CN110308281B - 一种泛素链固相检测方法和应用 - Google Patents
一种泛素链固相检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物样本中蛋白质泛素化修饰的高效、灵敏且无偏性的检测方法。以由两个不同的泛素结合结构域串联而成且N端含有标签蛋白(GST)的人工合成多肽(ThUBD)作为检测试剂。与通用的商业化泛素抗体相比,本发明提供的检测试剂以及固相检测方法能够高效、无偏性的识别泛素分子形成的8种不同泛素链,实现对生物样本内源泛素链的无偏性检测;可以显著提高泛素化蛋白质的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及对泛素链进行检测的方法;
本发明还涉及串联杂合泛素蛋白结合结构域(ThUBDA)的用途;
本发明也涉及检测泛素蛋白的试剂盒。
背景技术
泛素(Ubiquitin)是含有76个氨基酸的小蛋白,因其在真核细胞内广泛存在且高度保守而得名。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin Proteasome Systerm,UPS)是真核生物体内重要的蛋白质特异性降解途径之一。研究表明,除了介导蛋白质的特异性降解之外,泛素化修饰作为重要的调节信号还参与了包括细胞免疫应答、DNA损伤修复和细胞凋亡等几乎所有生命活动。泛素化修饰关键节点的失调与许多疾病的发生发展密切相关,其诸多调控靶点成为疾病治疗的潜在药物靶标。因此,蛋白质泛素化修饰的调控与功能研究是生命科学研究的热点之一。
蛋白质的泛素化修饰(Ubiquitination)是一种高度保守且过程可逆的翻译后修饰。在细胞内,泛素经由泛素活化酶E1,泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的级联酶促反应,通过其C末端的甘氨酸羧基与蛋白质底物的赖氨酸ε-氨基共价连接。泛素本身含有的7个赖氨酸(Lys6,Lys11,Lys27,Lys29,Lys33,Lys48和Lys63)以及泛素分子N端的蛋氨酸可以继续被泛素分子共价修饰,形成8种不同连接方式的多聚泛素链。不同连接方式的泛素链具有不同的空间拓扑结构,可以被不同的蛋白所识别进而介导不同的生物学功能。如最经典的K48链主要介导底物被26S蛋白酶体降解;K63泛素链则主要参与溶酶体的胞内运输、细胞内信号传导和DNA修复等非降解过程;非经典的线性泛素链(M1chain)主要参与NF-κB激酶的激活等过程;K11泛素链引导内质网相关的蛋白质降解和细胞周期调控等过程。由于被修饰蛋白质底物上不同的泛素链具有不同的结构,传导不同的生物学功能,因此,泛素链的研究是生命科学和健康医学研究的热点、重点,但也是难点。泛素化修饰纷繁复杂的结构特征与功能的多样性构成了精密的调控语言,称之为“泛素密码”。如何能够高效灵敏地检测泛素化蛋白上的泛素链信号具有重要的技术和应用需求。
泛素链和泛素信号可以被细胞内的泛素化系统识别并传递,进而将修饰底物引导到蛋白酶体降解或者其他细胞器发挥功能。泛素化修饰功能的发挥依赖于信号重要传递者——含有泛素结合结构域(Ubiquitin binding domain,UBD)的蛋白质。研究表明在人的蛋白质组中存在250多个包含有UBD的泛素受体蛋白。根据其生化与结构特征可分为16类,包括UBA(Ub-associated domain)、UIM(Ub-interacting motif)、PAZ(polyUb-associatedzinc finger)、MIU(motif interacting with Ub),CUE(coupling of Ub conjugation toER degradation),GAT(Golgi-localized,Gamma-era-containing,Arf-binding),UBZ(ubiquitin-binding zinc finger),UBC(ubiquitin-conjugating enzyme),UEV(ubiquitin-conjugating enzyme E2variant),UBM(ubiquitin binding motif),NZF(Np14zinc finger),ZnF-UBP(ubiquitin-specific processing protease zincfinger),ZnF-A20(zinc finger),GLUE(GRAM-like ubiquitin binding in EAP45),Jab1/MPN(Jun kinase activation domain binding/Mpr1p and Pad1p N-terminal)和PFU(PLAA family ubiquitin binding)。
