KR20200000972A

KR20200000972A - 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산 합성유전자를 이용한 표면발현벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물표면 발현 방법

Info

Publication number: KR20200000972A
Application number: KR1020180073345A
Authority: KR
Inventors: 박영철; 전재원; 박홍규; 강현준; 변세은; 박광서; 기대은
Original assignee: 주식회사 바이오리더스
Priority date: 2018-06-26
Filing date: 2018-06-26
Publication date: 2020-01-06
Also published as: US20220090099A1; CN112334580A; EP3816295A1; EP3816295A4; JP7116809B2; WO2020004877A1; JP2021528060A

Abstract

본 발명은 pgsA를 가지는 표면발현벡터, 폴리감마글루탐산 합성효소를 코딩하는 유전자 및 상기 벡터를 이용하여 미생물 표면에서 목적 단백질을 발현하는 방법에 관한 것이다. 외래 유전자들이 삽입된 상기 벡터는 미생물을 형질전환시키고 외래 단백질이 미생물의 표면에서 안정하게 발현되도록 한다.

Description

바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산 합성유전자를 이용한 표면발현벡터 및 이를 이용한 단백질의 미생물표면 발현 방법{SURFACE EXPRESSION VECTORS INCLUDING pgsA, GENE ENCODING POLY-GAMMA-GLUTAMATE SYNTHETASE, AND METHOD OF USING VECTORS TO EXPRESS TARGET PROTEIN ON SURFACE OF MICROORGANISM}

본 발명은 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질(pgsA)을 이용하여 외래 단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터에 관한 것이다. 또한 본 발명은 바실러스속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 이용하여 외래단백질을 미생물의 표면에 발현시키는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

세포 표면발현은 단백질이나 펩타이드 등을 적절한 표면발현 모체(anchoring motif)와 융합시켜서 그람 음성, 양성균, 곰팡이, 효모, 동물세포의 표면에 발현시키는 기술을 말한다 (Lee S. Y., et al., Trends Biotechnol., 21:4552, 2003). 최초의 세포 표면발현 기술은 1980년대 상대적으로 표면이 단순한 파지를 이용하여 펩타이드나 작은 단백질을 필라멘터스 파지(filamentous phage)의 pIII와 융합하여 발현시켜 이를 표면발현 시스템(surface-expression system)이라고 하였다. 파아지를 이용한 세포 표면발현은 항체의 스크리닝이나, epitope, high-affinity ligand 등의 스크리닝에 사용되었으나, 파아지의 표면에 발현될 수 있는 단백질의 크기가 상대적으로 제한되어 있어서 한계점을 드러내게 되었다. 따라서, 그 대안으로 박테리아를 이용한 세포 표면발현이 개발되었다. 박테리아나 효모와 같은 미생물의 표면 단백질을 표면발현 모체(surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로 발현시키는 분야이다.

특정 유기체의 외막단백질을 이용하여 외래단백질을 세포표면에 발현시키기 위해서는 적당한 표면단백질과 외래단백질을 유전자 수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성되도록 하고, 이들이 안정하게 세포내막을 통과하여 세포표면에 부착되어 유지되도록 해야 한다. 이를 위해서는 다음과 같은 성질을 갖는 단백질을 표면발현의 모체로 사용하는 것이 바람직하다: 첫째, 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호(secretion signal)를 N-말단에 가지고 있고, 둘째, 세포 외막 표면에 안정적으로 부착될 수 있는 표적신호(targeting signal)를 가져야 하며, 셋째, 세포의 성장에 악영향을 끼치지 않는 범위 내에서 세포표면에 다량으로 발현되어 단백질의 활성이 높게 나타날 수 있으면서, 마지막으로, 단백질의 크기에 관계없이 안정적으로 발현되어 다양한 반응에 이용될 수 있어야 한다 (Georgiou et al., TIBTECH, 11:6, 1993). 이러한 표면발현 모체는 숙주세포의 표면에 외막단백질의 N-말단이나 C-말단, 또는 단백질의 중앙에 삽입되도록 유전적으로 조작할 필요도 있다 (Lee et al., TIBTECH, 21:45, 2003)

세균의 표면에 단백질이 발현되기 위해서는, 세포 내에서 생합성된 단백질이 세포막을 통과할 수 있는 분비신호(secretion signal)가 그 단백질의 일차 서열상에 있어야 한다. 또한 그람음성 세균인 경우는 세포내막과 세포막공간을 통과하여 세포외막에 삽입 부착되어 막 외부로 돌출되게 안착되어야 한다.

세균의 경우 이러한 분비신호와 세포 표면에 안착하게 하는 표적신호(targeting signal)를 갖고 있는 단백질로는 표면단백질, 특수한 효소, 독소단백질 등을 예로 들 수 있다. 실제로 이들 단백질이 갖는 분비신호와 표적신호 등을 적당한 프로모터와 함께 사용하면 세균의 표면에 단백질을 성공적으로 발현시킬 수 있다.

외래 단백질의 표면 발현에 사용된 세균의 표면단백질은 세포외막 단백질, 지질단백질(lipoprotein), 분비단백질, 세포 표면기관 단백질 등 크게 4가지로 나눌 수 있다. 현재까지 주로 그람음성 세균에 존재하는 표면단백질, 예를들면, LamB, PhoE, OmpA 등을 이용하여 필요한 외래단백질을 세균의 표면에 발현시키려는 시도가 이루어졌다. 이들 단백질을 이용한 경우 외래단백질을 세포표면에 돌출한 루프(loop)에 삽입시키므로 구조적으로 삽입할 수 있는 단백질의 크기가 제한된다. 또한 삽입될 외래단백질의 C-말단과 N-말단이 입체적으로 가깝게 위치하여야 하므로, 그 거리가 멀 경우에는 연결 펩타이드로 두 말단 사이를 가깝게 하여야 하는 문제가 있다.

