CN108840925B - 一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48及其应用 - Google Patents

一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码基因如SEQ ID NO：2所示。本发明的短肽LvHcL48不管在动物水平还是在体外细胞水平，均能显著抑制WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421的转录，同时在体内还能显著抑制WSSV的增殖；还能与WSSV最重要的外膜蛋白VP28相互作用，可能为其发挥功能的作用机制。本发明的抗WSSV肽LvHcL48可以作为抑制WSSV的制剂，可作为添加剂添加到饲料中，以期提高对虾的抗WSSV能力。

Description

一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48及其 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抑制白斑综合症病毒(WSSV)的短肽及其编码基因与应用。
背景技术
对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是对虾养殖业中危害最大的一种病毒，该病毒传染力强、致死率高，对虾感染WSSV后，7-10天死亡率可达100％。至今仍未得到完全控制，成为对虾养殖业发展的主要障碍之一。
目前，对虾生产上均采用养殖抗病能力强的种类及切断WSSV传播途径等方法防止WSSV病害的传播。同时，多年来国内外许多学者试图通过增强对虾体质，提高抗病能力等对对虾WSSV进行防治。有研究表明，一些富含多糖、生物碱、有机酸等多种成分的天然免疫物质给虾口服或注射后，既有抗菌作用，又有免疫刺激作用，它们能增强虾类机体的细胞免疫和体液免疫的功能，提高对虾的抗病力。
因此，通过寻找具有抑制WSSV增殖的活性物质，添加到饲料中增强对虾体质，提高抗病能力等，不失为一种可行的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48，以解决现有技术存在的问题。
一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。
本发明还提供一种上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48的编码基因，如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供一种含上述编码基因的表达盒。
本发明还提供一种含上述编码基因的重组菌。
本发明还提供一种含上述编码基因的重组载体。
本发明还提供含上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48、上述编码基因或上述重组载体制备抑制WSSV的制剂中的用途。
本发明还提供一种用于抗WSSV的制剂，包含上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48、上述编码基因、上述重组载体中的一种或者多种混合。
一种含有上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48的饲料添加剂。
一种含有上述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48的饲料。
本发明的抗WSSV短肽LvHcL48可以采用本领域技术人员已知的方法进行原核表达和纯化。
与现有技术相比，本发明从感染WSSV 2h的凡纳滨对虾血浆中，通过双向电泳联合生物质谱等方法，分离鉴定到约8.9kDa来源于血蓝蛋白的降解肽段LvHcL48，通过N端测序、C端测序等方法获得LvHcL48的分子特征，根据LvHcL48的氨基酸序列相对应的核苷酸，设计引物，克隆得到LvHcL48的核苷酸组成，并构建到原核表达载体中，转化到大肠杆菌中，通过诱导表达并纯化得到重组的LvHcL48。并在体内和体外原代培养的血细胞中验证LvHcL48的活性，结果表明该肽段不管在动物水平还是在体外细胞水平，均能显著抑制WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421的转录，同时在体内还能显著抑制WSSV的增殖。通过进一步的蛋白相互作用实验研究，发现LvHcL48能与WSSV最重要的外膜蛋白VP28相互作用，可能为其发挥功能的作用机制。
附图说明
图1为实施例1分离得到本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48的2-DE图；
图2为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48和对照GST的SDS-PAGE图；
图3为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48在体内动物水平对WSSV极早期基因wsv069转录情况；
图4为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48在体内动物水平对WSSV晚期基因wsv421转录情况；
图5为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48在体内动物水平WSSV copy数的变化情况；
图6为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48在体外原代培养血细胞水平对WSSV极早期基因wsv069转录情况；
