CN102628054A - 一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于病毒检测技术领域的一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用。本发明重组抗原的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。采用基因拼接技术通过退火延伸PCR技术，获得大肠杆菌密码子优化的VP3基因，实现了优化VP3基因在大肠杆菌的高效表达，并通过亲和层析法纯化获得相应的重组EV71-VP3抗原，获得的EV71-VP3抗原能与手足口病患者血清发生特异的免疫反应，与EV71-VP1联合使用能提高手足口病检测的灵敏度，可用于对EV71急性感染的临床诊断。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原及其应用。
背景技术
肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)感染可以导致手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等，严重者能导致患者死亡。近些年EV71病毒引发的手足口病在我国呈上升趋势，2008年约有50000万人感染，死亡病例高达120人[Ooi E E，Phoon M C，Ishak B，et al.Seroepidemiology of human enterovirus 71.Emerg Infect Dis.2002；8：995-997.]。
EV71的早期诊断对后期疾病的防治工作具有重要意义。但建立在病毒培养基础上的“金标准法”，难以用于临床。尽管RNA检测已经研制成功，该方法操作复杂，且价格昂贵，难以在基层推广应用。同时由于EV71隐性感染的存在，仅凭RNA阳性往往不能确定患者是否为近期发病。相比之下，酶联检测简单、低廉，且是EV71-IgM是急性感染的重要标记物，具有更广泛的应用价值。目前，商品化EV71-IgM检测试剂中所采用的抗原均为灭活的EV71全病毒颗粒，能在发病的第二天即可检测出IgM抗体的存在，显然，以重组抗原为基础研制的试剂在生产及操作等方面较全病毒颗粒具有明显的优势。
EV71为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突出，直径约30nm。组成EV71病毒粒子基本单位为4种衣壳蛋白(VP1～VP4)，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其它3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上。目前，对EV71免疫诊断试剂的研究主要集中在重组VP1上，Shih等曾用EV71的VP1基因的原核表达产物作为抗原诊断EV71的感染，研究结果显示：重组EV71-VP1抗原能与全部的12份EV71急性感染者和26份既往感染者血清发生阳性反应，但与健康人(5份)和柯萨奇16急性感染者血清(2份)无交叉反应[Shin-RuShih，et al Expression of Caspid Protein VP1 for Use as Antigen for theDiagnosis of EV71 Infection.J Med Virol，200061：228-234]。但发明人的检测结果显示：仅以重组VP1建立的普通EV71-IgM检测技术其灵敏度显著低于全病毒颗粒为基础的商品化试剂，这一结果提示除了VP1外，还有存在其他具有诊断意义的抗原表位。
在对牛肠道病毒的研究中，发现针对VP3表位的中和活性要显著高于VP1表位，而最新的研究显示：恩韦肟(抗病毒药)类化合物AN-12-H5具有抑制EV71对BD细胞的感染的作用，但VP1和VP3位点的突变能使AN-12-H5作用消失，这些结果提示VP3在EV71病毒感染中可能具有与VP1相同的重要作用，但目前关于VP3抗原表位分析及其在EV71血清学检测中的应用未见报道。
但野生的EV71-VP3基因很难在大肠杆菌中实现高表达，主要原因在于野生型VP3基因共含有46个大肠杆菌表达系统的稀有密码子，占整个VP3氨基酸的18.9％，特别是G、R超过稀有密码子含量超过50％，限制了其基因的表达，直接影响了其在EV71-IgM ELISA检测试剂中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的基因。
本发明的目的还在于提供含肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的基因的载体和基因工程菌。
本发明的目的还在于提供肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途。
本发明的目的还在于提供肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71重组疫苗中的用途。
一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原，所述重组抗原的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
包含肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的表达载体。
所述表达载体的原始载体为pBET-28a。
包含肠道病毒71衣壳蛋白3表达载体的基因工程菌。
所述基因工程菌的原始菌株为大肠杆菌。
所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途。
所述抗体检测试剂用于检测手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎或脊髓灰质炎样的麻痹性疾病。
所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71重组疫苗中的用途。
本发明的有益效果：本发明根据VP3氨基酸序列，采用大肠杆菌优势密码子，反向翻译成基因序列，并采用退火延伸PCR技术进行基因拼接，获得726个核苷酸组成的改造后的VP3基因，并以此为基础，实现了EV71-VP3抗原的高效表达；本发明是建立高效表达的EV71-VP3重组抗原的基础上，可有效的避开生产和检测过程中与EV71病毒的接触，降低了整个实验的危险性；本发明对比了VP1和VP3抗原活性，显示VP1和VP3抗原与EV71血清的反应具有明显的互补性，两者联合使用能提高手足口病检测的灵敏度，EV71-VP3具有明确的免疫诊断意义，可用于对EV71急性感染的临床诊断。
附图说明
图1为EV71-VP3改造基因前后的克隆表达(从左到右依次为Marker、改造前、改造后)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1EV71-VP3基因的改造和合成