실제로 LamB 나 PhoE를 이용한 경우 50-60개 이상의 아미노산으로 이루어진 외래 폴리펩타이드를 삽입하면 구조적 제한을 가져와 안정한 막단백질을 형성하지 못하였다 [Charbit et al., J. Immunol., 139: 1658-1664 (1987) ; Agterberg et al., Vaccine, 8: 85-91 (1990)]. OmpA를 사용하여 외래단백질을 돌출된 루프에 삽입한 경우도 있지만 구조적 제한을 극복하기 위하여 세포외막에 안착하게 할 수 있는 최소한의 표적신호를 포함하는 일부 OmpA 단편만을 사용하였다. 이러한 방법으로 베타락타머제(-lactamase)를 OmpA 표적신호 C-말단에 연결하여 세포표면에 발현시킨 사례가 있다.

또한 최근에 알려진 표면발현에 사용된 그람음성 세균의 세포외막 단백질로 슈도모나스(Pseudomonas)속 유래의 빙핵활성 단백질(Ice-nucleation protein, INP)을 이용한 표면 발현이 시도되었다 [Jung et al., Nat, Biotechnol, 16: 576-560 (1998), Jung et al., Enzyme Microb. Technol, 22(5): 348-354 (1998), Lee et al., Nat. Biotechnol, 18: 645-648 (2000)]. 정(Jung) 등은 N-말단, 중앙의 반복구간 그리고 C-말단으로 구성된 빙핵활성 단백질의 C-말단에 레반슈크레이즈 (levansucrase)를, 그리고 중앙의 반복구간이 삭제된 N-말단 그리고 C-말단으로 구성된 빙핵활성 단백질의 C-말단에 카복실메틸셀룰레이즈(carboxymethylcellulase)를 융합하여 각각을 표면 발현시켜 효소 활성을 측정 확인하였다. 이(Lee) 등은 역시 N-말단, 혹은 N-말단과 C-말단으로 구성된 빙핵활성 단백질의 각각의 말단에 B형 간염 바이러스의 표면항원과 C형 간염바이러스의 코아(core) 항원을 대장균 또는 살모넬라 타이피 Ty21a (Salmonella typhi Ty21a) 균주의 표면에 발현시킨 다음 이들이 복합 생백신으로서 사용될 수 있음을 확인하였다.

지질단백질도 표면단백질로서 표면 발현에 이용되고 있다. 특히 대장균의 지질단백질은 그 N-말단에 분비신호를 갖고 세포내막을 통과할 수 있으며, 말단의 시스테인(L-cysteine)이 공유결합으로 세포외막 지질 또는 세포내막 지질과 직접 부착되어 있다. 주 지질단백질인 Lpp는 N-말단은 세포외막에, C-말단은 세포벽(peptidoglycan, PG)에 결합되어 있어 세포외막 단백질 OmpA 단편과 연결될 경우 안정적으로 외래단백질을 세포외막까지 분비하여 표면 발현할 수 있다[Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489: 2713-2717 (1992)]. 또 다른 지질단백질인 TraT는 지질단백질의 이러한 특성을 이용하여 폴리오바이러스의 C3 에피톱과 같은 펩타이드를 표면발현 하는데 사용되었다[Felici et al., J. Mol. Biol., 222: 301-310 (1991)]. 또한 아직 정확한 기능은 밝혀지지 않은 세포벽 부착형 지질단백질(Peptidoglycan-associated lipoprotein, PAL)도 재조합 항체의 표면발현에 사용되었다[Fuchs et al., Bio/Technology, 9: 1369-1372(1991)], 이 경우 PAL의 C-말단은 세포벽에 연결되고 N-말단은 재조합 항체에 연결되어 융합단백질이 표면 발현되었다.

세포외막을 통과하는 분비단백질도 표면단백질로서 이용될 수 있으나 그람음성 세균의 경우 분비단백질이 발달되어 있지 않으며, 몇몇 분비단백질의 경우만 그 특유의 분비기작에 관여하는 단백질들이 존재하여 세포외막 통과를 돕고 있다. 예를 들어 클랩시엘라(Klebsiella) 속의 풀룰란아제 (pullulanase)는 지질단백질로 그의 N-말단이 지방질로 치환되어 세포외막에 부착되어 있다가 완전히 세포 배양액 중으로 분비된다. 코낵커(Kornacker)등이 풀룰란아제의 N-말단 단편을 이용하여 베타락타머제를 세포 표면에 발현시켰으나 발현된 풀룰란아제-베타락타머제 융합단백질은 잠시 세포 표면에 부착되어있다가 세포 배양액 중으로 유리되는 단점이 있었다. 또한 이를 이용하여 세포막 공간(periplasmic space) 단백질인 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase)를 발현시킨 경우, 이의 분비를 위해서는 적어도 14개 이상의 단백질이 관련되므로 안정적으로 표면 발현되지 않았다[Kornacker et al., Mol. Microl., 4: 1101-1109 (1990)].

독특한 분비체계를 갖고 있는 병원 미생물 나이세리아(Neisseria) 유래의 IgA 프로테아제는 C-말단에 존재하는 단편에 N-말단에 존재하는 프로테아제를 세포외막에 안착하게 하는 신호를 갖고 있다. 일단 세포외막에 도달하여 세포 표면에 돌출한 프로테아제는 자신의 가수분해능에 의해 세포 배양액으로 분비된다. 크라우저(Klauser) 등은 이 IgA 프로테아제 -단편을 이용하여 약 12kDa의 콜레라 독소 B 소단위를 안정적으로 세포 표면에 발현시켰다 [Klauser et al., EMBO J., 9:1991-1999 (1990)]. 그러나 분비과정 중 세포막 공간에서 일어난 단백질의 접힘 (protein folding)에 의해 융합단백질의 분비는 억제되었다.