图7为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48在体外原代培养血细胞水平对WSSV晚期基因wsv421转录情况；
图8为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48与WSSV外膜裂解液的Far-Westernblotting分析；
图9为本发明的抑制WSSV的短肽LvHcL48与VP28相互作用的验证。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法
实施例1：与抑制WSSV有关的对虾血蓝蛋白降解肽段的分离和鉴定
(1)将WSSV稀释到1.4×102copy/μl，每只虾注射100μl，即104copy/虾，在注射后的2h抽取对虾血淋巴。用75％酒精棉球擦拭对虾头胸甲后缘，一次性注射器从对虾心脏抽取血淋巴并与抗凝剂(1:1)混合。4℃，800g离心10min，去除血细胞，取上清。4℃，32000rpm超速离心10h，去除大部分血蓝蛋白，取上清。预冷丙酮沉淀，去除不溶性蛋白，并用上样缓冲液溶解，于-20℃保存备用。
(2)采用BCA法测定蛋白浓度。96孔板各孔中加入20μl不同浓度的BSA ProteinStandard、待测样品和空白对照，然后向各孔中加入200μl BCA工作液，混合均匀；37℃放置30min，自然冷却至室温；使用酶标仪测定562nm波长(或540～590nm波长)下的吸光值；根据蛋白标准品浓度和吸光值，制作蛋白浓度标准曲线；根据蛋白浓度标准曲线和样品稀释倍数计算样品的蛋白浓度。
(3)双向电泳。取150μl水化上样缓冲液(使用前加入0.01g DTT，5μl Bio-Lyte 3-10)，加入200μg蛋白样品充分混匀，离心除去气泡。沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，确保胶条与电极紧密接触。在每根胶条上覆盖1ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序：50V主动水化12h，250V慢速除盐1h，1000V慢速除盐2h，4000V线性升压2h，4000V快速聚焦至32000Vh，500V保持24h。聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向Tricine-SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
(4)第二向Tricine-SDS-PAGE。参照
Figure GDA0003188624290000041
(2006)报道的方法进行，本实验所用胶浓度为：4％T，3％C浓缩胶、10％T，3％C夹层胶、16.5％T，3％C分离胶。电泳开始后，浓缩胶、夹层胶恒压30V，分离胶恒压120V，直至溴酚蓝距离胶底部2cm处时，将电压调至160V直至溴酚蓝全部至胶外。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面)。考马斯亮蓝染色液染色，扫描图像。
(5)比对实验组和对照组2-D电泳图，如图1所示，可以发现WSSV刺激对虾2h后的血淋巴中小分子肽段明显比对照组多，使用美国Bio-Rad公司提供的PDQuest 8.0软件进行凝胶图像分析，并寻找表达差异蛋白点。
(6)质谱鉴定。将差异显著(上调或下调)的蛋白点挖胶，送至北京华大蛋白进行质谱分析，鉴定是何种蛋白。
实施例2：与抑制WSSV有关的对虾血蓝蛋白降解肽段分子特征的获得
(1)根据质谱结果，将鉴定为血蓝蛋白的，且具有显著性差异的蛋白点进行胶回收，采用上海生工PAGE胶蛋白微量胶回收试剂盒进行。
(2)将胶回收蛋白送至上海中科新生命进行Edman N端测序。
(3)将蛋白样品送至深圳微纳菲生物技术有限公司进行C端测序。
(5)根据Edman N端测序、C端测序结果，进行该血蓝蛋白降解肽段氨基酸序列的推导。获得该降解肽段的氨基酸序列组成。
LvHcL48的氨基酸组成为：Arg-Phe-Leu-Ile-Pro-Lys-Gly-Asn-Glu-Gln-Gly-Leu-Glu-Phe-Asp-Leu-Val-Val-Ala-Val-Thr-Asp-Gly-Ala-Ala-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Gly-Leu-His-Glu-Asn-Thr-Glu-Phe-Asn-His-Tyr-Gly-Ser-His-Gly-Lys-Tyr-Pro-Asp-Asn-Arg-Pro-His-Gly-Tyr-Pro-Leu-Asp-Arg-Arg-Val-Pro-Asp-Glu-Arg-Val-Phe-Glu-Asp-Leu-Pro-Asn-Phe-Gly-His-Ile-Arg-Val-Lys
实施例3：基因克隆与原核表达该与抑制WSSV有关的对虾血蓝蛋白降解肽段
(1)根据多肽的N端和C端序列，定位至血蓝蛋白氨基酸序列中，结合核苷酸序列：CGATTCCTCATCCCCAAGGGTAATGAACAGGGTCTGGAGTTCGACCTTGTTGTTGCCGTGACTGATGGCGCAGCCGACGCAGCAGTGGATGGCCTCCACGAAAACACCGAATTCAATCATTATGGTTCCCATGGCAAGTACCCTGACAATCGCCCACATGGCTACCCTCTGGATCGCAGGGTTCCCGATGAACGTGTATTCGAAGATCTTCCCAACTTCGGCCACATCCGAGTTAAG，设计PCR引物，用肝胰腺的cDNA为模板进行PCR扩增。目的条带使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海生工)回收纯化，方法参见试剂盒说明手册，并测浓度，用于下一步实验。