UBD种类与结构的多样性决定了其与泛素结合的亲和力的多样性和特异性。不同的UBD结合泛素单体的能力存在很大差异,其解离常数(Kd)从2到750μM不等。许多蛋白质含有重复的UBD序列或形成蛋白质的二聚体,增强了与泛素链的亲和特性。多个UBD三维结构解析结果表明UBD可通过三种方式与泛素分子结合。大多数UBD与泛素分子第44位的异亮氨酸(Ile)为中心的疏水区结合。另外,Rabex-5蛋白中的ZnF-A20结构域则与泛素第58位的天冬氨酸(Asp)结合。UBD与泛素的识别机制决定了UBD与泛素及泛素链的结合能力与特异性。
2003年,Peng等利用芽殖酵母内源表达带有组氨酸标签的泛素蛋白,在变性条件下成功富集了酵母细胞中的泛素化蛋白质;相同的策略已被成功地应用到其他类泛素蛋白修饰的蛋白质底物的鉴定。然而该方法存在明显的局限性,经基因改造的泛素基因可用于酵母、细胞甚至转基因动物,但无法应用于临床标本内源蛋白的泛素化研究。利用人工表达泛素结合结构域UBD亲和纯化泛素化蛋白质成为有效的方法。Hjerpe等发现4个串联的UBA泛素结合结构域与泛素链的结合能力明显提高,而且能够保护多聚泛素化修饰,避免其被蛋白酶体降解及去泛素化酶的作用。Hikaru等改造Ub-ProT并结合酶切技术实现对泛素链长度与种类的分析。Shi等利用4个串联的UBA泛素结合结构域成功地从哺乳动物细胞中富集到许多原先未鉴定到的泛素化蛋白质。这些报道中均使用了单一的UBA结构域,在大规模泛素化蛋白质富集过程中,会根据所选择的泛素结合结构域的特性对不同泛素链修饰底物进行富集。高媛和李衍常等系统评价了不同UBD对泛素链的亲和能力与结合偏性,选择性组合不同的泛素结合结构域,构建了人工杂种蛋白,发展了高效、无偏性的串联杂合泛素结合结构域(Tandem hybrid ubiquitin binding domain,ThUBD),实现对细胞或组织样本的内源泛素化蛋白的有效富集。
然而,泛素链的有效检测还存在诸多挑战。目前,蛋白质免疫印迹法(即WesternBlot),是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的检测手段,其原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白样品或生物组织样品中靶标蛋白进行孵育结合,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质的表达情况。目前,生物样品内源的泛素化修饰检测主要依赖于泛素抗体识别泛素的特定序列。由于抗体是通过泛素序列中的抗原表位识别泛素分子,因此抗原表位的充分暴露成为了抗体识别泛素的先决条件。同时,由于不同的泛素链具有不同的空间结构,其中K63和M1链的结构是充分舒展的,K6,K11,K27,K33,K48链的结构是比较紧密的,K29链的空间舒展程度介于K63和K48之间。不同的空间拓扑结构,导致不同类型的泛素链中泛素抗原表位的暴露程度不同,泛素分子的抗原表位被包埋则会低泛素抗体的识别效率,具体表现就是泛素抗体对泛素链的识别存在偏好性。由此造成的问题是利用泛素抗体无法真实的反映样本中泛素化信号的强度。目前,缺乏能够区分开单泛素化修饰和多聚泛素链修饰的检测方法,现有的泛素抗体检测泛素链的灵敏度、无偏性和准确性有待提高。
中国专利ZL201410323921.1公开了一种串联杂种泛素蛋白结合结构域(Tandemhybrid ubiquitin binding domain,ThUBD),可以对所有赖氨酸连接的7种泛素链实现无偏性高效富集,比天然的泛素蛋白结合结构域具有更强的富集能力。
Far-western blotting技术是一种基于Western blotting的分子生物学方法,可以用来检测蛋白-蛋白之间的相互作用。Western blotting实验中,用抗体来识别目标蛋白,而在Far-western blotting中,识别目标蛋白的是非抗体蛋白质,通常称之为诱饵蛋白(Bait protein,bait蛋白)。诱饵蛋白通常融合有可被抗体特异性检测的通用标签,比如谷胱甘肽-S-转移酶标签(GST)或者组氨酸标签(His)等,利用标签特异性抗体进行固相(如NC或PVDF膜)识别与检测,进而反映目标蛋白的含量。据此,发明人提出假设:利用与8种泛素链具有高亲和能力、且无偏性的泛素蛋白结合结构域(ThUBD)作为诱饵蛋白,结合Far-western blotting技术,实现高灵敏无偏性检测细胞或组织内源蛋白泛素化修饰。
发明内容
本发明的目的是建立一种高效、灵敏且特异的泛素链生化检测技术,实现对生物样本内源所有泛素链信号的高灵敏度、无偏性的固相识别与检测。
本发明的另一目的是提供一种检测泛素链的试剂盒。
本发明的再一目的是提供串联杂合泛素蛋白结合结构域(ThUBD)在检测上的用途。
根据本发明的一方面,一种检测生物样本中蛋白质泛素链修饰的检测方法,所述方法以带有通用标签的杂种泛素结合结构域多肽作为检测试剂。
本发明所述检测方法将杂种泛素结合结构域多肽作为诱饵蛋白,结合Far-western blotting技术用于检测生物样本中蛋白质泛素链修饰。