이외에도 그람음성 세균의 경우 세포 표면에 존재하여 표면 발현에 응용할 수 있는 세포기관으로는 편모(Flagella), 필리(Pili) 및 핌브리아(Fimbriae) 등이 있다. 편모의 구성 소단위인 편모단백질(Flagellin)을 이용하여 콜레라 독소 B소단위와 B형 간염 바이러스로부터 유래한 펩타이드가 안정적으로 발현되었으며 이들은 그에 대한 항체와 강력하게 반응하였다[Newton et al., Science, 244: 70-72 (1989)]. 세포 표면에 실처럼 생긴 핌브리아의 구성단백질인 핌브린(fimbrilin)을 이용하여 외래 펩타이드의 발현을 시도한 결과 작은 펩타이드의 경우만 성공적으로 발현되었다[Hedegaard et al.,Gene, 85:115-124 (1989)].

위와 같은 그람음성 세균의 표면단백질에 의한 표면 발현 시도 외에 그람양성 세균의 표면단백질을 이용한 표면 발현이 최근에 시도되었다[Samuelson et al., J. Bacteriol., 177:1470-1476 (1995)]. 이 경우도 세포 내막을 통과할 수 있는 분비신호와 세포막에 부착되는 표면발현 모체를 필요로 한다. 실제로 스타필로코쿠스 (Staphylococcus hyicus) 유래의 리파제를 분비신호로 사용하고, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 프로테인A를 막 부착 모체로 사용하여 80개 아미노산으로 이루어진 말라리아 항원(malaria blood stage antigen)과 스트렙토코쿠스 단백질G 유래의 알부민 부착 단백질을 효과적으로 그람양성 세균의 표면에 발현시킨 사례가 있다.

상기한 그람음성 및 양성 세균의 표면 발현에 대한 연구를 통해 많은 유용한 단백질 발현 시스템이 개발되어 미국, 유럽과 일본 등에서 출원된 바 있다. 이중에서 특히 그람음성 세균의 세포외막 단백질을 이용한 경우가 5건(WO9504069, WO9324636, WO9310214, EP603672, US5356797) 보고 되었고, 세포 표면 기관인 필리(pili)를 이용한 경우가 한 건(WO9410330)이 있으며, 또한 세포 표면 지질단백질(lipoprotein)을 이용한 경우도 한 건(WO9504079)이 보고되었다.

이상과 같이 세균의 세포외막 단백질을 이용하여 외래단백질을 세포 표면에 발현시키기 위해서는 적당한 세포외막 단백질과 외래단백질을 유전자수준에서 서로 연결하여 융합단백질이 생합성되도록 유도하고, 이들이 안정하게 세포내막을 통과하여 세포외막에 부착되어 유지되도록 해야 한다. 하지만 위의 조건을 모두 만족시키는 표면발현 모체는 아직까지 개발되지 않은 상태이고 현재까지는 상기한 경우의 단점을 보완하는 수준이다.

이와 같은 배경에서, 본 발명자들은 바실러스 속 균주 유래의 폴리감마글루탐산의 합성 유전자(pgsA)를 새로운 표면발현 모체로 활용하는 것에 대하여 예의 검토하고 연구한 바, pgsA 유전자를 이용하여, 외래단백질을 미생물의 표면에 효과적으로 발현시키는 새로운 벡터, 및 미생물의 표면에 외래단백질을 다량 발현시키는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 미생물의 표면에 외래단백질을 대량 발현 시킬 수 있는 표면 발현모체로서 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 선택하고, 이를 이용하여 외래단백질이나 펩타이드를 미생물 표면에 발현시킬 수 있는 목적단백질의 표면발현벡터를 제조하고, 이것으로 형질전환된 다양한 형질전환체에서 외래단백질이 효율적으로 형질전환체의 표면에 발현시키는 방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코드하는 유전자 pgsA와 목적단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 목적단백질의 표면발현벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 pgsA는 폴리감마글루탐산을 생산하는 바실러스 속 균주에서 유래한 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코드하는 유전자 pgsA는 서열번호 13 내지 17 및 24 내지 26 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코드하는 유전자 pgsA는 서열번호 13 내지 16 및 24 내지 26 중 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 pgsA의 말단부위에 링커가 삽입되어 있고, 상기 삽입된 링커에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 목적단백질은 표면발현에 유리하도록 목적단백질의 아미노산 서열 중 일부분이 제거되거나 위치 특이적으로 돌연변이된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로모터는 유산균 유래의 알돌라아제 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 표면발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 형질전환에 사용된 미생물은 목적단백질의 세포 표면발현에 유리하도록, 발현된 목적단백질을 분해하는데 관련된 세포 내 또는 세포 외의 단백질 분해효소를 생산하지 못하도록 변형된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물은 유산균인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서 상기 유산균은 락토바실러스 속, 스트렙토코커스 속 및 비피도박테리움 속을 포함할 수 있다. 대표적으로 락토바실러스 속은 락토바실러스 아시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼(L. ferementum), 락토바실러스 델브루엑키(L. delbrueckii), 락토바실러스 존스니(L. johnsonii LJI), 락토바실러스 료터리(L. reuteri) 및 락토바실러스 불가리커스(L. bulgaricus); 스트렙토코커스 속은 스트렙토코커스 서모필러스(S. thermophilus); 비피도박테리움 속은 비피도박테리움 인판티스(B. infantis), 비피도박테리움 비피덤(B. bifidum), 비피도박테리움 론검(B. longum), 비피도박테리움 슈도론검(B. psuedolongum), 비피도박테리움 브레브(B. breve), 비피도박테리움 락티스 Bb-12(B. lactis Bb-12) 및 비피도박테리움 아돌레센티스(B. adolescentis) 등을 숙주로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 속이다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 목적단백질을 세포표면에 발현하는 단계 및 목적단백질이 표면에 발현된 세포를 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 세포표면 발현방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 목적단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달 단백질 혹은 그 일부분, 항체 혹은 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질, 결합도메인, 펩타이드, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 항원이 표면에 발현된 세포를 인간을 제외한 척추동물에 투여하여 체액성 면역 또는 세포성 면역을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 항원이 표면에 발현된 세포를 인간을 제외한 척추동물에 투여하여 면역반응을 유도하고, 상기 면역반응에 의해 생성된 항체를 회수하는 것을 특징으로 하는 척추동물에서 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 벡터는 그람음성균 또는 그람양성균에 적용되는 것을 특징으로 하는 목적단백질의 표면발현벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 제14항의 미생물 표면발현용 벡터에 목적단백질을 코드하는 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 재조합 벡터로 그람음성 또는 그람양성 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 (c) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적단백질을 숙주세포 표면에 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 그람음성 또는 그람양성 숙주세포의 표면에 목적단백질을 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른, 목적단백질의 표면발현벡터는 목적단백질을 안정하게 발현시킬 수 있으며, 본 발명에 따른 표면발현벡터는 목적단백질을 항시적으로 발현시키면서, 동시에 재조합 미생물에 표면발현시켜 필요로 하는 백신제조용 항원 제작 등에 유용하게 쓰일 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터, pKV-Pald-PgsA-EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA1), PgsA motif 1-60 a.a -EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA2), PgsA motif 1-70 a.a -EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA3), PgsA motif 1-80 a.a -EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA5), PgsA motif 1-100 a.a -EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA5), pKV-PgsA 1-188 a.a-EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA6), PgsA motif 25-60 a.a -EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA7), PgsA motif 25-70 a.a -EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 의한 락토바실러스 카제이를 숙주로 하는 표면발현벡터(pKV-Pald-pgsA8), PgsA motif 25-100 a.a -EGFP의 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 표면발현벡터 pKV-Pald-pgsA1 내지 pKV-Pald-pgsA8로 형질 전환시킨 락토바실러스 카제이에서 EGFP 단백질의 표면발현을 보여주는 웨스턴 블러팅 사진을 나타낸 것이다.

