CN103265629A - 一种制备胸腺法新的固相合成新工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，涉及一种多肽固相合成领域。本发明包括以下步骤：（1）在PEG羟基树脂上引入第一个保护氨基酸为Fmoc-Asn(Dmcp)-OH，其侧链酰胺用Dmcp保护，主链羧基与PEG羟基树脂连接；（2）对树脂上的游离羟基进行封闭；（3）第一个氨基酸脱保护后，引入二肽片段Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH，并进行缩合；（4）将剩余氨基酸自C端向N端按照Glu至Ser的顺序逐个同树脂上的多肽缩合；（5）N端第一个氨基酸Ser的氨基上引入乙酰基；（6）多肽从树脂上裂解下来。本发明操作简便，粗品纯度高，收率高，纯化容易，具备工业化生产前景。

Description

一种制备胸腺法新的固相合成新工艺
技术领域
本发明涉及一种多肽固相合成领域，具体涉及一种制备胸腺法新的固相合成新工艺。
背景技术
人胸腺肽α1（ Thymosin α1），又称胸腺28肽，是人胸腺产生的、存在于体内循环系统中的一种天然多肽。胸腺肽α1最初是从牛胸腺提取物第五组分中发现的N-乙酰化的酸性多肽，由28个氨基酸组成，分子量为3108。人胸腺肽α1的通用名为胸腺法新(Thymalfasin)。胸腺法新的生物活性比动物胸腺提取物（小牛胸腺肽）高上千倍，可促进T淋巴细胞在胸腺内增生及成熟，增加淋巴细胞分泌IL-2、α及r干扰素，增强IL-2受体的表达作用。此外，胸腺法新可增强NK细胞的数量和活性，通过对辅助T细胞、细胞毒淋巴细胞及NK细胞等免疫细胞的增殖作用，间接地杀死受病毒感染的肝细胞及肿瘤细胞。目前，胸腺法新作为免疫增强剂被广泛应用于重度感染、乙型肝炎、丙型肝炎、肿瘤免疫治疗和自身免疫性疾病。胸腺法新由SciClone Pharmaceuticals Inc.（美国赛生公司）开发上市，为冻干粉针注射剂，1995年前后进入中国。目前已经有30多个国家批准胸腺法新用于乙型和丙型肝炎的治疗及作为免疫增强剂供肿瘤病人使用，主要在亚洲国家使用。
胸腺法新的化学结构式为：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn
1980年美国罗氏公司和美国洛克菲勒大学的研究者报道了（Int J Peptide Protein Res 1980, 15, l-4）本品采用Boc保护基的固相合成法，总收率不到7%，后经美国洛克菲勒大学的改进（Biochemistry 1980, 19, 3233-3238），纯化收率提高到34%。1985年罗氏公司的FELIX等报道了（Int J Peptide Protein Res 1985,26, 130-148.）本品的片段液相合成法，最后四步的收率为30%。1988年德国图宾根大学的Echner等报道了（Liebigs Ann Chem 1988, 1095-1097.）本品氨基采用Fmoc保护基/侧链采用t-Bu的固相合成法，粗品收率为76%，但经过2次柱层析纯化后，精制品收率很低。2009年西班牙生物医学研究所和瑞士Lonza公司的研究者（Biopolymers 2009, 92(6), 565-572），采用改进的Fmoc/t-Bu的固相合成法，C端的Asp主链羧基用t-Bu保护，侧链羧基连接到PEG氨基树脂上，即采用Fmoc-Asp-OtBu作为第一个引入的保护氨基酸。该方法的粗品纯度达到90%。
虽然固相合成工艺已经非常成熟，但是对于难合成的氨基酸序列存在收率和纯度难以保证的缺陷，胸腺法新的酸性残留位置、β氨基酸的连续存在和需要大量的保护基来保护多肽等造成了其固相合成的难度。中国专利（CN101033248）报道了以Rink Amide PEGA树脂、Rink Amide AM树脂、Rink Amide MBHA树脂为起始原料，在接肽试剂中，与Fmoc-Asn(R1)-OH或Fmoc-Asp(R2)-R3加缩合剂进行接肽反应，逐个接上氨基酸，其间依次用乙酸酐封头合成胸腺法新的方法。中国专利（CN101104638A）报道了胸腺法新的固相合成工艺，即以Fmoc- Rink Amide 树脂或Fmoc- Rink Amide MBHA树脂为载体，将Fmoc-Asp-X的侧链羧基与树脂氨基相连，采用Fmoc策略依次固相合成序列剩余氨基酸的方法。中国专利（CN201110186259）报道了以Fmoc- Asn(Trt) -CTC树脂为起始原料，以HATU/NMM为缩合剂的胸腺法新固相合成工艺。中国专利（CN101166761）报道的胸腺法新固相合成法与西班牙和瑞士研究者（Biopolymers 2009, 92(6), 565-572）报道的内容完全相同。中国专利（CN101484467）报道了利用假脯氨酸二肽固相合成胸腺法新的工艺。这些固相合成方法采用的都是先进的Fmoc方法，但存在以下两点不足：（1）常规多肽固相合成方式将首个氨基酸连接到树脂上后采用逐个连接剩余氨基酸的方法，在部分区域容易发生肽链断裂，如发生前二个氨基酸（Glu-Asn）一起从树脂上断裂下来的反应，在肽链合成完毕从树脂上裂解下来后，有较高比例的断裂肽存在，导致纯度不高，影响收率。（2）多数现有技术在引入C端的第一个Asn时，Fmoc-Asn侧链酰胺采用Trt、Xan、Tmob等传统保护基，由于这些保护基的亲脂性过大，体积过大则位阻过大，合成中容易导致很多缺失肽产生。
发明内容
本发明在于提供一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，克服现有技术的缺陷，满足临床应用的需要。
本发明提供的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺所采用的技术方案包括以下步骤：
（1） 在PEG羟基树脂上引入第一个保护氨基酸为Fmoc-Asn(Dmcp)-OH，所述第一个保护氨基酸的侧链酰胺用Dmcp保护，主链羧基在缩合剂的作用下通过酯键与PEG羟基树脂连接；
（2）对树脂上的游离羟基进行封闭；
（3）引入的第一个保护氨基酸的氨基在脱保护试剂作用下脱去Fmoc保护基保护后，引入保护的二肽片段Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH，并在缩合剂的作用下进行缩合；