(2)纯化后的PCR产物和pGEX-6p-1用限制性内切酶进行酶切，胶回收后测浓度，并用T4连接酶于16℃过夜酶连。连接产物转化大肠杆菌菌株Rosetta中，并在含有100μg/mL氨苄青霉素(AMP)的LB固体培养基上，于37℃倒置培养。
(3)挑取单菌落，于含100μg/mL Amp的LB液体培养基37℃中培养。并进行菌液PCR验证，根据验证结果，部分送至华大科技测序验证序列的正确性。并依据测序结果，保留序列正确的菌种。在菌液中加入终浓度为15％的甘油，-20℃保存备用。
(4)将测序正确的菌株用于诱导表达。测序正确的菌株按1：100的比例加入液体LB培养基中(含Amp 100μg/mL)；37℃，200rpm摇床培养至OD600到0.6左右时加入IPTG，终浓度为0.05mM，同时取出1mL菌液作为未诱导对照；将在16℃诱导16h后的菌液转移至离心管中，4℃，5000g离心20min，收集菌体；加入适量超声破碎缓冲液(含50mM Tris，5mM EDTA，100mMNaCl，pH8.0，现加1mM PMSF)重悬浮菌体；置于冰上超声破碎菌体；4℃，20000g离心30min，分别收集上清和沉淀；进行SDS-PAGE分析，验证是否有诱导表达。
(5)尽可能将目的片段表达于上清，利于下一步的纯化。
(6)采用GST柱材(GE Heathercare，US)纯化GST标签的LvHcL48(GST-LvHcL48)。
(7)采用PreScission Protease(GE Healthcare，US)将GST标签去除，获得抗WSSV的LvHcL48。
(8)按照上述步骤将转化了pGEX-6P-1质粒的大肠杆菌BL21菌株进行诱导表达，用GST柱材纯化GST标签蛋白，采用10mM的还原性谷胱甘肽将GST从柱材上特异性洗脱下来；同时也将GST-LvHcL48洗脱下来，-20℃保存备用。
SDS-PAGE分析如图2所示：得到纯化的重组GST蛋白(rGST)和重组的LvHcL48(rLvHcL48)
实施例4：抑制WSSV短肽的动物体内水平活性验证
(1)将重组表达的短肽用灭菌的0.01M PBS(pH7.4)稀释至10μM(阴性对照为重组表达的GST)，加入102copy/μl的WSSV，阳性对照为0.01M PBS(pH7.4)稀释的102copy/μlWSSV，均于室温中孵育2h。
(2)用无菌的1ml注射器取100μl混合溶液从对虾第3腹节进行肌肉注射。
(3)于0、2、6、12和24hpi取虾血细胞，分别用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(Tiangen生化)和总RNA抽提试剂盒(上海飞捷生物有限公司)提取对虾基因组DNA和总RNA。
(4)用反转录试剂盒(全式金生物科技有限公司)将mRNA反转录成cDNA，并根据模板浓度稀释5-10倍；用无菌水将基因组DNA浓度调成一致。
(5)WSSV copy数的计算。以基因组DNA为模板，wsv421的qPCR引物检测对虾血细胞基因组DNA中的WSSV copy数。
(6)WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421转录水平的qPCR检测。用wsv069、wsv421和内参基因EF-1α进行qPCR分析，检测其转录情况。
结果如图3-5所示，与对照相比LvHcL48在体内能显著的抑制wsv069和wsv421的转录，同时可以显著的抑制WSSV的增殖。
实施例5：抑制WSSV短肽的体外细胞水平活性验证
(1)用抗凝剂(pH 6.0)收集对虾全血细胞，并用昆虫培养基INSERT XPRESS稀释，细胞计数后，细胞培养板中的每个孔接种106个全血细胞，待细胞贴壁后更换含3％双抗的培养基，于27℃细胞培养箱中培养24h。
(2)将原核表达得到的短肽用昆虫培养基稀释至1μΜ(阴性对照为原核表达纯化的GST)，加入106copy的WSSV，阳性对照为昆虫培养基稀释的106copy WSSV，均于27℃细胞培养箱中孵育2h。
(3)将细胞培养板取出，小心吸出培养基，用0.01M PBS(pH7.4)洗细胞三次，每孔加入含有10μΜ短肽和106copy WSSV的培养基混合液处理细胞。
(4)于处理后的0、2、6、12和24h用总RNA抽提试剂盒(上海飞捷生物有限公司)提取细胞的总RNA，再用反转录试剂盒(全式金生物科技有限公司)将mRNA反转录成cDNA，并根据模板浓度稀释5-10倍。
(5)WSSV极早期基因wsv069和晚期基因wsv421转录水平的qPCR检测。
结果如图6-7所示，与对照相比，LvHcL48在体外细胞水平，能显著的抑制wsv069和wsv421的转录。
实施例6：抑制WSSV短肽与WSSV外膜蛋白VP28的相互作用
(1)将100μL约108copy/μL溶解在0.01M PBS(pH7.4)的WSSV用0.5％的Triton X-100裂解，于室温下慢摇至溶液清亮；4℃，20000g离心30min，收集上清液即为WSSV外膜蛋白。分别取10μL 2mg/ml的WSSV裂解液上清和BSA进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，将一块胶用于考马斯亮蓝染色，另外两块采用Bio-Rad湿转仪用300mA电转1h，将胶上的蛋白转至PVDF膜上；用含5％脱脂奶粉的TBS室温封闭30min，TBST轻微洗涤，将PVDF膜分别与GST和GST-LvHcL48(0.1mg/mL)于4℃过夜孵育；将PVDF膜取出，分别用TBST洗6×5min，将膜转移至用封闭液稀释的鼠抗GST一抗(1:1000)中，室温孵育2h；TBST洗膜3×15min，羊抗鼠IgG-HRP二抗(1：3000)室温孵育1h，TBST洗涤3×15min；ECL显色，拍照，扫描图像并分析。结果如图所示，GST-LvHcL48孵育的比GST孵育的PVDF膜中多了一条带。