본 발명은 미생물의 표면에 외래단백질을 대량 발현 시킬 수 있는 새로운 표면 발현모체로서 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 선택하고, 이를 이용하여 외래단백질이나 펩타이드를 미생물 표면에 발현 시킬 수 있는 표면발현벡터를 제조하고, 이것으로 형질전환된 다양한 형질전환체에서 외래단백질이 효율적으로 형질전환체의 표면에 발현시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 이루는 유전자 pgsA를 포함하는 미생물 표면발현벡터 및 상기 벡터에 의해 형질전환된 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 상기 미생물 표면발현벡터를 이용하여 외래 단백질을 형질전환균주의 표면에 발현시키는 방법을 제공한다.

유전자 pgsA가 코딩하는 단백질은 바실러스 속에 존재하는 세포외막 단백질로서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis IFO3336; 낫또균; Biochem. Biophy. Research Comm., 263, 6-12, 1999), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis ATCC9945; Biotech. Bioeng. 57(4), 430-437, 1998), 바실러스 안쓰라시스(Bacillus anthracis; J. Bacteriology, 171, 722-730, 1989) 등으로부터 생산되는 식용, 수용성, 음이온성, 생분해성 고분자물질인 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 단백질이다.

낫또균(Bacillus subtilis IFO3336)의 경우, 세균으로부터 분리된 세포외막 단백질은 총 922개의 아미노산으로 이루어진 단백질로 pgsB, pgsC 및 pgsA로 이루어져 있으며, pgsB는 393 아미노산으로, pgsC는 149 아미노산으로 그리고 pgsA는 380 아미노산으로 구성이 되어 있다. 아시우찌(Ashiuchi) 등은 바실러스 낫또균 유래의 폴리감마글루탐산의 합성 유전자획 클로닝하고 대장균에 형질전환하여 대장균에서의 폴리감마글루탐산의 합성을 관찰한 바 있다[Ashiuchi et al., Biochem. Biophy. Res. Communications, 263: 6-12 (1999)].

그러나 상기 폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 이루는 단백질 pgsA의 구체적인 역할 및 기능은 아직 밝혀지지 않았다. 다만, 복합체 구성 단백질 중 pgsB는 아마이드 리게이즈계로서 pgsB의 N-말단의 특이 아미노산이 세포막 혹은 세포벽과 상호작용을 하고, pgsA의 경우 N-말단과 C-말단에 친수성의 특이 아미노산 서열을 갖고 있어서, pgsB의 도움과 더불어 이들 아미노산 서열이 세포내막을 통과할 수 있는 분비신호 와 표적 및 부착신호를 갖고 있는 것으로 추측된다.

본 발명자들의 연구결과, 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질은 그의 아미노산 일차 서열 구조와 특성상 외래단백질을 세포 표면에 발현시키는 표면발현 모체로서 많은 장점이 있음이 밝혀졌다: 첫째, 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질은 폴리감마글루탐산의 합성 및 세포외로의 분비를 위해서 세포 표면에 다량 발현될 수 있고, 둘째, 발현된 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질은 세포 주기상 휴지기에서도 안정하게 유지되며, 셋째, 구조적으로 특히 pgsA의 경우 세포 표면에 돌출되어 있으며, 넷째로는 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질은 그 기원이 그람양성 세균의 표면으로 다양한 그람양성 세균 뿐만이 아니라 그람음성 세균의 표면에서 안정되게 발현될 수 있다는 점등의 장점이 있다.