（4）将剩余氨基酸自C端向N端按照Glu至Ser的顺序逐个同树脂上的多肽缩合；
（5）N端第一个氨基酸Ser，在脱去氨基上的保护基后引入乙酰基；
（6）采用裂解试剂使多肽从树脂上裂解下来。
在上述制备方法中，所述步骤（1）的缩合剂采用HATU/DIEA、HATU/HOAt/DIEA、HATU/DMAP/DIEA、HATU/collidine、HATU/DMAP/Collidine，缩合次数为2次以上，每次缩合时间为2小时至12小时。
在上述制备方法中，所述步骤（2）的封闭方法为采用形成苯甲酸酯、形成对甲氧基苯甲酸酯或形成甲醚的方式进行，所述形成苯甲酸酯采用的封闭剂为苯甲酸酐/吡啶/DIEA、苯甲酸酐/DMAP/DIEA，或苯甲酰氯/吡啶/DIEA、苯甲酰氯/DMAP/DIEA；所述形成对甲氧基苯甲酸酯采用的封闭剂为对甲氧基苯甲酰氯/吡啶/DIEA、对甲氧基苯甲酰氯/DMAP/DIEA；所述形成甲醚所采用的封闭剂为碘甲烷。
在上述制备方法中，所述步骤（3）的缩合剂采用HATU/ collidine或HATU/HOAt/collidine。
在上述制备方法中，所述步骤（4）所述的剩余氨基酸采用下面的保护氨基酸引入：Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH；缩合剂采用HCTU/DIEA，缩合反应所用溶剂为DMF，或采用DMF与DCM的混合溶液；引入的保护氨基酸与缩合剂的摩尔比为1:1，HCTU与DIEA的摩尔比为1:2，引入的保护氨基酸及缩合剂与树脂上锚定氨基酸的摩尔比为10:1。
在上述制备方法中，所述脱保护试剂为哌啶/DMF，哌啶与DMF的摩尔比为1:4。
在上述制备方法中，所述步骤（5）采用乙酸酐/DIEA引入氨基上的乙酰基。
在上述制备方法中，所述步骤（6）裂解试剂为TFA/H2O，TFA与H2O的摩尔比为95:5。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
（1） 引入的第一个保护氨基酸的氨基在脱保护试剂作用下脱去Fmoc保护基保护后，不是逐个的引入剩余氨基酸，而是创新的引入二肽片段Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH，有效的减少了在此处容易产生的肽链断裂，形成的粗品纯度高，纯化容易，具备工业化生产前景；
（2） 在PEG羟基树脂上引入第一个保护氨基酸为Fmoc-Asn(Dmcp)-OH，其侧链酰胺用Dmcp保护，主链羧基在缩合剂的作用下通过酯键与PEG羟基树脂连接，将Dmcp用作保护基来保护Asn的侧链酰胺，比通常使用的Trt、Xan、Tmob等酰胺保护基体积小，不会因为位阻原因影响缩合，而且包含Dmcp取代基的保护氨基酸比包含Trt、Xan、Tmob的保护氨基酸，溶解度大，在多肽固相合成中不容易导致多肽的聚集。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的胸腺法新的固相合成新工艺方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中所使用的缩写或英文全称的含义列于下表：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
PEG 聚乙二醇
Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 9-芴甲氧羰基-N-二甲基-环丙基甲基-L-天冬酰胺
Dmcp 二甲基-环丙基甲基
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
DIEA 二异丙基乙基胺
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑
DMAP N,N-二甲氨基吡啶
Collidine 2,4,6-三甲基吡啶
t-Bu 叔丁基
Fmoc-Asn 9-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸
Trt 三苯基甲基
Xan 9-夹氧杂蒽基
Tmob 2,4,6-三甲氧苄基
Fmoc-Leu-OH 9-芴甲氧羰基-L-亮氨酸
Fmoc-Ile-OH 9-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸
Fmoc-Ser(tBu)-OH 9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-丝氨酸
Fmoc-Ala-OH 9-芴甲氧羰基-L-丙氨酸
Fmoc-Val-OH 9-芴甲氧羰基-L-缬氨酸
Fmoc-Asp(OtBu)-OH 9-芴甲氧羰基-天冬氨酸-β-叔丁酯
Fmoc-Thr(tBu)-OH 9-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-苏氨酸
Fmoc-Lys(Boc)-OH N-α-9-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-赖氨酸
Fmoc-Glu(OtBu)-OH 9-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-γ-叔丁酯
HCTU 6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐
DMF 二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
HMPB 4-羟甲基-3-甲氧基苯氧丁酸
HMPA 4-羟甲基-苯氧乙酸
TFA 三氟乙酸
HOOBt 3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪
Glu(OtBu)-OH L-谷氨酸-γ-叔丁酯
实施例1：