本发明所述的杂种泛素结合结构域多肽可以是如专利ZL201410323921.1记载的多肽,将其全文引用结合至本发明中。优选的是其中所述杂种泛素结合结构域多肽为如下(A)或(B)多肽:
(A)由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成;
(B)由至少两个相同的或不同的杂种泛素结合结构域单元串联而成;
所述杂种泛素结合结构域单元由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成。
所述泛素结合结构域可选自如下现有的16类泛素结合结构域(UBD):UBA结构域、UIM结构域、PAZ结构域、MIU结构域、CUE结构域、GAT结构域、UBZ结构域、UBC结构域、UEV结构域、UBM结构域、NZF结构域、UBP ZnF结构域、ZnF-A20结构域、GLUE结构域、Jab1/MPN结构域和PFU结构域。
更优选的所述杂种泛素结合结构域多肽选自:
(a)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域;
(b)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成;所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域;n为大于等于2的整数;
(c)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域;和
(d)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成;所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域;n为大于等于2的整数。
更优选的是,所使用的杂种泛素结合结构域多肽如下:
由两个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成,所述杂种泛素结合结构域单元:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域。
在本发明的检测方法中,所述通用标签为与所述杂种泛素结合结构域多肽连接的一标签蛋白,所述连接既可以是氨基端连接,也可以是羧基端连接。所述标签蛋白为能够进行免疫反应检测(亲和纯化)的标签蛋白。优选的标签蛋白选自:谷胱甘肽-S-转移酶标签、His标签、Flag标签、HA标签、Myc标签、纤维素结合域标签和钙调蛋白标签。更优选的标签蛋白为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签,连接于ThUBD的N端或者C端。
在一个具体的实施方案中,ThUBD的N末端含有GST标签,通过亲和纯化的方法得到高纯度的ThUBD。以ThUBD为诱饵蛋白,检测GST信号来反映内源蛋白泛素链修饰的强度。将ThUBD与Far-western blotting技术进行结合,有望实现对所有连接类型的泛素链的无偏性检测,如图1A所示。
在具体的检测方法中,所述方法可以为固相检测方法,包括如下步骤:
(1)从待测样品中分离提取蛋白质组或者特定靶蛋白;
(2)以步骤(1)获得的蛋白质,进行凝胶电泳,并转膜至NC或PVDF固相膜上,5-10%的脱脂奶粉封闭;
(3)对步骤(2)得到的NC或者PVDF膜与诱饵蛋白进行孵育结合;
(4)将步骤(3)的固相膜与所述诱饵蛋白所携带标签蛋白的特异性抗体进行二次孵育,显色;
其中所述诱饵蛋白为所述杂种泛素结合结构域多肽。
具体的实验流程如下:将变性条件或者非变性条件下提取的细胞或者组织蛋白质,利用二硫苏糖醇(DTT)60℃还原30分钟,室温避光条件下碘乙酰胺(IAA)烷基化30分钟,经SDS-PAGE分离后将蛋白电泳转移到固相载体如硝酸纤维素膜(NC膜)或者PVDF膜上,经TBST溶解的10%脱脂奶粉室温封闭1小时。然后,用5%奶粉溶液稀释的杂种泛素结合结构域多肽ThUBD对膜进行室温孵育1小时,ThUBD工作浓度为10nM。孵育后,用TBST洗去膜上未结合的蛋白,重复三次,每次10分钟。然后用GST的抗体对膜进行孵育,后续实验操作和普通的Western blot相同,如图1B所示。
根据本发明的另一方面,提供一种检测试剂盒,包含下述材料的至少一种:
(i)一所述的杂种泛素结合结构域多肽;
(ii)一固相吸附剂,所述固相吸附剂为将所述杂种泛素结合结构域多肽固定于固相载体上后所得;或
(iii)一层析柱,以(ii)中的所述固相吸附剂做为填料。
根据本明的又一方面,提供泛素结合结构域多肽在检测泛素化蛋白质中的应用,其中所述泛素结合结构域多肽为人工构建的杂种泛素结合结构域多肽,例如:如专利ZL201410323921.1记载的多肽。