본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 특성을 이용하여 외래단백질을 세균의 표면에 발현할 수 있는 유용한 벡터를 제공하는데 그 목적이 있다. 특히, 본 발명의 목적단백질의 표면발현벡터는 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 일차 서열상에 갖고 있는 분비신호와 표적신호를 포함한다.

또한, 본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 특성을 이용한 표면발현벡터를 사용하여 외래단백질을 미생물의 표면에 발현시키는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 특히, 본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 이용하여 외래단백질을 미생물의 표면에 발현시킴으로 세포의 파쇄 또는 단백질의 분리정제 과정을 거치지 않고 효율적으로 외래단백질을 이용할 수 있는 외래단백질의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 "목적단백질"또는 "외래단백질"은 상기 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주세포에서는 정상적으로는 존재할 수 없는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 유산균에서 바이러스 유래 또는 종양 유래 단백질을 인위적으로 발현하도록 조작하였을 경우, 상기 단백질을 외래단백질 또는 목적단백질이라 한다.

보다 구체적으로, 상기 목적단백질은 바람직하게는 감염성 미생물, 면역질환 유래 항원 또는 종양 유래의 항원, 예를 들면 진균성 병원체, 박테리아, 기생충, 장내 기생충(helminth), 바이러스 또는 알러지 유발물질 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다. 보다 상세하게는, 상기 항원은 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid), 인플루엔자 바이러스의 헤마어글루티닌(hemagglutinin) 또는 핵단백질, 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid), HIV의 gp120 또는 그 단편, HIV의 gag 단백질, IgA 프로티나아제(protease), 인슐린 펩티드 B, 스폰고스포라 서브테라네(Spongospora subterranea) 항원, 비브리오즈(Vibriose) 항원, 살모넬라(Salmonella) 항원, 뉴모코쿠스 항원(Pmeumococcus), RSV(Respiratory syncytial virus) 항원, 헤모필러스 인플루엔자(Hemophilus influenza) 외막 단백질, 스트렙토코쿠스 누모니애(Streptococcus pneumoniae) 항원, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori)의 우레아제(urease), 네세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis)의 필린(pilin), 네세리아 고노로에아(N. gonorrhoeae)의 필린(pilin), 멜라노마-관련 단백질(melanoma associated antigens: TRP2, MAGE-1, MAGE-3, gp100, 티로신아제, MART-1, HSP-70, beta-HCG), HPV-16, -18, -31, --35, 또는 -45에서 유래하는 E1, E2, E6 및 E7을 포함하는 인간파필로마바이러스(Human papillomma virus)의 항원, CEA 종양항원, 정상 또는 변이된 ras 단백질, 정상 또는 변이된 p53, Muc1, pSA 등을 포함하며, 또한, 콜레라, 디프테리아, 헤모필러스(Haemophilus), A형 간염, B형 간염, 인플루엔자, 홍역, 뇌염, 이하선염, 백일해, 수두, 폐렴(pneumococcal pneumonia), 소아마비, 공수병, 루벨라(rubella), 파상풍, 결핵, 애디슨병(Addison's disease), 면역반응 유발물질(immunogen), 알레르기 유발 물질(allergen), 고형 종양 및 혈액종양을 포함하는 암, 후천성 면역결핍증, 신장, 심장, 이자, 폐 뼈, 간 등의 이식 거부 시 관여하는 인자 등에서 유래하는 당업계 알려진 항원 및 자가면역을 유발하는 항원 등을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 표면 발현 방법으로 생산된 외래단백질을 다양한 용도에 제공할 수 있다. 본 용도에는 항체 및 효소의 효과적인 생산이 있으며, 이외에도 항원, 부착 또는 흡착 단백질 및 새로운 생리 활성 물질을 스크리닝하기 위한 펩티드라이브러리의 생산 등이 포함된다.

바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질을 포함한 모든 종류의 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 유전자를 이용한 표면발현벡터는 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

또한 본 발명의 폴리감마글루탐산의 합성 유전자를 이용한 표면발현벡터는 외래단백질을 미생물의 표면에 발현하기 위해 모든 균주에 적용할 수 있고, 바람직하게는 그람음성 세균, 더욱 바람직하게는 대장균, 살모넬라 타이피, 살모넬라 타이피뮤리움, 비브리모 콜레라, 마이코박테리움 보비스, 시겔라, 그리고 그람양성 세균, 바람직하게는 바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 스테필로코커스, 리스테리아 모노싸이토제네스, 스트랩토코커스 균주 등에 적용할 수 있다. 상기 균주를 이용한 모든 외래단백질의 제조방법은 본 발명의 범위에 포함된다.

필요에 따라 폴리감마글루탐산의 합성 유전자의 N-말단 혹은 C-말단에 모든 또는 일부 제한 효소의 다양한 인식 부위를 삽입할 수 있고, 이들 제한효소 부위가 삽입된 표면발현벡터는 모두 본 발명의 범위에 포함된다.

구체적으로 본 발명은 바실러스 속 균주에서 유래한 폴리감마글루탐산 합성 유전자인 pgsA를 포함하고, pgsA의 C-말단에 제한효소 인식부위를 삽입하여 다양한 외래단백질 유전자를 손쉽게 클로닝할 수 있는 표면발현벡터 pKV-Pald-pgsA1 내지 pKV-Pald-pgsA8를 제공한다.

본 발명은 폴리감마글루탐산의 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 복합체중 세포외막 단백질의 복합체인 pgsA로 구성되어 pgsA의 C-말단에 EGFP 단백질의 N-말단을 연결하여, EGFP 단백질을 융합단백질 형태로 그람양성균의 표면에 발현할 수 있는 표면발현벡터 pKV-Pald-pgsA1 내지 pKV-Pald-pgsA8을 제공한다.