1.第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2.树脂上游离羟基的封闭，采用形成苯甲酸酯封闭法：加入353mg苯甲酸酐、12mg吡啶、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，或加入219mg苯甲酰氯、19mg DMAP、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，或加入353mg苯甲酸酐、19mg DMAP、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，或加入219mg苯甲酰氯、12mg吡啶、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，振摇1小时。减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
3.氨基脱保护：用比例为1:4的哌啶/DMF溶液脱去氨基保护基（1分钟x 2次、10分钟x 2次、5分钟x 1次）。用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
4.二肽片段缩合：称取Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH 775mg，HATU 593mg，Collidine 378mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
5.氨基脱保护：用比例为1:4的哌啶/DMF溶液脱去氨基保护基（1分钟x 2次、10分钟x 2次、5分钟x 1次）。用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
6.第四个氨基酸的接入：称取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 692mg，HCTU 633mg，DIEA 403mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，振摇35分钟，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
7.氨基脱保护：用比例为1:4的哌啶/DMF溶液脱去氨基保护基（1分钟x 2次、10分钟x 2次、5分钟x 1次）。用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
8.余下氨基酸的接入：剩余的24个氨基酸的接入与脱氨基保护方法，与上面第四个氨基酸的接入方法相同。缩合剂全部采用过量10倍的HCTU、过量10倍的DIEA，反应溶剂为DMF 10ml，缩合时间为35分钟，脱氨基保护试剂是比例为1:4的哌啶/DMF，洗涤方式是用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。对N端算起的第19、20、21个氨基酸（Lys、 Lys和Glu）的接入，采用2次重复缩合的方法，缩合时间各为35分钟。N端第一个氨基酸（Ser）接入并脱去氨基保护基后，乙酰基的引入，采用过量10倍的乙酸酐与过量20倍的DIEA溶于DMF的溶液，振摇35分钟，减压滤去溶剂，然后用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。随后分别用甲醇、DCM各洗树脂2次，室温减压干燥树脂，称重。
9.从树脂上裂解下多肽：称取合成好的多肽-树脂730mg，加入95% TFA水溶液10ml，室温反应2小时，过滤，滤液减压浓缩，除去TFA，残余液加冰乙醚沉淀，离心，除去上清液，干燥，称重。树脂上游离羟基的封闭采用353mg苯甲酸酐、12mg吡啶、383mg DIEA为封闭剂的，得365mg白色粉末，纯度为89%的胸腺法新粗品；树脂上游离羟基的封闭采用219mg苯甲酰氯、19mg DMAP、383mg DIEA为封闭剂的，得362mg白色粉末，纯度为91%的胸腺法新粗品；树脂上游离羟基的封闭采用353mg苯甲酸酐、19mg DMAP、383mg DIEA为封闭剂的，得364mg白色粉末，纯度为90%的胸腺法新粗品；树脂上游离羟基的封闭采用219mg苯甲酰氯、12mg吡啶、383mg DIEA为封闭剂的，得360mg白色粉末，纯度为88%的胸腺法新粗品。
实施例2：
1.采用同实施例1相同的方法将第一个氨基酸锚定到树脂上。
2.树脂上游离羟基的封闭，采用形成甲醚封闭法：加入111mg碘甲烷溶于10ml DCM的溶液，加入固体无水高氯酸铁3mg，振摇2小时。吸取DCM溶液中悬浮的树脂，转移到另外的反应器中，弃去下层沉淀的高氯酸铁。减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
3.采用与实施例1相同的方法进行氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得372mg白色粉末，纯度为91%的胸腺法新粗品。
实施例3：
1.采用同实施例1相同的方法将第一个氨基酸锚定到树脂上。
2. 树脂上游离羟基的封闭，采用形成对甲氧基苯甲酸酯封闭法：加入266mg对甲氧基苯甲酰氯、12mg吡啶、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，或加入266mg对甲氧基苯甲酰氯、19mg DMAP、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，振摇1小时。减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
3.采用与实施例1相同的方法进行氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作。树脂上游离羟基的封闭采用266mg对甲氧基苯甲酰氯、12mg吡啶、383mg DIEA作为封闭剂的，得369mg白色粉末，纯度为90%的胸腺法新粗品；树脂上游离羟基的封闭采用266mg对甲氧基苯甲酰氯、19mg DMAP、383mg DIEA 作为封闭剂的，得378mg白色粉末，纯度为92%的胸腺法新粗品。
实施例4：