有益效果:本发明所提供的技术策略能够特异高效地检测8种泛素链的信号,而非被修饰蛋白质底物甚至泛素分子或者单体本身。首先,利用本发明中的检测方法对8种连接类型的二聚泛素链进行检测,结果显示本方法能够实现对泛素链的无偏性检测。常用的商业化抗泛素抗体显示对8种泛素链的检测均出现严重的偏性,即对K63链存在显著的偏好性,对其他泛素链的检测能力微弱。同时,与抗泛素抗体相比,本发明所提供的检测方法具有更高的灵敏度以及更低的检测下限。综上,本发明为蛋白质泛素化研究者提供了一种操作性强,高效,准确且无偏性的泛素链生化检测方法,能够比泛素抗体更加真实地检测待测样本上泛素链修饰的含量。
附图说明
图1:本发明的识别模式图(A)及流程图(B)。杂种泛素结合结构域多肽ThUBD能够特异性识别泛素链,然后利用标签抗体识别GST标签,显色信号反映生物样品中泛素链的相对含量及其变化。
图2:本发明方法的可行性及特异性检测。分别用GST标签、泛素抗体和ThUBD(即UBD-GST)为诱饵蛋白,与人肾上皮细胞293T和大肠杆菌(E.coli)全细胞蛋白进行孵育结合;GST和ThUBD孵育的样品分别再与GST抗体孵育,然后三者分别与相应的二抗孵育并显色检测。丽春红染色表征上样量(Ponceau S)。
图3:本检测方法的灵敏度与检测线性关系比较。与以抗泛素抗体为基础的检测方法对比,比较本发明方法的灵敏度。用本方法(A)和抗泛素抗体(B)对293T全细胞蛋白进行检测,设置上样梯度(1.25,2.5,5,10,20微克)和曝光时间梯度(3,10,30,60,120,300秒)显色。本方法在生物学样本的泛素链定量方面表现出良好的线性关系,R2达到0.99(C)。将两种方法检测到的泛素信号进行比较,在相同上样量,相同曝光时间的条件下,本方法的信号强度均高于以抗泛素抗体为检测手段的信号强度,比值中位数达到4.67倍(D)。
图4:本方法对二聚泛素链和泛素单分子的检测。银染(Silver staining)结果用来表征上样量(A),使用等质量量的二聚K63泛素链和泛素与ThUBD孵育结合,通过GST抗体检测结合泛素或者泛素链的UBD的信号(UBD-GST显色)(B)。
图5:本发明方法检测8种二聚泛素链。与商品化抗体相比,本方法能够更加无偏性地识别所有泛素链。将原始显色结果(A)的条带亮度进行数字化,以银染的灰度作为上样量基准,计算每一种链占所有8种泛素链所有信号的比例(B)。
图6:利用本发明方法对酵母细胞中纯化的Lsb1(Las seventeen bindingprotein)蛋白进行检测。纯化后的Lsb1,其蛋白条带用银染和生物素(Biotin)抗体进行表征,同时用泛素抗体和本发明方法(A)检测,比较泛素抗体和本方法对Lsb1上泛素链的检测结果(B),同时将纯化样品不同的条带进行切胶,进行胰蛋白酶消化并进行质谱检测。
图7:质谱分析Lsb1目标蛋白及其泛素化修饰的相对含量。将图6中切胶消化的组分进行质谱检测,并用质谱信号强度绝对定量值iBAQ(intensity based absolutequantification)对Lsb1、泛素、K48和K63链进行定量。
图8:Lsb1目标蛋白不同泛素链修饰组成分析。比较图6中组分4和组分6通过本发明方法(A)、抗泛素抗体(B)和质谱(C)检测泛素化信号的定量比例。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,除了ThUBD之外,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1:ThUBD固相识别泛素化蛋白的有效性和特异性
一、ThUBD融合蛋白的表达与纯化
将含有GST标签的ThUBD编码基因的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)(北京康为世纪生物科技有限公司产品,目录号:CW0808A)中。在37℃条件下用LB培养基培养到密度为A600(600nm处的吸光值)为0.4-0.6时,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.5mM,并在30℃条件下诱导融合蛋白表达4小时,收集菌液并在6000rpm,4℃条件下离心5分钟收集细胞。
收集的细胞重悬于裂解液(配方:1×PBS,pH 7.4,1mM DTT,10%甘油),超声破碎仪裂解细胞(工作2秒,静置4秒,总共超声30分钟,功率为25%),然后在4℃,15000rpm离心10分钟,将上清液转移到新离心管中。在上清液中加入谷胱甘肽琼脂糖凝胶颗粒(200微升,QIAGEN公司产品,其产品目录号为30900),在4℃旋转孵育60分钟。琼脂糖凝胶颗粒用洗杂缓冲液(配方:1×PBS,pH 7.4,1mM DTT)清洗3次,每次10毫升,降低非特异性结合的污染蛋白,得到特异性结合在琼脂糖凝胶颗粒上带有GST标签的ThUBD融合蛋白。用洗脱缓冲液(配方:1×PBS,pH 7.4,1mM DTT,5-20mM还原型谷胱甘肽)对结合在琼脂凝胶颗粒上的ThUBD融合蛋白进行洗脱,设置5,10,15,20mM GSH四个洗脱梯度,每个梯度洗脱2毫升。洗脱液合并,用超滤置换的方法将缓冲液置换为1×PBS,20%甘油,用BCA法测浓度(ThermoFisher,其产品目录号为23228)后,冻存于-30℃冰箱备用。