특히 일 실시예에 따르면, 바실러스 서브틸리스 청국장(Bacillus subtilis var. chungkookjang, KCTC 0697BP)로부터 폴리감마글루탐산 합성에 관여하는 세포외막 단백질의 유전자 pgsA를 획득하였으나, 유전자는 폴리감마글루탐산을 생산하는 모든 바실러스 속 균주로부터 pgsA를 획득하여 벡터를 제조하거나 외래 단백질을 표면발현시키는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다. 예컨대, 바실러스 서브틸리스 청국장에 존재하는 pgsA 유전자의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 타 균주 유래의 pgsA 유전자를 사용하여 벡터를 제조하거나 외래 단백질을 표면발현시키는 것도 본 발명의 범위에 포함될 것이다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 단백질이 효율적으로 대장균 세포표면에 발현되는지 알아보기 위하여 향상된 녹색형광단백질(enhanced Green fluorescent protein, EGFP)을 모델 단백질로 선택하여 확인하였다. "EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자"는 생체 내에서 녹색 빛을 내 해당 단백질을 발현하는 세포를 쉽게 관찰하게 해주는 유전자로, 형광 현미경으로 관찰이 가능한 이점이 있다. GFP는 jellyfish(Aequorea Victoria)에서 기원한 초록 형광 단백질로써 여러 연구분야에서 유전자 발현의 중요한 마커로 이용되고 있다. EGFP는 GFP의 돌연변이체로써 본래 GFP의 64번째 페닐알라닌(Phenylalanine) 아미노산 서열이 류신(Leucine)으로, 65번째에 위치되어 있는 세린(Serine) 아미노산 서열은 트레오닌(Threonine)으로 교체함으로써 본래의 GFP보다 더 강한 형광신호를 발광하는 장점이 있다.

본 발명자들은 상기 제작된 pKV-Pald-pgsA1 내지 pKV-Pald-pgsA8 재조합 벡터에 EGFP 유전자를 삽입하여 표면발현벡터를 제작하고, 이를 이용하여 락토바실러스 카제이를 형질변환시킨 다음, 배양하여 발현을 유도하고, 배양액을 일정량 채취하여 단백질을 수득하였다. 수득한 상기 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고, 항-EGFP 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅(western blotting)을 수행한 결과, 상기 제작된 pKV-Pald-pgsA1 내지 pKV-Pald-pgsA8 재조합 벡터에 단백질 EGFP가 성공적으로 삽입되어 세포표면에 발현되었음을 확인하였다.

또한, 상기 실시예에서는 EGFP 단백질을 외래 단백질로 사용하였으나, 기타 다른 효소, 항원, 항체, 부착단백질 또는 흡착단백질 등 어떠한 단백질도 외래 단백질이 될 수 있을 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 그람양성균에 적용되는 표면발현벡터를 제조하고, 숙주세포로 락토바실러스 카제이를 사용하였으나, 락토바실러스 카제이 이외의 여하한 그람양성균을 숙주세포로 활용할 수 있을 것이며, 그람양성균 이외에 여하한 그람음성균 및 그 밖의 세균들로 형질전환시키는 것도 당업자에게는 자명할 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 표면발현벡터 pKV-Pald-pgsA-EGFP의 제조

상기 EGFP 발현 벡터를 제조하기 위하여 pKV-Pald-PgsA-E7 (대한민국 등록특허 제10-1471043호 참조)에서 제조된 표면발현 벡터를 사용해서 PgsA의 C-terminal에 EGFP 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입시켜서 유산균에서 표면발현할 수 있는 벡터 pKV-Pald-PgsA-EGFP을 확보하였다.

먼저, pKV-Pald-PgsA-E7 벡터에서 pgsA와 융합된 HPV16 E7 유전자를 제거하고 EGFP를 코딩하는 유전자를 삽입하였다. 합성 EGFP 유전자 단편을 주형으로 서열번호 1과 서열번호 2을 프라이머로 사용해서 PCR을 수행하여 수득하였다.

서열번호 1: 5' TGGTGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG 3'

서열번호 2: 5' TGACTCTAGAACTAGTGTCGACGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCC 3'

그 결과, EGFP 유전자를 포함하고 있는 755bp의 절편을 확보하였으며, 상기 절편의 5'말단에는 BamHI 제한효소 부위를 포함하고 있으며, 상기절편의 3'말단에는 XbaI 제한효소 부위를 포함하고 있다. 확보된 DNA 절편에 BamHI과 XbaI 제한효소를 처리하여 절단하여 741bp 절편을 확보하였다.

pKV-Pald-PgsA-E7를 BamHI과 XbaI으로 절단하여 HPV16 E7 유전자 부분을 제거하고 벡터부분을 확보하였다.

BamHI과 XbaI으로 절단한 E7 유전자를 함유하고 있는 DNA 단편을 같은 제한효소로 절단한 벡터와 연결하여 pKV-Pald-PgsA-EGFP을 완성하였다 (도 1).

실시예 2: 표면발현벡터 PgsA motif 개량

본 실시예에서는 실시예 1에서 제조된 표면발현 벡터(pKV-Pald-PgsA-EGFP)를 사용해서 유산균 숙주에서 보다 안정적으로 높은 발현율을 나타낼 수 있도록 PgsA의 유전자를 단편으로 하는 개량을 실시하였다.

먼저, PgsA 단편 중 1-60 a.a, 1-70 a.a, 1-80 a.a, 1-100 a.a, 1-188 a.a를 포함하는 PgsA 단편을 확보하기 위하여, 표면발현 벡터 (pKV-Pald-PgsA-EGFP)을 주형으로 아래의 프라이머를 사용해서 PCR을 수행하여 수득하였다.