通过生物信息学软件，采用大肠杆菌优势密码子将EV71-VP3抗原的氨基酸序列反向翻译成核苷酸序列，改造后的EV71-VP3基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；考虑到目前国内基因引物合成效率，将上述基因分为共A、B、C和D 4段分别予以合成，四段基因片段末端具16个核苷酸的匹配序列。在进一步拼接成完整EV71-VP3基因序列，每段合成的引物序列如表1所示，共分为3步：
第1步：A、B、C、D基因片段的合成
合成上述基因共需要3轮退火延伸PCR反应，第一轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水23μl、XF1及XR1引物各1μl，期中X代表A、B、C、D，PCR反应条件为94℃1分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，5个循环；后续第n轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水22μl、XFn及XRn引物各1μl，n-1轮PCR产物1μl，n代表2，3；反应条件为PCR反应条件为94℃3分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得A、B、C、D四段基因。
第2步：AB基因片段和CD片段的PCR退火延伸合成
基因片段拼接的PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水23μl、A基因及B基因各1μl，PCR反应条件为94℃1分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，5个循环；第二轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水22μl、引物AF4及引物BR4基因各1μl，PCR反应条件为94℃1分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，5个循环；30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得AB基因片段；CD基因片段的拼接方法同AB，相应A换成C，B换成D，即可获得CD基因片段。
第3步：EV71-VP3基因片段的获得
PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水23μl、AB基因及CD基因各1μl，PCR反应条件为94℃1分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，5个循环；第二轮PCR反应体系为百泰克公司2×PCR反应液25μl、双蒸水22μl、引物AF3及引物DR3基因各1μl，PCR反应条件为94℃1分钟后，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分，5个循环；30个循环后再72℃延伸5分钟，即获得整个基因片段。
表1A、B、C、D基因片段PCR引物
实施例2EV71-VP3改造基因的克隆、表达及标记
1.EV71-VP3抗原表达质粒的构建
1.1PCR产物及表达载体pBET-28a双酶切
取实施例1合成的基因产物及pBET-28a表达载体各30μl分别放于Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(D)4μl、BamHI(10u/μl)和EcoRI(12u/μl)各1μl，加灭菌蒸馏水至40μl，置37℃水浴酶切过夜。
酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：PCR产物及载体pET-32a经双酶切后，用1.2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行。纯化基因再用上海华舜生物工程有限公司生产的小量胶回收试剂盒回收：即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入S1液，置55℃水浴10分钟使胶溶解，加入等量异丙醇，混匀，55℃温浴1分钟，然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。
1.2.连接：于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的基因各1μl、10×T4 DNA Ligase buffer 1μl、T4DNA Ligase(12u/ul)1μl，加灭菌蒸馏水至10μl，置16℃过夜。
1.3转化：在超净工作台中，用无菌吸头取100μl感受态细胞(感受态细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf中，加入上述连接物5μl，轻轻旋转混匀，冰浴30分。立即转移到42℃水浴中放置2分钟，每管加入0.5ml LB培养基(不加抗生素)，30℃水浴摇床培养60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(5ml/管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，32℃培养3小时，1mM IPTG诱导培养8h，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。EV71-VP3基因改造前和改造后克隆表达的情况参见附图1
2.抗原的表达与纯化
2.1表达菌株的培养：取-70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基中(100ml LB/500ml三角瓶)，30℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比例转种于LB培养基(同上)，30℃空气摇床培养约3小时，当OD600值达到0.7时，加入1mM IPTG，诱导培养8h，将菌液合并，6000rpm离心20分钟，弃上清，收集沉淀部分。
2.2提取包涵体：将沉淀称湿重，用10倍体积的20mmol/L pH8.0TE缓冲液将沉淀悬起，加入溶菌酶(1mg/ml悬液)，在室温下磁力搅拌10分钟。在冰浴中超声波破碎菌，每次超30秒钟，间隔30秒钟，共超10次。8℃，1,2000rpm，离心20分钟，弃上清，沉淀用1mol/L NaCl(用TE配制)洗一次，再用TE洗2次，收集沉淀。沉淀用8M脲(用PH8.0TE配制)溶解，加1％β-巯基乙醇。再于20℃，1,2000rpm，离心10分钟，去沉淀取上清。