二、以293T全细胞裂解液和泛素链样品为待测样本检测ThUBD识别泛素化蛋白的有效性和特异性。
将真核细胞293T和原核细胞大肠杆菌(E.coli)的全细胞蛋白裂解液用于检测新方法的有效性,原理与流程如图1所示。由于大肠杆菌是原核生物,天然状态下没有内源泛素分子和泛素化修饰,作为阴性对照;293T为真核细胞样本,存在大量的泛素化修饰,作为阳性对照。取等量的两者总蛋白平行进行SDS-PAGE凝胶电泳转膜到固定相NC膜(PALL,其产品目录号为66485)上,共三份。然后本实验设置三组实验:(1)作为阴性对照,取20nM的GST标签蛋白与待测样本膜进行孵育结合,然后与GST抗体孵育;(2)作为阳性对照,抗泛素抗体(Santa cruz,产品目录号为sc-8017)与待测样本膜孵育结合;(3)实验组,取20mM的ThUBD作为诱饵蛋白与待测样本膜进行孵育结合,然后与GST抗体(Abcam,产品目录号为Ab36415)孵育。后续操作与Western blot一致。其中第(1)组用来检测待测样本与GST标签的非特异性结合,排除由于GST标签与内源蛋白的相互作用带来的假阳性;第(2)组作为阳性对照,显示泛素化蛋白的检测结果,为评测实验组提供参考标准;第(3)组为实验组,用来检测ThUBD与非泛素修饰蛋白质组(E.coli)的非特异性结合信号以及真核细胞(293T)的结合信号。
结果如图2所示,第一组利用GST空标签进行孵育结合并显色,无论是大肠杆菌还是293T样本,都没有任何信号,排除了可能来自于GST与待测样本蛋白结合的可能,为证明ThUBD的显色结果是特异性来源于泛素结合结构域UBD与待测蛋白的结合提供了证据。ThUBD显色信号与阳性对照泛素抗体的显色结果类似,在大肠杆菌泳道没有任何信号,而在真核293T总细胞蛋白泳道的高分子量区域存在彗星拖尾状的强信号,表明ThUBD能够特异性识别泛素化信号。同时,结果显示ThUBD的检测灵敏度高于抗泛素抗体的检测灵敏度。在相同显色剂条件下,抗泛素抗体的曝光时间需要120秒,而ThUBD的检测曝光时间在仅为10秒时所检测到的信号分布与抗泛素抗体的结果相似,且强度相当。用ThUBD检测大肠杆菌的总细胞蛋白,和抗泛素抗体一样,都没有任何信号。因此,ThUBD识别的是293T全细胞蛋白中的泛素化信号,而不是非泛素化修饰蛋白。
通过实施例1,表达并定量了GST标签蛋白和杂种泛素结合结构域多肽ThUBD,排除了由于GST标签与复杂蛋白质组的非特异性结合的假阳性问题,证明了该方法以ThUBD为诱饵蛋白可以特异性地检测真核细胞内蛋白质的泛素化修饰信号强度。
实施例2:ThUBD固相识别泛素化蛋白的灵敏度高于基于抗泛素抗体的检测方法
一、ThUBD融合蛋白的表达与纯化
ThUBD融合蛋白的表达与纯化方法参照实施例1。
二、利用ThUBD对真核细胞内蛋白质泛素化进行检测
培养并收集293T细胞,利用裂解液提取细胞总蛋白,如实施例1所述。将不同量的293T细胞的总细胞蛋白在10%SDS-PAGE电泳分离后,转移到固相NC膜上,用本发明中的方法和商品化的抗泛素抗体分别进行孵育检测,所用NC膜和抗体参照实施例一。293T细胞全蛋白上样量依次递增,设置为1.25、2.5、5、10、20微克,立春红染色的结果作为上样量参考对照。同时,显色时设置不同的曝光时间,分别为3、10、30、60、120、300秒梯度曝光时间。将显色的深度转变为灰度数值,进行定量比较。
结果如图3显示,在相同上样量和曝光时间条件下,本发明的检测方法比抗泛素抗体表现出更高的灵敏度,如图3A、B所示。同时,将这些信号用软件ImageJ 1.48v进行数字化,用于定量分析泛素化信号和上样量的线性关系。如图3C所示,在ThUBD的检测结果中,将120秒曝光时间不同上样量与其信号强度绘制定量曲线,两者呈现良好的线性关系(R2=0.99),表明本检测方法可以准确反映泛素化水平的变化,信号强度可以用来定量比较泛素化水平。基于灰度值,计算本检测方法和抗泛素抗体检测的信号强度比值(UBD-GST/泛素抗体)(图3D),等上样量和相同曝光时间条件下,本发明方法检测到的泛素信号是抗泛素抗体检测信号的4.67倍,表明该方法的检测灵敏度显著高于商业化抗泛素抗体的检测灵敏度。
通过实施例2证明了本发明的检测方法可比商品化的抗泛素化抗体具有更高的灵敏度,同时本发明的方法在不同上样量与其信号强度呈现良好的线性关系,证明其定量动态范围宽,定量准确性高,可以用于复杂样本蛋白的泛素化水平的定量比较。
实施例3:ThUBD对8种泛素链的固相识别和检测
一、ThUBD融合蛋白的表达与纯化
ThUBD融合蛋白的表达与纯化方法,显色方法参照实施例1.