PgsA motif 1-60 a.a

서열번호 3:

5' TCGAGCATGCAATACCCACTTATTGCGATTTGCT 3'

서열번호 4: 5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCTGAGAGTACGTCGTCAGAATACGTT 3'

PgsA motif 1-70 a.a

서열번호 5:

5' TCGAGCATGCAATACCCACTTATTGCGATTTGCT3'

서열번호 6:

5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCTCCCATCATAATATCGCCTACAAAT 3'

PgsA motif 1-80 a.a

서열번호 7:

5' TCGAGCATGCAATACCCACTTATTGCGATTTGCT3'

서열번호 8:

5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCTTTTTGCTCCGTTACTTTTTCAACA 3'

PgsA motif 1-100 a.a

서열번호 9:

5' TCGAGCATGCAATACCCACTTATTGCGATTTGCT3'

서열번호 10:

5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCTGCTACATAATCCGAGGCTCTAAAG 3'

PgsA motif 1-188 a.a

서열번호 11

:5 TCGAGCATGCAATACCCACTTATTGCGATTTGCT 3'

서열번호 12:

5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCGACTTTCTGGTACGAAATTTTCTTT 3'

그 결과, 알돌레이즈 프로모터를 포함하며, 각각의 PgsA motif 단편을 포함하는 DNA 절편을 확보 하였으며, 상기 절편의 5' 말단에는 SphI 제한효소를 포함하고 있으며, 상기 절편의 3' 말단에는 BamHI 제한효소 부위를 포함하고 있다. 확보된 DNA 절편에 SphI과 BamHI을 처리하여 절편을 확보하였다. 또한, 각각의 PgsA1 내지 A5 motif 단편이 아래와 같은 염기서열을 갖는 것을 확인하였다.

PgsA 1-60 a.a 단편서열(PgsA1)

서열번호 13:

5'ATGAAAAAAGAACTGAGCTTTCATGAAAAGCTGCTAAAGCTGACAAAACAGCAAAAAAAGAAAACCAATAAGCACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCA 3'

PgsA 1-70 a.a 단편서열(PgsA2)

서열번호 14:

5'ATGAAAAAAGAACTGAGCTTTCATGAAAAGCTGCTAAAGCTGACAAAACAGCAAAAAAAGAAAACCAATAAGCACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCAGCCTCATTTGTAGGCGATATTATGATGGGA 3'

PgsA 1-80 a.a 단편서열(PgsA3)

서열번호 15:

5'ATGAAAAAAGAACTGAGCTTTCATGAAAAGCTGCTAAAGCTGACAAAACAGCAAAAAAAGAAAACCAATAAGCACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCAGCCTCATTTGTAGGCGATATTATGATGGGACGCTATGTTGAAAAAGTAACGGAGCAAAAA 3'

PgsA 1-100 a.a 단편서열(PgsA4)

서열번호 16:

5'ATGAAAAAAGAACTGAGCTTTCATGAAAAGCTGCTAAAGCTGACAAAACAGCAAAAAAAGAAAACCAATAAGCACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCAGCCTCATTTGTAGGCGATATTATGATGGGACGCTATGTTGAAAAAGTAACGGAGCAAAAAGGGGCAGACAGTATTTTTCAATATGTTGAACCGATCTTTAGAGCCTCGGATTATGTAGCA 3'

PgsA 1-188 a.a 단편서열(PgsA5)

서열번호 17:

5'ATGAAAAAAGAACTGAGCTTTCATGAAAAGCTGCTAAAGCTGACAAAACAGCAAAAAAAGAAAACCAATAAGCACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCAGCCTCATTTGTAGGCGATATTATGATGGGACGCTATGTTGAAAAAGTAACGGAGCAAAAAGGGGCAGACAGTATTTTTCAATATGTTGAACCGATCTTTAGAGCCTCGGATTATGTAGCAGGAAACTTTGAAAACCCGGTAACCTATCAAAAGAATTATAAACAAGCAGATAAAGAGATTCATCTGCAGACGAATAAGGAATCAGTGAAAGTCTTGAAGGATATGAATTTCACGGTTCTCAACAGCGCCAACAACCACGCAATGGATTACGGCGTTCAGGGCATGAAAGATACGCTTGGAGAATTTGCGAAGCAAAACCTTGATATCGTTGGAGCGGGATACAGCTTAAGTGATGCGAAAAAGAAAATTTCGTACCAGAAAGTC 3'

상기 pKV-Pald-PgsA-EGFP를 SphI과 BamHI으로 절단하여 알돌레이즈 프로모터와 PgsA 유전자 부분을 제거한 벡터부분을 확보하였다.

SphI과 BamHI으로 절단한 알돌레이즈 프로모터를 포함하며, 각각의 PgsA motif 단편 유전자를 함유하고 있는 DNA 단편을 같은 제한효소로 절단한 벡터와 연결하여 개량된 벡터를 완성하였다(도 2 내지 도 6).

한편, PgsA 단편 중 25-60 a.a, 25-70 a.a, 25-100 a.a를 포함하는 PgsA 단편을 확보하기 위하여, 표면발현 벡터 (pKV-Pald-PgsA-EGFP)을 주형으로 아래의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 수득하였다.

PgsA motif 25-60 a.a

서열번호 18:

5' CGCTGGATATCTACATGCACGTATTTATTGCCATTCCG 3'

서열번호 19:

5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCTGAGAGTACGTCGTCAGAATACGTT 3'

PgsA motif 25-70 a.a

서열번호 20:

5' CGCTGGATATCTACATGCACGTATTTATTGCCATTCCG 3'

서열번호 21:

5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCTCCCATCATAATATCGCCTACAAAT 3'

PgsA motif 25-100 a.a

서열번호 22:

5' CGCTGGATATCTACATGCACGTATTTATTGCCATTCCG 3'

서열번호 23:

5'TACGGGATCCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCAGAACCACCTGCTACATAATCCGAGGCTCTAAAG 3'

그 결과, 각각의 PgsA motif 단편을 포함하는 DNA 절편을 확보 하였으며, 상기 절편의 5' 말단에는 EcoRV 제한효소를 포함하고 있으며, 상기 절편의 3' 말단에는 BamHI 제한효소 부위를 포함하고 있다. 확보된 DNA 절편에 EcoRV와 BamHI을 처리하여 절편을 확보하였다. 또한, 각각의 PgsA motif 단편이 아래와 같은 염기서열을 갖는 것을 확인하였다.