(2)对照Far-Western blotting的结果，将考马斯亮蓝R250染色的SDS-PAGE胶上对应的条带切下，送至深圳微纳菲生物技术有限公司进行MALDI-TOF-MS分析，质谱鉴定结果表明位于26kDa处的条带为WSSV外膜蛋白VP28。
(3)根据WSSV外膜蛋白VP28的核苷酸序列，设计特异性引物，克隆得到VP28的完整核苷酸序列，构建pET-28a-VP28的重组质粒，按照实施例3诱导表达带His标签的重组蛋白His-VP28，采用Ni-NTA柱材纯化His-VP28。
(4)取20μL纯化的His-VP28分别加入含GST或GST-LvHcL48的柱材，于4℃孵育2h；弃上清液保留柱材，用1000μL含0.1％Triton X-100的0.01M PBS(pH7.4)洗涤柱材8次；20μL 0.01M PBS(pH7.4)重悬柱材，加入4μL5×loading buffer，于100℃水浴锅中煮5min，稍微离心后，将所有样品加入SDS-PAGE胶中进行电泳；电泳结束后，采用Bio-Rad湿转仪用300mA电转1h，将胶上的蛋白转至PVDF膜上；用含5％脱脂奶粉的TBS室温封闭30min，TBST轻微洗涤，将PVDF膜转移至用封闭液稀释的鼠抗GST一抗(1：2000)和鼠抗VP28抗体(1：2000)中，室温孵育2h；TBST洗膜3×15min，羊抗鼠IgG-HRP二抗(1：3000)室温孵育1h，TBST洗涤3×15min；ECL显色，拍照，扫描图像并分析。
结果如图8和图9所示，GST-LvHcL48能与WSSV的外膜蛋白VP28相互作用。图8通过Far-Western blotting分析，发现GST-LvHcL48能够与WSSV的外膜蛋白发生相互作用；继而通过质谱鉴定，该条带与WSSV主要的外膜蛋白VP28高度同源；提示LvHcL48可能与VP28相互作用。图9为GST-Pull down联合Western blotting，对图8的结果进行验证，结果表明LvHcL48确实能与VP28相互作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 汕头大学
<120> 一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48及其应用
<130> 2018
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Phe Leu Ile Pro Lys Gly Asn Glu Gln Gly Leu Glu Phe Asp Leu
1 5 10 15
Val Val Ala Val Thr Asp Gly Ala Ala Asp Ala Ala Val Asp Gly Leu
20 25 30
His Glu Asn Thr Glu Phe Asn His Tyr Gly Ser His Gly Lys Tyr Pro
35 40 45
Asp Asn Arg Pro His Gly Tyr Pro Leu Asp Arg Arg Val Pro Asp Glu
50 55 60
Arg Val Phe Glu Asp Leu Pro Asn Phe Gly His Ile Arg Val Lys
65 70 75
<210> 2
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgattcctca tccccaaggg taatgaacag ggtctggagt tcgaccttgt tgttgccgtg 60
actgatggcg cagccgacgc agcagtggat ggcctccacg aaaacaccga attcaatcat 120
tatggttccc atggcaagta ccctgacaat cgcccacatg gctaccctct ggatcgcagg 180
gttcccgatg aacgtgtatt cgaagatctt cccaacttcg gccacatccg agttaag 237

Claims (9)

1.一种来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种含有根据权利要求2所述编码基因的表达盒。
4.一种含有根据权利要求2所述编码基因的重组菌。
5.一种含有根据权利要求2所述编码基因的重组载体。
6.根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48、权利要求2所述编码基因或权利要求5所述重组载体在制备抑制WSSV的制剂中的用途。
7.一种用于抗WSSV的制剂，其特征在于，包含根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48、权利要求2所述编码基因、权利要求5所述重组载体中的一种或者多种。
8.一种含有根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48的饲料添加剂。
9.一种含有根据权利要求1所述来源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的抗WSSV肽LvHcL48的饲料。
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Litopenaeus vannamei hemocyanin exhibits antitumor activity in S180 mouse model in vivo;Shangjie Liu等;《PLOS ONE》;20170830;第1-14页 *
源于凡纳滨对虾血蓝蛋白化学合成肽段的抗黑曲霉活性;李长平等;《中国水产科学》;20180131;第25卷(第1期);第189-194页 *

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