二、利用ThUBD对泛素分子单体与二聚泛素链进行检测
测试ThUBD与泛素分子以及二聚泛素链的亲和能力。将等质量的泛素和2聚K63链同时与ThUBD进行孵育结合并进行显色检测,以银染的胶图用来表征上样量。结果如图4所示,在相同上样量的情况下,ThUBD对泛素链表现出较高的亲和能力,对泛素分子单体识别能力微弱,长时间曝光仍然无检测信号,表明ThUBD主要识别泛素链,而对泛素单体结合弱,与之前的文献报道一致。因此,该方法可以用于检测生物样本中泛素链的信号强度。
三、利用ThUBD对8种连接类型的泛素链进行检测。将8种二聚泛素链M1,K6,K11,K27,K29,K33,K48和K63(美国LifeSensors公司,货号为SI200)经15%SDS-PAGE分离后用银染进行定量,然后取等量的链(50纳克),经15%SDS-PAGE电泳分离后,转移到固相NC膜上。用本发明中建立的基于ThUBD的显色策略检测泛素链的信号。同时,用两种常用的商品化抗泛素抗体分别平行检测泛素链的信号。银染的胶图作为上样量参考。
结果如图5A所示,银染的胶图显示8种泛素链的上样量比较接近。ThUBD的显色结果(UBD-GST显色)显示,ThUBD能够识别8种泛素链,与银染的结果的含量基本一致。然而,利用两个商品化的抗泛素抗体(Anti ub-1,Santa cruz,产品目录号为sc-8017;Anti ub-2,Cell signaling,产品目录号为3969s),信号出现严重的偏好性,抗体对K63链表现出非常强的偏好性(图5A),其次是M1泛素链,长时间曝光K48泛素链也有微弱的信号,而其他泛素链则几乎无检测信号,这表明抗泛素抗体对泛素链的识别能力具有巨大的差异,无法准确地反映生物样本中的泛素化水平。将图4A中条带的信息用ImageJ 1.48v进行定量,每张膜上所有条带的亮度总和归一到100%(图5B)。从图中可以看到,基于ThUBD的检测结果与银染的结果具有高度的相似度,只有K27链略微弱一些,说明本方法可以在固相膜上准确地呈现出各种泛素链的化学剂量。然而,在泛素抗体的检测结果中,K63链的比例分别为总信号的78.8%和97.0%,对K63链表现出严重的偏好性,对其他泛素链的检测能力非常微弱。
通过实施例3,证明了基于ThUBD的泛素链固相检测技术,可以实现对所有8种类型泛素链的无偏性结合与检测,比商品化的抗体更准确地检测待测样本中泛素链的含量变化。
实施例4:ThUBD固相检测目标蛋白Lsb1上泛素链信号
一、ThUBD融合蛋白的表达与纯化
ThUBD融合蛋白的表达与纯化方法、显色方法参照实施例1.