PgsA 25-60 a.a 단편서열(PgsA6)

서열번호 24:

5'CACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCA 3'

PgsA 25-70 a.a 단편서열(PgsA7)

서열번호 25:

5'CACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCAGCCTCATTTGTAGGCGATATTATGATGGGA 3

PgsA 25-100 a.a 단편서열(PgsA8)

서열번호 26:

5'CACGTATTTATTGCCATTCCGATCGTTTTTGTCCTTATGTTCGCTTTCATGTGGGCGGGAAAAGCGGAAACGCCGAAGGTCAAAACGTATTCTGACGACGTACTCTCAGCCTCATTTGTAGGCGATATTATGATGGGACGCTATGTTGAAAAAGTAACGGAGCAAAAAGGGGCAGACAGTATTTTTCAATATGTTGAACCGATCTTTAGAGCCTCGGATTATGTAGCA 3'

pKV-Pald-PgsA-EGFP를 EcoRV와 BamHI으로 절단하여 PgsA 유전자 부분을 제거한 벡터부분을 확보하였다.

EcoRV와 BamHI으로 절단한 각각의 PgsA motif 단편 유전자를 함유하고 있는 DNA 단편을 같은 제한효소로 절단한 벡터와 연결하여 개량된 벡터를 완성하였다(도 7 내지 도 9).

실시예 3: PgsA motif 개량 표면발현벡터 형질전환체의 발현 확인

본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 PgsA motif 개량 표면발현벡터로 락토바실러스 카제이를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 배양하여 EGFP 단백질의 발현을 확인하였다. 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이에서 개량된 단편 pgsA1 내지 A8 중 어느 하나와 융합된 EGFP 단백질의 발현 여부를 조사하였다.

PgsA motif 단편 표면발현벡터로 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이를 MRS배지 (Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA), 30℃에서 정치배양하여 폴리감마글루탐산을 합성하는 유전자 단편 pgsA1 내지 A8 중 어느 하나의 C-말단과 융합된 EGFP 단백질의 표면발현을 유도하였다.

상기 배양된 락토바실러스 카제이의 전세포를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 및 EGFP에 대한 특이 항체를 이용한 웨스턴블럿팅을 수행하여 상기 융합단백질의 발현을 확인하였다.

구체적으로 발현이 유도된 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이 전세포를 동일한 세포농도에서 얻은 단백질로 디네이쳐(denature)시켜 시료를 준비하고, 이를 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 분석한 다음 분획된 단백질들을 PVDF (polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad) 멤브레인에 옮겼다. 단백질들이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충용액(50 mM 트리스 염산, 5 % 스킴 밀크(skim milk), pH 8.0)에서 1시간 동안 흔들어 블로킹시킨 다음, EGFP에 대한 토끼 유래의 폴리클론 1차 항체를 블로킹 완충용액에 1000배 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 HRP가 접합된 토끼에 대한 2차 항체를 블로킹 완충용액에 10000배 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 멤브레인은 완충용액으로 세척하고 세척된 멤브레인에 기질(lumigen PS-3 acridan, H202)을 첨가하여 약 2분간 발색시키고 CCD 카메라로 EGFP에 대한 특이 항체와 상기 융합단백질간의 특이적인 결합을 확인하였다 (도 10).

도 10은 본원발명과 비교하여 대조군으로 설정된 개량되지 않은 pgsA가 삽입된 pKV-Pald-pgsA 재조합 발현벡터에 따른 락토바실러스 카제이에서의 발현양상(lane 6 및 11) 및 본원발명에 따른 개량된 pgsA1 내지 A8가 삽입된 pKV-Pald-pgsA1 내지 A8 재조합 발현벡터에 따른 락토바실러스 카제이에서의 발현양상(lane 1 내지 5 및 lane 7 내지 10)을 나타낸다.

구체적으로, 도 10의 lane 1은 PgsA motif 1-60 a.a에 EGFP를 발현시킨 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이이고, lane 2은 PgsA motif 1-70 a.a, lane 3은 PgsA motif 1-80 a.a, lane 4는 PgsA motif 1-100 a.a에 EGFP를 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 발현이다. lane 5는 PgsA motif 1-188 a.a에 EGFP가 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 단백질 발현을 나타낸다. lane 6은 pKV-Pald-PgsA-EGFP가 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 단백질 발현을 나타낸다.

또한, 도 10의 lane 7은 PgsA motif 25-60 a.a에 EGFP를 발현시킨 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이이고, lane 8은 PgsA motif 25-70 a.a, lane 9는 PgsA motif 25-100 a.a에 EGFP를 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 발현이다. lane 10는 PgsA motif 1-188 a.a에 EGFP가 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 단백질 발현을 나타낸다. lane 11은 pKV-Pald-PgsA-EGFP가 형질전환된 재조합 락토바실러스 카제이의 단백질 발현을 나타낸다.

개량되지 아니한 pKV-Pald-pgsA-EGFP 표면발현벡터에 의한 EGFP 융합단백질의 발현과 비교하면 개량된 PgsA motif 단편을 포함하는 EGFP 융합 단백질이 더 강하게 발현됨을 확인하였다.

Claims

폴리감마글루탐산 합성효소 복합체를 코드하는 유전자 pgsA와 목적단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 목적단백질의 표면발현벡터.