산균에 의한 세포 매개성 면역반응 또한 비슷한 수준으로 증가하였다.
E7(Rb) 특이적인 T cell 면역반응 유도를 알아보기 위해서 E7 펩타이드에 의한 자극에 특이적으로 IFN-γ를 분비하는 전체 T cell 수를 측정하기 위해서 IFN-γ ELISPOT을 수행하였다.
비장세포를 분리하기 하루 전 plate에 anti-mouse IFN-g capture antibody를 코팅하였고, 실험 당일 분리한 비장세포는 well 당 2 X 105cell로 분주하였다. Cell이 분주된 well 에 E7 펩타이드 또는 PHA-M, media를 처리하고 2일간 배양하였다. 2일 후 plate의 내용물을 제거하고 증류수로 2회, 0.05% tween-20이 포함된 PBS로 3회 세척하였고, biotinylated anti-mouse IFN-g를 분주하고 상온에서 2시간 반응하였다. 반응 후 내용물을 제거하고 0.05% tween-20이 포함된 PBS로 3회 세척 후, streptavidin-HRP를 분주하고 상온에서 한 시간 반응하였다. 내용물을 제거하고 0.05% tween-20이 포함된 PBS로 4회 세척하고 PBS로 2회 세척한 후, 기질과 반응시켜 발색을 확인하면서 5-60분간 관찰했고, 증류수로 반응을 정지하였으며 ELISPOT reader를 사용해서 각 well의 spot 수를 측정하였다.
도 11에서 보는 바와 같이 pHAT-E7(Rb) 또는 pKV-E7(Rb)로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 경구 투여한 마우스의 경우 E7 펩타이드의 자극에 대한 IFN-γ 분비 세포수가 증가되는 것을 확인할 수 있으며, pHAT-E7(Rb)로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 투여한 군보다 pKV-E7(Rb)로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 투여한 군에서 좀 더 많은 수의 IFN-γ 분비 세포수의 분포를 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 인간 파필로마바이러스 항원단백질의 표면발현용 벡터로 형질전환된 재조합 유산균 및 이를 주요 성분으로 포함한 조성물은 자궁경부암 치료용 백신으로 활용할 수 있으며, 항시 HPV 항원을 고발현하는 형질전환된 재조합 균주를 경제적으로 대량 증식시켜 경구 백신으로 또는 질 부위에 직접 적용할 수 있으므로 매우 경제적인 효과가 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 단백질을 코딩하는 유전자, 프로모터, 표면발현을 위한 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스의 종양 유발관련 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 파필로마바이러스의 종양 유발관련 항원 단백질은 HPV의 E7 또는 E7(Rb)인 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 프로모터는 유산균 유래 알돌레이즈 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자는 pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제1항에 의한 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
  6. 제5항에 있어서, 상기의 미생물은 유산균인 것을 특징으로 하는 미생물.
  7. 제5항 또는 제6항의 형질전환된 재조합 미생물을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신.
  8. 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 HPV 항원을 표면발현시키는 단계; 및 상기 HPV 항원이 표면발현된 재조합 미생물을 회수하는 단계를 포함하는 HPV 항원이 표면발현된 미생물의 제조방법.
  9. 제8항의 방법으로 제조된 HPV 항원이 표면발현된 미생물을 유효성분으로 함유하는 자궁경부암 치료용 백신.
  10. 제7항 또는 제9항에 있어서, 상기 백신은 경구용인 것을 특징으로 하는 자궁 경부암 치료용 백신.
  11. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 단백질을 코딩하는 유전자, 유산균 유래 알돌레이즈 프로모터, 표면발현을 위한 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 폴리감마글루탐산 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스의 종양 유발관련 항원 단백질 E7을 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터.
  12. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 repE 변이 단백질을 코딩하는 유전자, 유산균 유래 알돌레이즈 프로모터, 표면발현을 위한 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자 pgsB, pgsC 및 pgsA로 구성된 군에서 선택되는 폴리감마글루탐산 유전자 및 상기 폴리감마글루탐산 합성효소복합체 유전자와 연결되는 인간 파필로마바이러스의 종양 유발관련 항원 단백질 E7(Rb)를 코딩하는 유전자를 함유하는 HPV 백신 제조용 표면발현 벡터.
  13. 제11항에 의한 벡터로 형질전환된 재조합 유산균.
  14. 제12항에 의한 벡터로 형질전환된 재조합 유산균.
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