二、酵母Lsb1蛋白的纯化
将含有HB标签的Lsb1(Las seventeen binding protein)编码基因的表达载体转化到酵母细胞中,在30℃条件下YPD培养基中培养到A600(吸光值600nm)为1.2-2.0,6000rpm,4℃条件下离心5分钟收集细胞。因Lsb1带有组氨酸和生物素标签,可以通过镍柱和链霉亲和素进行串联纯化,提高Lsb1的纯度。HB-Lsb1的理论分子量为37.2kDa。
酵母细胞重悬于裂解液(配方:50mM Tris pH 8.0,150mM NaCl,8M尿素,5mM IAA,5mM咪唑,0.5%NP-40,1mM NEM,1mM PMSF))中,用玻璃珠震荡破碎细胞,4℃条件下15000rpm离心10分钟,将上清液转移到新的离心管中。在蛋白上清液中加入Ni-NTA琼脂糖凝胶颗粒(200微升,QIAGEN公司产品,其产品目录号为30900),在4℃旋转孵育60分钟。琼脂糖凝胶颗粒用洗杂缓冲液(配方:150mM Tris pH 8.0,150mM NaCl,8M尿素,10mM咪唑,)清洗3次,每次10毫升。用洗脱缓冲液(配方:50mM Tris pH 8.0,150mM NaCl,8M尿素,50mM咪唑)将Lsb1融合蛋白从琼脂糖凝胶颗粒洗脱下来。洗脱后的蛋白溶液再与链霉亲和素的凝胶颗粒(ThermoFisher,其产品目录号为20353)进行孵育,在4℃旋转孵育60分钟。用洗杂缓冲液2(配方:50mM Tris pH 8.0,150mM NaCl)清洗3次,每次10毫升。最后将凝胶颗粒上的Lsb1蛋白用1×SDS溶解液洗脱下来,等待检测。
三、利用本发明技术检测Lsb1上泛素化修饰
将纯化得到的Lsb1蛋白经8%SDS-PAGE分离后,电泳转移到NC固相膜上。用本发明中建立的基于ThUBD的显色策略检测Lsb1上的泛素链信号。同时,用商品化的抗泛素抗体检测泛素化信号,用生物素抗体检测Lsb1的信号,用银染表征串联纯化后纯化蛋白总量。
结果如图6A所示,用抗生物素抗体检测到的信号与银染信号的带型与强弱分布一致,说明SDS-PAGE上的主要条带来自于Lsb1蛋白,串联纯化得到高纯度的目标蛋白Lsb1。同时,在分子量为40kD左右的位置,可以检测到未修饰的Lsb1蛋白,在本底条带的上部有丰富的条带,表明Lsb1发生大量的翻译后修饰,发生分子量迁移,暗示Lsb1可能发生高度的泛素化修饰。用ThUBD检测Lsb1蛋白上的泛素链修饰,结果显示在40kD位置附近,未修饰的Lsb1没有显色信号,而在其高分子量区域存在明显的泛素化的条带,且带型与各条带之间的信号强弱与抗生物素抗体检测的信号相似。该结果证明可以用ThUBD对目标蛋白的泛素化修饰进行有效检测,同时显示ThUBD特异性的识别Lsb1上修饰的泛素链而不识别非修饰的Lsb1(图6A)。
本实施例中同时用商业化抗泛素抗体(Anti Ub)和ThUBD对Lsb1蛋白上修饰的泛素链进行平行的检测,相同目标蛋白分别与抗体和ThUBD孵育结合并平行显色。结果显示,ThUBD的检测灵敏度显著高于抗泛素抗体的检测灵敏度。取ThUBD曝光0.3秒和抗体曝光60秒的两个结果进行对比,两种显色方法的检测条带类似。然而,我们发现不同条带的强弱分布存在一些差异,比如条带4和条带6,ThUBD检测信号强度接近,而抗泛素抗体检测信号显示条带6弱于条带4。为了进一步验证两种检测方法的准确性与可信度,将泛素化部分按照分子量在SDS-PAGE胶上,切胶消化后用质谱检测定量(图6B)。
四、目的条带的质谱检测及数据分析
按照图6B所示切割不同的条带,胶条进一步切为1mm3的颗粒,用脱色液(50mM碳酸氢铵,30%乙腈)对胶粒进行脱色,以100%乙腈进行脱水干燥后以12.5ng/μL的胰蛋白酶于37℃进行消化过夜,然后加入5%(体积分数)甲酸和50%(体积分数)乙腈的混合液终止消化,13300rpm离心后收集上清,重复2-3次。然后加入60微升乙腈,涡旋20分钟,13300rpm离心1分钟后收集上清,再次加入乙腈60微升,重复涡旋离心操作,直至凝胶颗粒中液体抽干,胶粒完全变硬。将得到的肽段溶液在真空干燥仪器中蒸干。