1.第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，HOAT 212mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，HOAT 212mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2.树脂上游离羟基的封闭，采用形成苯甲酸酯封闭法：加入353mg苯甲酸酐、12mg吡啶、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，振摇1小时。减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
3.采用与实施例1相同的方法进行氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得368mg白色粉末，纯度为90%的胸腺法新粗品。
实施例5：
1. 第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，再加入固体DMAP 1mg，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，再加入固体DMAP 1mg，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2. 采用与实施例4相同的方法进行树脂上游离羟基的封闭、氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得373mg白色粉末，纯度为92%的胸腺法新粗品。
实施例6：
1. 第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，再加入固体DMAP 1mg，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，再加入固体DMAP 1mg，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2. 采用与实施例4相同的方法进行树脂上游离羟基的封闭、氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得373mg白色粉末，纯度为92%的胸腺法新粗品。
实施例7：
1.第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，collidine 189mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，collidine 189mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2.采用与实施例4相同的方法进行树脂上游离羟基的封闭、氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得367mg白色粉末，纯度为90%的胸腺法新粗品。
实施例8：
1.第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，collidine 189mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，再加入固体DMAP 1mg，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，collidine 189mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，再加入固体DMAP 1mg，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2.采用与实施例4相同的方法进行树脂上游离羟基的封闭、氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得366mg白色粉末，纯度为91%的胸腺法新粗品。
实施例9：
1.第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，HOAT 212mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，HOAT 212mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2.采用与实施例4相同的方法进行树脂上游离羟基的封闭、氨基脱保护。
3.二肽片段缩合：称取Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH 775mg，HATU 593mg，HOAT 212mg，Collidine 378mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
4. 采用与实施例4相同的方法进行氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得375mg白色粉末，纯度为92%的胸腺法新粗品。
实施例10：
1.第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPB Novabiochem® PEG树脂（取代度0.52mmol/g）300mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇2小时或12小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇2小时或12小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2.采用与实施例4相同的方法进行树脂上游离羟基的封闭、氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，在混合液加入反应器后振摇2小时的情况下，得374mg白色粉末，纯度为86%的胸腺法新粗品；在混合液加入反应器后振摇12小时的情况下，得361mg白色粉末，纯度为93%的胸腺法新粗品。