2.3纯化：将上述溶解的包涵体溶液过镍离子柱，用吸附缓冲液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇，5mM咪唑，0.25M NaCl)平衡清洗上样后，用洗脱缓冲液(pH8.0，20mmol/L TE含6mol/L脲，0.1％β-巯基乙醇，200mM咪唑)洗脱，收集第一洗脱峰。再过Sephardex G-50凝胶过滤柱，缓冲液采用pH8.0，20mmol/L TE含0.1％SDS，收集第一洗脱峰。洗脱抗原采用SDS-PAGE进行纯化鉴定。
实施例3基于重组VP3抗原EV71-ELISA-IgM抗体检测技术的建立及其临床评价
1.EV71-VP3抗体检测技术
重组VP3抗原包被酶联板(PBS稀释到2μg/ml)，每孔100μl，4℃过夜后弃液，蒸馏水冲洗3次，拍干，每孔加入1％BSA 100μl，室温2h，弃液。每孔加入100μl样品稀液后，分别加入10μl的待测样本血清，37℃30min，弃液，用洗涤液洗板5次后弃液，拍干，加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgM(1∶1000)100μl，37℃温浴20min，弃液洗板5次拍干。加TMB显色液：A和B液各50μl，37℃避光显色10min，每孔加入终止液50μl，用酶标仪读取450nm吸光值OD。OD＞0.1判断为阳性。
2.EV71-VP1抗体的检测技术
重组VP1抗原包被酶联板(PBS稀释到2μg/ml)，每孔100μl，4℃过夜后弃液，蒸馏水冲洗3次，拍干，每孔加入1％BSA 100μl，室温2h，弃液。每孔加入100μl样品稀液后，分别加入10μl的待测样本血清，37℃30min，弃液，用洗涤液洗板5次后弃液，拍干，加入辣根过氧化物酶标记的抗人IgM(1∶1000)100μl，37℃温浴20min，弃液洗板5次拍干。加TMB显色液：A和B液各50μl，37℃避光显色10min，每孔加入终止液50μl，用酶标仪读取450nm吸光值OD。OD＞0.1判断为阳性。
实验结果证明，本发明所提供的VP3抗原能与83份EV71-RNA阳性患者血清中65份发生阳性反应，检出率为78.3％；VP1抗原能与其中的69份血清发生阳性反应，检出率为85.2％；两种抗原的反应活性存在明显互补，两者联合检测检出率可以达到97.6％，显著高于VP1、VP3单独的检出率；VP1、VP3与50份健康人血清中无交叉反应，特异性为100％。上述结果显示出本发明获得的VP3抗原具有EV71特异性的免疫学活性，联合VP1使用可以提高EV71检测的灵敏度，在EV71诊断试剂研究中具有一定的应用价值。
Claims (8)
1.一种肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原，其特征在于，所述重组抗原的基因核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.包含权利要求1所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的原始载体为pBET-28a。
4.包含权利要求2所述表达载体的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的原始菌株为大肠杆菌。
6.权利要求1所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途。
7.根据权利要求6所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71抗体检测试剂中的用途，其特征在于，所述抗体检测试剂用于检测手足口病、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎、脑炎或脊髓灰质炎样的麻痹性疾病。
8.权利要求1所述肠道病毒71衣壳蛋白3重组抗原在制备EV71重组疫苗中的用途。
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|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102558313A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-07-11 | 东南大学 | 肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用 |
| CN104650195A (zh) * | 2015-03-09 | 2015-05-27 | 盖中涛 | Ev71病毒 vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200948959A (en) * | 2008-05-06 | 2009-12-01 | Academia Sinica | Preparation of soluble capsid proteins of picornavirus using SUMO fusion technology |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW200948959A (en) * | 2008-05-06 | 2009-12-01 | Academia Sinica | Preparation of soluble capsid proteins of picornavirus using SUMO fusion technology |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| WANG，W ET AL: "3VBH_C ,GI:378792533", 《GENBANK》, 29 February 2012 (2012-02-29), pages 1 - 3 * |
| 宋远斌 等: "肠道病毒71 型VP1~VP4 基因克隆及其表达产物的免疫原性", 《南方医科大学学报》, vol. 31, no. 11, 7 November 2011 (2011-11-07), pages 1846 - 1850 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102558313A (zh) * | 2012-01-12 | 2012-07-11 | 东南大学 | 肠道病毒71型特异性重组蛋白抗原及其应用 |
| CN104650195A (zh) * | 2015-03-09 | 2015-05-27 | 盖中涛 | Ev71病毒 vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用 |
| CN104650195B (zh) * | 2015-03-09 | 2018-12-25 | 盖中涛 | Ev71病毒vp1重组抗原及其单克隆抗体与应用 |
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