将蒸干的肽段样品用20微升的溶解液(2%乙腈,1%甲酸)溶解,取2微升进行色谱-质谱联用分析,利用nano-UPLC(Waters Acquity)-MS/MS(美国Thermo FisherScientific,LTQ Orbitrap Velos)对样品完成数据采集。样品上样15厘米自装毛细管柱(360微米外径×75微米内径,填料为3微米fused-silica C18柱子)上,60-80分钟分析时间,液相梯度从98%A(2%乙腈,0.1%甲酸)到35%B(0.1%甲酸,99.9%乙腈),流速为300纳升/分钟。质谱数据采集利用数据依赖型全扫描(DDA)方法检测样品中不同泛素链的信号强度,一级全谱扫描(m/z=300-1600)在Orbitrap内完成,分辨率设置为30,000,自动增益控制AGC设置为106,最大离子注入时间MIT设置为150毫秒;二级谱图采用CID碰撞模式,选取丰度最高的前20进行二级碎裂,AGC设置为5×104,MIT设置为25毫秒。最小信号阈值(Minimal signal threshold)设置为2000,动态排除设置为40秒。将质谱的原始数据用MaxQuant软件(版本号V1.5.30)进行检索,对照Uniprot最新发布的酵母蛋白组数据库。统计不同的组分中Lsb1、泛素以及K48和K63链的质谱信号强度iBAQ(intensity basedabsolute quantification)值,进行不同组分之间的定量比较(图7)。结果显示,不同组分之间Lsb1和泛素的比例各不相同,随着分子量的增加,Lsb1的泛素化水平越来越高;同时不同组分之间的K48和K63泛素链的比例接近。
将本发明方法(A)、抗泛素抗体(B)和质谱(C)检测方法得到的信号强度进行比较。之前发现组分4与组分6的信号强度存在明显的差异,以质谱的定量结果为标准参考,评价ThUBD显色和泛素抗体显色的准确性。结果如图8所示,ThUBD检测到的组分4和6泛素信号比例为1:0.97,抗泛素抗体的检测比例为1:0.65,质谱检测到的比例为1:1.04,表明质谱的检测结果与本发明方法的检测更为接近。证明本发明方法比抗泛素抗体更能真实地反应底物上的泛素链信号。探究抗泛素抗体检测造成误差的原因,如图7所示组分6中K48泛素链的比例高于组分4。在实施例3中已经发现抗泛素抗体对K63存在显著的偏好性,而对K48泛素链的检测能力微弱。因此,组分6中K63链的比例低,K48链比例高,导致抗泛素抗体检测组分6的泛素链信号低于正常值。这里实例证明由于抗泛素抗体识别不同链的偏好性,导致无法真实地反映目标蛋白的泛素化修饰强度,而本发明方法能够准确地反映修饰底物上泛素链信号含量。
通过实施例4,以酵母内Lsb1的泛素化检测为应用实例,证明了以ThUBD为诱饵蛋白的泛素化固相检测技术显著优于抗泛素抗体的检测效果,能更加灵敏、准确地检测目标蛋白上泛素链含量。
Claims (3)
1.一种检测生物样本中蛋白质泛素链修饰的检测方法,其中所述方法以带有通用标签的串联杂种泛素蛋白结合结构域多肽作为检测试剂,将串联杂种泛素蛋白结合结构域多肽作为诱饵蛋白,结合Far-western blotting技术检测生物样本中蛋白质泛素链修饰;
所述通用标签为与所述串联杂种泛素蛋白结合结构域多肽连接的谷胱甘肽-S-转移酶标签;
所述方法包括如下步骤:
(1)从待测样品中分离提取蛋白质组或者特定靶蛋白;
(2)以步骤(1)获得的蛋白质,进行SDS-PAGE凝胶电泳,并转膜至NC或PVDF固相膜上,经TBST溶解的10%脱脂奶粉室温封闭1小时;
(3)用5%奶粉溶液稀释的串联杂种泛素蛋白结合结构域多肽对膜进行室温孵育1小时,串联杂种泛素蛋白结合结构域多肽工作浓度为10nM;
(4)将步骤(3)的固相膜与所述诱饵蛋白所携带标签蛋白的特异性抗体进行二次孵育,显色。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其中所述串联杂种泛素蛋白结合结构域多肽为如下(A)或(B)多肽:
(A)由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成;
(B)由至少两个相同的或不同的杂种泛素结合结构域单元串联而成;
所述杂种泛素结合结构域单元由至少两个不同的泛素结合结构域串联而成。
3.根据权利要求1至2任一项所述的检测方法,其中所述串联杂种泛素蛋白结合结构域多肽选自:
(a)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域;
(b)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成;所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的RABGEF1蛋白的ZnF-A20结构域;n为大于等于2的整数;
(c)由如下两个泛素结合结构域的氨基酸序列串联组成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域;和
(d)由n个相同的杂种泛素结合结构域单元串联而成;所述杂种泛素结合结构域单元由如下两个泛素结合结构域串联而成:来自于酵母的DSK2p蛋白的UBA结构域,以及来自于人类的UBQLN2蛋白UBA结构域;n为大于等于2的整数。
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