实施例11：
1.采用同实施例1相同的方法将第一个氨基酸锚定到树脂上。
2. 树脂上游离羟基的封闭，采用形成苯甲酸酯封闭法：加入353mg苯甲酸酐、12mg吡啶、383mg DIEA溶于10ml DMF的溶液，振摇1小时。减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
3.采用同实施例1相同的方法进行氨基脱保护。
4.二肽片段缩合：称取Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH 775mg，HATU 593mg，Collidine 378mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次，再称取Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH 775mg，HATU 593mg，Collidine 378mg，溶于冷却的10ml DMF中，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
5.采用同实施例1相同的方法进行氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得377mg白色粉末，纯度为93%的胸腺法新粗品。
实施例12：
1.第一个氨基酸锚定到树脂上：称取HMPA Novabiochem® PEG树脂（取代度0.47mmol/g）332mg，加入反应器中，加入10ml DCM溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DCM，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。然后加入10ml DMF溶胀半小时，减压滤去溶剂。再加入10ml DMF，振摇1分钟，减压滤去溶剂，再重复1次本步操作。称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF洗2次。再称取Fmoc-Asn(Dmcp)-OH 681mg，HATU 593mg，溶于冷却的10ml DMF中，再加入DIEA 403mg，然后将该混合液加入到反应器内，振摇4小时，减压滤去溶剂，用DMF及DCM以交替方式，各洗树脂5次。
2.采用与实施例4相同的方法进行树脂上游离羟基的封闭、氨基脱保护、二肽片段缩合、氨基脱保护、第四个氨基酸的接入、氨基脱保护、余下氨基酸的接入、从树脂上裂解下多肽的操作，得263mg白色粉末，纯度为87%的胸腺法新粗品。

Claims (8)

1.一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征包括以下步骤：
（1） 在PEG羟基树脂上引入第一个保护氨基酸为Fmoc-Asn(Dmcp)-OH，所述第一个保护氨基酸的侧链酰胺用Dmcp保护，主链羧基在缩合剂的作用下通过酯键与PEG羟基树脂连接；
（2）对树脂上的游离羟基进行封闭；
（3）引入的第一个保护氨基酸的氨基在脱保护试剂作用下脱去Fmoc保护基保护后，引入保护的二肽片段Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-OH，并在缩合剂的作用下进行缩合；
（4）将剩余氨基酸自C端向N端按照Glu至Ser的顺序逐个同树脂上的多肽缩合；
（5）N端第一个氨基酸Ser，在脱去氨基上的保护基后引入乙酰基；
（6）采用裂解试剂使多肽从树脂上裂解下来。
2.根据权利要求1所述的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征在于所述步骤（1）的缩合剂采用HATU/DIEA、HATU/HOAt/DIEA、HATU/DMAP/DIEA、HATU/collidine、HATU/DMAP/Collidine，缩合次数为2次以上，每次缩合时间为2小时至12小时。
3.根据权利要求1所述的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征在于所述步骤（2）的封闭方法为采用形成苯甲酸酯、形成对甲氧基苯甲酸酯或形成甲醚的方式进行，所述形成苯甲酸酯采用的封闭剂为苯甲酸酐/吡啶/DIEA、苯甲酸酐/DMAP/DIEA，或苯甲酰氯/吡啶/DIEA、苯甲酰氯/DMAP/DIEA；所述形成对甲氧基苯甲酸酯采用的封闭剂为对甲氧基苯甲酰氯/吡啶/DIEA、对甲氧基苯甲酰氯/DMAP/DIEA；所述形成甲醚所采用的封闭剂为碘甲烷。
4.根据权利要求1所述的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征在于所述步骤（3）的缩合剂采用HATU/ collidine或HATU/HOAt/collidine。
5.根据权利要求1所述的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征在于所述步骤（4）所述的剩余氨基酸采用下面的保护氨基酸引入：Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH；缩合过程中缩合剂采用HCTU/DIEA，缩合反应所用溶剂为DMF，或采用DMF与DCM的混合溶液；引入的保护氨基酸与缩合剂的摩尔比为1:1，HCTU与DIEA的摩尔比为1:2，引入的保护氨基酸及缩合剂与树脂上锚定氨基酸的摩尔比为10:1。
6.根据权利要求1所述的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征在于所述脱保护试剂为哌啶/DMF，哌啶与DMF的摩尔比为1:4。
7.根据权利要求1所述的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征在于所述步骤（5）采用乙酸酐/DIEA引入氨基上的乙酰基。
8.根据权利要求1所述的一种制备胸腺法新的固相合成新工艺，其特征在于所述步骤（6）裂解试剂为TFA/H2O，TFA与H2O的摩尔比为95:5。
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